Orientador: Maria Aparecida Marin Morales / Banca: Silvia Tamie Matsumoto / Banca: Mário sérgio Mantovani / Resumo: Os agrotóxicos, substâncias químicas muito utilizadas para combater pragas na agricultura e nas residências, além de contribuírem para o aumento da produtividade e, conseqüentemente, o crescimento economia, também são responsáveis pela contaminação ambiental, quando utilizados indiscriminadamente, e por muitos casos de intoxicações e doenças genéticas nos seres humanos. Dependendo de sua composição química, degradabilidade e persistência no ambiente, os agrotóxicos podem comprometer a cadeia alimentar e afetar o ecossistema como um todo. Dentre os agrotóxicos bastante utilizados em todo o mundo, está o organofosforado malation. Pelo seu amplo uso, torna-se preocupante os possíveis danos que este inseticida possa promover no meio ambiente e nos organismos a ele expostos, pois alguns trabalhos já mostram esta sua ação detrimental. Desta forma, este trabalho investigou o potencial de indução de danos no DNA, para diferentes concentrações de malation, por meio das técnicas de aberrações cromossômicas e teste do micronúcleo em A. cepa e micronúcleo e ensaio do cometa em células HTC (hepatoma tissue culture). Nos testes com células meristemáticas e F1 de A. cepa, expostas por 24 e 48 horas ao malation, foram verificadas freqüências significativamente elevadas de AC e MN. Após 24 horas de exposição, não houve aumento na quantidade de AC, mas sim de MN. A análise das células F1 de A. cepa, juntamente com o teste de AC, forneceu dados importantes sobre a fixação dos danos genéticos induzidos pelo malation. Nenhum resultado relevante de citotoxicidade foi verificado em A. cepa. Após passarem pelo teste de recuperação, somente as células expostas às menores concentrações testadas apresentaram diminuição nos índices de AC e MN. / Abstract: Pesticides, chemicals widely used to combat pest in agriculture and in homes, besides contribute to the increase productivity and the economy, are also responsible for environmental pollution and for many intoxications cases and genetic diseases in human beings. Depending on their chemical composition, degradability and degree of persistence in the environment, the pesticides can endanger the food chain and affect the entire ecosystem. Among the pesticides most used in the world is the organophosphate malathion. Due to its widespread use it has been worrying the possible damages that can promote this insecticide in the environment and in organisms exposed to it. This study investigated the induction potential of DNA damage with several malathion concentrations using chromosomic aberration (CA) techniques, micronucleus test (MN) in A. cepa and micronucleus and comet assay in hepatoma tissue culture (HTC). In A. cepa tests, meristematic and F1 cells exposed for 24 and 48 hours to malathion showed significative frequencies of CA and MN. After 24 hours of exposure, there was no increase in the CA amounts, but was observed an increase to frequency of MN. The F1 cells analysis, together with the CA tests, provided important data on the genetic damages fixation induced by malathion. No relevant results of citotoxicity were verified in A. cepa. After the recovery test, the cells exposed to the smaller tested concentrations of malathion showed reduction of AC and MN indices. In the HTC cells test, was verified by the comet assay, genotoxic effects for all the tested concentrations, after exposure for 24 hours to the insecticide, but by the micronucleus tests, no significative results were found. These data suggest that the DNA lesions were repaired and not elapsed in mutation. With the concomitant realization of different tests, the clastogenic action of malathion could be verified. / Mestre

Orientador: Maria Aparecida Marin Morales / Banca: Carmem Silvia Fontanetti Christofoletti / Banca: Mateus Mondin / Resumo: Os agrotóxicos constituem uma importante estratégia da agricultura, para a obtenção de uma produtividade economicamente viável, pois são substâncias utilizadas no combate de organismos indesejáveis. Os inseticidas são agentes que têm ação de combater insetos, tanto na fase adulta como larval. O fipronil é um composto do grupo fenil-pirazol, toxicologicamente classificado como altamente tóxico, amplamente utilizado em campos agrícolas do estado de São Paulo, bem como nas residências, para combater insetos pragas. A ação deste inseticida se dá pela sua ligação ao canal de cloro, promovendo o bloqueio da ativação da condução dos estímulos nervosos, pelo ácido gama-aminobutírico (GABA), uma substância que controla o fluxo de íons cloro, através da membrana da célula nervosa. Em pequenas concentrações, apresenta uma eficiente ação nos organismos alvos. Esta característica também pode causar problemas ao meio ambiente, muitas vezes, longe até dos lugares onde foi aplicado. O fipronil, em temperaturas moderadas, é estável no ambiente por cerca de um ano. Estudos mostram que esse inseticida pode ser degradado em diversos metabólitos, que são ainda mais tóxicos que ele. Quanto a sua persistência no ambiente, o fipronil apresenta variações decorrentes da sua formulação, mas os seus metabólicos podem ser mais persistentes que o próprio inseticida. Resíduos de fipronil podem ser bioacumulado no tecido adiposo, indicando uma potencialidade de transferência via cadeia trófica. No presente trabalho, foram avaliadas as potencilidades tóxicas, citotóxicas, genotóxicas e mutagênicas do inseticida fipronil, por meio de bioensaios com Allium cepa, cujas sementes foram expostas à germinação em fipronil. / Abstract: The pesticides are an important strategy for agriculture, to obtain productivity economically viable, because they are substances used to eliminate pest organisms. Insecticides are agents which have action to combat insects, in both the adult and larval stage. The fipronil is a group composed of phenyl-pyrazole, toxicologically classified as highly toxic, and it is widely used in agricultural fields in Sao Paulo State, as well as in homes, to combat insect pests. This insecticide acts through its connection to the channel chlorine, promoting blockade in the activation of the conduct of nervous stimuli, the gamma-aminobutyric acid (GABA), a substance that controls the flow of chloride ions through the cell membrane of nerve. In small concentrations, presents an efficient action in the organism targets. This feature can also cause problems to the environment, often far to the places where it is applied. In moderate temperatures, the fipronil is stable in the environment for about a year. Studies show that this insecticide can be degraded in various metabolites, which are even more toxic than the fipronil. Relative to its persistence in the environment, the fipronil presents variations resulting from its formula, but their metabolites may be more persistent than the insecticide. Residues of fipronil can be bioacumulated in adipose tissue, indicating a potential of transference by the food chain. In the present research, it had been evaluated the toxic, cytotoxic, genotoxic and mutagenic potentials of the fipronil insecticide through bioassays with Allium cepa, whose seeds were exposed to germination in this insecticide. The results indicate that the insecticide presented no toxic and cytotoxic effects for the A. cepa species, when we compared the data resulting from the tests performed with the insecticide and with the negative control. / Mestre

Orientador: Eliana Aparecida Varanda / Banca: Denise Crispim Tavares / Banca: Flávia Aparecida Resende / Resumo: A família Fabaceae tem ocorrência em toda faixa tropical e em regiões temperadas, sendo uma família que apresenta grande potencial econômico. Machaerium, um dos gêneros pertencente a esta família, tem sido utilizado para diversos fins, tais como a recomposição de áreas degradadas ou uso medicinal para o tratamento de diarréia, cólicas menstruais, tosse e aftas bucais. Já o gênero Crotalaria, tem sido empregado na agricultura como adubo verde no combate à erosão e também despertado interesse para a indústria farmacêutica, já que os componentes produzidos por plantas deste gênero podem atuar como antimicrobiano, antimalárico, anti-inflamatório, anti-hepatotóxico e até mesmo no tratamento contra o câncer. As plantas medicinais têm sido cada vez mais empregadas na recuperação da saúde, sendo nas últimas décadas, muitos estudos direcionados na identificação de produtos naturais com propriedades terapêuticas. Apesar da notável utilização das plantas no tratamento das mais diversas patologias, a pesquisa científica tem mostrado que alguns componentes presentes nestas plantas podem apresentar efeitos nocivos, como a mutagenicidade, o que pode restringir seu uso. Assim, é indispensável a realização de ensaios que possam garantir o uso seguro desses compostos. Diante disso, o teste de Ames foi empregado no presente trabalho para análise do potencial mutagênico de Machaerium hirtum e Crotalaria pallida, já que consiste num ensaio de triagem para avaliação da atividade mutagênica, identificando mutágenos entre substâncias puras, em misturas e em amostras ambientais. Tanto o extrato de folhas, quanto o de caule de M. hirtum não se mostraram mutagênicos em nenhuma das concentrações testadas, o que é interessante, visto a grande utilização popular e propriedades farmacológicas já descritas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The Fabaceae family has occurred throughout the tropical and temperate regions, been a family that has great economic potential. Machaerium, one of the genera belonging to this Family, has been used for various purposes since the restoration of degraded areas, to treat diarrhea, menstrual cramps, coughing, and thrush. The genus Crotalaria has been used in agriculture as fertilizer to prevent erosion and also aroused interest in the pharmaceutical industry, since the components produced by these plants can act as antimicrobial, antimalarial, anti-inflammatory, anti-hepatotoxic and even in cancer treatment. Medicinal plants have been increasingly employed in health recovery, and in recent decades, many studies have focused on the identification of natural products with therapeutic properties. Despite the remarkable use of plants in the treatment of several pathologies, scientific research has shown that some components present in these plants may have adverse effects as mutagenicity, which may restrict their use. Thus, assays that ensure the use of these compounds are extremely important. Therefore, Ames test was employed in this study to analyze the mutagenic potential of Crotalaria pallida and Machaerium hirtum because this assay is a screening test for evaluation of mutagenic activity, identifying mutagens between pure substances and mixtures and in environmental samples. Both leave and stem extracts from M. hirtum were not mutagenic in any of the tested concentrations, which is interesting because the wide use and pharmacological properties from this plant. In the extracts of leaves and seeds from C. pallida, positive results were obtained in the Ames test, which make unsafe their use. Knowing that beyond the mutagenic activity, activation of the enzyme cyclooxygenase-2 (COX-2) is also involved... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Resumo: Bacillus thuringiensis é uma bactéria gram-positiva e possui habilidade de produzir proteínas denominadas Cry ou delta-endotoxinas, durante a fase de esporulação. Estas proteínas são utilizadas no controle biológico de várias ordens de insetos. No entanto, pouco se conhece a respeito das vias metabólicas envolvidas na produção dessas proteínas, por exemplo, na natureza, é possível encontrar isolados que produzem grande quantidade de proteínas Cry, como também é possível encontrar outros isolados que produzem poucas quantidades. Considerando que essa diferença é devida a uma regulação gênica diferenciada entre isolados, a identificação dessa regulação pode levar a um incremento na produção de proteínas. Neste trabalho, foram analisados 10 clones mutantes comparados com o isolado selvagem (Bt1) quanto à mortalidade de lagartas neonatas de Spodoptera frugiperda considerando também a quantidade de proteínas Cry produzidas por estes mutantes. Os resultados demonstram que dois clones identificados como B9 e E2, demonstraram um bom controle dessas lagartas, mesmo aquelas que permaneceram vivas, ocorreu um atraso em seu desenvolvimento. Quanto à produção de proteínas, os clones apresentaram perfil protéico entre ~45 kDa e ~120 kDa, perfil característico encontrado entre estirpes ativas contra Lepidópteros. No entanto, os clones que apresentaram bons níveis de mortalidade (B9 e E2) mostraram somente a banda de ~65 kDa similar ao isolado selvagem, que pode ser a responsável pela sua ação inseticida. Os resultados obtidos demonstram a possibilidade de efetuar melhoramento genético em B. thuringiensis por meio de mutagênese mediada por transposon e abre caminho para o estudo das vias metabólicas envolvidas na produção de proteínas Cry. / Abstract: Bacillus is a gram-positive bacterium and produces internal crystal inclusions named crystal (Cry) proteins or d - endotoxins during the sporulation phase. These proteins as used to control several agriculture insect pests. However little is known concerning the metabolic pathways involved in the production of these proteins. For example, in nature, it is possible to find isolates that produce large quantities of the Cry proteins as well as it is possible to find ones that produce limited quantities. Since such difference might be related to gene regulation the identification of regulation factors found in these isolated should lead to an increment on the crystal protein production found in isolated naturally exhibiting lower production. In this work, ten mutant clones were analyzed compared to the wild type (Bt1) with respect to Spodoptera frugiperda neonatal larvae mortality considering also the amount of crystal protein produced by these mutants. The results have demonstrated that two mutant clones named B9 and E2 have produced strong control of these larvae; while at the same time eliciting a delay on the development of the ones that eventually did not dye at first. As for the Cry protein content, the cloned presented a protein profile ranging from ~45 kDa to ~120 kDa which is typical of Cry proteins acting on lepidopterans. The clones that have shown good mortality levels (B9 and E2) have exhibited only a protein band with ~65 kDa, similar to the one produced by the wild type strain, which might be related to its control activity. Finally, the results obtained seem to lead to the possibility of improving genetically B. thuringiensis using mutagenesis induced by transposon and at the same time might pave the way to the shed light on the study of metabolic pathways involved in the Cry proteins production. / Orientador: Manoel Victor Franco Lemos / Coorientador: Marcelo Luiz de Laia / Banca: Janete Apparecida Desidério Sena / Banca: Cristina Lacerda Soares Petrarolha Silva / Mestre

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Os recifes de corais são ecossistemas diversos com alta densidade de biodiversidade, o que leva a intensa competição entre as espécies. Estas espécies podem produzir substâncias desconhecidas, muitas com valor farmacológico. Chromonephthea braziliensis é um coral mole invasor, originário do Oceano Indo-Pacífico, que foi possivelmente transportado por plataformas de petróleo e cuja presença é uma ameaça para a biodiversidade da região de Arraial do Cabo (RJ). Esta espécie produz metabólitos secundários que são responsáveis pela indução de danos para o ecossistema local. A finalidade deste estudo é a busca de novas substâncias para quimioterapia geral com base na estrutura de compostos bioativos. Extratos desse coral foram preparados a partir de colônias liofilizadas (solventes: hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol). Realizaram-se análises químicas para a caracterização dos extratos e avaliaram-se as atividades: mutagênicas e citotóxicas, usando o ensaio de mutação reversa bacteriana (Salmonella/microssoma) com as linhagens TA97, TA98, TA100 e TA102; genotóxicas, utilizando análise da quebra do DNA e formação de micronúcleos na linhagem RAW 264,7 de macrófagos e; tóxicas para náuplios de microcrustáceos Artemia salina. Observou-se citotoxicidade, na presença de S9 mix, dos extratos diclorometano para a linhagem TA102 na concentração de 20 g/100 L/placa e metanol para a TA97 com 5 e 20 g/100 L/placa. Os extratos diclorometano, acetato de etila e metanol apresentaram genotoxicidade no DNA plasmidial em concentrações elevadas (250 g/mL), mas nenhum dano ao DNA foi observado no ensaio de micronúcleo. Todos os extratos foram tóxicos para os náuplios de microcrustáceos em pelo menos uma das concentrações usadas (0,01 1000 g/mL), e a LC50 pode ser determinada apenas para os extratos hexano, diclorometano e acetato de etila. / Coral reefs are diverse ecosystems that have a high density of biodiversity leading to intense competition among species. These species may produce unknown substances, many with pharmacological value. Chromonephthea braziliensis is an invasive soft coral from the Indo-Pacific Ocean that has been possibly transported by oil platforms and whose presence can be a threat to Arraial do Cabo regions biodiversity. This species produces secondary metabolites that are responsible for inducing damage to the local ecosystem. The purpose of this study is the search of new drugs for generally chemotherapy based on the structure of bioactive compounds. Coral extracts were prepared from dried colonies (solvents: hexane, dichloromethane, ethyl acetate, and methanol). Chemical analyses were performed to characterize the extracts and evaluated their cytotoxic and mutagenic activities, using the bacterial reverse mutation assay (Salmonella/microsome) with TA97 strains, TA98, TA100 and TA102; genotoxic activity, using DNA breakage analysis and micronucleus formation and; toxic effects for nauplii microcrustaceans. Cytotoxicity was observed in the presence of S9 mix for dichloromethane extract for strain TA102 at the 20 g/plate concentration and methanol extract for TA97 at 5 and 20 g/plate. The dichloromethane, ethyl acetate and methanol extracts present genotoxicity for plasmidial DNA at high concentrations (250 g/mL), but no DNA damage was observed in micronucleus assay. All extracts were toxic for nauplii microcrustaceans at least one of tested concentrations (0.01 1000 g/mL), but LC50 was calculated only for the hexane, dichloromethane and ethyl acetate extracts.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / As estatinas são fármacos inibidores competitivos da enzima hidroxi-3-metil-glutaril Coenzima A (HMGCoA) redutase, amplamente utilizados para o controle da hipercolesterolemia total e, em especial, para a redução dos níveis séricos de LDLc (Low Density Lipoprotein cholesterol). Além do efeito primário, esses fármacos apresentam vários efeitos secundários, chamados de efeitos pleiotrópicos, envolvendo atividade anti-inflamatória, antitumoral e antiparasitária. Para o desenvolvimento de inovações na área de química medicinal é imprescindível avaliar o risco de efeitos adversos para saúde ou, em outras palavras, a segurança terapêutica do novo produto nas condições propostas de uso. Nesse sentido, o objetivo desse trabalho foi investigar a genotoxicidade de quatro análogos inibidores da biossíntese de lipídios, da classe das estatinas, em modelos experimentais in vitro, testados previamente contra o clone W2 de Plasmodium falciparum a fim de se obter o IC50 dessas moléculas frente ao patógeno. Foram desenvolvidas quatro novas moléculas (PCSR02.001, PCSR09.001, PCSR08.002 e PCSR10.002). Para a avaliação da toxicidade, foram realizados o teste de mutagenicidade bacteriana (teste de Ames), o ensaio de viabilidade celular utilizando o reagente WST-1 e o ensaio de indução de micronúcleos, ambos utilizando uma linhagem ovariana (CHO-K1) e uma linhagem hepática (HepG2). Levando em conta o fato de nenhuma das amostras ter induzido efeitos mutagênicos nas linhagens de S. enterica sorovar Typhimurium, e PCSR10.002 ter apresentado citotoxicidade sugere-se então que este composto seja o mais tóxico. Comparativamente, PCSR10.002 foi mais genotóxico e citotóxico para a linhagem CHO-K1 do que para a linhagem HepG2. PCSR02.001 apresentou elevado potencial genotóxico para células ovarianas, mas não foi capaz de induzir a formação de micronúcleos em células hepáticas, apresentando, portanto um perfil similar ao observado em PCSR10.002. Assim como a atorvastatina, PCSR09.001 apresentou elevado potencial pró-apoptótico para a linhagem de hepatócitos. Já PCSR08.002, apresentou aumento na apoptose de CHO-K1. A indução de apoptose não é necessariamente um evento negativo, já que é pouco lesiva e responsável pela eliminação de células danificadas. Porém, as respostas de apoptose induzidas por esse composto foram muito inferiores àquelas induzidas pela atorvastatina (cerca de 4 vezes menor que a atorvastatina). PCSR08.002 foi aquele se mostrou menos tóxico e essa amostra foi a que teve menor risco relativo, em uma análise global das respostas de citotoxicidade e não demonstrou ter potencial genotóxico para as linhagens utilizadas nesse estudo. Conclui-se, portanto, que a análise da atividade toxicológica utilizando modelos experimentais in vitro dessas estatinas constitui um importante passo para o estabelecimento de novos candidatos à fármacos com maior segurança. / Statin drugs are competitive inhibitors of the enzyme 3-hydroxy-methyl-glutaryl coenzyme A (HMGCoA) reductase, widely used for the control of hypercholesterolemia and overall, in particular for the reduction of serum LDLc (Low Density Lipoprotein cholesterol). In addition to the primary effect, these drugs have many secondary effects, called pleiotropic effects, involving anti-inflammatory, antitumor, and antiparasitic activities. For the development of innovations in the field of medicinal chemistry is essential to evaluate the risk of adverse health effects, or in other words, the therapeutic safety of the new product under the proposed conditions of use. Accordingly, the aim of this study was to investigate the genotoxicity of four analogues of lipid biosynthesis inhibitors, from the class of statins in experimental models in vitro, previously tested against the W2 clone of Plasmodium falciparum to obtain the IC50 of these molecules against the pathogen. Four new molecules (PCSR02.001, PCSR09.001, PCSR08.002 and PCSR10.002) were developed. For the assessment of toxicity, bacterial mutagenicity test (Ames test) were performed, the cell viability assay using WST-1 reagent and micronuclei induction assay, both using an ovarian lineage (CHO-K1) and an hepatic lineage (HepG2). Taking into account the fact that none of the samples have induced mutagenic effects in strains of S. enterica serovar Typhimurium , and PCSR10.002 have shown cytotoxicity then we suggest that this compound is the most toxic. Comparatively, PCSR10.002 was more cytotoxic and genotoxic for the CHO-K1 cell line, than for HepG2 line. PCSR02.001 showed high genotoxic potential for ovarian cells, but was not able to induce the formation of micronuclei in liver cells, thus showing a similar profile to that observed in PCSR10.002. Just like atorvastatin, PCSR09.001 showed high pro-apoptotic potential for hepatocyte lineage. Have PCSR08.002, showed an increase in apoptosis of CHO-K1. The induction of apoptosis is not necessarily an adverse event, since little is harmful and responsible for the elimination of damaged cells. However, the apoptotic responses induced by this compound were much lower than those induced by atorvastatin (about 4 times less than atorvastatin). PCSR08.002 was that was less toxic and this sample had a lower relative risk in a global analysis of the responses and cytotoxicity demonstrated no genotoxic potential for strains used in this study. Therefore it is concluded that the analysis of toxicological activity using in vitro experimental models of these statins is an important step towards the establishment of more safely new candidate-drugs.

A manutenção da estabilidade do material hereditário das células requer fidelidade na replicação do DNA, precisão na segregação dos cromossomos e a capacidade de evitar mutações herdáveis, causadas por injúrias espontâneas e induzidas no genoma. Para enfrentar estes desafios, as células possuem processos evolutivamente conservados, incluindo reparação do DNA e mecanismos de checkpoint. Falhas no cumprimento destes mecanismos podem resultar em morte celular, no acúmulo de mutações herdáveis e na indução de instabilidade genômica, a qual é uma característica predominante de células tumorais. Em Saccharomyces cerevisiae, a visão mais recente dos estágios iniciais da resposta de checkpoint indica que dois complexos de proteínas, Mec1-Ddc2 e Rad17- Mec3-Ddc1, são recrutados à região de lesão no DNA. Rad17p, Mec3p, e Ddc1p (os homólogos humanos são Rad1, Hus1, e Rad9, respectivamente) formam um complexo heterotrimérico estruturalmente relacionado ao antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA), o fator de processividade das DNA polimerases δ e ε. Recentemente, identificamos um alelo mutante de MEC3 – pso9-1 – o qual é fortemente sensível a vários agentes indutores de danos no DNA e apresenta baixa mutabilidade induzida. Para prosseguir nas investigações dos efeitos da proteína mutante Pso9-1, a seqüência completa do alelo mutante foi determinada. A comparação das seqüências obtidas com a seqüência tipo-selvagem depositada nos bancos de dados revelou a deleção de um único nucleotídeo, na posição 802 (802delA), a qual leva a uma forma truncada de Pso9p. O alelo mutante pso9-1[802delA] codifica, um polipeptídeo de 276 aminoácidos, no qual os últimos nove aminoácidos estão fora da fase leitura apropriada e seu domínio carboxi-terminal, drasticamente diminuído. Esta mutação afetou as propriedades de ligação de Pso9-1p, impedindo as interações com seus parceiros de complexo Rad17p e Ddc1p. Ensaios adicionais de interação empregando construções de mec3 que não continham os últimos 25 e 75 aminoácidos do domínio carboxiterminal também não foram capazes de manter interações estáveis. Além disso, a linhagem mutante pso9-1 perdeu a capacidade de detectar danos no DNA, uma vez que dava continuidade no ciclo-celular, após tratamento com 8-metoxipsoraleno fotoativado. Uma vez analisada a reposta a danos no DNA de mutantes deficientes no componente de PCNA-like, Pso9p/Mec3p, em combinação à inativação de subunidades de DNA polimerases replicativas (Pols α, δ and ε), foi encontrada uma interação aditiva entre PSO9/MEC3 e POL32, o qual codifica a terceira subunidade da DNA polimerase δ. A hipersensibilidade de pol32Δ a 8-MOP fotoativado, revelada por estas análises genéticas, sugeriu fortemente a participação ainda não descrita de uma polimerase replicativa na reparação de pontes intercadeias. Esta hipótese foi confirmada, já que o mutante pol32Δ também se mostrou extremamente deficiente em ligar extremidades de DNA não-coesivas, particularmente em casos de extremidades protuberantes 5’, sugerindo um papel para a DNA polimerase δ em recombinação não-homóloga (NHEJ). A coleção de dados apresentada neste trabalho reafirma a importância de proteínas como Pso9p/Mec3p que iniciam a sinalização de anormalidades no DNA. Além disso, amplia a rede de proteínas que responde a danos do tipo pontes intercadeias, mostrando que uma proteína em particular, como visto para Pol32p, pode ter tarefas adicionais como mecanismo de segurança, a fim de garantir a estabilidade genômica. / Maintenance of stability of hereditary material of cells requires fidelity in DNA replication, precision in chromosome segregation, and the ability to avoid heritable mutations caused by spontaneous and induced genomic insults. To cope with these challenges cells have evolved evolutionarily conserved processes, including DNA repair and checkpoint mechanisms. Failure to enforce these mechanisms can result in cell death or in accumulation of heritable mutations and the induction of genome instability, which is a predominant characteristic of cancer cells. In Saccharomyces cerevisiae, it is the current understanding of the initial stages of the checkpoint response that two protein complexes, Mec1-Ddc2 and Rad17-Mec3- Ddc1, are recruited to sites near a DNA lesion. Rad17p, Mec3p, and Ddc1p (the human homologues are Rad1, Hus1, and Rad9, respectively) form a heterotrimeric complex structurally related to the proliferating cell nuclear antigen (PCNA), the processivity factor of DNA polymerases δ and ε. We have recently identified a yeast mutant allele of MEC3 – pso9-1 – which is strongly sensitive to DNA damaging agents and confers low induced mutability. To further investigate the effects of the Pso9-1 mutant protein, the complete sequence of the mutant allele was determined. The comparison of obtained sequences with the databank-deposited wild-type MEC3 sequence revealed a single deletion of nucleotide position 802 (802delA) that leads to a truncated Pso9p. The 802delA frameshift mutant allele thus encodes a 276 amino acid polypeptide in which the last nine amino acids are out of proper reading frame and that has its carboxyl terminus dramatically shortened. This mutation affected the binding properties of Pso9-1p, abolishing its interactions with both Rad17p and Ddc1p. Further interaction assays employing mec3 constructions lacking the last 25 and 75 amino acid carboxyl termini were also not able to maintain stable interactions. Moreover, the pso9-1 mutant strain could no longer sense DNA damage since it continued in the cell cycle after photoactivated 8-methoxypsoralen treatment. When analyzing the response to DNA damage of yeast mutants lacking the yeast PCNA-like component Pso9p/Mec3p in combination with defective subunits of three replicative DNA polymerases (Pols α, δ and ε), we found an additive interaction between PSO9/MEC3 and POL32, which codifies the third subunit of DNA polymerase δ. The hypersensitivity of pol32Δ to photoactivated 8-MOP revealed by these genetic analyses strongly suggested the hitherto unknown participation of a replicative polymerase in the repair of interstrand cross-links. This assumption was confirmed since we also found the pol32Δ mutant extremely deficient in joining non-cohesive DNA ends, particularly in cases of mismatched 5’ overhangs, suggesting a role for DNA polymerase δ in non-homologous end-joining (NHEJ). The collection of data presented in this work reasserts the relevance of sensor proteins as Pso9p/Mec3p in initiating the signaling of structural abnormalities in DNA. Moreover, it amplifies the network of interstrand cross-links responsive proteins, showing that a particular protein, as seen for Pol32p, may have additional tasks as a safety mechanism in ensuring genomic stability.

Orientador: Angelo Berchieri Junior / Resumo: Salmonella Enteritidis e Salmonella Typhimurium causam infecções em seres humanos e animais que são frequentemente associadas à extensa colonização intestinal e excreção fecal. A presença de estrutura flagelar no patógeno está relacionada à indução de inflamação intestinal e atenuação de infecção sistêmica no hospedeiro. Por outro lado, a infecção por estirpes aflageladas resulta em pouca inflamação e consequente infecção sistêmica grave. No presente estudo, foi avaliada a hipótese de que a síntese de maior quantidade de flagelina em estirpes de Salmonella geneticamente modificadas poderia levar a infecção sistêmica menos intensa em aves. Para investigar as conseqüências da superprodução de flagelina, foram construídas estirpes de Salmonella Enteritidis e Typhimurium contendo deleções nos genes clpP e fliD (que levam à superexpressão de flagelina) e patogenicidade e imunogenicidade foram comparadas com as respectivas estirpes selvagens em aves infectadas. Os resultados indicaram que o aumento da síntese de flagelina por SE ΔclpPΔfliD e STM ΔclpPΔfliD culmina em déficit da taxa de multiplicação bacteriana. Porém, tais alterações não interferiram na capacidade de colonização cecal e excreção fecal das estirpes mutantes. O mesmo foi observado em fígado e baço, mas após 14 dpi as estirpes mutantes tendem a serem eliminadas destes órgãos. Mesmo com síntese mais elevada de flagelina, as estirpes mutantes recrutaram quantidades semelhantes de linfócitos e macrófagos em tonsila cecal... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Salmonella Enteritidis and Salmonella Typhimurium cause infections in humans and animals that are often associated with extensive intestinal colonization and faecal shedding. The presence of flagellar structure in the pathogen is related to the induction of intestinal inflammation and attenuation of systemic infection in the host. On the other hand, the absence of flagellin results in severe systemic infection as a result of mild inflammatory intestinal responses provoked by aflagellated strains. The hypothesis that higher flagellin production by Salmonella strains could induce immunogenic response during infection in chickens was evaluated in the present study. To investigate the consequences of flagellin overproduction, strains of Salmonella Enteritidis and Typhimurium containing clpP and fliD deletions (which lead to flagellin overexpression) were constructed, and pathogenicity and immunogenicity were compared with their respective wild-type strains in infected chickens. The results suggested that the increase in flagellin synthesis by SE ΔclpPΔfliD and STM ΔclpPΔfliD culminates in a deficit in the bacterial multiplication rate. However, that changes did not interfere with the capacity for caecal colonization and faecal excretion of mutant strains. The same was observed in the liver and spleen, but after 14 dpi, mutant strains tend to be eliminated from these organs. Even with higher flagellin synthesis, the mutant strains recruited similar amounts of lymphocytes and macro... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Daisy Maria Fávero Salvadori / Resumo: As consequências da poluição ambiental não se limitam a danos ao ambiente, mas também atingem diretamente a saúde humana. Recentemente, a Organização Mundial de Saúde divulgou que um terço da população mundial não tem acesso a água potável e, mesmo quando existe, há o perigo desta conter poluentes nocivos à saúde, e que não foram totalmente eliminados após as etapas de tratamento. Nesse contexto, os possíveis efeitos toxicológicos dos resíduos dos compostos corantes descartados pela indústria têxtil em rios que abastecem cidades vêm sendo investigados, na tentativa de eliminar, ou mesmo reduzir, os riscos para as populações expostas. Assim, este estudo foi delineado com o objetivo de avaliar o potencial carcinogênico de amostras de água sob a influência de atividades têxteis (água do Ribeirão Quilombo - RQ - e do efluente tratado da Estação de Tratamento de Esgoto - ETE - de Americana, SP) em cólon de ratos e o potencial toxicogenômico dos corantes sintéticos Disperse Red 1 (DR1) e Disperse Blue 291 (DB291) em células de medula óssea, sangue periférico, fígado e rins de camundongos. Foi também investigado o potencial tóxico-reprodutivo do DR1 em células germinativas de camundongos. Os resultados mostraram que a exposição crônica às amostras de água do RQ e do efluente tratado da ETE não induziram lesões pré-neoplásicas no cólon de ratos, mas foram detectados sinais de hepatotoxicidade. Em relação aos corantes DR1 e DB291 foi observado aumento na frequência de micronúcleos em ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: / Doutor

Orientador: Ticiana Sidorenko de Oliveira Capote / Resumo: A doença periodontal (DP) é uma desordem imunoinflamatória, disbiótica, multifatorial e com suscetibilidade genética. Estudos demonstraram a associação entre periodontite e diabetes mellitus (DM). Considerando que tanto o DM como a DP estão associadas a um estado de inflamação crônica e a uma produção aumentada de espécies reativas de oxigênio, elas podem estar relacionadas à produção de danos no DNA. Portanto, o objetivo deste projeto foi investigar a relação da periodontite crônica com perfil glicêmico e danos no DNA. Foram realizados exames bioquímicos (Hemoglobina glicada - HbA1c; Glicemia jejum; Insulina; Colesterol total; Triglicérides) e periodontais, avaliação de indicadores antropométricos de obesidade (IMC e relação quadril/cintura), e avaliação do dano ao DNA pelo ensaio de micronúcleo pelo bloqueio da citocinese (CBMN) em linfócitos, observando a frequência de células binucleadas com micronúcleo (FBMN) e a frequência de micronúcleo (FMN). Os pacientes foram divididos conforme seus níveis glicêmicos e seu perfil periodontal em três grupos: grupo A, n=37, sem periodontite e sem DM tipo 2 - DM2; grupo B, n=47, com periodontite, sem DM2; grupo C, n=19, com periodontite e com DM2. Regressão multivariada de Poisson foi realizada utilizando a FBMN ou a FMN como variáveis dependentes. Os valores foram estimados em razão de taxa com seus respectivos intervalos de confiança definidos em 95% (IC 95%). Os parâmetros periodontais dos pacientes diabéticos e com periodontite est... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre