Orientador: Prof. Dr. Carlos Alberto-Silva / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Neurociência e Cognição, Santo André, 2018. / Os Peptídeos Potenciadores de Bradicinina (BPPs) são oligopeptídeos presentes na fração de baixo peso molecular (FBP) do veneno da serpente Bothrops jararaca (Bj). Estes peptídeos são descritos como inibidores naturais da Enzima Conversora de Angiotensina. Porém, eles também alteram a atividade catalítica e a expressão da argininosuccinato sintetase (AsS), favorecendo a síntese de Larginina. Este aminoácido participa de várias vias metabólicas importantes, incluindo a formação de poliaminas e agmatina com atividade neuroprotetora amplamente descrita. Além disso, FBP apresenta atividade neuroprotetora contra o estresse oxidativo induzido em cultura de células do hipocampo de ratos. Com isso, o objetivo do presente estudo foi avaliar a possível atividade neuroprotetora da FBP e BPPs sintéticos contra o estresse oxidativo induzido por H2O2 em cultura de células humanas de linhagem SH-SY5Y. A citotoxicidade do veneno bruto (VB), FBP (0,001 ¿ 10 µg/mL) e BPPs [BPP-5a; BPP-7a; BPP-10c; BPP-11e, BPP-12b e BPP-AP (0,1 ¿ 10 µM)] por 3, 6, 12, 24 e 48 h foi avaliada pelo teste de MTT. Para os ensaios de neuroproteção, a cultura de células foi previamente tratada com BPPs (1 µM) ou FBP (0,1 µg/mL) por 4 horas. Em seguida, foi adicionado H2O2 450 µM para indução do estresse oxidativo. Após 20 horas, foram realizados os ensaios de viabilidade celular. Os resultados indicaram que todos os BPPs, com exceção da FBP, foram neuroprotetores. Em especial, os peptídeos BPP-5a, BPP-7a e BPP-10c foram os mais eficientes. Os mecanismos envolvidos na neuroproteção foram avaliados pela análise das espécies reativas de oxigênio (EROs ¿ DCFH), peroxidação lipídica (TBARS), expressão da AsS e iNOS, níveis de nitrito (Griess) e o potencial de membrana mitocondrial (TMRM). Os três peptídeos reduziram a geração de EROs, síntese de NO, expressão de NF-?B e a peroxidação lipídica. Entretanto, apenas o BPP-10c aumentou os níveis de expressão da AsS. Este resultado sugere que o aumento da disponibilidade de L-arginina pode estar relacionado com o seu efeito neuroprotetor. Ainda, o BPP-10c e BPP-5a reduziram as alterações no potencial de membrana mitocondrial frente ao estresse oxidativo, um importante mecanismo na neuroproteção. Curiosamente, o BPP-7a na presença do H2O2 não reduziu a síntese de NO. Este dado sugere a inibição da oxidação do cofator enzimático BH4, um significativo ativador da NOS. Os resultados obtidos até o momento sugerem que os mecanismos envolvidos na neuroproteção são distintos, apesar destes peptídeos possuírem semelhanças estruturais. Este foi o primeiro estudo a demonstrar que os BPPs apresentam atividade neuroprotetora contra o estresse oxidativo. / The Bradykinin Potentiating Peptides (BPP), present in Low Molecular Weight Fraction (LMWF) of Bothrops jararaca (Bj), are described as natural inhibitors of angiotensin conversing enzyme (ACE) and argininossucinate synthase (AsS) activators, improving L-arginine synthesis, the agmatine and polyamines formation, which have neuroprotective properties. Have been demonstrated that LMWF show neuroprotective action on rat hippocampal cell culture. The aim of this study is to evaluate the possible neuroprotective activity of LMWF and BPPs against oxidative stress induced by H2O2 in SHSY5Y human cell line. Initially, the crude venom (CV), LMWF (0.001 ¿ 10 µg/mL) and [BPP-5a; BPP7a; BPP-10c; BPP-11e, BPP-12b e BPP-AP (0.1 ¿ 10 µM)] cytotoxicity were analyzed after 3, 6, 12, 24 e 28 h using MTT assay. For the neuroprotection assays, the cell culture was treated with BPPs (1 µM) or LMWF (0.1 µg/mL) and, after 4 h, H2O2 450 µM was added to induce oxidative stress. The cell viability assay was performed 20 h later. Our results suggest that all BPPs tested (excepting LMWF) were neuroprotective and the peptides BPP-5a, BPP-7a and BPP-10c were the most efficient. The neuroprotection mechanisms were assessed by the reactive oxygen species (ROS ¿ DCFH), lipid peroxidation (TBARS), AsS and iNOS expression, levels of nitrite (Griess) and mitochondrial membrane potential (TMRM) analyses. BPP-5a, BPP-7a and BPP-10c reduced the ROS, NO, NF-?B expression, and the lipid peroxidation. However, only BPP-10c enhanced the AsS expression, suggesting that the increase of L-arginine availability might be related to neuroprotection. In addition, BPP-10c and BPP-5a avoided the mitochondrial membrane potential promoted by H2O2. Interestingly, there is the hypothesis that only BPP-7a inhibited the co-factor BH4 oxidation because did not decrease NO synthesis. Overall, we demonstrated for the first time that the neuroprotective mechanisms of BPPs against oxidative stress could be distinct.

O L-glutamato (L-Glu) é o principal neurotransmissor excitatório em vertebrados e é fundamental para funções primordiais do sistema nervoso central (SNC), tais como aprendizagem e memória. Entretanto, quando este neurotransmissor está em excesso na fenda sináptica, pode provocar uma série de eventos excitotóxicos, que por sua vez, estão associados a muitas neuropatologias. A terapia da maioria dessas doenças é ineficiente e provoca sérios efeitos colaterais. Portanto, é necessário desenvolver fármacos mais efetivos e com menos efeitos colaterais. Assim, peçonhas de artrópodes como a da aranha P. bistriata, se apresentam como fontes alternativas de compostos neuroativos, pois já demonstraram efeitos neuroprotetores in vitro e in vivo, bem como anticonvulsivos. Destarte, o objetivo deste estudo foi investigar um possível efeito neuroprotetor da fração RT10, isolada da peçonha de P.bistriata, em cultura primária de neurônios e glia (CPNGs), do tecido nervoso de ratos recém-nascidos, expostos a concentrações tóxicas de L-Glu (5 mM). As CPNGs foram tratadas durante 3 horas, previamente à lesão, que foi feita por um período de 12h. Ambas as exposições (tratamento e lesão) foram conduzidas no 7.º dia in vitro (DIV). Para analisar quantitativamente e qualitativamente os efeitos dos tratamentos, bem como demonstrar a composição das CPNGs foram realizados ensaios de viabilidade celular, com o sal sódico de resazurina (SSR) e, imunomarcações com anticorpos primários para MAP2, NeuN e GFAP. A fração RT10 foi neuroprotetora, pois diminuiu a perda celular nos testes com o SSR em 10%, nas CPNGs, expostas ao L-Glu, além de apresentarem efeito maior (5%), que o do fármaco Riluzol (RIL). A neuroproteção da RT10 também foi observada nos ensaios de imunocitoquimica. Os neurônios tratados com RT10 e RIL, que foram marcados com anti-MAP2 tiveram maior prolongamentos dos dendritos em relação aos neurônios não tratados. Portanto, a intensidade da fluorescência de anti-MAP2 para os neurônios tratados com esta fração foi 38% maior em relação aos não tratados; e 21% maior quando comparados ao grupo RIL. Deste modo, podemos considerar a RT10, como uma ferramenta para a prospecção de novos fármacos contra neurodegenerações, in vitro e principalmente estudos de mecanismo de ação, cujas variáveis podem ser mais bem controladas. / L-Glutamate (L-Glu), the major excitatory neurotransmitter in the central nervous system of vertebrates, is essential to the occurrence of cognitive functions. However, when L-Glu is over-accumulated in a synaptic cleft it can provoke excitotoxicity (EXT), which has been implicated in many neurological disorders (NDs). The current therapies against NDs are undereffective and can provoke side effects, so it is necessary to develop new treatments. In this regard, neuroactive compounds obtained from Parawixia bistriata spider venom are an alternative source of neuroactive compounds, because they showed neuroprotective effects in vitro and in vivo. Thus, the main aim of this work was to evaluate a possible neuroprotective effect of RT10 fraction obtained from P. bistriata venom in primary culture of neuron and glial cells (PCNGCs) from cerebral tissue of newborn Wistar rats, after the exposition to L-glu toxic concentration (5mM). The PCNGCs were submitted to the neuroprotection treatments for 3 hours and previously to the neurotoxic treatment, which the L-glu stayed for 12h in the PNGCs. The both expositions were conducted on the 7th day in vitro (DIV). The Resazurin sodium salt (RSS) and immunocytochemistry (MAP2, NeuN e GFAP primary antibodies) trials were utilized to measure quantitatively and qualitatively the treatments, as well as to prove the culture composition. In the RSS trial, the RT10 was neuroprotector, since avoided the cell death in 10%, under the PCNGCs which were exposed to L-Glu. in addition, RT10 demonstrated higher effect than rilozole (5%). RT10 attenuated the toxic effects of L-Glu under the neuromorphology, consequently the fluorescence intensity of MAP2 at PCNGC treated with RT10 was 38% higher than untreated group and it was 21% higher than riluzole group. Thus, we can consider that RT10 compounds are valuable tools to the prospection of new drugs against NDs.

A utilização experimental de CS é apontada como uma perspectiva benéfica no tratamento da lesão medular devido estas células produzirem fatores neurotróficos e citocinas inflamatórias que influenciam o ambiente do sistema nervoso. Ratos machos foram submetidos à lesão medular contusa de intensidade moderada (25mm) ao nível do 11o segmento torácico. As CS cultivadas a partir do nervo ciático foram pré-tratadas ou não com as citocinas inflamatórias TGF-1 (5ng/ml) ou TNF- (30ng/ml) e inoculadas no local da lesão imediatamente após o trauma. O grupo controle e o grupo lesão receberam inoculação do meio de cultura. Após a cirurgia os ratos foram submetidos à análise do comportamento motor durante 8 semanas. O BBB mostrou melhora do comportamento motor ao longo do período analisado para o grupo tratado com as CS. Este efeito não foi potenciado pelo pré-tratamento das CS com as citocinas inflamatórias. As medulas espinais foram processadas e receberam coloração pelo Violeta de Cresilo ou imunomarcação com a GAP-43, o glutamato, o NPY, a substância P, a GFAP, o FGF-2 e do NG2. Os tratamentos realizados neste desenho experimental não alteraram as respostas neuroprotetivas. Segundo análise estereológica não foram encontradas diferenças no número estimado de neurônios remanescentes e no volume de tecido preservado entre os grupos que receberam lesão medular. A lesão promoveu uma diminuição da imunorreatividade da GAP-43 no corno anterior, que foi revertida quando a lesão recebeu tratamento com as CS prétratadas ou não com a citocina TGF-1. O resultado do tratamento com as CS foi o de aumento na imunorreatividade do glutamato nas células no corno anterior e no funículo lateral quando comparado com o grupo lesão. Para o NPY no corno anterior houve aumento da imunorreatividade do grupo tratado com as CS apenas em comparação ao grupo controle. Já no funículo lateral a lesão aumentou a imunorreatividade NPY em comparação ao grupo controle, inclusive quando houve tratamento com as CS, mas este deixou de existir quando houve prétratamento das CS com as citocinas. Referente ao FGF-2, no funículo lateral e no fascículo grácil houve aumento da imunorreatividade no grupo tratado com as CS, acrescidas ou não de TGF-1, apenas em comparação ao grupo controle. Porém, o tratamento com as CS aumentou a imunorreatividade do FGF-2 na região do fascículo grácil. A imunorreatividade do FGF-2 aumentou na região de epicentro da lesão, e este efeito foi mantido nos grupos tratados com as CS, acrescidas ou não de TGF-1. Houve significante aumento da imunorreatividade da GFAP no corno anterior e no funículo lateral quando os grupos lesados foram tratados com as CS e/ou citocinas comparado ao grupo controle. Na região do epicentro, a lesão promoveu aumento da imunorreatividade da GFAP, que foi potencializado quando houve tratamento com as CS. A lesão promoveu aumento da imunorreatividade do NG2 no epicentro, inclusive quando houve tratamento com as CS. O melhor desempenho motor observado no grupo que recebeu inoculação de CS provavelmente está relacionado a fatores como respostas plásticas e neuroquímicas no tecido preservado da medula espinal. / The experimental use of Schwann cells is indicated on spinal cord treatment due to the ability of these cells to produce neurotrophic factors and inflammatory cytokines, influencing nervous system environment. Male rats were submitted to a moderate spinal cord contusion (25mm) at 11th thoracic level. Culture Schwann cells were obtained from sciatic nerves and pre-treated or not with inflammatory cytokines TGF-1 (5ng/ml) or TNF- (30ng/ml) and then were inoculated in lesion site just after trauma. Sham and lesion groups received culture medium inoculation. After surgery, rats were submitted to behavior analyses during 8 weeks. BBB showed motor recovery in the Schwann cell group. This effect was not potentiated by pretreated of Schwann cells with inflammatory cytokines. The spinal cords were processed for Cresil Violet or immunolabeling to GAP-43, glutamate, NPY, substance P, GFAP, FGF-2 and NG2. Stereological analyses showed no differences in the estimated number of remaining neurons and in the volume of the preserved tissue among the lesioned groups. The injury reduced GAP-43 immunoreactivity in ventral horn, which was reverted when injury was treated with Schwann cells pre-treated or not with TGF-1. Schwann cell treatment enhanced glutamate immunoreactivity in the ventral horn and lateral funiculus compared with lesioned group. In ventral horn, NPY immunoreactivity was enhanced in Schwann cells group compared with sham group. In lateral funiculus, the injury or the treatment with Schwann cells increased NPY immunoreactivity, comparing with sham group. FGF-2 of lateral funiculus and gracile fasciculus enhanced in Schwann cells group. Treatment with Schwann cells enhanced FGF-2 immunoreactivity in gracile fasciculus. Injury enhanced FGF-2 immunoreactivity in epicenter region, also observed in the groups treated by Schwann cells. In ventral horn and lateral funiculus when the lesioned groups were treated by Schwann cells and/or cytokines there was significant increase in GFAP immunoreactivity compared with sham group. In epicenter, the injury promoted GFAP immunoreactivity increase that was potentiated by Schwann cells treatment. The injury produced NG2 increase in epicenter, included by Schwann cells treatment. The motor recovery showed in Schwann cell group is probably related to neurochemical plasticity in spinal cord preserved tissue.

A lesão medular (LM) promove uma condição devastadora que resulta em comprometimentos sensorial e motor, impedindo o desempenho funcional do indivíduo. O entendimento sobre os mecanismos envolvidos na reorganização cortical após uma eficiente estratégia terapêutica pode fornecer informações relevantes para o aprimoramento de tecnologias assistivas, como neuropróteses. Este trabalho teve como objetivos investigar as alterações funcionais e estruturais no córtex sensório-motor de ratos Wistar submetidos à atividade física na esteira após a lesão medular contusa. O objetivo secundário foi investigar a reorganização de outras áreas relacionadas ao comportamento motor, como o estriado, a substância negra e a medula espinhal. 17 ratos foram divididos aleatoriamente em três grupos: treinado (TR, n = 6), controle (CTL, n = 7) e sham (n = 4). Todos os animais receberam um implante de matriz de micro-eletrodos no córtex sensório-motor. Os animais dos grupos TR e CTL foram submetidos à LM contusa e os do grupo sham somente ao procedimento cirúrgico sem a LM. Foi realizada a avaliação eletrofisiológica antes da LM e nos 1º, 3º, 5º, 7º, 14º, 21º, 28º, 35º, 42º, 49º e 56º dias pós-operatórios (dPO) da lesão. O grupo TR realizou treinamento motor em uma esteira com velocidade controlada, tendo início no 5º dPO e foi realizado por 15 minutos, cinco vezes na semana. Os outros dois grupos ficaram sem treinamento. No 57º dPO, os animais foram sacrificados, e as medulas espinhais e os encéfalos foram coletados para análise imunohistoquímica. Os resultados eletrofisiológicos mostraram que houve uma diminuição significativa do número de neurônios corticais registrados ao longo do tempo para os animais com LM; existem neurônios que disparam em função do movimento mesmo após a LM, sendo o número desses neurônios significativamente menor nos animais controles; observou-se um padrão de atividade de potencial de campo local do córtex sensório-motor que antecede a ativação muscular. A análise imunohistoquímica do encéfalo mostrou diminuição significativa da imunoreatividade para o marcador de neurofilamentos no córtex motor do grupo CTL e no estriado para os grupos CTL e TR; no córtex somatossensorial houve aumento significativo desta marcação para o grupo TR; não houve diferença da imunoreatividade entre os grupos para o marcador de neurofilamentos na substância negra e nem para a proteína de vesícula, sinaptofisina, nas diferentes áreas encefálicas. Na medula espinhal verificou-se, na região rostral à lesão, aumento significativo da imunoreatividade para os marcadores de proteína associada ao microtúbulo 2 (MAP2), da sinapsina (SYS) e da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) para o grupo TR e diminuição significativa da SYS para o grupo CTL; no segmento central à lesão, houve diminuição significativa da imunoreatividade para os marcadores MAP2 e SYS e aumento significativo para GFAP e OX-42 para os grupos CTL e TR; no segmento caudal à lesão houve diminuição significativa da imunoreatividade para os marcadores GFAP, SYS, MAP2 e OX-42 para o grupo CTL e aumento significativo do marcador MAP2 para o grupo TR. Os resultados obtidos neste trabalho mostram que a atividade física realizada na esteira após a LM é capaz de promover reorganização cortical sensório-motora e medular por meio da neuroproteção e neuroregeneração / Spinal cord injury (SCI) results in a devastating condition, which leads to motor and sensory deficits that impair the injured person functional performance. The understanding about the mechanisms involved in cortical reorganization after an efficient therapeutic strategy can provide relevant information for the improvement of assistive technology, such as neuroprosthesis. This work aimed to investigate the functional and structural changes in the sensorimotor cortex of spinal cord injured Wistar rats, which were submitted to treadmill training. A secondary objective was to investigate the reorganization of other areas related to the movement, such as striatum, substantia nigra and spinal cord. 17 rats were randomly divided into three groups: trained (TR, n = 6), control (CTL, n = 7) and sham (n = 4). All animals received a microelectrodes array in the sensorimotor cortex. Control and trained animals were submitted to contusive SCI and the sham group only to the surgical procedure without the contusion. Electrophysiological assessments were accomplished before SCI and on the 1st, 3rd, 5th, 7th, 14th, 21st, 28th, 35th, 42nd, 49th and 56th post-operative days (POd). The TR group performed the motor training on a treadmill with controlled speed, starting on the 5th POd and it was done for 15 minutes, five times per week. The other two groups did not receive any training. On the 57th POd, the animals were sacrificed and the spinal cords and brains were collected for immunohistochemistry analysis. Electrophysiological data revealed that there was a significant decrease of the cortical neurons number with time for the injured animals; there was neurons that fire in function of the movement even after the SCI, but the number of these neurons was significant smaller in CTL group; it was observed a pattern of sensorimotor local field potential activation before the muscular activation. Brain immunohistochemistry data showed immunoreactivity significant decrease for neurofilament staining of the CTL motor cortex and CTL and TR striatum; the somatosensory cortex had a significant increase of this maker for TR group; there was no difference between groups for the neurofilament maker in the substantia nigra and neither to the vesicle protein maker, synaptophysin, in the different brain areas. In the spinal cord rostral to the lesion there were significant increase of the immunoreactivity for the microtubule associated protein 2 (MAP2), synapsin (SYS) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) for the TR group and significant decrease of SYS for the CTL group; central to the lesion, there were immunoreactivity significant decrease for the MAP2 and SYS makers and a significant increase for the GFAP and OX-42 makers in CTL and TR groups; and caudal to the lesion, there were immunoreactivity significant decrease for the GFAP, SYS, MAP2 and OX-42 for the CTL group and significant increase of MAP2 maker for the TR group. Together these findings show that the physical activity on a treadmill after spinal cord injury is capable of producing sensorimotor cortex and spinal cord reorganization throughout the neuroprotection and neuroregeneration

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T12:08:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Spejo_AlineBarroso_M.pdf: 5889410 bytes, checksum: 655242e3ec4018faf3f968013fd8d36d (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Estudos recentes mostram resultados promissores no tratamento de lesões ao sistema nervoso (SN) através do implante de células-tronco, atribuindo essa melhora funcional à produção de fatores tróficos pelas células. Neste trabalho, o efeito neuroprotetor e neurorregenerativo de células-tronco mesenquimais (CTM) de ratos Lewis-EGFP foi investigado após o esmagamento das raízes motoras L4, L5 e L6. Cinco ratas fêmeas Lewis foram utilizadas em cada um dos seguintes grupos: G1 - esmagamento de raízes motoras; G2 - esmagamento de raízes motoras e injeção de DMEM (Meio de Eagle modificado pela Dubelco) na interface da substância branca e cinzenta (funículo lateral); G3 - esmagamento de raízes motoras e injeção de CTM (funículo lateral). Após 4 semanas, a sobrevivência neuronal foi estudada por coloração de Nissl, onde se observou, a partir da contagem neuronal, aumento da sobrevivência no grupo tratado com CTM. A técnica de imunoistoquímica foi utilizada para avaliar a expressão de sinaptofisina, sinapsina, VGLUT1 (Transportador vesicular de glutamato-1) e GAD65 (Glutamato descarboxilase 65KDa). A expressão de sinaptofisina e sinapsina na superfície dos motoneurônios lesionados mostrou uma menor redução de inputs em animais tratados com CTM, sugerindo uma possível redução no processo de eliminação sináptica. Para detectar possíveis mudanças no equilíbrio de inputs excitatórios / inibitórios em aposição ao corpo dos neurônios motores, os anticorpos VGLUT1 (marcador de terminais glutamatérgicos) e GAD 65 (marcador de terminais GABAérgicos) foram utilizados. A redução dos terminais glutamatérgicos foi semelhante em todos os grupos. Enquanto a redução de terminais GABAérgicos ocorreu em maior proporção em G1 e G2, em relação ao grupo tratado com CTM. Os dados indicam que CTM podem proteger os neurônios contra a excitotoxicidade, resultando em menor perda de células. Com sobrevida de 12 semanas após a lesão, a regeneração nervosa foi avaliada através da análise morfológica do nervo isquiático (área do nervo, número e morfometria de fibras mielínicas) e da recuperação da função motora (walking track test). O grupo tratado com DMEM apresentou nervo com menor área e menor número de fibras mielínicas do que o tratado com CTM, porém, o grupo tratado com células obteve resultados semelhantes ao grupo que sofreu apenas esmagamento. A morfometria revelou fibras com menor mielinização nos três grupos lesionados, em comparação ao nervo contralateral à lesão, porém, para os lados ipsilaterais não houve diferença entre os tratamentos. A função motora apresentou-se melhor no grupo tratado com CTM, quando comparada com o tratado com DMEM, mas não em relação ao grupo que sofreu apenas esmagamento. O efeito das CTM na função motora foi agudo, mostrando eficiência de 4 a 6 semanas após a lesão. Assim, as CTM mostraram efeito neuroprotetor e contribuíram para a regeneração, porém a forma de administração dessas células, através de injeção diretamente na medula, apesar de resultar num maior número de células enxertadas, contribuindo com a sobrevivência dos neurônios, mostrou-se um problema quando avaliada a regeneração e função motora dos animais, indicando a necessidade de desenvolvimento de outras formas de administração / Abstract: Recent studies have shown promising results in the treatment of nervous system injuries through stem cells implantation, attributing this functional improvement to the production of trophic factors by these cells. In this study, the neuroprotective and neurorregenerative effects of mesenchymal stem cells (MSC) from Lewis-EGFP mice was investigated after crushing the motor roots L4, L5 and L6. Five female rats Lewis were used in each of the following groups: G1 - motor roots crushing; G2 - motor roots crushing and DMEM (Dulbeco's Modified Eagle Medium) injection in the white/gray matter interface; G3 - motor roots crushing and MSC injection in the white/gray matter interface. At 4 weeks after injury, neuronal survival was evaluated by Nissl staining, and revealed, by the neuronal count, increased survival in the group treated with MSC. The technique of immunohistochemistry was used to evaluate the expression of synaptophysin, synapsin, VGLUT1 (Vesicular Glutamate Transporter-1) and GAD65 (Glutamate decarboxylase 65). The expression of synaptophysin and synapsin on the surface of lesioned motoneurons, showed a smaller decrease of inputs in animals treated with MSC, suggesting a possible reduction in synaptic elimination process. To detect possible changes in the balance of excitatory / inhibitory inputs reaching the cell body of the motoneurons, antibodies for VGLUT1 (marker of glutamatergic terminals) and GAD 65 (marker of GABAergic terminals) were used. The reduction of glutamatergic terminals was similar in all groups. While the reduction of GABAergic terminals was in greater extent in G1 and G2 with respect to the group treated with MSC. The data indicate that MSC can protect neurons against excitotoxicity, resulting in decreased cell loss. With survival of 12 weeks after the injury, nerve regeneration was assessed by morphological analysis of the sciatic nerve (nerve size, number and morphology of myelinated fibers) and motor function recovery (walking track test). The group treated with DMEM showed nerve with smaller area and fewer myelinated fibers than treated with MSC, however, the group treated with cells was not better than the group that only suffered crushing. Morphometry revealed fibers with less myelination in the three injured groups, compared to the contralateral side, but there was no difference between treatments. Motor function appeared better in MSC-treated group in comparison to the DMEM-treated, but not in relation to the group which only suffered crushing. The effect of MSC in motor function was acute, demonstrating efficiency between 4 to 6 weeks after injury. Thus, the MSC shown to be neuroprotective and contributed to regeneration, but the form of administration of such cells, by direct injection into spinal cord, has to be improved or substituted by another method / Mestrado / Biologia Celular / Mestra em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T12:05:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Benitez_SuzanaUlian_M.pdf: 7544701 bytes, checksum: 2e552c7219f0c635a4b0afecffd3204d (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Lesões nas raízes dorsais da medula espinal são frequentes e muitas vezes decorrentes de acidentes automobilísticos. Devido à possibilidade de geração de dor neuropática, os procedimentos cirúrgicos não priorizam o reparo do componente aferente, sendo reparado apenas o componente motor. Adicionalmente, a perda das informações sensoriais gera parestesia ou anestesia do membro lesado, bem como descoordenação motora. Nesse contexto, novas terapias precisam ser desenvolvidas para o reparo das raízes dorsais. Uma substância capaz de conectar tecidos por adesão e que promova a hemostase e estabilidade do tecido, como o selante de fibrina (SF), pode ser uma alternativa a ser empregada no reparo de raízes lesadas. Além disso, o emprego conjunto do SF com células-tronco mononuclares de medula óssea (CTMMO) pode potencializar uma eventual regeneração tecidual. Assim, o presente estudo avaliou a resposta glial, a reorganização sináptica, a morfologia das fibras sensoriais e a coordenação motora após reparo com SF e terapia celular. Para isso, foram empregados ratos Lewis fêmeas (6-8 semanas), sendo divididos em três grupos: rizotomia (RZ, n=20), rizotomia reparada com SF (RZ+SF; n=22) e rizotomia reparada com SF e CTMMO (RZ+SF+CT; n=20). O tempo de sobrevida pós-cirúrgico foi de até 8 semanas. Para imunoistoquímica, foram utilizados anticorpos anti-VGLUT1 (terminais pré-sinápticos glutamatérgicos), GAD65 (terminais pré-sinápticos gabaérgicos), sinaptofisina (terminais sinápticos), GFAP (astrócitos), Iba1 (microglia) e BDNF (fator neurotrófico). Além disso, foram realizados citoquímica com Sudan black (coloração para lipídeos) e os testes comportamentais von-Frey eletrônico e walking track test (sistema CatWalk). Os resultados demonstraram regeneração das aferências nos grupos RZ+SF e RZ+SF+CT. Porém, apenas no segundo grupo, houve crescimento axonal até lâminas mais profundas da medula espinal, o que resultou em melhor desempenho nos testes comportamentais. Concluímos que o reimplante de raízes sensitivas com SF e CTMMO pode ser uma alternativa terapêutica para o reparo de lesões dorsais na interface do SNC e SNP / Abstract: Dorsal root lesions are common and often occur in automobile accidents. Due to the possibility of generating neuropathic pain, surgical procedures do not prioritize the repair of the afferent component, focusing on the motor output instead. Moreover, the loss of sensory inputs triggers paresthesis or anesthesia of the injured limb, and motor impairments. In this context, new therapies have to be developed for dorsal root repair. A substance that can promote tissue adhesion and stability and tissue haemostasis, such as fibrin sealant (FS), could be an alternative for the repair of damaged roots. Furthermore, the combined use of FS plus bone marrow mononuclear stem cells (BMSC) may enhance tissue regeneration. Thus, the present study evaluated the glial response, synaptic changes, the cytoarchitecture of the sensory fibers and motor coordination with FS with or without cell therapy for root replantation. Female Lewis rats (6-8 weeks old) were divided into three groups: rhizotomy (RZ, n = 20), rhizotomy repaired with FS (RZ+FS, n = 22) and rhizotomy repaired with SF and BMSC (RZ+FS+SC, n = 20). The survival time after surgery was up to 8 weeks. For immunohistochemistry VGLUT 1 (presynaptic glutamatergic terminals), GAD65 (GABAergic presynaptic terminals), synaptophysin (synaptic terminals), GFAP (astrocytes), Iba1 (microglia) and BDNF (neurotrophic factor) antibodies were used. Also, cytochemistry with Sudan black (lipid staining) and the behavioral tests electronic von-Frey and Walking track test (CatWalk system) were carried out. The results showed regeneration of afferent inputs in groups RZ+FS and RZ+FS+SC. However, only in the group with BMSC, the axonal growth was able to reach deeper laminae of the spinal cord, resulting in a better performance in behavioral tests. We conclude that the sensory root replantation with FS and BMSC may be an alternative therapy for the repair of dorsal root injuries in the CNS and PNS interface / Mestrado / Biologia Celular / Mestra em Biologia Celular e Estrutural

A hipóxia-isquemia (HI) é a principal causa de mortalidade no período perinatal e, nos sobreviventes, a incidência de comorbidades neurológicas é elevada. O encéfalo imaturo, altamente susceptível ao insulto hipóxico-isquêmico, é bastante sensível a estímulos ambientais tais como o enriquecimento ambiental (EA). Os objetivos deste estudo foram: 1) investigar o desempenho comportamental em um novo teste de memória e aprendizagem, o Ox-maze; 2) analisar a atividade das enzimas Na+,K+-ATPase, catalase (CAT) e glutationaperoxidase (GPx) no hipocampo; 3) caracterizar os neurônios piramidais da região CA1 hipocampal quanto à arborização dendrítica; 4) analisar alterações astrocíticas e sinápticas pela avaliação da imunoreatividade das proteínas GFAP e sinaptofisina usando a técnica de imunofluorescência e, 5) quantificar a densidade celular por meio de cortes semifinos da região CA1 do hipocampo de animais hipóxico-isquêmicos expostos a um ambiente enriquecido. Ratos com sete dias de idade foram divididos em quatro grupos e submetidos ou não ao procedimento cirúrgico de acordo com o grupo experimental ao qual pertenciam: controle mantido em ambiente padrão (CTAP), controle em ambiente enriquecido (CTAE), HI em ambiente padrão (HIAP) e HI em ambiente enriquecido (HIAE). Passado o período de EA (1h/dia, 6 dias/semana, 9 semanas iniciando após o desmame), os parâmetros mencionados foram avaliados nos animais. Os dados indicaram que a HI causou um prejuízo na memória e no aprendizado no teste do “OX-maze”, o qual foi revertido pelo efeito do ambiente enriquecido. A HI causou diminuição da atividade enzimática da Na+,K+-ATPase no hipocampo contralateral, assim como uma redução na imunorreatividade à sinaptofisina e nadensidade neuronal, sendo que o EA foi efetivo na recuperação da atividade da enzima Na+,K+-ATPase e dos níveis de sinaptofisina no hipocampo contralateral à lesão. As atividades de CAT e GPX não foram alteradas pela HI em nenhum dos grupos avaliados, mesmo resultado encontrado nas análises de GFAP e de padrão de arborização dendrítica. Por fim, neste estudo foi observado o importante efeito lesivo causado pela HI neonatal e o papel do EA como estratégia neuroprotetora na recuperação funcional, na atividade da Na+,K+-ATPase e na expressão de sinaptofisina. Este estudo traz avanços em busca dos mecanismos pelos quais a melhora funcional ocorre em animais HI expostos ao EA, mas pode-se verificar que não fica totalmente esclarecido como esta estratégia atua. Outros estudos são necessários para a identificação de possíveis mecanismos que atuem como mediadores da resposta funcional do EA após um evento isquêmico. / Hypoxia-ischemia (HI) is the main mortality cause in perinatal period and, in survivors, the incidence of neurological disabilities is elevated. The immature brain, highly susceptible to hypoxic-ischemic insult, is sensible to environmental stimuli, as environmental enrichment (EE). The aims of this study were to investigate: 1) behavioral performance in a new memory and learning task, the oxmaze task; 2) evaluate Na+,K+-ATPase, catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx) activities in the hippocampus; 3) characterizes dendritic arbor in pyramidal neurons from CA1 region from hippocampus; 4) analyze alterations in hippocampal synaptophysin and GFAP immmunoreactivity and, 5) analyze neuronal density alterations in hippocampus of hypoxic-ischemic rats exposed to enriched environment. Seven-day-old rats were divided into four groups: controlmaintained in standard environment (CTSE), control submitted to EE (CTEE), HI in standard environment (HISE) and HI in EE (HIEE). Past the end of EE period (1 hour/day, 6 days/week, 9 weeks), mentioned parameters were evaluated in animals. Present results indicate learning and memory in the “OXmaze” task were impaired in HI rats and this effect was recovered after EE. On the contralateral hemisphere, HI caused a decrease in Na+,K+-ATPase activity that was recovered by EE. Results also indicate that HI damage decreases hippocampal synaptophysin immunoreactivity and neuronal density, moreover EE was effective in recovering synaptophysin levels on contralateral to the lesion hippocampus. The activities of GPx and CAT were not changed by HI in any group evaluated, some result founded on GFAP immunoreactivity and dendritic arborization characterization analysis. In conclusion, the important effect of HI lesion and the role of EE like neuroprotective strategy on functional impairment and on Na+,K+-ATPase activity and synaptophysin immunoreactivity was proven. Although this study have important advances in search of mechanisms by which the functional enhancement occurs in the animals submitted to HI and exposed to EE, it can be seen that it is not completely clear how this approach works. Further studies are needed to identify possible mechanisms that act as mediators of EE functional response after an ischemic event.

A hipóxia-isquemia (HI) é a principal causa de mortalidade no período perinatal e, nos sobreviventes, a incidência de comorbidades neurológicas é elevada. O encéfalo imaturo, altamente susceptível ao insulto hipóxico-isquêmico, é bastante sensível a estímulos ambientais tais como o enriquecimento ambiental (EA). Os objetivos deste estudo foram: 1) investigar o desempenho comportamental em um novo teste de memória e aprendizagem, o Ox-maze; 2) analisar a atividade das enzimas Na+,K+-ATPase, catalase (CAT) e glutationaperoxidase (GPx) no hipocampo; 3) caracterizar os neurônios piramidais da região CA1 hipocampal quanto à arborização dendrítica; 4) analisar alterações astrocíticas e sinápticas pela avaliação da imunoreatividade das proteínas GFAP e sinaptofisina usando a técnica de imunofluorescência e, 5) quantificar a densidade celular por meio de cortes semifinos da região CA1 do hipocampo de animais hipóxico-isquêmicos expostos a um ambiente enriquecido. Ratos com sete dias de idade foram divididos em quatro grupos e submetidos ou não ao procedimento cirúrgico de acordo com o grupo experimental ao qual pertenciam: controle mantido em ambiente padrão (CTAP), controle em ambiente enriquecido (CTAE), HI em ambiente padrão (HIAP) e HI em ambiente enriquecido (HIAE). Passado o período de EA (1h/dia, 6 dias/semana, 9 semanas iniciando após o desmame), os parâmetros mencionados foram avaliados nos animais. Os dados indicaram que a HI causou um prejuízo na memória e no aprendizado no teste do “OX-maze”, o qual foi revertido pelo efeito do ambiente enriquecido. A HI causou diminuição da atividade enzimática da Na+,K+-ATPase no hipocampo contralateral, assim como uma redução na imunorreatividade à sinaptofisina e nadensidade neuronal, sendo que o EA foi efetivo na recuperação da atividade da enzima Na+,K+-ATPase e dos níveis de sinaptofisina no hipocampo contralateral à lesão. As atividades de CAT e GPX não foram alteradas pela HI em nenhum dos grupos avaliados, mesmo resultado encontrado nas análises de GFAP e de padrão de arborização dendrítica. Por fim, neste estudo foi observado o importante efeito lesivo causado pela HI neonatal e o papel do EA como estratégia neuroprotetora na recuperação funcional, na atividade da Na+,K+-ATPase e na expressão de sinaptofisina. Este estudo traz avanços em busca dos mecanismos pelos quais a melhora funcional ocorre em animais HI expostos ao EA, mas pode-se verificar que não fica totalmente esclarecido como esta estratégia atua. Outros estudos são necessários para a identificação de possíveis mecanismos que atuem como mediadores da resposta funcional do EA após um evento isquêmico. / Hypoxia-ischemia (HI) is the main mortality cause in perinatal period and, in survivors, the incidence of neurological disabilities is elevated. The immature brain, highly susceptible to hypoxic-ischemic insult, is sensible to environmental stimuli, as environmental enrichment (EE). The aims of this study were to investigate: 1) behavioral performance in a new memory and learning task, the oxmaze task; 2) evaluate Na+,K+-ATPase, catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx) activities in the hippocampus; 3) characterizes dendritic arbor in pyramidal neurons from CA1 region from hippocampus; 4) analyze alterations in hippocampal synaptophysin and GFAP immmunoreactivity and, 5) analyze neuronal density alterations in hippocampus of hypoxic-ischemic rats exposed to enriched environment. Seven-day-old rats were divided into four groups: controlmaintained in standard environment (CTSE), control submitted to EE (CTEE), HI in standard environment (HISE) and HI in EE (HIEE). Past the end of EE period (1 hour/day, 6 days/week, 9 weeks), mentioned parameters were evaluated in animals. Present results indicate learning and memory in the “OXmaze” task were impaired in HI rats and this effect was recovered after EE. On the contralateral hemisphere, HI caused a decrease in Na+,K+-ATPase activity that was recovered by EE. Results also indicate that HI damage decreases hippocampal synaptophysin immunoreactivity and neuronal density, moreover EE was effective in recovering synaptophysin levels on contralateral to the lesion hippocampus. The activities of GPx and CAT were not changed by HI in any group evaluated, some result founded on GFAP immunoreactivity and dendritic arborization characterization analysis. In conclusion, the important effect of HI lesion and the role of EE like neuroprotective strategy on functional impairment and on Na+,K+-ATPase activity and synaptophysin immunoreactivity was proven. Although this study have important advances in search of mechanisms by which the functional enhancement occurs in the animals submitted to HI and exposed to EE, it can be seen that it is not completely clear how this approach works. Further studies are needed to identify possible mechanisms that act as mediators of EE functional response after an ischemic event.

A hipóxia-isquemia (HI) é a principal causa de mortalidade no período perinatal e, nos sobreviventes, a incidência de comorbidades neurológicas é elevada. O encéfalo imaturo, altamente susceptível ao insulto hipóxico-isquêmico, é bastante sensível a estímulos ambientais tais como o enriquecimento ambiental (EA). Os objetivos deste estudo foram: 1) investigar o desempenho comportamental em um novo teste de memória e aprendizagem, o Ox-maze; 2) analisar a atividade das enzimas Na+,K+-ATPase, catalase (CAT) e glutationaperoxidase (GPx) no hipocampo; 3) caracterizar os neurônios piramidais da região CA1 hipocampal quanto à arborização dendrítica; 4) analisar alterações astrocíticas e sinápticas pela avaliação da imunoreatividade das proteínas GFAP e sinaptofisina usando a técnica de imunofluorescência e, 5) quantificar a densidade celular por meio de cortes semifinos da região CA1 do hipocampo de animais hipóxico-isquêmicos expostos a um ambiente enriquecido. Ratos com sete dias de idade foram divididos em quatro grupos e submetidos ou não ao procedimento cirúrgico de acordo com o grupo experimental ao qual pertenciam: controle mantido em ambiente padrão (CTAP), controle em ambiente enriquecido (CTAE), HI em ambiente padrão (HIAP) e HI em ambiente enriquecido (HIAE). Passado o período de EA (1h/dia, 6 dias/semana, 9 semanas iniciando após o desmame), os parâmetros mencionados foram avaliados nos animais. Os dados indicaram que a HI causou um prejuízo na memória e no aprendizado no teste do “OX-maze”, o qual foi revertido pelo efeito do ambiente enriquecido. A HI causou diminuição da atividade enzimática da Na+,K+-ATPase no hipocampo contralateral, assim como uma redução na imunorreatividade à sinaptofisina e nadensidade neuronal, sendo que o EA foi efetivo na recuperação da atividade da enzima Na+,K+-ATPase e dos níveis de sinaptofisina no hipocampo contralateral à lesão. As atividades de CAT e GPX não foram alteradas pela HI em nenhum dos grupos avaliados, mesmo resultado encontrado nas análises de GFAP e de padrão de arborização dendrítica. Por fim, neste estudo foi observado o importante efeito lesivo causado pela HI neonatal e o papel do EA como estratégia neuroprotetora na recuperação funcional, na atividade da Na+,K+-ATPase e na expressão de sinaptofisina. Este estudo traz avanços em busca dos mecanismos pelos quais a melhora funcional ocorre em animais HI expostos ao EA, mas pode-se verificar que não fica totalmente esclarecido como esta estratégia atua. Outros estudos são necessários para a identificação de possíveis mecanismos que atuem como mediadores da resposta funcional do EA após um evento isquêmico. / Hypoxia-ischemia (HI) is the main mortality cause in perinatal period and, in survivors, the incidence of neurological disabilities is elevated. The immature brain, highly susceptible to hypoxic-ischemic insult, is sensible to environmental stimuli, as environmental enrichment (EE). The aims of this study were to investigate: 1) behavioral performance in a new memory and learning task, the oxmaze task; 2) evaluate Na+,K+-ATPase, catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx) activities in the hippocampus; 3) characterizes dendritic arbor in pyramidal neurons from CA1 region from hippocampus; 4) analyze alterations in hippocampal synaptophysin and GFAP immmunoreactivity and, 5) analyze neuronal density alterations in hippocampus of hypoxic-ischemic rats exposed to enriched environment. Seven-day-old rats were divided into four groups: controlmaintained in standard environment (CTSE), control submitted to EE (CTEE), HI in standard environment (HISE) and HI in EE (HIEE). Past the end of EE period (1 hour/day, 6 days/week, 9 weeks), mentioned parameters were evaluated in animals. Present results indicate learning and memory in the “OXmaze” task were impaired in HI rats and this effect was recovered after EE. On the contralateral hemisphere, HI caused a decrease in Na+,K+-ATPase activity that was recovered by EE. Results also indicate that HI damage decreases hippocampal synaptophysin immunoreactivity and neuronal density, moreover EE was effective in recovering synaptophysin levels on contralateral to the lesion hippocampus. The activities of GPx and CAT were not changed by HI in any group evaluated, some result founded on GFAP immunoreactivity and dendritic arborization characterization analysis. In conclusion, the important effect of HI lesion and the role of EE like neuroprotective strategy on functional impairment and on Na+,K+-ATPase activity and synaptophysin immunoreactivity was proven. Although this study have important advances in search of mechanisms by which the functional enhancement occurs in the animals submitted to HI and exposed to EE, it can be seen that it is not completely clear how this approach works. Further studies are needed to identify possible mechanisms that act as mediators of EE functional response after an ischemic event.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Oxidative stress has been linked to some neurodegenerative disorders. Current therapies are limited to attenuate the symptoms, however some studies have shown that antioxidant compounds may be able to prevent or delay neuronal oxidative damage, including those present in plant extracts. For these reasons, this study investigated the possible antioxidant activity of the ethanolic extract of Luehea divaricata leaves in brain of rats in vitro and the possible antioxidant mechanisms involved. The extract was evaluated against basal and sodium nitroprusside (SNP) 5 μM induced lipid peroxidation in brain of rats through measurements of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) production. Slices of brain areas were treated with SNP 100 M and extract to determine cellular viability by MTT reduction assay. Scavenger activity was evaluated against NO, DPPH and OH through Griess reagent, DPPH and deoxyribose oxidation assays, respectively. The chelating and reducing capacity for iron were determined by the orto-phenantroline method. The extract was screened by HPLC for the presence of gallic, chlorogenic, and caffeic acids, quercetin, rutin, and kaempferol. Only rutin was detected and then was used, in the same concentrations of the extract, as standard in all assays. L. divaricata extract (1-10 μg/ml) protected against induced lipid peroxidation, decreased basal levels of TBARS (about 50%) and maintained the cells viable. The extract was not able to protect deoxyribose against OH and to chelate iron, however it inhibited NO and DPPH in 33.14% at 20 μg/ml and 53.93% at 50 μg/ml respectively, and showed a reducing power in a concentration and time dependent manner. Therefore, L. divaricata ethanolic leaf extract showed antioxidant properties in vitro at low concentrations. The antioxidant mechanisms were related to scavenger activity on reactive oxygen and nitrogen species and metal reducing property. These effects were similar or more powerful than rutin in same concentrations in all assays, except in NO scavenger activity, and, thus, other unidentified compounds present in the extract appear to be associated with the effects observed in this study. More studies are needed regarding the identification of these compounds and the neuroprotective activity of the extract. / O estresse oxidativo tem sido relacionado a algumas desordens neurodegenerativas. As terapias atuais para essas doenças estão limitadas a atenuar os sintomas apresentados, entretanto alguns estudos têm mostrado que compostos antioxidantes podem ser capazes de prevenir ou retardar o dano oxidativo neuronal, incluindo aqueles presentes em extratos vegetais. Por esses motivos, neste trabalho foi investigada a possível atividade antioxidante do extrato etanólico das folhas de Luehea divaricata em cérebro de ratos in vitro e os possíveis mecanismos antioxidantes envolvidos. O extrato foi avaliado contra a peroxidação lipídica basal e induzida por nitroprussiato de sódio (NPS) 5 μM em cérebro de ratos através da quantificação da produção de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Fatias de áreas do cérebro foram tratadas com NPS 100 M e extrato para determinar a viabilidade celular através do ensaio da redução do MTT. A atividade scavenger do extrato foi testada contra ON, DPPH e OH através do reagente de Griess e dos ensaios de DPPH e de oxidação da desoxirribose, respectivamente. A capacidade quelante e redutora frente ao ferro foram determinadas através do método da orto-fenantrolina. O extrato foi analisado por HPLC quanto à presença dos ácidos gálico, clorogênico e cafeico, quercetina, rutina e kaempferol. Somente a rutina foi detectada e então usada como padrão, nas mesmas concentrações do extrato, em todos os testes. O extrato de L. divaricata (1-10 μg/ml) protegeu o cérebro contra peroxidação lipídica induzida, diminuiu os níveis basais de TBARS (± 50%) e manteve as células viáveis. O extrato não foi capaz de proteger a desoxirribose contra OH e de quelar o ferro, entretanto inibiu ON e DPPH em 33,14% a 20 μg/ml e 53,93% a 50 μg/ml respectivamente, e mostrou poder redutor de maneira concentração e tempo dependentes. Assim, o extrato etanólico das folhas de L. divaricata demonstrou propriedade antioxidante in vitro em baixas concentrações. Os mecanismos antioxidantes foram relacionados ao efeito scavenger de espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio e à atividade redutora de metais. Esses efeitos foram similares ou superiores em comparação às mesmas concentrações de rutina, exceto na capacidade scavenger de ON e, portanto, outros compostos ainda não determinados no extrato parecem estar associados às atividades observadas neste trabalho. Mais estudos devem ser realizados em relação à identificação desses compostos e à atividade neuroprotetora do extrato.