Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-03-22T12:40:44Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_EfeitosAntiInflamatorios.pdf: 3276887 bytes, checksum: c31dfde2051eb70ff42d388148ea2939 (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-03-24T17:05:39Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_EfeitosAntiInflamatorios.pdf: 3276887 bytes, checksum: c31dfde2051eb70ff42d388148ea2939 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-24T17:05:39Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_EfeitosAntiInflamatorios.pdf: 3276887 bytes, checksum: c31dfde2051eb70ff42d388148ea2939 (MD5) Previous issue date: 2016-06-10 / A medula espinhal é o componente do sistema nervoso central (SNC) com funções cruciais para o estabelecimento da locomoção, habilidades motoras, somestesia e controle autonômico. Lesões medulares estão entre as condições patológicas mais graves e mais debilitantes à saúde humana, com grande incidência em todas as regiões do mundo. A reprodução dos diferentes tipos de lesão da medula espinhal (ME) em animais de experimentação e o entendimento de sua fisiopatologia, bem como a busca de tratamentos que minimizem os danos neurológicos e estimulem a recuperação morfofuncional do indivíduo afetado são temas de grande relevância científica e clínica. Neste estudo, investigamos os possíveis efeitos neuroprotetores e/ou anti-inflamatórios do extrato supercrítico de gergelim (Sesamun indicum L.) em tempos agudos após lesão experimental da medula espinhal (ME) de ratos adultos. Ratos machos adultos foram submetidos à hemissecção da ME em uma mesa estabilizadora em nível de T8. Os grupos controle e sham (falso operado) foram tratados com tween a 5% (veículo) e o grupo tratado recebeu injeções intraperitoneais de extrato de gergelim (150 mg/kg divido em duas doses diárias) em tempos agudos e sub-agudos de sobrevida após a lesão (1, 3 e 7 dias). Foram obtidas secções de 20 μm da ME com auxílio do um criostato. Estas seções foram coradas com azul de metileno, hematoxilina-eosina (HE), tricrômico de gomori, violeta de cresila e imunomarcadas por anticorpos específicos para a identificação de neutrófilos (anti-MBS-1) e micróglia (anti-ED1). Avaliou-se a força muscular por registro eletromiográfico realizados nos animais controle e tratados com gergelim, 1 e 7 dias após o trauma da ME. Os animais controle apresentaram cavitação progressiva da ME concomitante com recrutamento de neutrófilos e ativação microglial/macrofágica. O tratamento com extrato de gergelim induziu preservação tecidual e diminuição considerável do recrutamento de neutrófilos nos tempos de 1 e 3 dias após a indução da lesão experimental, o que foi confirmado por análise quantitativa (p<0.05). O tratamento com gergelim também diminuiu a ativação microglial/macrofágica no tempo de 7 dias após a lesão (P<0.05). Os registros eletromiográficos revelaram que o tratamento com gergelim induziu cerca de 50% de recuperação da força muscular em relação aos animais controle. Os resultados sugerem que o extrato de sementes de gergelim preto é anti-inflamatório, neuroprotetor e induz recuperação da força muscular em ratos adultos submetidos à trauma experimental da medula espinhal. Estudos futuros devem confirmar que fitoterápicos à base de gergelim podem ser usados como possíveis agentes neuroprotetores para tratamento da lesão da medula espinhal humana. / The spinal cord is a component of central nervous system (CNS) with crucial functions for locomotion, motor skills, somatosensory and authonomic control. Spinal injuries are among the more serious and debilitating pathological conditions to human health with large worldwide. The use of experimental models of spinal cord injury (SCI) is pivotal to understandthe SCI pathophysiology as well as search for treatments to minimize the neurological deficits and improve functional recovery. In this work, we aimed to investigate the neuroprotective and anti-inflammatory effects of supercritical gergelim (Sesamum indicum L.) extract in the acute phase of SCI in adult rats. Male Adult rats were submitted to spinal cord (SC) hemissection at T8. The sham (non lesioned) and control animals were treated with 5% tween(veicle), while treated animals received intraperitoneal (i.p) injections of Gergelim extract (150 mg/kg divided in two doses per day). Animals were allowed to recovery and were perfused at 1, 3 and 7 days post-lesion. 20 μm sections were obtained using a cryostat and stained with methylen blue, hematoxylin-eosin (HE), trichromic of Gomori and cresyl violet for gross histopathology. In addition, sections were immunolabeled with specific antibodies against neutrophils (anti-MBS-1) and activated microglia/macrophages (anti-ED1). The muscle force was assessed through electromiographic records performed in both control and treated animals at 1 and 7 days postlesion. The control animals presented progressive SC cavitation concomitant with neutrophil recruitment and microglia/macrophage activation. The treatment with gergelim extract induced tissue preservation and considerable decrease of neutrophil recruitment at 1 and 3 days, which was confirmed by quantitative analysis (ANOVA-Tukey, p<0.05). The gergelim treatment also decreased the microglia/macrophage activation at 7 days (ANOVA-Tukey, p<0.05). The electromiographic records revealed that the gergelim treatment improved the muscular force in about 50% compared to control animals. The results suggest that black gergelim seed extract is anti-inflammatory, neuroprotective and induces muscle force recovery in adults rats submitted to acute SCI. Future studies should confirm that a phytotherapic obtained from black sesame extract can be used as possible neuroprotective agent for human SCI.

O aumento da expectativa de vida da população mundial tem se associado com uma maior prevalência de doenças neurodegenerativas. A Doença de Alzheimer (DA) é a doença neurodegenerativa mais comum e a principal causa de demência em indivíduos com mais de 60 anos, sendo caracterizada por um declínio progressivo na memória e função mental dos pacientes. Esses sintomas são acompanhados por alterações histopatológicas no cérebro desses indivíduos, incluindo a presença de uma grande quantidade de placas senis, formadas pela deposição do peptídeo beta-amiloide (Aβ), e de emaranhados neurofibrilares formados pela hiperfosforilação da proteína Tau. Estudos indicam que a deposição do Aβ é uma das principais responsáveis pelo desenvolvimento da DA, causando dano neuronal através da ativação de várias vias pró-apoptóticas e dando origem aos sintomas de demência típicos dessa doença. Até o momento, não existem tratamentos eficazes para o combate à DA, de forma que a maior parte das intervenções farmacológicas é destinada apenas ao tratamento de alguns de seus sintomas. A proteína translocadora (TSPO) se localiza em pontos de contato entre as membranas mitocondriais interna e externa e está relacionada com o transporte de colesterol para o interior da mitocôndria e com a regulação da esteroidogênese e da apoptose. Estudos mostram que ligantes da TSPO apresentam efeitos neuroprotetores em diferentes modelos experimentais de lesão cerebral e doenças neurodegenerativas. Especificamente em relação à DA, um estudo indicou que o 4’-clorodiazepam (4’-CD), um ligante da TSPO, apresenta efeitos neuroprotetores em um modelo animal dessa doença, sendo um possível candidato para o seu tratamento. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi verificar o efeito neuroprotetor do 4’-CD em diferentes modelos in vitro de toxicidade induzida pelo Aβ, além de seus efeitos sobre o desenvolvimento de neurônios hipocampais. Inicialmente, demonstramos que o 4’-CD reduziu a morte celular de células SH-SY5Y expostas a um modelo de toxicidade induzida pela administração de Aβ. Esses efeitos estiveram associados com a redução da expressão da proteína pró-apoptótica Bax e com um aumento da expressão da survivina, uma proteína anti-apoptótica. A expressão das proteínas Bcl-xl e procaspase-3, por outro lado, não foi alterada pelos tratamentos. Posteriormente, estudamos os efeitos neuroprotetores do 4’-CD contra a toxicidade induzida pela administração do Aβ em culturas organotípicas de hipocampo. Nesses experimentos, foi demonstrado que o 4’-CD reduz a morte celular de culturas organotípicas de hipocampo expostas ao Aβ através de um aumento na expressão da enzima SOD, sem alterar, no entanto, a expressão das proteínas Akt e procaspase-3. Por fim, foi avaliado o efeito do 4’-CD sobre o desenvolvimento de culturas primárias de neurônios hipocampais de camundongos machos e fêmeas. Foi observado que as culturas de neurônios hipocampais das fêmeas apresentaram um desenvolvimento mais rápido do que as dos machos. O 4’-CD acelerou a maturação e aumentou a ramificação neurítica dos neurônios hipocampais dos machos, mas não exerceu qualquer efeito sobre os neurônios das fêmeas. Em suma, foi observado que o 4’-CD apresenta efeitos neuroprotetores contra o Aβ em células SH-SY5Y e em culturas organotípicas do hipocampo, apresentando-se como um fármaco em potencial para o tratamento da DA. Além disso, foi observado que o 4’-CD exerceu um efeito dependente do sexo sobre o desenvolvimento de culturas primárias de neurônios hipocampais, estimulando o desenvolvimento e a ramificação neurítica de neurônios hipocampais de machos, mas não de fêmeas. / The increase in life expectancy of the world population has been associated with a higher prevalence of neurodegenerative diseases. The Alzheimer’s Disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder and the main cause of dementia among people over 60 years, being characterized by a progressive decline in the memory and mental function of the patients. These symptoms are associated with histopathological changes in the brain of these patients, including the presence of senile plaques, formed by the deposition of amyloid-beta (Aβ), and neurofibrillary tangles, which are related to the hyperphosphorylation of Tau protein. Studies indicate that Aβ deposition is a major contributor to AD progression, promoting neuronal damage through the activation of different pro-apoptotic pathways and giving rise to the typical dementia symptoms of this disease. To date, there are no effective treatments for AD, so that most of the pharmacological intervention is intended for the treatment of some of its symptoms. The translocator protein (TSPO) is located in contact sites between the outer and the inner mitochondrial membranes and is involved in the cholesterol transport into the mitochondria and in the regulation of steroidogenesis and apoptosis. Studies show that TSPO ligands present neuroprotective effects in different experimental models of brain injury and neurodegenerative diseases. Specifically regarding AD, a study indicated that 4’-chlorodiazepam (4’-CD), a TSPO ligand, is neuroprotective in an animal model of this disease, being a possible candidate for its treatment. Therefore, the aim of this study was to evaluate the neuroprotective effect of 4’-CD in different experimental models of Aβ- induced neurotoxicity in vitro, as well as its effects on the development of hipocampal neurons. First, it was demonstrated that 4’-CD decreased the cell death of SH-SY5Y cells exposed to the Aβ. This effect was associated with the inhibition of the Aβ-induced upregulation of Bax, a pro-apoptotic protein, and downregulation of survivin, a prosurvival protein. On the other hand, the expression of Bcl-xl and procaspase-3 was not change by the treatments. After, it was studied the neuroprotective effects of 4’-CD against Aβ in organotypic hipocampal cultures. In these experiments, it was shown that 4’-CD decreases the cell death of organotypic hippocampal slices exposed to the Aβ by increasing the protein expression of SOD, but without changing the expression of Akt and procaspase-3. Finally, due to the importance of the processes of neuronal development and maturation in the regeneration of CNS after injury, it was evaluated the effect of 4’-CD on the development of primary hippocampal neurons of male and female mice. It was observed that female primary hippocampal neurons presented an increased rate of development than male neurons. 4’-CD stimulated the development and increased the neuritic branching of male but not from female neurons. In summary, it was observed that 4’-CD presented a neuroprotective effect against Aβ in SH-SY5Y cells and in rat organotypical hippocampal slices, presenting itself as a promising agent for the treatment of AD. Also, it was observed that 4’-CD modulates the development of hippocampal neurons in a sex-dependent manner, stimulating the development of male but not from female cells.

Astrócitos são células gliais com fundamental importância no sistema nervoso central (SNC), tanto em condições fisiológicas quanto patológicas. Estas células são essenciais na plasticidade neural, no metabolismo de neurotransmissores, na defesa antioxidante, na regulação do metabolismo energético, na homeostase iônica, na resposta inflamatória, na manutenção da barreira sangue-cérebro, na migração neuronal e na estabilização da comunicação entre as células. Assim, alterações em funções astrocitárias (como as que ocorrem no envelhecimento) estão relacionadas a importantes alterações na funcionalidade cerebral. Desta forma, esta tese teve por objetivo demonstrar que a cultura de astrócitos derivada de ratos Wistar adultos, desenvolvida e caracterizada pelo nosso grupo de pesquisa, pode ser um modelo de estudo fidedigno e versátil das propriedades celulares astrocitárias. Nossos resultados apontam que esta metodologia pode ser utilizada para elucidar o perfil de aminoácidos e gliotransmissores assim como da atividade enzimática glial e gerenciamento de neurotransmissores. Também demonstramos que a cultura adulta não é derivada de progenitores neurais e que parâmetros mitocondriais observados no cérebro adulto foram reproduzidos in vitro. A análise de respostas a estímulos demonstrou ser variável, dependendo da idade dos animais. Da mesma forma, o uso de culturas de diferentes idades revelou o efeito antienvelhecimento da guanosina, sugerindo sua atividade glioprotetora. Finalmente, demonstramos que culturas preparadas a partir de animais neonatos submetidas a um modelo de senescência in vitro apresentam respostas diferentes das apresentadas por culturas preparadas a partir de animais adultos e/ou envelhecidos, demonstrando que o modelo mais adequado para elucidar propriedades astrocitárias do cérebro maduro é o derivado de animais adultos. Portanto, demonstramos com este estudo a importância da disponibilidade de uma ferramenta como a cultura de astrócitos adultos e elucidamos características bioquímicas, celulares e moleculares desta ferramenta, evidenciando algumas de suas diferenças em comparação à cultura preparada a partir de ratos neonatos. Assim, ampliamos a compreensão das propriedades e funções celulares desta ferramenta, fornecendo respostas mais aproximadas às respostas fornecidas por astrócitos do cérebro maduro in vivo, especialmente no estudo do envelhecimento e das doenças neurodegenerativas. / Astrocytes are glial cells of pivotal importance in the central nervous system (CNS), both in physiological and pathological conditions. Some of their roles include neural plasticity, neurotransmitter metabolism, antioxidant defenses, control of energy metabolism, ionic homeostasis, inflammatory response, formation and maintenance of blood-brain barrier, neuronal migration and cellular communication. Thus, changes in astrocytic function (such as occurs in aging) are related to changes in brain function. The aim of this thesis was to demonstrate that astrocyte cultures from adult Wistar rats (developed and characterized by our research group) might be a reliable and versatile tool for studying astrocytic cellular properties. Our results suggest that this culture model is suitable to study the amino acids content and gliotransmitters, as well as glial enzymatic activity and neurotransmitter management. Next, we showed that the astrocyte cultures are not derived from neural progenitors and tissue mitochondrial parameters were reproduced in in vitro cultures. Responses to stimulus were variable, depending on the animals’ age. Accordingly, guanosine presented an anti-aging effect, indicating its glioprotective activity. Finally, we showed that cultures prepared from newborn rats submitted to an in vitro senescence model presented different responses when compared with mature animals, indicating that our culture model is the most suitable model to represent astrocytic properties in the mature brain. Therefore, this study demonstrates the relevance of this tool to understanding the biochemical, cellular and molecular properties of adult astrocytes, showing some differences related to the culture prepared from newborn animals. Thus, we amplify the comprehension about cellular functions of this tool, providing closer responses related to mature brain in vivo, especially regarding studies about aging and neurodegenerative diseases.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-06-29 / Introducao: A inflamacao tem sido relacionada a varias doencas neurodegenerativas e dados clinicos e experimentais sugerem uma funcao crucial nos processos inflamatorios no desenvolvimento da epilepsia, em particular, nos mecanismos geradores de crises (ictogenese) e na transformacao de uma rede neuronal normal a uma rede geradora de crises. A lovastatina, substancia usada na reducao da sintese do colesterol, tambem esta relacionada com a resposta inflamatoria, podendo modular a producao de citocinas e diminuir e o estresse oxidativo. Objetivos: O presente estudo teve como objetivo analisar a acao da lovastatina no desenvolvimento das diferentes fases do modelo de epilepsia, induzido por pilocarpina em ratos. Metodos: Ratos Wistar machos foram analisados nos 3 periodos do modelo da pilocarpina (350mg/kg) fases: aguda (24h), silenciosa (15 dias) e cronica (30 dias apos a 1.a crise espontanea) e para cada periodo do modelo usamos 4 grupos de animais: salina, lovastatina (Lova), pilocarpina (Pilo) e pilocarpina+lovastatina (Pilo+Lova). O tratamento com lovastatina (20 mg/kg) se iniciou 2 h apos o inicio do estado de mal epileptico e foi administrada por 15 dias, duas vezes ao dia nos animais do grupo silencioso e cronico. O cerebro foi processado para realizacao de PCR em tempo real e imuno-histoquimica de IL-1ƒÀ, IL-6, TNF-ƒ¿, IL-10, receptor B1 e B2 de cininas e quantificacao de aminoacidos no hipocampo. Alem disso, o tecido hipocampal foi processado para as tecnicas de Nissl e Neo-Timm modificado. Alem disso, foi medida a temperatura corporea na fase aguda, duracao do periodo silencioso e frequencia de crises na fase cronica. Resultados: O tratamento com a lovastatina no grupo Pilo+Lova mostrou diminuicao da expressao de RNAm e das proteinas IL-1ƒÀ e TNF-ƒ¿ nas 3 fases do modelo Notamos tambem reducao nos niveis do receptor B1 e B2 de cininas na fase aguda e de IL-6 nas fases aguda e silenciosa do modelo. Houve um aumento da expressão de IL-10 na fase crônica e não houve alteração nos níveis dos aminoácidos no hipocampo dos animais desse grupo, quando comparado ao grupo Pilo. Foi observada uma normalização da temperatura corpórea dos ratos submetidos ao SE e tratados com lovastatina. Não houve diferença significativa entre o grupo Pilo e Pilo+Lova na duração da fase silenciosa e na freqüência de crises. Foi observada uma preservação de neurônios em CA1 e também uma diminuição no brotamento de fibras musgosas no grupo Pilo+Lova, quando comparado ao grupo Pilo, na fase crônica do modelo. Conclusão: O presente estudo demonstrou que o tratamento com a lovastatina diminuiu diversos parâmetros importantes relacionados com o dano neuronal induzido pelo SE, no hipocampo de ratos nas diferentes fases do modelo experimental de epilepsia induzido pela pilocarpina. / Introduction: Inflammation has been associated with several neurodegenerative diseases and experimental and clinical data suggest a crucial role in inflammatory processes in the development of epilepsy, particularly in seizure-generating mechanisms (ictogenesis) and transformation of a normal neuronal network into a network generating seizures. Lovastatin, a drug used in the reduction of cholesterol synthesis, is also related to the inflammatory response and can modulate cytokine production reducing the oxidative stress. Objectives: This study aimed to analyze the action of lovastatin in different stages of development model of epilepsy induced by pilocarpine in rats. Methods: Male Wistar rats were analyzed in three periods of the pilocarpine-induced epilepsy (350mg/kg) into phases: acute (24h), silent (15 days) and chronic (30 days after the 1st spontaneous seizure) and for each period of this model we used 4 groups of animals: saline-treated, lovastatin (Lova), pilocarpine (Pilo) and pilocarpine + lovastatin (Pilo+ Lova). Treatment with lovastatin (20 mg / kg) begun 2 h after the onset of status epilepticus (SE) and was administered for 15 days, twice a day the animals in the silent and chronic phases. The brain was processed for performing real-time PCR and immunohistochemistry of IL-1ƒÀ, IL-6, TNF-ƒ¿, IL-10 and kinin B1 and B2 receptors and quantification of amino acids in the hippocampus. Besides, the hippocampal tissue was processed for Nissl techniques and Neo-Timm. In addition, body temperature was measured in the acute phase and the duration of the silent period and seizure frequency in chronic phase was analyzed. Results: Treatment with lovastatin in Pilo + Lova group showed decreased expression of mRNA and proteins IL-1ƒÀ and TNF-ƒ¿ in the three phases of this model, We also noted reduction of kinin B1 and B2 receptor in the acute and IL-6 into acute and silent periods. There was an increased expression of IL-10 in the chronic phase of this model. There was no change in amino acids levels in the hippocampus of rats from Pilo+Lova group when compared to Pilo group. We observed a normalization of body temperature of rats subjected to SE and treated with lovastatin. There was no significant difference between the group Pilo and Pilo + Lova on the duration of the silent phase and in seizure frequency. We observed a preservation of neurons in CA1 and also a reduction of mossy fiber sprouting in Pilo+ Lova group as compared to the Pilo group in the chronic phase of the model. Conclusion: This study demonstrated that treatment with lovastatin decreased number of important parameters related to the neuronal damage induced by SE in the hippocampus of rats at different stages of the experimental model of epilepsy induced by pilocarpine. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

O aumento da expectativa de vida da população mundial tem se associado com uma maior prevalência de doenças neurodegenerativas. A Doença de Alzheimer (DA) é a doença neurodegenerativa mais comum e a principal causa de demência em indivíduos com mais de 60 anos, sendo caracterizada por um declínio progressivo na memória e função mental dos pacientes. Esses sintomas são acompanhados por alterações histopatológicas no cérebro desses indivíduos, incluindo a presença de uma grande quantidade de placas senis, formadas pela deposição do peptídeo beta-amiloide (Aβ), e de emaranhados neurofibrilares formados pela hiperfosforilação da proteína Tau. Estudos indicam que a deposição do Aβ é uma das principais responsáveis pelo desenvolvimento da DA, causando dano neuronal através da ativação de várias vias pró-apoptóticas e dando origem aos sintomas de demência típicos dessa doença. Até o momento, não existem tratamentos eficazes para o combate à DA, de forma que a maior parte das intervenções farmacológicas é destinada apenas ao tratamento de alguns de seus sintomas. A proteína translocadora (TSPO) se localiza em pontos de contato entre as membranas mitocondriais interna e externa e está relacionada com o transporte de colesterol para o interior da mitocôndria e com a regulação da esteroidogênese e da apoptose. Estudos mostram que ligantes da TSPO apresentam efeitos neuroprotetores em diferentes modelos experimentais de lesão cerebral e doenças neurodegenerativas. Especificamente em relação à DA, um estudo indicou que o 4’-clorodiazepam (4’-CD), um ligante da TSPO, apresenta efeitos neuroprotetores em um modelo animal dessa doença, sendo um possível candidato para o seu tratamento. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi verificar o efeito neuroprotetor do 4’-CD em diferentes modelos in vitro de toxicidade induzida pelo Aβ, além de seus efeitos sobre o desenvolvimento de neurônios hipocampais. Inicialmente, demonstramos que o 4’-CD reduziu a morte celular de células SH-SY5Y expostas a um modelo de toxicidade induzida pela administração de Aβ. Esses efeitos estiveram associados com a redução da expressão da proteína pró-apoptótica Bax e com um aumento da expressão da survivina, uma proteína anti-apoptótica. A expressão das proteínas Bcl-xl e procaspase-3, por outro lado, não foi alterada pelos tratamentos. Posteriormente, estudamos os efeitos neuroprotetores do 4’-CD contra a toxicidade induzida pela administração do Aβ em culturas organotípicas de hipocampo. Nesses experimentos, foi demonstrado que o 4’-CD reduz a morte celular de culturas organotípicas de hipocampo expostas ao Aβ através de um aumento na expressão da enzima SOD, sem alterar, no entanto, a expressão das proteínas Akt e procaspase-3. Por fim, foi avaliado o efeito do 4’-CD sobre o desenvolvimento de culturas primárias de neurônios hipocampais de camundongos machos e fêmeas. Foi observado que as culturas de neurônios hipocampais das fêmeas apresentaram um desenvolvimento mais rápido do que as dos machos. O 4’-CD acelerou a maturação e aumentou a ramificação neurítica dos neurônios hipocampais dos machos, mas não exerceu qualquer efeito sobre os neurônios das fêmeas. Em suma, foi observado que o 4’-CD apresenta efeitos neuroprotetores contra o Aβ em células SH-SY5Y e em culturas organotípicas do hipocampo, apresentando-se como um fármaco em potencial para o tratamento da DA. Além disso, foi observado que o 4’-CD exerceu um efeito dependente do sexo sobre o desenvolvimento de culturas primárias de neurônios hipocampais, estimulando o desenvolvimento e a ramificação neurítica de neurônios hipocampais de machos, mas não de fêmeas. / The increase in life expectancy of the world population has been associated with a higher prevalence of neurodegenerative diseases. The Alzheimer’s Disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder and the main cause of dementia among people over 60 years, being characterized by a progressive decline in the memory and mental function of the patients. These symptoms are associated with histopathological changes in the brain of these patients, including the presence of senile plaques, formed by the deposition of amyloid-beta (Aβ), and neurofibrillary tangles, which are related to the hyperphosphorylation of Tau protein. Studies indicate that Aβ deposition is a major contributor to AD progression, promoting neuronal damage through the activation of different pro-apoptotic pathways and giving rise to the typical dementia symptoms of this disease. To date, there are no effective treatments for AD, so that most of the pharmacological intervention is intended for the treatment of some of its symptoms. The translocator protein (TSPO) is located in contact sites between the outer and the inner mitochondrial membranes and is involved in the cholesterol transport into the mitochondria and in the regulation of steroidogenesis and apoptosis. Studies show that TSPO ligands present neuroprotective effects in different experimental models of brain injury and neurodegenerative diseases. Specifically regarding AD, a study indicated that 4’-chlorodiazepam (4’-CD), a TSPO ligand, is neuroprotective in an animal model of this disease, being a possible candidate for its treatment. Therefore, the aim of this study was to evaluate the neuroprotective effect of 4’-CD in different experimental models of Aβ- induced neurotoxicity in vitro, as well as its effects on the development of hipocampal neurons. First, it was demonstrated that 4’-CD decreased the cell death of SH-SY5Y cells exposed to the Aβ. This effect was associated with the inhibition of the Aβ-induced upregulation of Bax, a pro-apoptotic protein, and downregulation of survivin, a prosurvival protein. On the other hand, the expression of Bcl-xl and procaspase-3 was not change by the treatments. After, it was studied the neuroprotective effects of 4’-CD against Aβ in organotypic hipocampal cultures. In these experiments, it was shown that 4’-CD decreases the cell death of organotypic hippocampal slices exposed to the Aβ by increasing the protein expression of SOD, but without changing the expression of Akt and procaspase-3. Finally, due to the importance of the processes of neuronal development and maturation in the regeneration of CNS after injury, it was evaluated the effect of 4’-CD on the development of primary hippocampal neurons of male and female mice. It was observed that female primary hippocampal neurons presented an increased rate of development than male neurons. 4’-CD stimulated the development and increased the neuritic branching of male but not from female neurons. In summary, it was observed that 4’-CD presented a neuroprotective effect against Aβ in SH-SY5Y cells and in rat organotypical hippocampal slices, presenting itself as a promising agent for the treatment of AD. Also, it was observed that 4’-CD modulates the development of hippocampal neurons in a sex-dependent manner, stimulating the development of male but not from female cells.

Astrócitos são células gliais com fundamental importância no sistema nervoso central (SNC), tanto em condições fisiológicas quanto patológicas. Estas células são essenciais na plasticidade neural, no metabolismo de neurotransmissores, na defesa antioxidante, na regulação do metabolismo energético, na homeostase iônica, na resposta inflamatória, na manutenção da barreira sangue-cérebro, na migração neuronal e na estabilização da comunicação entre as células. Assim, alterações em funções astrocitárias (como as que ocorrem no envelhecimento) estão relacionadas a importantes alterações na funcionalidade cerebral. Desta forma, esta tese teve por objetivo demonstrar que a cultura de astrócitos derivada de ratos Wistar adultos, desenvolvida e caracterizada pelo nosso grupo de pesquisa, pode ser um modelo de estudo fidedigno e versátil das propriedades celulares astrocitárias. Nossos resultados apontam que esta metodologia pode ser utilizada para elucidar o perfil de aminoácidos e gliotransmissores assim como da atividade enzimática glial e gerenciamento de neurotransmissores. Também demonstramos que a cultura adulta não é derivada de progenitores neurais e que parâmetros mitocondriais observados no cérebro adulto foram reproduzidos in vitro. A análise de respostas a estímulos demonstrou ser variável, dependendo da idade dos animais. Da mesma forma, o uso de culturas de diferentes idades revelou o efeito antienvelhecimento da guanosina, sugerindo sua atividade glioprotetora. Finalmente, demonstramos que culturas preparadas a partir de animais neonatos submetidas a um modelo de senescência in vitro apresentam respostas diferentes das apresentadas por culturas preparadas a partir de animais adultos e/ou envelhecidos, demonstrando que o modelo mais adequado para elucidar propriedades astrocitárias do cérebro maduro é o derivado de animais adultos. Portanto, demonstramos com este estudo a importância da disponibilidade de uma ferramenta como a cultura de astrócitos adultos e elucidamos características bioquímicas, celulares e moleculares desta ferramenta, evidenciando algumas de suas diferenças em comparação à cultura preparada a partir de ratos neonatos. Assim, ampliamos a compreensão das propriedades e funções celulares desta ferramenta, fornecendo respostas mais aproximadas às respostas fornecidas por astrócitos do cérebro maduro in vivo, especialmente no estudo do envelhecimento e das doenças neurodegenerativas. / Astrocytes are glial cells of pivotal importance in the central nervous system (CNS), both in physiological and pathological conditions. Some of their roles include neural plasticity, neurotransmitter metabolism, antioxidant defenses, control of energy metabolism, ionic homeostasis, inflammatory response, formation and maintenance of blood-brain barrier, neuronal migration and cellular communication. Thus, changes in astrocytic function (such as occurs in aging) are related to changes in brain function. The aim of this thesis was to demonstrate that astrocyte cultures from adult Wistar rats (developed and characterized by our research group) might be a reliable and versatile tool for studying astrocytic cellular properties. Our results suggest that this culture model is suitable to study the amino acids content and gliotransmitters, as well as glial enzymatic activity and neurotransmitter management. Next, we showed that the astrocyte cultures are not derived from neural progenitors and tissue mitochondrial parameters were reproduced in in vitro cultures. Responses to stimulus were variable, depending on the animals’ age. Accordingly, guanosine presented an anti-aging effect, indicating its glioprotective activity. Finally, we showed that cultures prepared from newborn rats submitted to an in vitro senescence model presented different responses when compared with mature animals, indicating that our culture model is the most suitable model to represent astrocytic properties in the mature brain. Therefore, this study demonstrates the relevance of this tool to understanding the biochemical, cellular and molecular properties of adult astrocytes, showing some differences related to the culture prepared from newborn animals. Thus, we amplify the comprehension about cellular functions of this tool, providing closer responses related to mature brain in vivo, especially regarding studies about aging and neurodegenerative diseases.

O sistema canabinóide parece participar de vários processos neurobiológicos, incluindo neuroproteção e plasticidade. Os objetivos deste estudo foram avaliar os efeitos de ablações retinianas sobre a expressão do receptor canabinóide CB1 e de proteínas estruturais no tecto óptico de pintos pelos métodos de imuno-histoquímica, immunoblotting e PCR em tempo real. Além disso, avaliamos os efeitos do tratamento com agonistas e antagonistas canabinóides em culturas de células do tecto óptico expostas ao NMDA por citometria de fluxo e quanto à morfologia. A ablação retiniana parece gerar um aumento da expressão da proteína CB1 no tecto óptico desaferentado, mas não dos níveis de RNAm. O tratamento das culturas com o agonista canabinóide diminuiu o número de células inviáveis e de DNA fragmentado gerados pelo NMDA. O aumento da expressão de CB1 após a ablação indica uma localização pós-sináptica desses receptores e sugere um papel do sistema canabinóide em processos de plasticidade. Os resultados da cultura de células sugerem um papel neuroprotetor do sistema canabinóide. / The cannabinoid system (CS) seems to have a role in several neurobiological processes, including neuroprotection and neuronal plasticity. The aims of this study were to verify the effects of unilateral retinal ablation on the expression of cannabinoid receptor CB1 and other structural proteins in the optic tectum of chick brain by immunohistochemistry, immunoblotting and real time PCR. Moreover, we evaluated the effects of cannabinoids agonists and antagonists treatment in optic tectum cell cultures exposed to the NMDA by flow cytometry and in the morphology. The retinal ablation seems to generate an increase in the expression of protein CB1 in the deafferented optic tectum, but not in the levels of mRNA. The treatment of the cultures with the cannabinoid agonist decreased the number of unviable cells and fragmented DNAs generated by NMDA. This increase of CB1 expression indicates a post-synaptic localization of these receptors and suggests a role of the CS in plasticity processes. The results of cell culture suggest neuroprotector role of the CS.

Spermine (SPM) is an aliphatic amine which contains four nucleophilic centers and is found in all eukaryotic cells, including nervous cells. It belongs to the group of polyamines, which are molecules associated with both neuroprotection and neurotoxicity. The aim of this study was to investigate the effects of spermine on some parameters of toxicity induced by striatal administration of quinolinic acid (QA), an experimental model of Huntington s disease in adult and male Wistar rats. The intrastriatal administration of QA (180 nmol/site) induced contralateral rotations and increase the number of contralateral body swings. The previous striatal administration of SPM caused mixed effects: at the dose of 0.1 nmol/site increased the number of contralateral rotations; but at 10 nmol/site it reduced both the number of rotations and the contralateral body swings induced by QA. The mechanism by which SPM decreases these motor alterations is probably through its interaction with the NMDA receptor, since the co-administration with arcaine (antagonist of polyamine binding sites on this receptor) reversed its protective effect. The increase of protein carbonyl content induced by QA (180 nmol/site) in striatum of rats was prevented by the administration of 10 nmol/site of SPM. Besides, the bilateral striatal injection of QA (180 nmol/site) impaired the performance in the recognition memory task. The post-training striatal administration of SPM (0.1 and 1 nmol/site) reversed the QA-induced cognitive deficit. It was also evaluated whether spermine prevented QA-induced neuromorphological alterations. QA caused striatal neuronal degeneration and reactive astrogliosis. SPM, at the dose that improved the cognitive performance (0.1 nmol/site), had no effect on striatal neuronal degeneration but reversed the intense astrocytic reaction induced by QA. These results suggest that SPM has neuroprotective properties, presenting a dose dependent pattern of polyamine, in this experimental model of Huntington disease. / A espermina (SPM) é uma amina alifática, contendo quatro centros nucleofílicos e é encontrada em todas as células eucarióticas, incluindo células nervosas. Ela pertence ao grupo das poliaminas, moléculas responsáveis tanto por efeitos neuroprotetores quanto neurotóxicos. O objetivo do presente trabalho foi investigar os efeitos da SPM sobre alguns parâmetros de toxicidade induzidos pela administração estriatal de ácido quinolínico (AQ), um modelo experimental da doença de Huntington em ratos Wistar machos adultos. A administração intraestriatal unilateral de AQ (180 nmol/sítio) induziu o aparecimento de rotações contralaterais e aumento do percentual de balanços corporais contralaterais. A prévia administração estriatal de SPM mostrou efeitos diversos: na dose de 0,1 nmol/sítio aumentou o número de rotações; porém na dose de 10 nmol/sítio ela diminuiu tanto o número de rotações quanto o percentual de balanços corporais contralaterais induzidos pelo AQ. O mecanismo pelo qual a SPM diminui estas alterações motoras é, provavelmente, devido à sua interação com o receptor NMDA, uma vez que sua co-administração com a arcaína (antagonista do sítio das poliaminas neste receptor) reverteu o efeito protetor da mesma. A administração de 10 nmol/sítio de SPM preveniu o aumento do conteúdo de proteína carbonil induzida pela injeção de AQ (180 nmol/sítio) no estriado de ratos. Além disso, foi observado prejuízo cognitivo na tarefa de reconhecimento de objetos após a injeção estriatal bilateral de AQ (180 nmol/sítio). A administração estriatal póstreino de SPM (0,1 e 1 nmol/sítio) reverteu este déficit cognitivo induzido pelo AQ. Para avaliação das alterações neuromorfológicas neste modelo foram observadas degeneração neuronal e reação astrocitária. O AQ aumentou significativamente a degeneração de neurônios estriatais e a astrogliose reativa. A SPM, na menor dose que melhorou o desempenho cognitivo (0,1 nmol/sítio), não teve efeito sobre a degeneração neuronal estriatal; no entanto, ela foi capaz de reverter a intensa reação astrocitária induzida pela injeção de AQ. Estes resultados sugerem que a SPM tem propriedades neuroprotetoras, que apresentam um padrão dependente da dose da poliamina, neste modelo experimental da doença de Huntington.

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This study aimed to evaluate the antioxidant activity in vitro, as well as and the possible neuroprotective effect in vivo of the isoflavonoid formononetin (FORM) in an experimental model for the study of Parkinson's disease (PD). Among the methods used to determine the antioxidant activity of FORM in vitro, they were elected the DPPH, ABTS and FRAP. In the in vivo assays, FORM was evaluated for its biological activity on experimental PD induced by 6- hydroxydopamine (6-OHDA, 10 μg in 2 μL) injection in the right striatum. Control groups received saline containing 0.02% of ascorbic acid. The animals were subjected to the open field behavioral test after 21 days of surgery. The immunohistochemical analysis of tyrosine hydroxylase TH was performed in the substantia nigra pars compacta (SNc) and the inflammatory response was evaluated at the striatum (hystochemical for hematoxylin eosin) after sacrifice 28 days of surgery. Statistical analysis was performed by one way analysis of variance or, in the case of graduated inflammatory response, by the Kruskal-Wallis test with Dunn's extension. The in vitro results of DPPH, ABTS and FRAP showed significant antioxidant action of FORM, similar to that of the vitamins A and E (p > 0.05) and synergism between FORM and vitamin A (for equivalent vitamin C and Trolox, p < 0.001). In the open field test the rearing, crossings, ambulation (to the right and left), the immobility time and latency to onset the movement were similar between the group treated with FORM 20 mg/kg and the lesioned group and different from the groups treated with vehicle and FORM 10 mg/kg. In immunostaining for TH SNc, it was observed that 6-OHDA caused a decrease in the mean number of dopaminergic neurons (22% remaining) in the lesioned group, whereas the treatment with FORM 10 mg/kg promoted an increase to 51% and FORM 20 mg/kg in 79%, p < 0.0001. The data were also indicative of anti-inflammatory action of FORM evidenced in histopatholological analysis and by the reduction in the microglial inflammatory infiltrate. It was found that lesioned rats treated with vehicle exhibited severe grade of inflammatory response (more than 50% of the microglial infiltrate) while in the group without lesion less than 10% of inflammatory infiltrate. On the other hand, in the groups treated with FORM (10 and 20 mg/kg), there was a moderate inflammatory response, (10 to 50% infiltrate p < 0.0001). Therefore, the treatment with FORM promoted a neuroprotective and anti-inflammatory effects, which may be associated with high antioxidant activity. / Considerando a demanda de tratamentos efetivos para prevenção e tratamento da doença de Parkinson (DP) e o papel do estresse oxidativo em desordens neurológicas e neurodegenerativas, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a atividade antioxidante in vitro, bem como a possível ação neuroprotetora in vivo do isoflavonóide formononetina (FORM) em modelo experimental para estudo da DP. Dentre os métodos usados para determinar a atividade antioxidante da FORM in vitro, foram eleitos o DPPH, o ABTS e o FRAP. Em ensaios in vivo, foi avaliada sua atividade biológica frente à lesão da via nigroestriatal causada por 6- hidroxidopamina (6-OHDA, 10 μg em 2 μL), com o lado direito utilizado como parâmetro para microinjeção no estriado. Animais controle receberam solução salina contendo 0,02% de ácido ascórbico. Os animais foram submetidos a teste comportamental de campo aberto, 21 dias após a cirurgia e procedeu-se à análise imunohistoquímica para a enzima tirosina hidroxilase (TH) e análise histoquímica (hematoxilina eosina) para avaliação de alterações estruturais e da resposta inflamatória, no estriado e na substância negra compacta (SNc), após eutanásia aos 28 dias. Os dados foram submetidos à análise de variância de uma via (ANOVA) seguida do pósteste de Tukey, à exceção do escore da resposta inflamatória, que foi analisado por meio de Teste Kruskal-Wallis, com extensão de Dunn. Nos resultados in vitro, através dos testes DPPH, ABTS e FRAP encontrou-se ação antioxidante de FORM semelhante à das vitaminas A e E e sinergismo entre a FORM e a vitamina A (por Equivalente de vitamina C e Trolox, p < 0,001). Nos resultados in vivo, para os testes de comportamento em campo aberto, foram avaliados os parâmetros de elevações (rearing), explorações (crossing), ambulações para a direita e esquerda, o tempo de imobilidade e de latência para início do movimento, sendo os resultados do grupo tratado com FORM a 20 mg/kg semelhantes aos do grupo não lesionado e diferentes dos grupos lesionados tratados com veículo e FORM a 10 mg/kg. Na imunomarcação para TH na SNc, a 6-OHDA promoveu diminuição de neurônios, ficando remanescentes em média 22% no grupo lesionado e tratados com veículo, enquanto que o tratamento com FORM a 10 mg/kg promoveu aumento do número médio em 51% e o tratamento com FORM a 20 mg/kg em 79%. Os dados foram indicativos também de efeito anti-inflamatório da FORM, evidenciada na análise de infiltrado inflamatório microglial. Verificou-se que animais lesionados e tratados com veículo apresentaram grau severo de inflamação (mais de 50% de infiltrado inflamatório), o grupo controle apresentou menos de 10% de infiltrado inflamatório, enquanto nos grupos tratados com FORM (10 e 20 mg/kg) observou-se grau moderado de inflamação (10 a 50% de infiltrado p < 0,0001). Portanto, o tratamento com a FORM promoveu aumento na sobrevivência de neurônios dopaminérgicos e diminui a resposta inflamatória no estriado, efeitos que podem estar associados a sua atividade antioxidante.