Em Angiospermas, o pistilo, contido na flor, é um órgão de extrema importância na reprodução vegetal, sendo que analisar a função dos genes expressos nos tecidos especializados que o compõem, é fundamental para um melhor entendimento do processo reprodutivo vegetal. Utilizando a técnica de screening diferencial de uma biblioteca de cDNA de estigma/estilete de Nicotiana tabacum, foi identificado um clone de cDNA (PA3), com alta similaridade a metiltransferases (SAMT, BAMT, e JAMT). O gene correspondente ao cDNA (PA3) foi denominado NtPMT (Nicotiana tabacum Pistil Methyltransferase). As metiltransferases são enzimas envolvidas em processos como desenvolvimento vegetal, respostas de defesa, sinalização química, polinização, entre outros. Dois clones de cDNAs, (46B11 e 134B02), codificando proteínas com alta similaridade a metiltransferases, foram isolados de um banco de ESTs (TOBEST), e utilizados para experimentos de expressão heteróloga. Para tanto, foram construídos dois plasmídeos recombinantes, contendo uma \"tag\" de histidinas em fusão N-terminal com as regiões codificadoras das proteínas, sob controle de um promotor forte e regulável. Os vetores de expressão bacterianos foram utilizados para transformar diferentes linhagens de Escherichia coli [BL21 (DE3), BL21(DE3) Códon Plus-RP e BL21 (DE3) Rosetta], de forma a analisar os níveis de expressão em diferentes temperaturas de cultivo (37°C, 30°C e 20°C) e diferentes tempos de indução (1, 2, 3, 4, 5 e 20hs). O vetor de expressão pEXP17¬46B11 foi utilizado para transformar as três linhagens de E. coli, enquanto o vetor de expressão pEXP17-134B02 foi introduzido apenas em BL21(DE3) Rosetta. Em BL21 (DE3) a proteína esperada (22,7kDa), correspondente ao clone pEXP17-46B11, foi produzida apenas em 37°C, apresentando um bom nível de expressão já nas primeiras três horas de indução. Por outro lado, as cepas BL21 (DE3)Códon Plus-RP e BL21 (DE3) Rosetta foram capazes de produzir boa quantidade da proteína recombinante, em todas as condições testadas. Entretanto, a proteína de fusão (22,7kDa) pôde ser observada apenas na fração celular insolúvel, na maioria das condições testadas, provavelmente na forma de corpos de inclusão. Contudo, ao se utilizar 20h de indução, na temperatura de 20°C, foi possível detectar uma pequena quantidade da proteína recombinante pEXP17-46B11 na fração celular solúvel, resultado confirmado por análises de Western blot. A linhagem BL21(DE3) Rosetta também apresentou bons níveis de expressão da proteína recombinante pEXP17-134B02, em todas as condições testadas. Entretanto, a proteína, com massa esperada (13,9kDa), foi observada apenas na fração celular insolúvel, provavelmente na forma de corpos de inclusão. Apesar de a proteína pEXP17-46B11 estar insolúvel, os bons níveis de expressão obtidos tornaram possível a utilização da mesma para a produção de anticorpos policlonais. Para tanto, bandas da proteína recombinante, induzidas em BL21(DE3) Rosetta, por três horas, à 37ºC, foram cortadas do gel de poliacrilamida, e utilizadas para a imunização de camundongos. Dois fragmentos do gene NtPMT foram amplificados via PCR, a partir do DNA genômico de N. tabacum e de suas prováveis espécies parentais, Nicotiana sylvestris e Nicotiana tomentosiformis. Após clonagem e sequenciamento, os fragmentos obtidos foram utilizados para análises comparativas de seqüências, visando um melhor entendimento da história evolutiva desse gene, nas três espécies de Nicotiana. Os resultados obtidos corroboraram com uma das hipóteses de origem evolutiva, segundo a qual, a espécie N. tabacum teria surgido a partir de um cruzamento entre um ancestral de N. sylvestris e um ancestral de N. tomentosiformis. / In Angiosperms, the pistil of the flower is an organ of extreme importance in plant reproduction and to analyze the function of the genes expressed in the specialized tissues of the pistil is very important for a better understanding of the reproductive process. Through the differential screening of a Nicotiana tabacum stigma/style cDNA library, a cDNA clone (PA3), encoding a protein with high similarity to methyltransferases (SAMT, BAMT and JAMT), has been identified. The gene corresponding to the cDNA (PA3) has been designated NtPMT (Nicotiana tabacum ? Pistil Methyltransferase). The methyltransferases are enzymes involved in processes such as: plant development, defense responses, chemical signaling, pollination, among others. Two cDNA clones (46B11 and 134B02), encoding proteins with high similarity to methyltransferases have been isolated from the TOBEST cDNA library and have been used in heterologous expression experiments. For this purpose, two recombinant plasmids have been constructed, containing a histidine tag in N-terminal fusion with the regions encoding the proteins, under the control of a strong and regulated promoter. The bacterial expression vectors were used for the transformation of different Escherichia coli strains [BL21 (DE3), BL21(DE3) Codon Plus-RP and BL21 (DE3) Rosetta], in order to analyze the expression levels in different growth temperatures (37°C, 30°C and 20°C) and different induction periods (1, 2, 3, 4, 5 and 20 hours). The expression vector pEXP17¬46B11 was used to transform the three strains of E. coli, and the expression vector pEXP17-134B02 has been introduced only in BL21(DE3) Rosetta. In BL21 (DE3), the expected protein (22.7kDa), corresponding to the pEXP17-46B11 clone, has been produced only at 37°C, showing a good expression level already at the first three hours of induction. On the other hand, the strains BL21 (DE3) Codon Plus-RP and BL21 (DE3) Rosetta were capable of producing good quantity of the recombinant protein in all conditions tested. However, the fusion protein (22.7kDa) could be observed only at the insoluble cellular fraction, in the majority of conditions tested, probably as inclusion bodies. However, using 20 h of induction at the temperature of 20°C, it was possible to detect a small quantity of the pEXP17-46B11 recombinant protein in the soluble cellular fraction, a result that has been confirmed by Western blot analyzis. The strain BL21(DE3) Rosetta has also shown good expression levels of the pEXP17-134B02 recombinant protein in all conditions tested. However, the protein with the expected mass (13.9kDa) has been observed only in the insoluble cellular fraction, probably as inclusion bodies. Despite the fact the pEXP17-46B11 protein was insoluble, the good expression levels obtained made possible its use in the production of policlonal antibodies. For this purpose, bands of the recombinant protein obtained in BL21(DE3) Rosetta, induced for three hours at 37ºC, were cut from the poliacrylamide gel and used for the immunization of mouses. Two fragments of the NtPMT gene were amplified by PCR, from genomic DNA of N. tabacum and its putative parental species Nicotiana sylvestris e Nicotiana tomentosiformis. After cloning and sequencing, the obtained fragments were used for comparative sequence analysis, aiming a better understanding of the evolutionary history of this gene in the three Nicotiana species. The results corroborate the hypothesis of the N. tabacum evolutionary origin in which it was originated by the cross between an ancestral of N. sylvestris and an ancestral of N. tomentosiformis.

Em Angiospermas, o pistilo, contido na flor, é um órgão de extrema importância na reprodução vegetal, sendo que analisar a função dos genes expressos nos tecidos especializados que o compõem, é fundamental para um melhor entendimento do processo reprodutivo vegetal. Utilizando a técnica de screening diferencial de uma biblioteca de cDNA de estigma/estilete de Nicotiana tabacum, foi identificado um clone de cDNA (PA3), com alta similaridade a metiltransferases (SAMT, BAMT, e JAMT). O gene correspondente ao cDNA (PA3) foi denominado NtPMT (Nicotiana tabacum Pistil Methyltransferase). As metiltransferases são enzimas envolvidas em processos como desenvolvimento vegetal, respostas de defesa, sinalização química, polinização, entre outros. Dois clones de cDNAs, (46B11 e 134B02), codificando proteínas com alta similaridade a metiltransferases, foram isolados de um banco de ESTs (TOBEST), e utilizados para experimentos de expressão heteróloga. Para tanto, foram construídos dois plasmídeos recombinantes, contendo uma \"tag\" de histidinas em fusão N-terminal com as regiões codificadoras das proteínas, sob controle de um promotor forte e regulável. Os vetores de expressão bacterianos foram utilizados para transformar diferentes linhagens de Escherichia coli [BL21 (DE3), BL21(DE3) Códon Plus-RP e BL21 (DE3) Rosetta], de forma a analisar os níveis de expressão em diferentes temperaturas de cultivo (37°C, 30°C e 20°C) e diferentes tempos de indução (1, 2, 3, 4, 5 e 20hs). O vetor de expressão pEXP17¬46B11 foi utilizado para transformar as três linhagens de E. coli, enquanto o vetor de expressão pEXP17-134B02 foi introduzido apenas em BL21(DE3) Rosetta. Em BL21 (DE3) a proteína esperada (22,7kDa), correspondente ao clone pEXP17-46B11, foi produzida apenas em 37°C, apresentando um bom nível de expressão já nas primeiras três horas de indução. Por outro lado, as cepas BL21 (DE3)Códon Plus-RP e BL21 (DE3) Rosetta foram capazes de produzir boa quantidade da proteína recombinante, em todas as condições testadas. Entretanto, a proteína de fusão (22,7kDa) pôde ser observada apenas na fração celular insolúvel, na maioria das condições testadas, provavelmente na forma de corpos de inclusão. Contudo, ao se utilizar 20h de indução, na temperatura de 20°C, foi possível detectar uma pequena quantidade da proteína recombinante pEXP17-46B11 na fração celular solúvel, resultado confirmado por análises de Western blot. A linhagem BL21(DE3) Rosetta também apresentou bons níveis de expressão da proteína recombinante pEXP17-134B02, em todas as condições testadas. Entretanto, a proteína, com massa esperada (13,9kDa), foi observada apenas na fração celular insolúvel, provavelmente na forma de corpos de inclusão. Apesar de a proteína pEXP17-46B11 estar insolúvel, os bons níveis de expressão obtidos tornaram possível a utilização da mesma para a produção de anticorpos policlonais. Para tanto, bandas da proteína recombinante, induzidas em BL21(DE3) Rosetta, por três horas, à 37ºC, foram cortadas do gel de poliacrilamida, e utilizadas para a imunização de camundongos. Dois fragmentos do gene NtPMT foram amplificados via PCR, a partir do DNA genômico de N. tabacum e de suas prováveis espécies parentais, Nicotiana sylvestris e Nicotiana tomentosiformis. Após clonagem e sequenciamento, os fragmentos obtidos foram utilizados para análises comparativas de seqüências, visando um melhor entendimento da história evolutiva desse gene, nas três espécies de Nicotiana. Os resultados obtidos corroboraram com uma das hipóteses de origem evolutiva, segundo a qual, a espécie N. tabacum teria surgido a partir de um cruzamento entre um ancestral de N. sylvestris e um ancestral de N. tomentosiformis. / In Angiosperms, the pistil of the flower is an organ of extreme importance in plant reproduction and to analyze the function of the genes expressed in the specialized tissues of the pistil is very important for a better understanding of the reproductive process. Through the differential screening of a Nicotiana tabacum stigma/style cDNA library, a cDNA clone (PA3), encoding a protein with high similarity to methyltransferases (SAMT, BAMT and JAMT), has been identified. The gene corresponding to the cDNA (PA3) has been designated NtPMT (Nicotiana tabacum ? Pistil Methyltransferase). The methyltransferases are enzymes involved in processes such as: plant development, defense responses, chemical signaling, pollination, among others. Two cDNA clones (46B11 and 134B02), encoding proteins with high similarity to methyltransferases have been isolated from the TOBEST cDNA library and have been used in heterologous expression experiments. For this purpose, two recombinant plasmids have been constructed, containing a histidine tag in N-terminal fusion with the regions encoding the proteins, under the control of a strong and regulated promoter. The bacterial expression vectors were used for the transformation of different Escherichia coli strains [BL21 (DE3), BL21(DE3) Codon Plus-RP and BL21 (DE3) Rosetta], in order to analyze the expression levels in different growth temperatures (37°C, 30°C and 20°C) and different induction periods (1, 2, 3, 4, 5 and 20 hours). The expression vector pEXP17¬46B11 was used to transform the three strains of E. coli, and the expression vector pEXP17-134B02 has been introduced only in BL21(DE3) Rosetta. In BL21 (DE3), the expected protein (22.7kDa), corresponding to the pEXP17-46B11 clone, has been produced only at 37°C, showing a good expression level already at the first three hours of induction. On the other hand, the strains BL21 (DE3) Codon Plus-RP and BL21 (DE3) Rosetta were capable of producing good quantity of the recombinant protein in all conditions tested. However, the fusion protein (22.7kDa) could be observed only at the insoluble cellular fraction, in the majority of conditions tested, probably as inclusion bodies. However, using 20 h of induction at the temperature of 20°C, it was possible to detect a small quantity of the pEXP17-46B11 recombinant protein in the soluble cellular fraction, a result that has been confirmed by Western blot analyzis. The strain BL21(DE3) Rosetta has also shown good expression levels of the pEXP17-134B02 recombinant protein in all conditions tested. However, the protein with the expected mass (13.9kDa) has been observed only in the insoluble cellular fraction, probably as inclusion bodies. Despite the fact the pEXP17-46B11 protein was insoluble, the good expression levels obtained made possible its use in the production of policlonal antibodies. For this purpose, bands of the recombinant protein obtained in BL21(DE3) Rosetta, induced for three hours at 37ºC, were cut from the poliacrylamide gel and used for the immunization of mouses. Two fragments of the NtPMT gene were amplified by PCR, from genomic DNA of N. tabacum and its putative parental species Nicotiana sylvestris e Nicotiana tomentosiformis. After cloning and sequencing, the obtained fragments were used for comparative sequence analysis, aiming a better understanding of the evolutionary history of this gene in the three Nicotiana species. The results corroborate the hypothesis of the N. tabacum evolutionary origin in which it was originated by the cross between an ancestral of N. sylvestris and an ancestral of N. tomentosiformis.

Šio darbo tikslas buvo patikrinti ar įmanoma padidinti mielių Saccharomyces cerevisiae K2 tipo kilerinio preprotoksino geno raiškos galimybes augaluose, naudojant konstitutyvų žiedinio kopūsto mozaikos viruso CaMV 35S promotorių. Šiam tikslui pasiekti buvo atlikta: neonkogeninių agrobakterijų (Agrobacterium tumefaciens) kamieno konjugantų atrinkimas, turinčių augalų transformacijos vektorių pART27-KillK2 su mielių K2 tipo kilerinį preprotoksiną koduojančiu genu; atlikta paprastojo tabako (Nicotiana tabacum L.) transformacija minėtų agrobakterijų pagalba bei selektyvi Nicotiana tabacum L. transgeninio kaliaus atranka. Po sėkmingos Agrobacterium tumefaciens konjugacijos su E.coli kamienu, turinčiu kilerinę plazmidę pART27-KillK2 ir sėkmingos modelinio augalo N.tabacum agrobakterinės lapų eksplantų transformacijos, buvo taikomas PGR metodas bei vykdomas kileriškumo patikrinimas. PGR ir DNR elektroforezės pagalba buvo nustatyta, kad KillK2 genas yra įsiterpęs į augalo genomą ir vyksta silpna šio geno raiška, tačiau žiedinio kopūsto mozaikos viruso CaMV 35S promotoriaus prieš šį geną aptikti nepavyko. Ankstesnių tyrimų metu buvo manoma, kad K2 tipo kilerinio preprotoksino geno informacija transformuotuose augaluose su vektoriumi pGA482-KillK2 yra realizuojama kuomet šio geno transkripcija tiesiogiai reguliuojama mielių alkoholdehidrogenazės ADH1 promotoriumi, tačiau šio darbo metu, atliekant tyrimus, buvo parodyta, kad promotorius ADH1 taip pat nėra prisijungęs prie geno KillK2... [toliau žr. visą tekstą] / The aim of this work was to verify the possibility to increase expression of yeast (Saccharomyces cerevisiae), K2 type killer preprotoxin in plants, using constitutive cauliflower mosaic virus CaMV 35S promoter. In order to achieve it, the following was done: selection of unoncogenic strain of agrobacterium (Agrobacterium tumefaciens) with plant transformation vector pART27-KillK2, containing K2 type killer preprotoxin gene; transformation of plain tobacco (Nicotiana tabacum L.) with mentioned agrobacteria; selection of Nicotana tabacum L. transgenic callus. Following the success of the Agrobacterium tumefaciens conjugation with E.coli strain (containing killer plasmid pART27-KillK2) and successful transformation of model N.tabacum plant with A.tumefaciens, there was used the PCR method to check out the killer effect of it. PCR and DNA electrophoresis showed that KillK2 gene is incorporated into plant genome and there is weak expression of this gene. However there was not found the promoter of couliflower mosaic virus CaMV 35S upstream this gene. In the previous studies, it was considered that the expression of mentioned transformed gene exist only when the transcription of it is directly regulated by alcoholdehidrogenase ADH1 promoter. However after investigation it was shown that promoter ADH1 isn’t connected to beginning of gene KillK2. There is the possibility that both ADH1 and CaMV35S promoters are remote from the beginning of KillK2 gene, or the iniciation is done by... [to full text]

In this project the effect of viral infection on the metabolism of nitrogenous compounds in tobacco plants (Nicotiana tabacum L. cv. Petit Havana SR1) was studied. The tobacco plants were infected with Potato virus Y, strain NTN, ELISA confirmed the presence of the virus. Enzymes that participate in C4 plants in Hatch-Slack cycle fosfoenolpyruvate carboxylase (EC 4.1.1.31, PEPC), NADP-dependent malic enzyme (EC 1.1.1.40, NADP-ME), pyruvate, phosphate dikinase (EC 2.7.9.1, PPDK) are present also in C3 plants and are related to plant responses to stress conditions. As a result of viral infection, the activities of all these enzymes were increased. Infection caused by PVYNTN decreased activity of nitrate reductase (EC 1.7.1.1, NR), an enzyme catalyzing reduction of nitrates to nitrites. The activity of enzymes catalyzing the synthesis of glutamine from glutamate and ammonium ions: glutamine synthetase (EC 6.3.2.1, GS) and glutamate synthase (EC 1.4.1.14, GOGAT) was enhanced. In addition to this main route of nitrogen fixation the plant can still use glutamate dehydrogenase (EC 1.4.1.2, GDH). This enzyme can also catalyze the opposite reaction, deamination of glutamate. The direction of response depends on environmental conditions. In this case a significant increase of oxidative-deaminating activity...

A produção de fumo na região sul do Brasil, mais precisamente no Estado do Rio Grande do Sul (RS), exerce grande importância na atividade econômica e social. Na área econômica, o fumo é responsável pela arrecadação de grandes somas em impostos. No campo social, a atividade fumageira é grande geradora de empregos diretos e indiretos. Os agricultores que trabalham nas lavouras de fumo estão em constante contato com a planta. Consequentemente, estes trabalhadores se expõem tanto aos compostos orgânicos e inorgânicos presentes nas folhas, como aos pesticidas naturais e sintéticos relacionados. “Green tobacco sickness” (GTS) é conhecida como risco ocupacional à saúde de trabalhadores do campo no plantio de tabaco. Os sintomas têm sido atribuídos ao envenenamento agudo por nicotina seguido por contato dermal com as folhas do fumo. Contudo autores salientam que os efeitos sinérgicos da nicotina e dos pesticidas devem ser examinados. Neste trabalho utilizou-se Cantareus aspersus com o objetivo de identificar a ação genotóxica e/ou mutagênica das folhas de Nicotiana tabacum através da exposição dermal. O caracol terrestre tem sido utilizado nos últimos anos devido a sua fácil aclimatação e manipulação em laboratório e por sua sensibilidade e resistência aos testes de genotoxicidade. Nestes animais foram realizados testes de biomonitoramento de exposição: Ensaio Cometa e quantificação dos elementos químicos pela técnica PIXE; bem como, testes de biomonitoramento de efeito: Teste de Micronúcleo e quantificação do Citocromo P450. Nosso estudo dosou a quantidade de nicotina na água, exposta à superfície da folha, por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e realizou “screening” fitoquímico de N. tabacum. Trinta moluscos terrestres foram expostos a diferentes tratamentos: dez expostos a folhas de tabaco sem pesticida; dez expostos a folhas de tabaco com pesticida e dez expostos a folhas de Lactuca sativa L. (grupo controle). Células da hemolinfa foram coletadas após 0, 24, 48 e 72 horas de exposição, o dano ao DNA foi avaliado pelo Ensaio Cometa em todos os períodos e a freqüência de micronúcleos somente em 72 horas. Resultados significativos foram encontrados nos grupos expostos a folhas de fumo, através do Ensaio Cometa, no período de 24, 48 e 72 horas de exposição e em 72 horas através doTeste de Micronúcleos, quando comparados ao grupo controle. Não houve diferença significativa entre caracóis expostos a folhas de fumo com e sem pesticida, portanto, podemos afirmar que o pesticida flumetralin não contribuiu com os danos ao DNA observados. “Screening” fitoquímico revelou presença de alcalóide, cumarina, traços de saponina e flavonóides. Inibição da atividade da enzima do Citocromo P450 ocorreu somente no grupo exposto a folhas de fumo sem pesticida. Doze elementos inorgânicos diferentes foram quantificados nas folhas de tabaco e nos caracóis expostos a folhas sem pesticida e, dez nos caracóis expostos a folhas com pesticida. Por cromatografia foram dosados 0,02% de nicotina por folha. A presença de alcalóides (nicotina), cumarinas, saponinas, flavonóides e diferentes metais provavelmente influenciaram o efeito mutagênico e genotóxico em C. aspersus expostos ao fumo. Estes efeitos possivelmente tenham sido causados pela complexa mistura presente nas folhas que podem interagir produzindo efeitos sinérgicos, antagônicos ou influenciando a absorção de um dado composto. As enzimas do sistema Citocromo P450 em C. aspersus expostos a folhas de fumo sem veneno podem ter sido inibidas pela nicotina, pelos flavonóides e pelo cobre. Por fim, nosso estudo providencia dados biológicos e químicos sobre C. aspersus expostos à folha de fumo e confirma a sensibilidade do Ensaio Cometa e do Teste de Micronúcleos na avaliação de misturas complexas, indicando associação entre nicotina, cumarina e interação flavonóide/metal (principalmente cobre e ferro) como principais causadores de dano ao DNA em células de hemolinfa do molusco terrestre C. aspersus por folhas de N. tabacum. / Tobacco production in southern Brazil, precisely in Rio Grande do Sul state (RS) play a major role in economic and social activity. Tobacco farmers are routinely exposed to complex mixtures present in tobacco leaves including organic and inorganic compounds. Green tobacco sickness (GTS) is a form of nicotine poisoning that affects workers who have direct dermal contact with tobacco plants during cultivation and harvesting. However, some authors suggest that the synergistic effects of nicotine and pesticide should be examined. The purpose of this study was to evaluate the genotoxic and mutagenic effect of tobacco leaves, with and without exposure to flumetralin in Cantareus aspersus through dermal exposure. The land mollusk was utilized because of its easy acclimatization and manipulation in the laboratory and for its sensibility and resistance in genotoxicity tests. Biomonitoring exposure test was performed on these animals: Comet Assay and chemical elements quantification by PIXE; biomonitoring tests for effects were also carried out: Micronuclei Test and cytochrome P450 quantification. Nicotine dosage was performed in water exposed to the surface of tobacco leaves, by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and screening phytochemistry in Nicotiana tabacum. Thirty land mollusks were exposed to different treatments; ten snails to tobacco leaves with pesticide; ten to tobacco leaves without pesticide and ten snails exposed to lettuce leaves (control group). Hemolymph cells were collected after 0, 24, 48 and 72 hours, the DNA damage was evaluated by single cell gel assay for all these periods, and the frequency of micronuclei only in 72h. Significant results were found in groups exposed to tobacco leaves during 24, 48 and 72 hours of exposure by Comet Assay and by Micronucleus Test when compared to the control group. No difference was observed between different periods or between exposure to leaves with and without pesticide. This result shows that no genotoxic effect can be attributed to pesticide. Chemical results found alkaloid, coumarin, saponin traces, flavonoids and different metals. Inhibition of cytochrome P450 enzymes occurs only in the group without pesticide. Twelve inorganic elements were found in tobacco leaves and in snails exposed to tobacco leaves without pesticide. Ten inorganic elements were found in tobacco leaves with pesticide. Nicotine dosage found 0.02% of this alkaloid per leaf. The presence of coumarin, saponin traces, flavonoids, alkaloid (nicotine) and different metals probably causes genotoxic effects on land mollusks exposed to tobacco leaves with and without pesticide. This induction of DNA damage by dermal exposure to tobacco leaves was caused by a complex mixture present in the leaves. The enzymes of cytochrome P450 systems were inhibited by nicotine, flavonoids and copper. Our study provided chemical and biological data on C. aspersus exposed to tobacco leaves. The results of our study confirm the sensibility of the Comet Assay and Micronucleus Test for the evaluation of the complex mixture, indicating an association between nicotine, coumarin and flavonoid/metal interaction (mainly copper and iron) as the main causes of DNA damage in hemolymph cells from the land mollusk C. aspersus by N. tabacum.

Este trabajo de tesis pretende profundizar el conocimiento de las vacuolas asociadas a la senescencia (VAS) a través de tres temáticas: - el desarrollo, entendido como la variación temporal de las VAS, su biogénesis y el efecto de moduladores de la senescencia; - la caracterización de la actividad biológica de las VAS participando en el desmantelamiento del aparato fotosintético; - y la relación entre el mecanismo de autofagia y el desarrollo de las VAS. En general, para abordar estos objetos de estudios se empleó un sistema sencillo y frecuentemente empleado en trabajos sobre senescencia foliar. El modelo de senescencia inducida permite trabajar en un sistema relativamente homogéneo y reproducible. Consiste en separar las hojas de la planta, tratarlas con un precursor de la hormona etileno, denominado etefón, y almacenarlas en oscuridad. De esta manera, la senescencia es inducida por el corte y la oscuridad, y sincronizada a nivel tisular por el tratamiento hormonal.

A produção de fumo na região sul do Brasil, mais precisamente no Estado do Rio Grande do Sul (RS), exerce grande importância na atividade econômica e social. Na área econômica, o fumo é responsável pela arrecadação de grandes somas em impostos. No campo social, a atividade fumageira é grande geradora de empregos diretos e indiretos. Os agricultores que trabalham nas lavouras de fumo estão em constante contato com a planta. Consequentemente, estes trabalhadores se expõem tanto aos compostos orgânicos e inorgânicos presentes nas folhas, como aos pesticidas naturais e sintéticos relacionados. “Green tobacco sickness” (GTS) é conhecida como risco ocupacional à saúde de trabalhadores do campo no plantio de tabaco. Os sintomas têm sido atribuídos ao envenenamento agudo por nicotina seguido por contato dermal com as folhas do fumo. Contudo autores salientam que os efeitos sinérgicos da nicotina e dos pesticidas devem ser examinados. Neste trabalho utilizou-se Cantareus aspersus com o objetivo de identificar a ação genotóxica e/ou mutagênica das folhas de Nicotiana tabacum através da exposição dermal. O caracol terrestre tem sido utilizado nos últimos anos devido a sua fácil aclimatação e manipulação em laboratório e por sua sensibilidade e resistência aos testes de genotoxicidade. Nestes animais foram realizados testes de biomonitoramento de exposição: Ensaio Cometa e quantificação dos elementos químicos pela técnica PIXE; bem como, testes de biomonitoramento de efeito: Teste de Micronúcleo e quantificação do Citocromo P450. Nosso estudo dosou a quantidade de nicotina na água, exposta à superfície da folha, por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e realizou “screening” fitoquímico de N. tabacum. Trinta moluscos terrestres foram expostos a diferentes tratamentos: dez expostos a folhas de tabaco sem pesticida; dez expostos a folhas de tabaco com pesticida e dez expostos a folhas de Lactuca sativa L. (grupo controle). Células da hemolinfa foram coletadas após 0, 24, 48 e 72 horas de exposição, o dano ao DNA foi avaliado pelo Ensaio Cometa em todos os períodos e a freqüência de micronúcleos somente em 72 horas. Resultados significativos foram encontrados nos grupos expostos a folhas de fumo, através do Ensaio Cometa, no período de 24, 48 e 72 horas de exposição e em 72 horas através doTeste de Micronúcleos, quando comparados ao grupo controle. Não houve diferença significativa entre caracóis expostos a folhas de fumo com e sem pesticida, portanto, podemos afirmar que o pesticida flumetralin não contribuiu com os danos ao DNA observados. “Screening” fitoquímico revelou presença de alcalóide, cumarina, traços de saponina e flavonóides. Inibição da atividade da enzima do Citocromo P450 ocorreu somente no grupo exposto a folhas de fumo sem pesticida. Doze elementos inorgânicos diferentes foram quantificados nas folhas de tabaco e nos caracóis expostos a folhas sem pesticida e, dez nos caracóis expostos a folhas com pesticida. Por cromatografia foram dosados 0,02% de nicotina por folha. A presença de alcalóides (nicotina), cumarinas, saponinas, flavonóides e diferentes metais provavelmente influenciaram o efeito mutagênico e genotóxico em C. aspersus expostos ao fumo. Estes efeitos possivelmente tenham sido causados pela complexa mistura presente nas folhas que podem interagir produzindo efeitos sinérgicos, antagônicos ou influenciando a absorção de um dado composto. As enzimas do sistema Citocromo P450 em C. aspersus expostos a folhas de fumo sem veneno podem ter sido inibidas pela nicotina, pelos flavonóides e pelo cobre. Por fim, nosso estudo providencia dados biológicos e químicos sobre C. aspersus expostos à folha de fumo e confirma a sensibilidade do Ensaio Cometa e do Teste de Micronúcleos na avaliação de misturas complexas, indicando associação entre nicotina, cumarina e interação flavonóide/metal (principalmente cobre e ferro) como principais causadores de dano ao DNA em células de hemolinfa do molusco terrestre C. aspersus por folhas de N. tabacum. / Tobacco production in southern Brazil, precisely in Rio Grande do Sul state (RS) play a major role in economic and social activity. Tobacco farmers are routinely exposed to complex mixtures present in tobacco leaves including organic and inorganic compounds. Green tobacco sickness (GTS) is a form of nicotine poisoning that affects workers who have direct dermal contact with tobacco plants during cultivation and harvesting. However, some authors suggest that the synergistic effects of nicotine and pesticide should be examined. The purpose of this study was to evaluate the genotoxic and mutagenic effect of tobacco leaves, with and without exposure to flumetralin in Cantareus aspersus through dermal exposure. The land mollusk was utilized because of its easy acclimatization and manipulation in the laboratory and for its sensibility and resistance in genotoxicity tests. Biomonitoring exposure test was performed on these animals: Comet Assay and chemical elements quantification by PIXE; biomonitoring tests for effects were also carried out: Micronuclei Test and cytochrome P450 quantification. Nicotine dosage was performed in water exposed to the surface of tobacco leaves, by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and screening phytochemistry in Nicotiana tabacum. Thirty land mollusks were exposed to different treatments; ten snails to tobacco leaves with pesticide; ten to tobacco leaves without pesticide and ten snails exposed to lettuce leaves (control group). Hemolymph cells were collected after 0, 24, 48 and 72 hours, the DNA damage was evaluated by single cell gel assay for all these periods, and the frequency of micronuclei only in 72h. Significant results were found in groups exposed to tobacco leaves during 24, 48 and 72 hours of exposure by Comet Assay and by Micronucleus Test when compared to the control group. No difference was observed between different periods or between exposure to leaves with and without pesticide. This result shows that no genotoxic effect can be attributed to pesticide. Chemical results found alkaloid, coumarin, saponin traces, flavonoids and different metals. Inhibition of cytochrome P450 enzymes occurs only in the group without pesticide. Twelve inorganic elements were found in tobacco leaves and in snails exposed to tobacco leaves without pesticide. Ten inorganic elements were found in tobacco leaves with pesticide. Nicotine dosage found 0.02% of this alkaloid per leaf. The presence of coumarin, saponin traces, flavonoids, alkaloid (nicotine) and different metals probably causes genotoxic effects on land mollusks exposed to tobacco leaves with and without pesticide. This induction of DNA damage by dermal exposure to tobacco leaves was caused by a complex mixture present in the leaves. The enzymes of cytochrome P450 systems were inhibited by nicotine, flavonoids and copper. Our study provided chemical and biological data on C. aspersus exposed to tobacco leaves. The results of our study confirm the sensibility of the Comet Assay and Micronucleus Test for the evaluation of the complex mixture, indicating an association between nicotine, coumarin and flavonoid/metal interaction (mainly copper and iron) as the main causes of DNA damage in hemolymph cells from the land mollusk C. aspersus by N. tabacum.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by wesley oliveira leite (leite.wesley@yahoo.com.br) on 2009-09-11T14:41:32Z No. of bitstreams: 1 2008_IsabelaTristanLourenco.pdf: 848788 bytes, checksum: 214c95dbc0900473fba14a30a8fbb720 (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-07-27T16:43:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_IsabelaTristanLourenco.pdf: 848788 bytes, checksum: 214c95dbc0900473fba14a30a8fbb720 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-07-27T16:43:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_IsabelaTristanLourenco.pdf: 848788 bytes, checksum: 214c95dbc0900473fba14a30a8fbb720 (MD5) Previous issue date: 2008-10 / Fitonematóides são responsáveis por grandes perdas econômicas na agricultura mundial estimadas em US$ 125 bilhões anuais. Esses fitopatógenos têm seu ciclo de vida dividido em seis estádios de desenvolvimento (ovo, juvenil 1-4 e adulto), durando em torno de 28 dias. O juvenil 2 penetra na raiz de planta hospedeira por força mecânica e degradação enzimática para estabelecer a interação planta-patógeno e se diferenciar em fêmea adulta apomítica, depositando em torno de 2000 ovos. Práticas agronômicas têm tido geralmente pouco sucesso e alto custo, sendo o cultivo de variedades resistentes, quando existentes, a forma mais eficiente de controle. Uma estratégia alternativa promissora é a transformação genética de plantas para expressão de moléculas que afetem o parasitismo. A metodologia de RNA interferente tem revolucionado a pesquisa experimental e muitas aplicações biotecnológicas estão sendo desenvolvidas. A abordagem planejada é a transformação genética de icotiana tabacum com construções plasmidiais para expressão de RNA dupla fita, tendo como propósito o silenciamento dos genes-alvo Isocitrato Liase, Arginina Quinase, Proteína 14-3-3 e Proteína de choque térmico 90 de Meloidogyne incognita. Desses genes-alvo, quatro fragmentos gênicos foram selecionados, isolados, subclonados em vetor para RNAi e estão em fase de transformação de planta, para futura realização de bioensaios avaliação de resistência a fitonematóides. Adicionalmente, foi realizada uma análise da expressão dos quatro genes-alvo, normalizados com os genes constitutivos de β- actina e 18S rRNA, por PCR quantitativo em tempo real. Observou-se que alguns genes-alvo são diferencialmente expressos quando comparados as fases de ovo, juvenil 2 e fêmea. A maior diferença de expressão foi do gene codificador de Isocitrato Liase, que é 100 vezes mais expresso em ovo e fêmeas, comparado com J2. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Plant parasitic nematodes are responsible for huge economic losses in world agriculture that reaches US$ 125 billion yearly. The most important of these phytopatogens, Meloidogyne incognita, has six developmental stages during the life cycle (egg, four juveniles and female). The juvenile 2 enters the host root via mechanical force and enzymatic degradation to establish the host-pathogen interaction and differentiate in apomitic adult female, which deposits 2000 eggs. Current agronomic practices have usually been unsuccessful and expensive, so the cultivation of resistant varieties is actually the most efficient way to control nematodes. In this work, it was chosen to transform icotiana tabacum using plasmidial constructions for double strand RNA expression, aiming silencing target genes Isocitrate Lyase, Arginine Kinase, 14-3-3 Protein and Heat Shock Protein 90 of Meloidogyne incognita. Four regions of target genes were selected, isolated, subcloned in RNAi vector and are being used for plant transformation. In addition, it was done an expression analysis of the four target genes, normalized with housekeeping genes β- actin e 18S rRNA, using quantitative real time PCR. This experiment showed that these genes are differentially expressed when compared during egg, J2 and female phases. The major expression difference observed was the Isocitrate Lyase gene, which is a hundred times more expressed in egg or female when compared with J2.

A eritropoietina (EPO) é um hormônio que pertence a um grupo de fatores de crescimento hematopoiético, controlando a proliferação e a diferenciação de células da medula óssea. Ela age induzindo a elevação da produção de células vermelhas, aumentando a quantidade de hemoglobina e o oxigênio circulante. Este hormônio é principalmente secretado pelo rim, e é amplamente usado na medicina no tratamento de anemias, desordens renais e cardíacas, tumores e diversas outras doenças. A EPO recombinante tem sido produzida em células de mamíferos (COS-1 e CHO) em culturas in vitro e tem sido expressa experimentalmente em células de insetos, leveduras e bactérias. Até o momento, há somente uma descrição da expressão transgênica desta proteína em plantas sem, no entanto, sucesso na regeneração de plantas saudáveis e férteis. No presente trabalho, plantas transgênicas de arroz (Oryza sativa) e tabaco (Nicotiana tabaccum) contendo o gene da EPO foram geradas, nas quais foi avaliada a expressão gênica e detectada a presença da proteína recombinante. O gene recombinante da EPO utilizado foi sintetizado baseado na técnica de “overlapping” de nucleotídeos. Um fragmento de 582 pb correspondente ao cDNA da EPO foi clonado e submetido a seqüenciamento automático. Uma mutação no nucleotídeo 252 (G A) foi identificada, o que não modificou o aminoácido codificado pelo códon, uma glicina. O fragmento foi transferido para o vetor de expressão pWUbi.tm1, o qual contém o promotor do gene da ubiquitina e o terminador tm1'. Este cassete de expressão foi transferido para o vetor binário pWBVec4a, que foi transformado nas cepas AGL1 e LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens. Estas cepas foram utilizadas na transformação de arroz e de tabaco, respectivamente. A integração do transgene no genoma da planta foi comprovada por PCR. A expressão da EPO nas plantas de tabaco foi detectada por RT-PCR convencional e quantitiativa, e a presença da proteína foi avaliada por SDS-PAGE e Western blot, provando o sucesso da obtenção de plantas transgênicas de tabaco expressando EPO. Foi obtida por auto-fecundação a geração T1, a qual apresentou segregação mendeliana. Nenhuma das plantas avaliadas apresentou qualquer tipo de deformidade ou mal-formação. Não foi possível a obtenção de plantas de arroz transgênicas devido à deficiência das mesmas no processo de regeneração, possivelmente em conseqüência da super-expressão do transgene em função do promotor escolhido. / Erythropoietin (EPO) is a hormone that belongs to a group of growth hematopoeitic factors, which control the proliferation and differentiation of marrow bone´s cells. It acts inducing the production of blood red cells, increasing the amount of circulating hemoglobin and oxygen. This hormone, mostly secreted by kidneys, is widely used in medicine as a treatment for anaemia, kidney and heart disorders, tumors and numerous diseases. Recombinant EPO has been produced in mammalian cells (COS-1 and CHO) cultured in vitro and has been also experimentally inserted into insect, yeast and bacterial cells. Up to now, to the best of our knowledge, there is only one description of transgenic expression of this protein in plants but without success in the generation of healthy, fertile plants. In the present work we evaluated the expression of human EPO in plants such as rice (Oryza sativa) and tobacco (Nicotiana tabaccum). The recombinant EPO gene was synthesized based on the nucleotide “overlapping” technique. A fragment of 582 bp corresponding to the EPO cDNA was cloned and then submitted to automatic sequencing. At that time, a mutation on nucleotide 252 (G A) was identified. It did not modify the encoded amino acid of the codon, a glycine. This fragment was transferred to the expression vector pWUbi.tm1, armed with the promoter of the ubiquitin gene and the terminator tm1’. This expression cassette was transferred to the binary vector pWBVec4a, which was then transformed into strains ALG1 and LB4404 of Agrobacterium tumefaciens. These strains were employed in the transformation of rice and tobacco, respectively. Transgenic integration into plant genomes was evaluated by PCR. The expression of EPO in tobacco plants was detected by conventional and quantitative RTPCR and the presence of the protein was evaluated by SDS-PAGE and western blot, successfully proving the generation of transgenic tobacco plants expressing EPO. By selfcrossing it was obtained a collection of T1 plants, which presented mendelian segregation of the transgene, and none of the plants presented any kind of miss-formation or deformity. It was not possible to obtain rice transgenic plants due to their deficiency in the regeneration process, possibly due to the transgene over-expression driven by the ubiquitin promoter.

119 f.:il / Submitted by JURANDI DE SOUZA SILVA (jssufba@hotmail.com) on 2013-03-22T13:13:24Z No. of bitstreams: 6 dissertacaocarmoledinapt 6.pdf: 1646302 bytes, checksum: 79de50acc1c94381c2b17a9839618893 (MD5) dissertacaocarmoledinapt 5.pdf: 3009238 bytes, checksum: 2bf5502c2e18d8f6cdde3f8b8d51c8bf (MD5) dissertacaocarmoledinapt 4.pdf: 5084844 bytes, checksum: 572923dca3a0ead79b5abbbdf2d8a249 (MD5) dissertacaocarmoledinapt 3.pdf: 5860730 bytes, checksum: 4f6bb1a0c2280aaf1a290fbea2f4cf68 (MD5) dissertacaocarmoledinapt 2.pdf: 6362133 bytes, checksum: 325f4f1d2b21d00225a3d41723a8f883 (MD5) dissertacaocarmoledinapt 1.pdf: 3722597 bytes, checksum: 489b4912180c41689ae0f9b41e3f6ba5 (MD5) / Approved for entry into archive by Lêda Costa(lmrcosta@ufba.br) on 2013-04-18T12:30:32Z (GMT) No. of bitstreams: 6 dissertacaocarmoledinapt 6.pdf: 1646302 bytes, checksum: 79de50acc1c94381c2b17a9839618893 (MD5) dissertacaocarmoledinapt 5.pdf: 3009238 bytes, checksum: 2bf5502c2e18d8f6cdde3f8b8d51c8bf (MD5) dissertacaocarmoledinapt 4.pdf: 5084844 bytes, checksum: 572923dca3a0ead79b5abbbdf2d8a249 (MD5) dissertacaocarmoledinapt 3.pdf: 5860730 bytes, checksum: 4f6bb1a0c2280aaf1a290fbea2f4cf68 (MD5) dissertacaocarmoledinapt 2.pdf: 6362133 bytes, checksum: 325f4f1d2b21d00225a3d41723a8f883 (MD5) dissertacaocarmoledinapt 1.pdf: 3722597 bytes, checksum: 489b4912180c41689ae0f9b41e3f6ba5 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-18T12:30:32Z (GMT). No. of bitstreams: 6 dissertacaocarmoledinapt 6.pdf: 1646302 bytes, checksum: 79de50acc1c94381c2b17a9839618893 (MD5) dissertacaocarmoledinapt 5.pdf: 3009238 bytes, checksum: 2bf5502c2e18d8f6cdde3f8b8d51c8bf (MD5) dissertacaocarmoledinapt 4.pdf: 5084844 bytes, checksum: 572923dca3a0ead79b5abbbdf2d8a249 (MD5) dissertacaocarmoledinapt 3.pdf: 5860730 bytes, checksum: 4f6bb1a0c2280aaf1a290fbea2f4cf68 (MD5) dissertacaocarmoledinapt 2.pdf: 6362133 bytes, checksum: 325f4f1d2b21d00225a3d41723a8f883 (MD5) dissertacaocarmoledinapt 1.pdf: 3722597 bytes, checksum: 489b4912180c41689ae0f9b41e3f6ba5 (MD5) Previous issue date: 2009 / A presente dissertação revela a investigação prático-teórica em processos criativos utilizando como material a Nicotiana Tabacum (folhas e o fumo de corda) e outros tipos de cordas no processo criativo através de técnicas diferenciadas, fundamentada na, poïetica traduzindo-se em resultados de uma pesquisa em arte. A fenomenologia da percepção dos objetos encontrados na memória do eu coletivo gera uma poética, baseada em elementos e materiais, com significados plásticos conceituais a partir da estética do odor na construção da obra de arte; sustentados principalmente, por conceitos de filósofos e pensadores como Gilles Deleuze, Luigi Pareyson, Merleau-Ponty, René Passeron e Sandra Rey. O método experimental de diafanização e cortes histológicos permitiu submeter a matéria às variações de textura, cor, brilho, volume, resistência, durabilidade observando os resultados e utilizando-se de conhecimentos científicos da folicular Nicotiana tabacum dos pesquisadores Kraus, Arduin, Silva e colaboradores, para diálogo da descrição harmônica da matéria em relação as idéia. Esse resultado refere-se à conquista do sentido social da obra de arte,utilizando-se de materiais e texturas de que o artista se vale para representar e transmitir suas convicções intelectuais e políticas, enraizadas na história da cultura baiana, onde se ligue identidade e contemporaneidade. / Salvador