A Doença de Parkinson, uma condição neurodegenerativa e progressiva, está relacionada à morte de neurônios localizados na Substância Negra compacta, um dos componentes dos Núcleos da Base. Quando há a morte de neurônios dopaminérgicos nigrais, esta via modulatória é perdida, levando ao desequilíbrio entre as vias direta e indireta, esta última tendo sua atividade aumentada em detrimento da outra. O estriado tem um papel importante no recebimento e filtração de sinais motores corticais e talâmicos e suas maiores populações neuronais são GABAérgicas, demonstrando a importância do neurotransmissor GABA nesta modulação. O estriado recebe projeções dopaminérgicas vindas da Substância Negra compacta e, na falta desta aferentação, surgem os sintomas e sinais da Doença de Parkinson. Nosso objetivo é caracterizar a liberação de GABA nesta estrutura, avaliando os efeitos de outros transmissores e também o papel de alguns sinalizadores intracelulares neste processo. Para isto, empregamos o método de superfusão e liberação de GABA radiomarcado, previamente carregado, em tecido picado in vitro. A lesão nigral é produzida por cirurgia estereotáxica e microinjeção de 6-OHDA no feixe medial prosencefálico (mfb). Diversas drogas foram utilizadas para avaliarmos diferentes passos na liberação do transmissor. Concluímos que a liberação é fortemente dependente de cálcio e segue o modelo de exocitose vesicular, além de a subpopulação neuronal GABAérgica estrital estudada sofrer pouca influência de aferências glutamatérgicas e colinérgicas. No entanto, drogas dopaminérgicas regulam complexamente a liberação de GABA no estriado e ela também é bastante dependente de calmodulina. Conjecturamos se algumas drogas antipsicóticas que agem sobre calmodulina devem seu efeito terapêutico, ou parte dele, a esta ação e se, no modelo de DP de lesão unilateral por 6-OHDA, há comunicação entre os hemisférios lesado e não lesado após o estabelecimento da lesão e processo de rearranjo neuronal / Parkinsons disease, a progressive and neurodegenerative condition, is related to the death of neurons located in Substantia Nigra compacta, a component of Basal Ganglia. When nigral dopaminergic neurons die, this modulatory pathway is lost leading to imbalance between direct and indirect pathways, the latter having its activity increased over the former. Striatum has an essential role in receiving and filtering motor signals from cortex and thalamus and its major neuronal populations are composed by GABAergic neurons, showing how important is GABA in this modulation. Striatum receives dopaminergic projections from Substantia Nigra compacta and in its absence the typical signals and symptoms of the disease arise. We aimed to characterize GABA relase at this structure, assessing the effect of other transmitters as well the role of some intracellular signaling molecules in this process. For that, we employed the superfusion method and release of preloaded radiolabeled GABA from chopped striatal tissue. Nigral injury was produced by stereotaxic surgery and 6-OHDA microinjection at medial forebrain bundle (mfb). Several drugs were used to evaluate different steps in transmitter release. We concluded that the release is strongly calcium-dependent and follows vesicular exocytosis model; in addition the striatal GABAergic subpopulation of neurons studied here undergo little influence of glutamatergic and cholinergic afferents. However, dopaminergic drugs complexly regulate striatal GABA release and it also shows high involvement of calmodulin. We wonder if some antipsychotic drugs that act over calmodulin owe their therapeutical effects, or at least part of it, to this activity and if in 6-OHDA unilateral lesion parkinsonism model there is communication between injuried and healthy hemispheres after the establishment of the injury and neuronal rearrangement process

O Transtorno da Depressão Maior (MDD) é uma doença muito difundida em todo mundo e com uma alta prevalência, principalmente em mulheres. Transtornos de humor são recorrentes e ameaçam a vida, devido ao risco de suicídio. Apesar disso, a etiologia do MDD ainda é pouco entendida e diversas hipóteses foram desenvolvidas na tentativa de explicá-la. Uma delas está ligada ao estresse. Distúrbios no eixo hipotálamo-hipófiseadrenal (HPA) estão presentes em cerca 70% de pacientes com depressão. Ao buscar um melhor modelo animal para estudo do impacto do estresse no desenvolvimento da depressão, chegamos ao estresse leve crônico (CMS). Em estudos prévios desenvolvidos neste laboratório, observamos que há diferenças entre tipos de estressores e os mediadores secretados na resposta do eixo HPA, isto é, durante o estresse físico é secretado o mediador vasopressina, enquanto que no estresse psicológico, é secretado o mediador CRF; já nos estresses considerados mistos (como nado forçado), ambos os mediadores estão presentes. Assim, propusemos estabelecer protocolos de CMS baseados no protocolo original de Paul Willner, pesquisador que desenvolveu este modelo, empregando estressores do tipo físico ou psicológico, separadamente. O que observamos foi que nenhum dos dois tipos de estressores conseguiu levar os animais à anedonia (queda na preferência por sacarose). No entanto, ao observar o ganho de peso dos animais ao longo do tempo e o mapeamento cerebral com citocromo c oxidase, notamos que o estresse teve seu impacto no animais. Comparados a outros modelos de depressão, o CMS tem a premissa de desenvolver um estado depressivo nos animais antes do teste com drogas antidepressivas, fazendo com que tenha uma alta validade preditiva. Ele também pode incorporar outros endpoints para avaliar outros comportamentos, além da anedonia, que possam demonstrar o estado depressivo no animal. Por exemplo, observamos no mapeamento cerebral que a substância negra e a PAG estiveram mais ativas no estresse físico e elas podem estar implicadas na busca por recompensa e na modulação de dor, respectivamente. Concluímos que o modelo de CMS é apropriado, embora ainda necessite de estudos quanto à equivalência de intensidade de estressores / Major Depressive Disorder (MDD) is a widespread disease all over the world with a high prevalence, especially among women. Mood disorders are recurrent and life threatening, due to suicide risk. Despite those, MDD etiology is poorly understood and several hypotheses have been developed to try and explain it. One of them is connected to stress. Disorders on the hypothalamus-pituitary-adrenal (HPA) axis are present in up to 70% of patients with depression. While searching for a better animal model to study the impact that stress might have on depression onset, we came across the Chronic Mild Stress (CMS) model. During previous studies developed in this lab, weve observed that there are differences between types of stressors and mediators involved in the HPA axis response, i.e. during physical stress, the mediator secreted is vasopressin, whereas during psychological stress, the mediator is CRF; on mixed stress (like forced swim), both mediators are present. That way, we proposed to set up CMS protocols based on Paul Willner (the researcher who developed this model)s original one, employing physical or psychological stressors separately. None of the types of stressors were able to induce anhedonia (decrease in sucrose preference) in the animals. However, noticing the animals weight gain over time, and cerebral mapping with cytochrome c oxidase, we could see that stress had impact over the animals. Compared to other depression models, CMS has the presupposition of leading the animals to a depressive-like state before testing antidepressant drugs, which gives it a high predictive validity. The model can also incorporate different endpoints to assess other behaviors, besides anhedonia, that may show the animals depressive-like state. For instance, we observed in the brain mapping that substantia nigra and PAG were more activated in physical stress and they can be implicated in reward seeking and pain modulation, respectively. So, we conclude that the CMS model is appropriate, although it still needs more research regarding the intensity of stressors equivalence

A dieta intermitente (DI), quando não causa desnutrição, expõe os organismos a um estresse nutricional moderado que estimula as proteínas de estresse e os mecanismos de defesa do organismo, tornando-o mais resistente a estímulos tóxicos. A DI atua em vias associadas à sobrevivência celular e à inflamação, envolvendo com isso a modulação do NF-<font face=\"Symbol\">kB. Porém, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares associados a estes efeitos, assim como o envolvimento de vias como a do CREB e da WNT, além de sua correlação com a sinalização inflamatória. Este projeto tem como objetivo avaliar os efeitos da DI na cognição e hipocampo de ratos na ausência ou presença de LPS. Os resultados mostraram que a DI melhora o desempenho dos animais nos testes comportamentais labirinto de Barnes e esquiva inibitória. Ainda, a DI induz um aumento de pCREB e da sinalização canônica da WNT e promove o aumento da razão IL-10 / TNF e a diminuição dos níveis de RNAm do Tlr-4, Nosi e Cox-2 no hipocampo. Os dados sugerem que a DI induz um predomínio das vias de sinalização protetoras no SNC de ratos. / The intermittent fasting (IF) protocol, when it does not cause malnutrition, induces a moderate nutritional stress to the organism which stimulates the stress proteins and the body\'s defense mechanisms, making it more resistant to toxic stimuli. The IF seems to act by mechanisms associated with cell survival and inflammation, thereby involving NF-<font face=\"Symbol\">kB modulation. However, little is known about the molecular mechanisms involved, as well as the participation of CREB and WNT pathways and its correlation with inflammatory signaling. This study investigates the effects of IF on cognition and on rat hippocampus in absence or presence of LPS. The results showed that IF improved performance in Barnes maze and inhibitory avoidance behavioral tests. Also, IF induced both increase of pCREB and canonical WNT signaling pathway, and decrease in inflammatory mRNA markers levels, such as Tlr-4, iNos and Cox-2. In addition, IF can also increase IL-10 / TNF ratio levels. Our results suggest that IF induces a prevalence of protective signaling pathways in the central nervous system.

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Los objetivos principales de esta Tesis doctoral fueron: 1) cuantificar los efectos agudos y crónicos de fármacos opiáceos (mi-, delta- y kappa-selectivos) así como los cambios inducidos durante los estados de abstinencia (procesos de tolerancia y dependencia) sobre la vía de señalización del receptor Fas (formas de expresión de Fas, proteína de acople FADD y caspasas efectoras) en cerebro de rata; 2) identificar el tipo de receptor opioide involucrado en la modulación del complejo de señalización Fas/FADD mediante la utilización de ratones deficientes en receptores opioides (mi-, delta- y kappa-KO), e investigar la posible existencia de un tono opioide endógeno regulando las proteínas de esta vía en el cerebro; 3) averiguar si la modulación del complejo Fas y/o FADD por fármacos opiáceos implica (como mecanismo molecular) la participación de MAPK ERK1/2, analizando la reversión de un efecto opioide tras inhibición selectiva de los enzimas MEK1/2, tanto "in vitro" (PD98059) en células SH-SY5Y, como "in vivo" (SL 327) en cerebro de rata; 4) cuantificar en cerebro humano "postmortem" el estatus de la vía Fas/FADD y caspasas efectoras, así como los componentes de la vía de señalización del AMPc (AC/PKA/CREB) y de las MAPK (Ras/Raf/MEK/ERK) en la corteza prefrontal de adictos a opiáceos, como modelo experimental más directo al problema de la adicción en humanos.Las diversas proteínas de estudio se cuantificaron mediante técnicas inmunológicas cuantitativas (separación electroforética seguida de Western blot) empleando anticuerpos específicos. Los principales resultados y conclusiones mayores de este trabajo de Tesis doctoral son:1. La adicción a opiáceos en cerebro de rata se asocia con incrementos en la densidad del receptor apoptótico Fas y con decrementos de la proteína FADD, transductora de la señal de muerte, sin que además se alteren las caspasas efectoras 8 y 3, lo que sugiere que los procesos de adicción a estos fármacos no están asociados con la inducción de apoptosis cerebral mediados por esta vía.2. La modulación de Fas (receptor nativo) por opiáceos depende mayormente del receptor mi-opioide, y la regulación de sus formas agregadas (trímeros relevantes en el inicio de la señalización) así como la de FADD se asocia con el receptor delta-opioide, lo que demuestra una modulación diferencial de los componentes de esta vía por el sistema opioide que podría tener repercusiones terapéuticas.3. La modulación inhibitoria de FADD por agonistas delta-opiáceos es dependiente, a través de un mecanismo indirecto, de la activación de las quinasas MAPK ERK1/2, vía de señalización que a su vez se ha relacionado con la regulación de varios mecanismos anti-apoptóticos. 4. La adicción a opiáceos en cerebro humano se asocia con una disminución en la densidad de FADD en la corteza prefrontal (efectos a corto y largo plazo) sin que se alteren las diversas formas del receptor Fas y ciertas caspasas efectoras, lo que de nuevo demuestra una probable menor actividad de esta proteína acopladora de Fas en este modelo humano de adicción a opiáceos. 5. La adicción a opiáceos en cerebro humano (efectos a largo plazo) también se asocia con una aparente normalización de los componentes de la vía de señalización del AMPc (AC I, PKA, CREB y pCREB) y con una marcada inhibición de la vía de las MAPK (formas fosforiladas de MEK y de ERK1/2), lo que sugiere la inducción de alteraciones de plasticidad neuronal en estos cerebros humanos.En su conjunto, los resultados de esta Tesis demuestran la clara participación del complejo Fas/FADD en la adicción a opiáceos, tanto en los procesos de tolerancia como de dependencia física, lo que añade un nuevo nivel de complejidad a la señalización de los receptores opioides, probablemente mediatizando efectos no-apoptóticos relacionados con fenómenos de plasticidad neuronal. / The aim of this PhD work was to investigate the interactions between opioids receptors and the signaling pathway of the Fas/FADD (Fas Associated-Death Domain) receptor, involved in the regulation of apoptosis and neuronal plasticity. The main results and conclusions are: 1) opiate addiction in rat brain is associated with a strong up-regulation of the pro-apoptotic Fas receptor and a moderate down-regulation of the anti-apoptotic Bcl-2 oncoprotein, without altering the content of caspases-8/3, suggesting that possible apoptotic signals engaged by Fas activation would be offset by decreased signal transduction through FADD and effector caspases-8/3; 2) the mi-opioid receptors appears to be associated with a tonic stimulation of monomeric Fas receptor, whereas the delta-opioid receptors tonically inhibits the basal density of trimeric Fas as well as that of FADD. This suggests posible homeostatic interactions between mi- and delta-opioid receptors in the control of Fas receptor machinery, being a major task of the delta-receptor to restrain the activation of Fas signalling; 3) the direct involvement of the two MAP kinases (sequential activation of MEK and ERK) in the in vivo regulation of FADD by the opiate; 4) opiate addiction in human brain is associated with a down-regulation of the inmunodensity of FADD in the prefrontal cortex (short-term and long-term abuse) without altering Fas receptor and effector caspases-8/3; 5) opiate addiction in human brain (long-term abuse) is associated with a normal regulation of the components of the cyclic AMP pathway components (AC I, PKA, CREB, pCREB) and with an important down-regulation of the MAPK (specially pMEK and pERK) pathway components in the prefrontal cortex, suggesting alterations in the neuronal plasticity in those human brains. In summary, the results of this PhD work demonstrated a clear participation of the complex Fas/FADD in opiate addiction, suggesting a new level of complexity in the signaling mediated through the activation of opioids receptors, probably mediating non-apoptotic effects related with neuronal plasticity.

A dieta intermitente (DI), quando não causa desnutrição, expõe os organismos a um estresse nutricional moderado que estimula as proteínas de estresse e os mecanismos de defesa do organismo, tornando-o mais resistente a estímulos tóxicos. A DI atua em vias associadas à sobrevivência celular e à inflamação, envolvendo com isso a modulação do NF-<font face=\"Symbol\">kB. Porém, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares associados a estes efeitos, assim como o envolvimento de vias como a do CREB e da WNT, além de sua correlação com a sinalização inflamatória. Este projeto tem como objetivo avaliar os efeitos da DI na cognição e hipocampo de ratos na ausência ou presença de LPS. Os resultados mostraram que a DI melhora o desempenho dos animais nos testes comportamentais labirinto de Barnes e esquiva inibitória. Ainda, a DI induz um aumento de pCREB e da sinalização canônica da WNT e promove o aumento da razão IL-10 / TNF e a diminuição dos níveis de RNAm do Tlr-4, Nosi e Cox-2 no hipocampo. Os dados sugerem que a DI induz um predomínio das vias de sinalização protetoras no SNC de ratos. / The intermittent fasting (IF) protocol, when it does not cause malnutrition, induces a moderate nutritional stress to the organism which stimulates the stress proteins and the body\'s defense mechanisms, making it more resistant to toxic stimuli. The IF seems to act by mechanisms associated with cell survival and inflammation, thereby involving NF-<font face=\"Symbol\">kB modulation. However, little is known about the molecular mechanisms involved, as well as the participation of CREB and WNT pathways and its correlation with inflammatory signaling. This study investigates the effects of IF on cognition and on rat hippocampus in absence or presence of LPS. The results showed that IF improved performance in Barnes maze and inhibitory avoidance behavioral tests. Also, IF induced both increase of pCREB and canonical WNT signaling pathway, and decrease in inflammatory mRNA markers levels, such as Tlr-4, iNos and Cox-2. In addition, IF can also increase IL-10 / TNF ratio levels. Our results suggest that IF induces a prevalence of protective signaling pathways in the central nervous system.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Os efeitos da melatonina (Mel) in vivo foram estudados no sistema dopaminÃrgico nigroestriatal de ratos, utilizando um modelo experimental da doenÃa de Parkinson que consiste na injeÃÃo intraestriatal da neurotoxina 6-hidroxidopamina (6-OHDA). Ratos Wistar, machos (200-250g) foram submetidos a lesÃo unilateral com 6-OHDA, tratados com melatonina nas doses de 2, 5, 10 e 25 mg/kg, i.p. 1 hora apÃs a lesÃo e depois, diariamente durante 7 dias, quatro semanas apÃs a lesÃo, foi realizado o teste rotacional e 24 horas depois os animais foram sacrificados, os seus cÃrebros dissecados e os estriados direito (ipsilateral â lado lesionado) e esquerdo (contralateral â lado nÃo lesionado) utilizados para dosagens de monoaminas em HPLC e ensaios de binding dopaminÃrgico. Para as dosagens de malonildialdeÃdo (MDA), os animais foram sacrificados no oitavo dia apÃs a lesÃo. Os resultados demonstraram que a injeÃÃo intraestriatal de 6-OHDA diminuiu cerca de 77 à 85% os conteÃdos das monoaminas e dos seus metabÃlitos no lado ipsilateral quando comparado com o lado contralateral nos controles. O tratamento com melatonina, nas doses estudadas, reverteu parcialmente as diminuiÃÃes causadas pela lesÃo com 6-OHDA nos nÃveis destes neurotransmissores, e os conteÃdos se aproximaram de 50% daqueles observados nos lados contralaterais dos controles ou dos grupos tratados com melatonina. A Mel foi mais eficiente na dose de 5 mg/kg, i.p., e os efeitos foram similares entre as doses mais baixas e as mais altas, caracterÃstica de um tipo de resposta com a curva em forma de sino. O prÃ-tratamento e o tratamento crÃnico com melatonina na dose que obteve o melhor efeito tambÃm foram estudados, o tratamento crÃnico promoveu uma melhor recuperaÃÃo dos nÃveis de monoaminas enquanto os efeitos do prÃ-tratamento foram similares aos do grupo Mel 5 mg/kg, durante 7dias. O comportamento rotacional induzido pela apomorfina (3 mg/kg) foi bloqueado em cerca de 60, 89, 78 e 47% nos grupos tratados com melatonina nas doses de 2, 5, 10 e 25 mg/kg, i.p., respectivamente. O tratamento crÃnico bloqueou o comportamento rotacional em cerca de 96% e o prÃ-tratamento 86%. A melatonina (5 mg/kg) produziu uma upregulation dos receptores D1 (Bmax: 277,8+/-25,8) associada com uma diminuiÃÃo nos valores do Kd (1,5+/-0,1) quando comparado ao controle (Bmax:194,8+/-19,0; Kd:2,9+/-0,38). Um efeito similar foi observado com o tratamento com NAS (Bmax: 245,3+/-27,6; Kd: 1,1+/-0,28), precursor da melatonina. Foi verificado um aumento nos nÃveis de MDA, nos controles (127%), quando comparado com o grupo falso operado (104%), o tratamento com melatonina (106%) recuperou esses nÃveis à valores prÃximos do normal, sugerindo uma aÃÃo antioxidante da melatonina in vivo. Os resultados apresentados podem indicar uma aÃÃo neuroprotetora da melatonina e sugerem um possÃvel papel no tratamento de doenÃas neurodegenerativas causadas pelo estresse oxidativo, como a doenÃa de Parkinson. / The present work studied the neuroprotective effects of melatonin In vivo on the nigrostriatal dopaminergic system in rats after a unilateral 6-hydroxydopamine (6-OHDA) lesions in rat striatum. Results showed that the intrastriatal injection of 6-OHDA significantly decreases DA, DOPAC and HVA levels. Although there is also a decrease in 5-HT levels no changes were observed in 5-HIAA levels as compared to controls. On the other hand, melatonin (2, 5, 10 and 25 mg/kg, i.p., daily for 7 days) treatment starting 1 h after 6-OHDA lesions, partially reverses the decreases caused by 6-OHDA lesions on these neurotransmitter levels, and contents were brought to approximately 50% of that observed in the contralateral sides of controls or the melatonin treated group. Melatonin was more efficient at the doses of 5 and 10 mg/kg, i.p., and effects were similar between the lowest and highest doses characteristic of a bell-shaped type of response. Pretreatment and cronic treatment with melatonin at the 5mg/kg dose were also tested, cronic treatment promoted a recovey of monoamines levels more efficiently while the pretreatment effects were similar to the melatonin treatment at the dose of the 5mg/kg for 7 days. The apomorphine-induced rotational behavior (3 mg/kg, i.p.) was blocked by 60, 89, 78 and 47% after the doses of 2, 5, 10 and 25 mg/kg, i.p., respectively. Similarly, in this case the doses of 5 and 10 mg/kg were also more efficient. The cronic treatment blocked the rotational behavior by 86%. Melatonin (5mg/kg) produced an upregulation of D1 receptors associated with a decrease in Kd value. While no change was observed in maximum density of D2 receptors, the Kd value was also decreased, a similar effect was observed with its precursor N-acetylserotonin. Compared with sham-operated and expressed as a ratio relative to the contralateral side, there was an increase in the lipid peroxidation product malondialdehyde (MDA, 127%) on controls which was restored to normal levels on the melatonin treated group, suggesting the in vivo action of melatonin as an antioxidant. The present results may indicate a neuroprotective action of melatonin and suggest a possible role in the treatment of oxidative stress-induced neurodegenerative disease such as Parkinsonâs disease.

O Transtorno da Depressão Maior (MDD) é uma doença muito difundida em todo mundo e com uma alta prevalência, principalmente em mulheres. Transtornos de humor são recorrentes e ameaçam a vida, devido ao risco de suicídio. Apesar disso, a etiologia do MDD ainda é pouco entendida e diversas hipóteses foram desenvolvidas na tentativa de explicá-la. Uma delas está ligada ao estresse. Distúrbios no eixo hipotálamo-hipófiseadrenal (HPA) estão presentes em cerca 70% de pacientes com depressão. Ao buscar um melhor modelo animal para estudo do impacto do estresse no desenvolvimento da depressão, chegamos ao estresse leve crônico (CMS). Em estudos prévios desenvolvidos neste laboratório, observamos que há diferenças entre tipos de estressores e os mediadores secretados na resposta do eixo HPA, isto é, durante o estresse físico é secretado o mediador vasopressina, enquanto que no estresse psicológico, é secretado o mediador CRF; já nos estresses considerados mistos (como nado forçado), ambos os mediadores estão presentes. Assim, propusemos estabelecer protocolos de CMS baseados no protocolo original de Paul Willner, pesquisador que desenvolveu este modelo, empregando estressores do tipo físico ou psicológico, separadamente. O que observamos foi que nenhum dos dois tipos de estressores conseguiu levar os animais à anedonia (queda na preferência por sacarose). No entanto, ao observar o ganho de peso dos animais ao longo do tempo e o mapeamento cerebral com citocromo c oxidase, notamos que o estresse teve seu impacto no animais. Comparados a outros modelos de depressão, o CMS tem a premissa de desenvolver um estado depressivo nos animais antes do teste com drogas antidepressivas, fazendo com que tenha uma alta validade preditiva. Ele também pode incorporar outros endpoints para avaliar outros comportamentos, além da anedonia, que possam demonstrar o estado depressivo no animal. Por exemplo, observamos no mapeamento cerebral que a substância negra e a PAG estiveram mais ativas no estresse físico e elas podem estar implicadas na busca por recompensa e na modulação de dor, respectivamente. Concluímos que o modelo de CMS é apropriado, embora ainda necessite de estudos quanto à equivalência de intensidade de estressores / Major Depressive Disorder (MDD) is a widespread disease all over the world with a high prevalence, especially among women. Mood disorders are recurrent and life threatening, due to suicide risk. Despite those, MDD etiology is poorly understood and several hypotheses have been developed to try and explain it. One of them is connected to stress. Disorders on the hypothalamus-pituitary-adrenal (HPA) axis are present in up to 70% of patients with depression. While searching for a better animal model to study the impact that stress might have on depression onset, we came across the Chronic Mild Stress (CMS) model. During previous studies developed in this lab, weve observed that there are differences between types of stressors and mediators involved in the HPA axis response, i.e. during physical stress, the mediator secreted is vasopressin, whereas during psychological stress, the mediator is CRF; on mixed stress (like forced swim), both mediators are present. That way, we proposed to set up CMS protocols based on Paul Willner (the researcher who developed this model)s original one, employing physical or psychological stressors separately. None of the types of stressors were able to induce anhedonia (decrease in sucrose preference) in the animals. However, noticing the animals weight gain over time, and cerebral mapping with cytochrome c oxidase, we could see that stress had impact over the animals. Compared to other depression models, CMS has the presupposition of leading the animals to a depressive-like state before testing antidepressant drugs, which gives it a high predictive validity. The model can also incorporate different endpoints to assess other behaviors, besides anhedonia, that may show the animals depressive-like state. For instance, we observed in the brain mapping that substantia nigra and PAG were more activated in physical stress and they can be implicated in reward seeking and pain modulation, respectively. So, we conclude that the CMS model is appropriate, although it still needs more research regarding the intensity of stressors equivalence

A Doença de Parkinson (DP) é um distúrbio neurodegenerativo. Suas características e seus sintomas neuropatológicos são bem definidos, mas sua etiologia ainda continua desconhecida. A DP esporádica é caracterizada anatomo-patologicamente pela presença de Corpos de Lewy, que são agregados lipoproteicos que se encontram no interior do neurônio. A <font face=\"Symbol\">a-sinucleína é uma proteína solúvel presente nos terminais pré-sinápticos de vários sistemas de transmissão. Evidências sugerem que esta proteína é um componente fundamental dos Corpos de Lewy localizados nos neurônios dopaminérgicos do sistema nigroestrital de pacientes portadores de DP. Postula-se que a <font face=\"Symbol\">a-sinucleína possui uma função fundamental na patogênese da DP, pois pode afetar a homeostase de neurônios dopaminérgicos, levando ao aumento da dopamina no citosol e consequente estresse oxidativo. O fator de transcrição nuclear kappa B (NF-<font face=\"Symbol\">kB) participa da regulação de respostas imunes, inflamatórias e morte celular. No sistema nervoso central este fator está presente em diversos tipos de células nervosas e seu papel é paradoxal, ora apontado como neurotóxico, ora como neuroprotetor. O NF<font face=\"Symbol\">kB pode ser estimulado por vários fatores entre eles neurotransmissores (por exemplo: dopamina e glutamato), estresse e proteína <font face=\"Symbol\">b-amilóide. Neste trabalho, pretendemos estudar as modificações moleculares nas células SH-SY5Y transduzidas com a <font face=\"Symbol\">a-sinucleína na sua forma selvagem (WT), mutante (A30P) e truncada (1-120) e tratadas com meio condicionado (CM) (proveniente do tratamento da glia com LPS) ou TNF. Analisamos a modulação da atividade do NF-<font face=\"Symbol\">kB, onde observamos o aumento da atividade quando as células foram tratadas com TNF mas não com CM. Ainda, observamos que ocorre diminuição da fosforilação da proteína MAPK42/44 durante o mesmo tratamento, e que esta diminuição pode estar ligada ao aumento da morte celular. / Parkinsons Disease (PD) is a neurodegenerative disease. The characteristics and symptoms are well defined; nevertheless its etiology remains unknown. The sporadic PD is characterized by the presence of Lewy Body (aggregate of proteins) inside the neurons. Alpha-synuclein is a soluble protein present in the pre synaptic terminal of neurons. Evidences suggest that this protein is a fundamental component of Lewy bodies localized in the dopaminergic neurons of PD patients. It is already known that alpha-synuclein has a fundamental role in pathogenesis of PD, because it can affect the homeostasis of dopaminergic neurons, leading to increase of dopamine in the cytosol and consequent oxidative stress. The nuclear transcription factor kB (NF-<font face=\"Symbol\">kB) regulates the immune, inflammatory and cell death responses. In the central nervous system, this factor is present in several types of cells and its role is paradoxal, since it can be neurotoxic or can be protective. The NF<font face=\"Symbol\">kB can be stimulated by several factors, including dopamine, glutamate, stress and <font face=\"Symbol\">b-amyloid protein. In this work, we observed the molecular modification in SH-SY5Y cells transduced with alpha-synuclein (wild-type, A30P and truncated 1-120) and treated with conditioned medium (CM) (from primary culture of glia treated with LPS) or TNF. We analyzed the modulation of NF-<font face=\"Symbol\">kB activity, in which was observed that the activity was increased when the cells were treated with TNF but not with CM. Moreover, we show that there is a decrease of MAPK42/44 phosphorilation during the treatment, and this decrease is linked to the increase of cell death of these cells overexpressing alpha-synulein.

A enzima Na+, K+-ATPase é uma proteína de membrana altamente conservada em eucariotos, capaz de gerar um gradiente eletroquímico, fundamental para o balanço osmótico das células, o potencial de repouso das membranas e a propriedade excitatória das células musculares e nervosas. Além de seu papel regulatório na homeostasia iônica, desempenha um papel na transdução de sinal e na ativação de transcrição gênica, modulando na presença de ouabaína o crescimento celular, migração e morte celular programada. A Ouabaína (OUA) é um esteróide cardiotônico, produzido no córtex da adrenal e no hipotálamo. Em linhas gerais, a sinalização da Na+, K+-ATPase promovida pela OUA parece ativar vias associadas à modulação de fatores de transcrição como a via da Src, MAPK, Ca2+ e NF-<font face=\"Symbol\">kB. Evidências indicam que o NF-<font face=\"Symbol\">kB exerça algum tipo de modulação na via canônica do WNT, no entanto os mecanismos moleculares ainda são desconhecidos. A via de sinalização WNT desempenha função importante na embriogênese e na homeostase de tecidos adultos. Assim, o objetivo do presente projeto é verificar se a administração intrahipocampal de OUA é capaz de modular a atividade das vias canônicas do NF-<font face=\"Symbol\">kB e da WNT. Estas vias foram estudadas em um decurso temporal imediato (1 -2 horas) e tardio (10, 24 e 48 horas) utilizando técnicas como Western Blotting, RT-PCR e EMSA. Os resultados encontrados mostram que a OUA (10 nM) foi capaz de ativar a via de sinalização NF-<font face=\"Symbol\">kB, após 1 hora, 10, 24 e 48 horas. A OUA também foi capaz de ativar a via canônica do WNT, sendo que após 10 horas ocorreu aumento da proteína pGSK-3<font face=\"Symbol\">b, enquanto que em 24 horas, observamos aumento da translocação nuclear da <font face=\"Symbol\">b-CATENINA. Além disso, pode-se verificar aumento de BDNF ao longo de todo o decurso temporal. / The enzyme Na+,K+-ATPase is an integral membrane protein, highly conserved in eukaryotes, that establishes the electrochemical gradient across the plasma membrane, which is essential to maintain the osmotic balance of cells, the resting membrane potential and the excitatory property of nerve and muscle cells. Besides its role in ion homeostasis, several recent studies suggest that this pump may also act as a signal transducer and transcription activator involved in cell growth, differentiation and programmed cell death. Ouabain (OUA), the ligand of Na+,K+-ATPase, is a steroid derivative that is produced by the adrenal cortex and hypothalamus. After OUA binding, the Na+,K+-ATPase signaling seems to activate pathways such as Src, MAPK, NF-<font face=\"Symbol\">kB and Ca2+. Some evidences indicate a possible crosstalk between the NF-<font face=\"Symbol\">kB signaling pathway and the canonical WNT pathway, however the molecular mechanisms are still unknown. The canonical WNT play important roles during embryogenesis and in adult tissue homeostasis. The aim of this project is to verify if the intrahipocampal administration of OUA is able to modulate the activity of the canonical pathways of NF-<font face=\"Symbol\">kB and WNT. Both pathways were studied after 1 and 2 hours, and after 10, 24 and 48 hours by methods such Western blot, RT-PCR and Electrophoretic mobility shift assays. The results show that the OUA (10 nM) was able to activate the signaling pathway NF-<font face=\"Symbol\">kB after 1, 10, 24 and 48 hours. The OUA was also able to activate the canonical WNT pathway, since after 10 hours there was an increased in pGSK-3<font face=\"Symbol\">b protein, whereas in 24 hours, we observed increased nuclear translocation of <font face=\"Symbol\">b-CATENIN. Moreover, we found increased levels of BDNF throughout the time course.