Les télomères sont des séquences d’ADN, généralement répétées en tandem, localisées à l’extrémité des chromosomes linéaires. Une des fonctions principales des télomères est de différencier l’extrémité des chromosomes des cassures double-brin, et ainsi de prévenir l’activation des voies de réparation de l’ADN. Chez les mammifères, cette fonction est plus spécifiquement assurée par le complexe shelterin. Il s’agit d’un complexe hétérogène composé de six protéines distinctes : TRF1, TRF2, POT1, RAP1, TPP1 et TIN2, qui interagit spécifiquement avec l’ADN télomérique. Au sein de ce complexe, les protéines RAP1 et TRF2 coopèrent afin d’empêcher l’extrémité des chromosomes d’être perçue comme un dommage de l’ADN, ce qui autrement aboutirait à des fusions inter-chromosomiques suite au processus de réparation. La protéine TRF2 se lie directement à la molécule d’ADN dans laquelle elle s’enroule de façon spécifique. Cette propriété est primordiale pour générer une structure d’ADN en forme de boucle, appelée t-loop, et dont le bon fonctionnement des télomères dépend. Les travaux effectués au cours de cette thèse ont mis en évidence deux scenarii indépendants dans lesquels la protéine RAP1 assure un rôle critique dans la stabilité des télomères. Premièrement, RAP1 peut prévenir les fusions inter-chromosomiques dans des cellules exprimant une forme altérée de TRF2 incapable de former des t-loops. Deuxièmement, l’inhibition de RAP1 dans des cellules en sénescence réplicative conduit à l’activation des voies de réparation de l’ADN et à la formation de fusions inter-chromosomiques. Ces observations font écho à des résultats précédents obtenus dans des cellules HeLa traitées avec l’inhibiteur de la télomérase BIBR1532, et dont l’expression de la protéine RAP1 était abolie par shRNA. De plus, j’ai montré que les fusions interchromosomiques engendrées par la perte de RAP1 sont dépendantes de la ligase IV, qui est un acteur principal de la voie de réparation de l’ADN par recombinaison non-homologue (NHEJ). Dans l’ensemble, ces travaux démontrent l’importance de la protéine RAP1 dans la stabilité des télomères lorsque la protéine TRF2 est non fonctionnelle, mais aussi dans des situations physiologiques telles que la sénescence réplicative. / In mammals, the shelterin complex is the guardian of telomere stability. It operates through a set of six proteins (TRF1, TRF2, POT1, RAP1, TPP1 and TIN2) that binds telomeric DNA and protects it from being recognized as DNA double-strand breaks and therefore control DNA repair and DNA damage response pathways. Among them, RAP1 and TRF2 cooperate and together protect chromosome extremities from end-to-end fusions. TRF2 is seen as a major factor to control telomere DNA topology by wrapping DNA around itself in a right handed manner. This property of TRF2 is required to promote the formation of t-loops, special DNA structures at telomeres that are considered as protective barriers to DNA damage response and fusion. Here we demonstrate two independent situations where RAP1 dysfunction is critical for telomere protection. First, in cells expressing a wrapping-deficient TRF2 allele that cannot form t-loops, RAP1 appears as a backup anti-fusion mechanism. Second, RAP1 downregulation in replicative senescent cells leads to telomere fusions and DNA damage response activation. This is consistent with similar observations in HeLa cells treated with the telomerase inhibitor BIBR1532, and in which RAP1 expression was abolished by an inducible shRNA system. In addition, we show that fusions triggered by RAP1 loss are dependent upon ligase IV, which is a key player of the classical non-homologous end-joining (c-NHEJ) repair pathway. Altogether, these results indicate that RAP1 takes over telomere protection when TRF2 cannot properly function or in the normal physiological situation, such as replicative senescence.

Activée par la chimiothérapie, la sénescence est un mécanisme suppresseur de tumeur qui empêche la progression tumorale. Cependant, certaines cellules cancéreuses sont capables d’émerger et de provoquer une rechute clinique. Les mécanismes mis en place par les cellules pour échapper à la sénescence ne sont pas encore clairement connus. Nous avons récemment décrit que les cellules qui échappent à la sénescence résistent à l’anoïkis et sont dépendantes de Mcl-1. Dans cette étude, nous caractérisons plus en détail cette émergence en réponse à l'irinotécan, un traitement de première ligne utilisé dans le cancer colorectal. Nos résultats indiquent que la kinase Aktest activée comme une voie de survie lors de l'étape précoce de la sénescence et qu’elle est également réactivée lors de l’émergence. L'inhibition de la kinase avec le GSK690693 empêche l’émergence et améliore l’efficacité du traitement, à la fois in vitro et in vivo. Cette amélioration a été corrélée à l'inhibition de la sénescence et l’activation concomitante de l'apoptose via l’inactivation de Mcl-1 par Noxa. De plus, en utilisant des cellules p21Waf1 déficientes, nous avons confirmé que la voie p53-p21, principal régulateur de la sénescence, favorise l’émergence. A l’inverse, son inhibition améliore l'efficacité du traitement par induction de l'apoptose. Ces résultats mettent en évidence que l'inhibition d’Akt améliore l’efficacité de l’irinotécan et empêche l'émergence de cellules persistantes en diminuant la sénescence au profit de la réponse apoptotique. Par conséquent, nous proposons que l’utilisation d’inhibiteurs d’Akt en thérapies séquentielles devrait être considérée dans le futur pour améliorer le traitement des cancers colorectaux réfractaires à l’irinotécan. / Activated by chemotherapy, senescence is a tumor suppressive mechanism that prevents tumor progression. However, some cancer cells can emerge to induce clinical relapse. The mechanisms set up by cells to escape senescence are not yet clearly known. We have recently described that cells that escape senescence are more transformed than non treated parental cells ; they resist anoikis and depend on Mcl-1. In this study, we further characterize this emergence in response to irinotecan, a first line treatment used in colorectal cancer. Our results indicate that the Akt kinase was activated as a feedback pathway during the early step of senescence and also during emergence. Inhibition of the kinase with GSK690693 prevented cell emergence and improved treatment efficacy, both in vitro and in vivo. This improvement was correlated with senescence inhibition, p21waf1 down regulation and a concomitant activation of apoptosis due to Noxa upregulation and Mcl-1 inactivation. Indeed, Noxa inactivation prevented apoptosis and increased the number of emergent cells. Moreover, using p21waf1-deficient cells, we further confirmed that an intact p53-p21-senescence pathway favored cell emergence and that its down regulation improved treatment efficacy through apoptosis induction. These results highlight that Akt inhibition improves irinotecan treatment and prevent cell emergence by switching the senescence response to apoptosis. Therefore, we propose that use of Akt inhibitors in sequential therapies should be considered in future to improve the treatment of irinotecan-refractory colorectal cancers.

Zelluläre Seneszenz wird als terminaler Zellzyklusarrest definiert, der mit dem Altern und funktionellen Verlust von Geweben verknüpft ist. Eine Seneszenzreaktion wird ebenso durch Onkogene und zytotoxischen Stress verursacht. Die Ausführung des Seneszenzprogramms wird durch eine zeitlich hochdynamische Aktivität von Transkriptionsfaktoren (TF) bedingt. Interessanterweise kann die Zelllinienzugehörigkeit einer Zelle durch die Expression von linien-aberranten TF überschrieben werden. Die vorliegende Arbeit untersucht Chemotherapie-induzierte Seneszenz (TIS) in Bcl-2 überexprimierenden, deshalb vor Apoptose geschützten, murinen Eµ-Myc B-Zell Lymphomen in An- oder Abwesenheit der Seneszenz-essentiellen Histonmethyltransferase Suv39h1. Analysen auf Transkriptom- und auf Proteinebene ergeben dabei, dass in einer Seneszenz-spezifischen Weise die TF AP-1, PU.1 und C/EBPβ induziert werden, welche normalerweise für die Funktion und Entwicklung myeloischer Zelllinien bedeutend sind. Dementsprechend korreliert der Seneszenzzustand mit Transkripten, Oberflächenmarkern und einer enzymatischen Funktion der myeloischen Linie. Indem die identifizierten TFs heruntergeschaltet oder überexprimiert werden, wird ihre direkte Beteiligung an der Linienuntreue der TIS Lymphome demonstriert. TIS-Kapazität wird als für den Erfolg von Krebstherapie günstige Eigenschaft betrachtet, da sie zu einem Wachstumsblock führt. Nichtsdestotrotz können sich verweilende TIS Zellen krebsbiologisch auch nachteilig auswirken. Anhand von murinen und humanen, klinisch annotieren Transkriptomdatensätzen kann hier in beiden Spezies ein myeloisch verschobenes, Linienuntreue anzeigendes Genexpressionsprofil mit einer besseren Überlebensprognose korreliert werden. Die vorliegenden Befunde legen nahe, dass die Modulation von TF Aktivitäten in Seneszenz einen potentiellen therapeutischen Angriffspunkt darstellt, um den für den Therapieerfolg nützlichen Zweig des TIS Phänotyps zu befördern. / Cellular senescence is regarded as an irreversible cell cycle arrest associated with tissue aging and its functional decline. A senescence response is also evoked by oncogenic and cytotoxic stress. The execution of the senescence program relies on a highly dynamic sequence of transcription factor (TF) activities. Interestingly, cell lineage commitment can be overridden by the expression of lineage-aberrant TFs. This thesis examines chemotherapy-induced senescence (TIS) in Bcl-2 overexpressing, thus apoptosis-protected, murine Eμ-Myc B-cell lymphomas with or without the senescence-essential histone methyltransferase Suv39h1. Transcriptome as well as protein level analyses reveal senescence-specific induction of the TFs AP-1, PU.1 and C/EBPβ which are typically crucial for myeloid lineage commitment and function. Correspondingly, the senescent state associates with myeloid lineage transcripts, surface markers and enzymatic function, reminiscent of, but not equal to a transdifferentiation phenotype. By knocking down and overexpressing the identified TFs, we demonstrate their direct involvement in the lineage infidelity of TIS lymphomas. TIS-capacity is viewed as beneficial to cancer therapy outcome due to its block on proliferation. However, lingering TIS cells can also be detrimental due to the acquisition of latent stemness properties or tumor-protective remodeling of their microenvironment. By interrogating murine and human, clinical course-annotated transcriptome data sets, an association between a myeloid-skewed, lineage infidelity indicating gene expression profile and better tumor prognosis is established in both species. The presented findings suggest that modulation of the senescent TF activities could be therapeutically exploited to foster the cancer patient-beneficial branch of the TIS phenotype.

Le matériel génétique contenant l'information des cellules humaines se présente sous forme de chromosomes linéaires dont l'extrémité est protégée par une structure appelée télomères. Les télomères correspondent à une séquence d'ADN répétée, recouverte de protéines spécifiques, qui permettent aux cellules d'étiqueter l'extrémité de leurs chromosomes afin de les différencier des cassures internes de l'ADN nécessitant une réparation. Ainsi, ils jouent un rôle prépondérant dans la protection du génome. Les chromosomes sont organisés et compartimentés dans le noyau de la cellule. Cette organisation est primordiale, la proximité des chromosomes à la membrane nucléaire qui délimite ce noyau est essentielle pour de nombreuses fonctions régulatrices du génome, comme l'activation et la répression des gènes contenant les informations. A chaque division cellulaire, cette organisation est perdue après le désassemblage de la membrane nucléaire et la condensation de la chromatine qui va permettre de correctement répartir les chromosomes entre les cellules filles. Après la division, les noyaux des cellules filles se reforment, la membrane nucléaire est rétablie, et les chromosomes sont repositionnés comme dans la cellule mère. Ce mécanisme de mémoire spatiale est encore inconnu mais est vital au maintien de la stabilité du génome. Une large proportion de télomères sont ancrés à la membrane nucléaire en fin de division, et y restent durant la reformation du noyau. Le laboratoire s'intéresse à cette association afin de caractériser son rôle pendant cette phase clé du cycle cellulaire. Nous cherchons à comprendre ce fonctionnement chez les cellules normales et les cellules de patients atteints de pathologies associées au vieillissement accéléré. Ce projet de thèse à pour but de comprendre l'impact d'une déformation de la membrane nucléaire sur le matériel génétique, et sur l'intégrité des télomères qui protègent l'information génétique. Nous utilisons des techniques de pointe de microscopie, et de biologie cellulaire et moléculaire afin de mieux comprendre le lien entre l'organisation du noyau et le maintien de la stabilité du génome. / The material that contains genetic information of human cells consists in linear chromosomes. The extremities of chromosomes are protected by a specific structure called telomeres. Telomeres are made of repeated DNA sequence, covered by special proteins that prevent cells to recognize extremities of their chromosomes as internal DNA break, thus not to perform unnecessary repair that will result in genome instability. Therefore, telomeres play a major role in genome protection. Chromosomes are spatially organized in the cell nucleus. This organization is important as positioning of chromosomes in the nucleus ensures proper regulatory functions of the genome, such as activation or repression of genes. During the cell division process, this organization is lost after nuclear membrane disassembly and the condensation of DNA, to allow correct segregation of chromosomes between daughter cells. After cell division, the nuclei of daughter cells are reformed, and nuclear membrane is reconstructed. The chromosomes are then relocated as in the mother cell. This mechanism of spatial memory is not well understood yet, but is key to maintain stability of the genome. A large proportion of telomeres are anchored to the nuclear membrane at the end of mitosis, and stay during nuclear envelope reformation. Our laboratory focuses on characterizing the role of telomere anchoring during this important phase of cell cycle. In particular, we want to understand this mechanism in normal cells and cells from patients with premature aging disease. This thesis aims to understand the impact of nuclear envelope abnormalities on the genetic material, in particular on telomere integrity, as telomeres protect genetic information. Here, we use microscopy approaches and techniques of molecular and cellular biology to better understand the link between nuclear organisation and genome stability maintenance.

Cellular senescence is a distinct cell state, characteristic by cessation of cell proliferation and it is accompanied by specific morphological and biochemical alterations. Increasing and persisting incidence of senescence cells has been shown to have detrimental effect on an organism largely contributing to its ageing. Senescent cells also positively support tumour growth and can even stimulate carcinogenic transformation of surrounding cells. Moreover, senescence can be induced even in tumour cells spontaneously or by chemotherapy. Regardless of an initial stimuli and type of cells, there are two main senescence inducing pathways p16/pRb and p53/p21. Both senescent cells as well as senescent cancer cells seems to have modified apoptotic signalling at the level of mitochondria and Bcl-2 family proteins. In this study, we aimed to analyse effect of senescent state as well as pre-senescent (growth arrested state) induced by p16/pRb and p53/p21 signalling pathways on the response of H28 mesothelioma cancer cells-derived clonal cultures to various cell death-inducing stimuli. By inducible expression of p16 and p21 proteins in doxycycline-dependent manner, we forced cells to acquire senescent-like phenotype, which we detailly characterised. Our results showed that senescent-like phenotype, manifests...

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Diabetes mellitus is hallmarked by accelerated atherosclerosis, a major cause of mortality among patients with diabetes. Efficient therapies for diabetes-associated atherosclerosis are absent. Accelerated atherosclerosis in diabetic patients is associated with reduced endothelial thrombomodulin (TM) expression and impaired activated protein C (aPC) generation. Here, we directly compared the effects of high glucose and oxidized LDL, revealing that high glucose induced more pronounced responses in regard to maladaptive unfolded protein response (UPR), senescence, and vascular endothelial cell barrier disruption. Ex vivo, diabetic ApoE mice displayed increased levels of senescence and UPR markers within atherosclerotic lesions compared with nondiabetic ApoE mice. Activated protein C pretreatment maintained barrier permeability and prevented glucose-induced expression of senescence and UPR markers in vitro. These data suggest that high glucose-induced maladaptive UPR and associated senescence promote vascular endothelial cell dysfunction, which—however—can be reversed by aPC. Taken together, current data suggest that reversal of glucose-induced vascular endothelial cell dysfunction is feasible.

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