As flavoproteinas AhpF (Alquil Hidroperoxido Redutase subunidade F) e TrxR (Tiorredoxina Redutase) sao membros da familia piridina dissulfeto redutase e possuem atividade dissulfeto redutase as custas de NAD(P)H. A proteina TrxR e responsavel pela reducao de Tiorredoxina (Trx) que participa do ciclo catalitico de grande parte das enzimas da familia peroxirredoxina, alem de outras enzimas. AhpF e dedicada a reducao de AhpC, (Alquil Hidroperoxido Redutase subunidade C) uma peroxirredoxina exclusiva de bacterias, AhpC e AhpF juntas formam sistema AhpR (Alquil Hidroperoxido Redutase). AhpF possui dois dominios, Trx-like (N-terminal) e TrxR-like (C-terminal); sendo que a ultima possui alta similaridade de estrutura e sequencia a TrxR. De forma interessante AhpF possui atividade NADH-oxidase formadora de H2O2, enquanto TrxR nao possui. Provavelmente pequenas mudancas na sua estrutura contribuem para essa diferenca. A atividade NADH-oxidase esta presente em algumas flavoproteinas e esta geralmente centrada no anel de isoaloxazina do cofator FAD. Este anel quando no estado radicalar e chamado de semiquinona. A semiquinona pode estar protonada ou desprotonada, sendo que a ultima forma e relacionada com atividades oxidase e oxigenase de maneira geral, mas ainda nao existem regras claras a respeito da reatividade de flavoproteinas com o oxigenio. Para elucidar quais poderiam ser essas diferencas, nos clonamos os genes para as proteinas TrxR, AhpC e AhpF da bacteria fitopatogenica Xylella fastidiosa e os expressamos em Escherichia coli. Reconstituimos com sucesso o sistema AhpR in vitro, medindo o consumo de H2O2 na presenca de AhpC, AhpF e NADH atraves de eletrodos especificos para peroxido. Da mesma forma caracterizamos a atividade NADH-oxidase de AhpF medindo o consumo de oxigenio e a producao de peroxido de hidrogenio. Alem disso, demonstramos que a atividade NAD(P)H-oxidase e ausente em TrxR atraves de ensaios de consumo de NADH. A expressao de somente o dominio C-terminal de AhpF manteve a atividade NADH-oxidase como na proteina selvagem, levando a crer que sao diferencas no motivo TrxR-like que disparam a atividade NADH-oxidase. Analisando a sobreposicao de estruturas tridimensionais de AhpF e TrxR disponiveis no PDB em conjunto com o alinhamento de sequencia de aminoacidos destas proteinas em diferentes organismos, identificamos tres possiveis candidatos que poderiam estar envolvidos na atividade NADH-oxidase. Atraves de mutacao sitio dirigida, identificamos que a retirada do residuo de histidina entre o motivo CXXC de AhpF fez o mutante AhpF H347T apresentar metade da atividade especifica NADHoxidase. Da mesma forma a mutacao reversa em TrxR, adicionando o residuo de histidina no motivo CXXC levou a TrxR T142H apresentar uma atividade especifica significativamente maior que a TrxR selvagem. Os dados em conjunto sugerem que o residuo de histidina por sua natureza polar e relevante para a desprotonacao do anel de izoaloxazina do FAD, e a sua consequente reatividade com o oxigenio, sendo um fator importante para a atividade NADH-oxidase presente em AhpF / The flavoproteins AhpF (Alkylhydroperoxide reductase subunit F) and TrxR (Thioredoxin Reductase) are members of the nucleotide pyridine disulfide oxidoreductase family and possess disulfide reductase activity at the expense of NAD(P)H. The TrxR protein is responsible for the reduction of thioredoxin (Trx), which is used in the catalytic cycle of most peroxiredoxins, among other enzymes. AhpF is dedicated to reducing the bacterial peroxiredoxin AhpC, and together they form the AhpR system (Alkylhydroperoxide reductase system). AhpF has two domains, Trx-like (N-terminal) and TrxR-like (C-terminal); the latter has high of similarity to TrxR. Intriguingly, AhpF has an H2O2-forming NAD(P)H-dependent oxidase activity, while TrxR does not. Slight changes in the structures of these two enzymes probably account for this phenomenon. The NADH-oxidase activity is present in some flavoproteins and is generally centered in the isoalloxazine ring of the FAD cofactor. This ring in its radical state is called a semiquinone, which can be protonated or deprotonated. The deprotonated form is related to oxidase and oxygenase activities, but there are no clear rules as to the reactivity of flavoproteins and molecular oxygen. In order to elucidate these differences, we have cloned genes which code the proteins TrxR, AhpC and AhpF of the phytopathogenic bacteria Xylella fastidiosa and have expressed them in Escherichia coli. We have successfully reconstituted the AhpR system in vitro, measuring the H2O2 decrease in the presence of AhpC, AhpF and NADH, by using specific electrodes. We have similarly characterized the NADH-oxidase activity of AhpF by measuring the decrease in the levels of oxygen and the production of hydrogen peroxide. Furthermore, through assays measuring the consumption of NADH, we have demonstrated that the NAD(P)H-oxidase activity is non-existent in TrxR. The expression of only the C-terminal domain of AhpF showed NADH-oxidase activity similar to the wild-type protein, which indicated that the NADH-oxidase activity occurs due to differences in the TrxR-like motif. By analyzing the superposition of the threedimensional structures of AhpF and TrxR, as well as the alignment of their amino acid sequence in different organisms, we identified three possible candidates which could be involved in NADH-oxidase activity. Through site-directed mutation, we found that the removal of the histidine residue within the CXXC motif of AhpF caused the mutant AhpF H347T to present half of the NADH-oxidase specific activity, when compared to the wild-type protein. Likewise, the reverse mutation in TrxR, adding the histidine residue to the CXXC motif, caused TrxR T142H to have a significantly higher specific activity when compared to the wild-type TrxR. The data suggests that, because of its polar nature, the histidine residue is relevant to the deprotonation of the isoalloxazine ring of FAD and its reactivity to oxygen, and, therefore, is an important factor to the NADHoxidase activity of AhpF

Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de biossensores eletroquímicos baseados na imobilização de duas enzimas diferentes em filmes de polipirrol (PPI) eletrodepositados, a fitase e a polifenol oxidase (PFO), esta última na forma de extrato bruto do fruto de abacate. Como a fitase hidrolisa cataliticamente ácido fítico (AF) em íons fosfatos, foram preparados biossensores por imobilização da enzima sobre filmes de PPI para a detecção indireta de ácido fítico via íons fosfatos. Foram utilizados dois métodos de imobilização; no primeiro, a enzima, fitase, foi imobilizada ao filme de PPI por imersão do filme em uma solução contendo a enzima por um período de 2 h, no segundo, a fitase foi encapsulada em lipossomos de dipalmitoil fosfatidil glicerol (DPPG) e depois foi imobilizada nos filmes de PPI depositados em eletrodos impressos. O segundo método se mostrou melhor para a detecção de ácido fítico, pois levou a um maior alcance linear e um baixo valor de limite de detecção. Neste caso, verificou-se que o DPPG preservou a integridade enzimática e levou a biossensores mais estáveis e sensíveis. Já para a PFO, que catalisa a oxidação de compostos fenólicos a quinonas, foram preparados biossensores para a detecção indireta de catecol. Para esta enzima, foram utilizados três métodos de imobilização: adsorção, ligação cruzada e confinamento, sendo o último que levou a melhores respostas. O método de confinamento consiste na adição da enzima, juntamente com o monômero, à solução de eletropolimerização, quando se procede com a metodologia normal de preparo dos filmes de PPI, que foram caracterizados por: microscopia de força atômica (AFM), microscopia eletrônica de varredura (MEV), espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) e espectroscopia de reflexão e absorção no infravermelho com modulação da polarização (PM-IRRAS). Estas técnicas de caracterização permitiram com que a presença da enzima fosse associada às modificações das características estruturais e morfológicas dos filmes de PPI. / This doctoral thesis reports on the development of electrochemical biosensors based on the immobilization of enzymes phytase and polyphenol oxidase (PPO) (the latter in the form of crude extract of avocado fruit) on electrodeposited polypyrrole films (PPY). As phytase catalytically hydrolyzes phytic acid (PA) in phosphate ions, biosensors were prepared by its immobilization on PPY films for the indirect detection of PA via phosphate ions. In the first method the enzyme was maintained on the PPY film for a period of 2 h, whereas in the second, it was encapsulated in Dipalmitoyl Phosphatidyl glycerol (DPPG) and immobilized on printed electrodes. The second system proved more viable for the detection of PA and showed broader linear range and low detection limit because DPPG preserved the integrity of the enzyme and produced more stable and sensitive biosensors. Regarding PPO, which catalyzes the oxidation of phenolic compounds to quinones, biosensors for the indirect detection of catechol via the formation of quinone in solution were prepared. Three methods of immobilization were used: adsorption, cross-linking and confinement. The latter yielded favorable results in comparison to other methods. The films were characterized by atomic force microscopy (AFM), scanning electron microscopy (SEM) spectroscopy, fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy and reflection absorption and infrared polarization modulation (PM-IRRAS) techniques and revealed the presence of the enzyme and a modification in the structural characteristics and morphology of the films.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Oxidase Alternativa (AOX) em plantas à codificada por uma pequena famÃlia multigÃnica de origem nuclear (DNA genÃmico). Essa famÃlia multigÃnica foi bem estudada em mono e dicotiledÃneas sendo subdividida em duas subfamÃlias: Aox1 e Aox2. Os genes Aox1 sÃo encontrados em mono e eudicotiledÃneas apresentando expressÃo mais relacionada a condiÃÃes de estresses enquanto que os genes Aox2 sÃo encontrados apenas em eudicotiledÃneas com expressÃo constitutiva. VÃrios genes Aox1 e apenas hum gene Aox2 sÃo encontrados na maioria das eudicotiledÃneas estudadas. Nesse trabalho, caracterizou-se a famÃlia multigÃnica da Aox no gÃnero Medicago (Medicago truncatula e Medicago sativa) pertencente à ordem Fabales. Em Medicago truncatula, a famÃlia multigÃnica da Aox foi carcterizada atravÃs de busca por bioinformÃtica em bancos de dados identificando-se 4 genes Aox (Aox1, Aox2a, Aox2b1 e Aox2b2) no genoma dessa espÃcie revelando pela primeira vez uma duplicaÃÃo do gene Aox2b. OligonucleotÃdeos especÃficos desenhados para cada um dos genes foram usados para amplificaÃÃo por PCR, clonagem e seqÃenciamento parcial dos referidos genes em Medicago sativa. A expressÃo gÃnica foi estudada, atravÃs de RT-PCR semiquantitativa, em sementes durante a germinaÃÃo (0, 24 e 48 horas de apÃs embebiÃÃo) e em raÃzes e folhas de Medicago sativa crescidas em meio hidropÃnico de Hoagland e submetidas a diferentes condiÃÃes de estresse (0, 6, 12 e 24 hs apÃs tratamento): controle, Ãcido salicÃlico (0,5 mM), PEG (100 g/L), H2O2 (10 mM) e cisteÃna (0,5 mM). Os resultados revelaram que todos os 4 genes Aox foram detectados em sementes de Medicago sativa, entretanto os genes Aox1, 2b1 e 2b2 apresentaram aumento da expressÃo durante a germinaÃÃo enquanto que o Aox2a mostrou-se constitutivo. Em folhas os genes Aox1, 2a e 2b1 foram detectados em todas as condiÃÃes testadas jà o Aox2b2 foi detectado mais intensamente apenas nas condiÃÃes de estresse. De maneira semelhante ao observado durante a germinaÃÃo os genes Aox1, 2b1 e 2b2 tiveram expressÃo aumentada em resposta a todas as condiÃÃes de estresse. O Aox2a mostrou-se constitutivo, mas foi intensamente expresso. Em raÃzes, todos os genes foram detectados e um perfil semelhante de induÃÃo dos genes Aox1, 2b1 e 2b2 tambÃm foi observado com exceÃÃo do tratamento com PEG onde apenas Aox1 foi induzido. O Aox2a tambÃm se mostrou constitutivo, mas foi fracamente expresso. Com a finalidade de se compreender melhor a co-expressÃo dos genes Aox1, 2b1 e 2b2 em Medicago sativa os promotores foram clonados e seqÃenciados revelando regiÃes idÃnticas entre eles indicando o envolvimento de elementos cis comuns na regulaÃÃo. Esses resultados corroboram com a co-expressÃo induzida por estresse de Aox1/Aox2b observada anteriormente em feijÃo. Contudo, em Medicago sativa, observamos expressÃo diferencial entre tecidos: no tecido radicular os genes Aox1, Aox2a e 2b1 podem sem induzidos por estresses e/ou mostram uma caracterÃstica de expressÃo. Por outro lado, em folhas o gene Aox2b2 diferenciou por apresentar apenas caracterÃstica de gene induzido em condiÃÃes de estresse. / In plants, Alternative Oxidase (AOX) is enconded by small milti gene family located in genomc DNA. This multi gene family was studied in mono and dicots plants being clusterd in two subfamilies: Aox1 and Aox2. Aox1 gene are found in all angiosperms tÃxon presenting gene expression related to stress situations while Aox2 genes are found in dicots plants only and presenting a houkeeping expression. Many Aox1 genes e just one Aox2 are found in the most of dicots studied. However, in Fabales, as cowpea and soybean, is found a profile with two genes Aox2 (Aox2a , Aox2b) and one Aox1 gene. In this work was characterized a multi gene family of Aox genes in Medicago genus (Medicago truncatula e Medicago sativa) belonging to Fabales Order. Data mining in genBanks characterized four Aox genes (Aox1, Aox2a, Aox2b1 and Aox2b2) in Medicago truncatula genome revealing for first time a duplication of Aox2b genes. Specifics primers designed for each Aox gene and then were used to amplification by PCR, cloning and partial sequencing of these genes in Medicago sativa. Gene expression was carried out by semiquantitative RT-PCR in: germination seeds (0, 24, 48 hours of germination), roots and leaves from Medicago sativa grewth in Hoaglendâs medium and applied to disticts stress conditions (0, 6, 12 e 24 hs after treatment): control, salicylic acid (0,5mM), PEG (100g/L), H2O2 (10mM) e cisteÃne (0,5mM). The results revealed that all four Aox genes were detected in seed of Medicago sativa. However, Aox1, Aox2b1 and Aox2b2 genes presented high expression during germination while Aox2a showed constitutive expression. In leaves, Aox1, Aox2a and Aox2b1 were detected in all conditions tested, but Aox2b2 was observed more strong in stress situations only. Simirily observed in germination, Aox1, Aox2b1 and Aox2b2 increased transcripts levels in response to all stress conditions. Aox2a, one more time, had constitutive, but very strong expression. In roots, all genes were detected and a similar induction profile of Aox1, Aox2b1 and Aox2b2 were confirmed less to PEG treatment where just Aox1 was responsive. Aox2a had constitutive expression too, but it was weakly expressed. In order to understand the co-expresion of Aox1, Aox2b1 and Aox2b2 genes, the promoter regions were cloned and sequenced revealing close motifs among them suggesting th involviment of cis-elements in their regulation. Theses resuls corroborate with co-expression stress-induced of Aox1/Aox2b found in cowpea. However, in Medicago sativa, it was observed tissue-specific exression. Aox1, Aox2a and Aox2b1 with characteristics constitutive and induced in seeds germination and roots tissue while in leaves Aox2b2 differed by present stress-induced expression only.

A utilização descontrolada de pesticidas tem provocado no decorrer dos anos a intoxicação de milhares de pessoas no mundo, uma vez que, seus resíduos têm sido depositados em alimentos, em solos e em ambientes aquáticos. Assim, a construção de duas novas plataformas sensoras para a detecção de pesticidas é o objetivo desse trabalho. Na primeira plataforma foi utilizado o polieletrólito catiônico polietilenoimina (PEI) em conjunto com o polissacarídeo extracelular algal (PSE) produzido pela microalga criptofícea Cryptomonas tetrapirenoidosa preparados através da técnica de deposição \"spin-coating\". E a segunda plataforma foi produzida por eletrodeposição pulsada, entre um potencial de redução e um de oxidação, utilizando nanoestruturas de óxido de zinco (ZnO). Para caracterizar as plataformas, foram utilizadas as técnicas de microscopia eletrônica de varredura com fonte de emissão de campo (FEG-SEM), difração de raios X (XRD), espectroscopia de absorção ultravioleta-visível (UV-Vis), microscopia de força atômica (AFM) e espectroscopia de reflexão-absorção no Infravermelho com modulação da polarização (PM-IRRAS). Através da imobilização da enzima polifenol oxidase na forma de extrato bruto em sua fonte natural (fruto abacate), as plataformas de PEI/PSE e ZnO, foram avaliadas como biossensores de catecol e do inseticida carbaril. De modo comparativo, as plataformas de PEI/PSE sem a presença imobilizada da enzima também foram estudadas para a detecção do catecol e do carbaril. A simplicidade na formação e na construção dessas plataformas vem qualificá-las como viáveis a serem produzidas em escala industrial e com baixo custo de processamento. E diante dos resultados obtidos no desenvolvimento desses biossensores destaca-se a eficiência e a rapidez de detecção, o que os tornam economicamente promissores e competitivos em termos de aplicações ambientais. / The uncontrolled use of pesticides has resulted over the years the intoxication of thousands of people in the world, since their waste has been deposited in food, in soil and aquatic environments. Thus, the construction of two new sensors platforms for pesticide detection is the objective of this work. At first platform was used cationic polyelectrolyte polyethyleneimine (PEI) along with the extracellular algal polysaccharide (EPS) produced by microalgae criptofícea Cryptomonas tetrapirenoidosa prepared by deposition technique \"spin-coating\". The second platform was produced by pulsed electrodeposition between a reduction and an oxidation potential using nanostructures zinc oxide (ZnO). To characterize the platforms, we used the techniques of field emission gun scanning electron microscopy (FEG-SEM), X-ray diffraction (XRD), ultraviolet visible absorption spectroscopy (UV-Vis), atomic force microscopy (AFM), and polarization modulation infrared reflection-absorption spectroscopy (PM-IRRAS). By immobilization of the polyphenol oxidase enzyme as a crude extract in their natural source (avocado fruit), platforms PEI/PSE and ZnO, they were evaluated as catechol and carbaryl insecticide biosensors. In a comparative way, the platforms PEI/PSE without the presence of immobilized enzyme were also studied for detection of catechol and carbaryl. The simplicity in the formation and construction of these platforms comes qualify them as viable to be produced on an industrial scale and low cost processing. And on the results obtained in the development of such biosensors stand out the efficiency and speed of detection, which make them economically promising and competitive in terms of environmental applications.

nÃo hà / O cloroplasto à uma organela caracterÃstica dos organismos fotossintetizantes sendo seu papel primordial na geraÃÃo de energia a partir de gÃs carbÃnico e Ãgua. Essa organela pode ter seu funcionamento comprometido quando submetida a estresses ambientais devido a fragilidade e complexidade do sistema. Para evitar perdas provocadas pelo estresse existem vÃrios mecanismos de adaptaÃÃo e regulaÃÃo das reaÃÃes que ocorrem no cloroplasto. Recentemente caracterizou-se mais um desses provÃveis mecanismos que foi chamado de clororespiraÃÃo. A clororespiraÃÃo foi esclarecida com a descoberta de uma enzima similar a oxidase alternativa da mitocondria que chamou-se de oxidase terminal do plastÃdeo (PTOX). A funÃÃo dessa respiraÃÃo do cloroplasto permanece incerta, mas uma das hipÃteses mais aceitas à que o funcionamento da clororespiraÃÃo poderia prevenir a formaÃÃo de espÃcies reativas de oxigÃnio atravÃs da reciclagem dos intermediÃrios redutores do cloroplasto. No presente trabalho foi caracterizado a presenÃa de dois genes que codificam para a oxidase terminal do plastÃdeo em plantas de Zea mays. Estudou-se tambÃm a expressÃo diferencial de ambos genes da PTOX em resposta ou estresse hÃdrico, alÃm da caracterizaÃÃo da clororespiraÃÃo atravÃs da atividade da NADH desidrogenase plastidial (NDH) em gel de poliacrilamida. A caracterizaÃÃo molecular dos genes da PTOX mostrou homologia de 60% quando comparadas as sequÃncias dos genes e de 79% quando comparadas as prÃ-proteÃnas traduzidas. Os genes dessa proteÃna tÃm estruturas similares, sendo compostos por oito introns e 9 Ãxons. Um estudo das regiÃes dos promotores dos genes mostrou que existiam elementos comuns porÃm a presenÃa de elementos diferentes como, o elementos cis MBS que à responssivo à seca, poderia revelar uma regulaÃÃo diferencial dos genes. A resposta diferencial foi confirmada atravÃs de RT-PCR semiquantitativo. O gene chamado de ptox1 teve sua expressÃo estÃvel, podendo ser considerado um gene constitutivo, enquanto que o gene chamado de ptox2 teve um aumento da expressÃo proporcional ao estresse aplicado tanto em folhas como em raÃzes de plantas de milho. A anÃlise da atividade da NDH em gel (zimograma) revelou a presenÃa dessa enzima em cloroplastos de milho confirmando a presenÃa das enzimas da clororespiraÃÃo. O estudo filogenÃtico de sequencias de cDNA de bancos de dados mostraram que milho e sorgo pertencentes ao grupo das monocotiledÃneas, sÃo espÃcies muito prÃximas e que compartilham dois genes ortÃlogos da PTOX identificados como ptox1 e ptox2. Concluiu-se pela primeira vez a presenÃa de dois genes da PTOX no genoma do milho, uma monocotiledÃena de metabolismo C4. Os genes foram denominados de ptox1 e ptox2. Eles foram encontrados em raÃzes e folhas e apenas o gene da ptox2 pareceu ser induzido em resposta ao estresse osmÃtico. / The chloroplast is an organelle characteristic of photosynthetic organisms and their role in generating energy from carbon dioxide and water. This organelle may be functionally compromised when subjected to environmental stresses due to the fragility and complexity of the system. To avoid losses caused by stress there are several mechanisms of adaptation and adjustment of the reactions that occur in the chloroplast. Recently characterized most likely of these mechanisms has been called clororespiraÃÃo. The clororespiraÃÃo was clarified with the discovery of an enzyme similar to mitochondria that the alternative oxidase is called terminal plastid oxidase (PtOx). The function of chloroplast respiration remains uncertain, but one of the most accepted hypothesis is that the operation of clororespiraÃÃo could prevent the formation of reactive oxygen species by recycling intermediate reducing the chloroplast. Characterized in this study was the presence of two genes coding for the terminal oxidase in plant plastid of Zea mays. Was also studied the differential expression of both genes in response PtOx or water stress, and the characterization of clororespiraÃÃo through the activity of the NADH dehydrogenase plastid (NDH) polyacrylamide gel. The molecular characterization of genes PtOx showed homology of 60% when comparing the sequences of genes and 79% when compared to the pre-translated proteins. Genes of this protein have similar structures are composed of eight introns and exons 9. A study of regions of the promoters of the genes showed that there were common elements but the presence of different elements as the cis elements that MBS is responssivo drought, could reveal a differential regulation of genes. The differential response was confirmed by semiquantitative RT-PCR. The gene was called ptox1 stable expression could be considered a constitutive gene, whereas the gene was called ptox2 increased expression proportional to applied stress in both leaves and roots of corn plants. The analysis of the activity of NDH gel (zymogram) revealed the presence of this enzyme in chloroplasts corn confirming the presence of enzymes clororespiraÃÃo. The phylogenetic analysis of cDNA sequences from databases showed that corn and sorghum in the group of monocots are closely related species which share two of the orthologous genes identified as PtOx ptox1 and ptox2. It appeared that the first time the presence of two genes PtOx into the maize genome, a C4 monocotiledÃena metabolism. Genes were named ptox1 and ptox2. They were found in the roots and leaves and only ptox2 gene appeared to be induced in response to osmotic stress.

Neste trabalho são apresentados resultados relacionados a estudos sobre o comportamento eletroquímico do lactato e do peróxido de hidrogênio em diversos eletrodos em meio de diferentes pHs utilizando voltametria cíclica. Também foi investigado o comportamento eletroquímico do peróxido de hidrogênio em eletrodos modificados com filmes de hexacianoferratos utilizando eletrodos de platina e carbono vítreo. A vantagem do uso do CTAB na modificação da superfície de carbono vítreo com Azul da Prússia foi confirmada no que se refere à melhora da sensibilidade e da estabilidade das medidas. Numa etapa posterior desenvolveu-se um biossensor para a determinação de lactato pelo monitoramento de peróxido de hidrogênio produzido na reação catalisada de lactato com oxigênio na presença da enzima lactato oxidase. Nessa etapa, o trabalho consistiu em imobilizar a enzima lactato oxidase na superfície do eletrodo, previamente, modificado com Azul da Prússia, com o auxílio de Nafion®. Após a construção do biossensor e a otimização das condições de análise (pH, quantidade de enzima, volume da amostra e vazão) para obtenção de maior sinal analítico no desenvolvimento do método para a determinação de lactato por análise em fluxo, averiguou-se a repetibilidade das medidas (Clactato = 0,28 mmol L-1) obtendo-se um desvio padrão de 2,2% para 18 repetições. A freqüência analítica foi estimada em 160 injeções por hora com limite de detecção de 0,84 µmol L-1 e linearidade até 0,28 mmol L-1 de lactato. O biossensor foi aplicado na quantificação de lactato em amostras alimentares (cervejas alcoólicas e não alcoólicas) e biológicas (sangue liofilizado e recém coletado). Por fim, realizaram-se estudos envolvendo a variação da concentração de lactato sanguíneo em função da intensidade de atividade esportiva. Os resultados obtidos pelo método proposto foram comparados com aqueles oriundos do uso de método de referência. / Results on the investigation of the electrochemical behavior of lactate and hydrogen peroxide at various electrodic surfaces at different pHs using cyclic voltammetry are presented. Experiments were also carried out with platinum and glassy carbon electrodes modified with hexacyanoferrate films. The advantage of using CTAB in the electrodeposition step of Prussian Blue films onto glassy carbon surfaces was confirmed taking into account both the stability and sensitivity of measurements. The immobilization of lactate oxidase onto glassy carbon electrodes modified with a Prussian Blue layer using Nafion® was performed to fabricate a biosensor for lactate. The biosensor was used in the development of a FIA amperometric method for the determination of lactate. Under optimal operating conditions (pH = 6.9, E = -0.1 V), the linear response of the method was extended up to 0.28 mmol L-1 lactate with a limit of detection of 0.84 µmol L-1. The repeatability of the method for injections of a 0.28 mmol L-1 lactate solution was 2.2 % (n = 18). The analytical frequency was calculated as 160 injections h-1. The usefulness of the method was demonstrated by determining lactate in beer (alcoholic and nonalcoholic beers) and blood samples (lyophilized and freshly collected). Finally, the influence of physical exercise on the blood lactate level was studied. Results obtained by using the proposed amperometric detector compared well with the reference method.

Este trabalho descreve a preparação, a caracterização e o uso de um biossensor bienzimático confeccionado com as enzimas glicose oxidase e frutose dehidrogenase imobilizadas em camadas auto-organizadas ou self-assembled monolayers (SAMs) de cistamina para a quantificação de açúcares em alimentos. Após o preparo do eletrodo de ouro com a SAM de cistamina, biossensores foram construídos e para obtenção de melhores respostas, condições foram otimizadas, tais como: concentração do mediador tetratiafulvaleno (TTF), porcentagem de glutaraldeído, temperatura e tempo de vida do biossensor. Com as condições estabelecidas, fez-se então, a determinação analítica da D-glicose e da D-frutose em eletrólito puro pelo método da adição de padrão e os resultados foram obtidos por voltametria cíclica e cronoamperometria. A corrente de pico de oxidação do mediador de elétrons (TTF) aumentou proporcionalmente com o aumento da concentração e não ocorreram deslocamentos nos potenciais de pico. Os limites de detecção (LD) foram encontrados por meio do desvio padrão da média aritmética de dez amperogramas do branco no potencial equivalente aos dos picos de oxidação do mediador de elétrons TTF, juntamente com o valor do coeficiente angular da curva analítica. Após a obtenção da curva analítica o biossensor foi aplicado diretamente em amostras de refrigerante dietético e não dietético, bem como em amostras de adoçantes comerciais, onde foram realizados testes comparativos da resposta dos biossensores. Para o eletrólito puro e amostras de refrigerante dietético e de adoçantes, ou seja, onde não há presença de D-glicose e D-frutose, notou-se a ausência de corrente de pico, enquanto que para as amostras de refrigerante não dietético, houve um valor significativo de resposta de corrente, indicando a presença dos açúcares em estudo. Com o propósito de verificar a influência de interferentes e o efeito de matriz, foi construída uma curva analítica para a D-glicose e para a D-frutose, em amostras de refrigerante dietético e adoçantes, onde foram obtidas as menores quantidade destes açúcares. Para o refrigerante não dietético, foi determinado o valor inicial dos açúcares presentes nas amostras. Pode-se afirmar que a utilização dos biossensores baseados nas enzimas GOx e FDH mostraram-se eficientes para a determinação dos açúcares D-glicose e D-frutose nas amostras analisadas (com diferença significativa nos valores de corrente), apresentando uma resposta rápida, além da eliminação do efeito da matriz. A utilização do mediador de elétrons (TTF) possibilitou a reação em potencial próximo de zero, diminuindo o efeito de interferentes e evitando a desnaturação das enzimas. / This work describes the preparation, characterization and application of a bienzymatic biosensor based in the glucose oxidaze and fructose dehydrogenase immobilized on self-assembled monolayer of cystamine for sugar quantification in foodstuff. After the modification of the gold electrode with cystamine, the biosensors were developed and optimized for best responses. Optimization parameters were: mediator tetrathiafulvalene (TTF) concentration, glutaraldehyde percentage, temperature and life time of the biosensor. With the best conditions established, the analytical determinations of d-glucose and d-fructose in pure phosphate buffer were conducted by the standard additions method and the results obtained by cyclic voltammetry and chronoamperometry. The oxidation peak current related to the TTF voltammetric behavior raised proportionally to the increasing concentration of d-glucose or d-fructose, in a given and constant peak potential. The methodology detection limits were found using the standard deviation of ten chronoamperograms of the blank solution, in the potential value corresponding to that of TTF oxidation, and the slope of the analytical curve. After the analytical curve acquirement the biosensor was directly applied in samples of diet or non-diet softdrinks, as well as in commercial sweeteners samples, with comparative tests of the biosensor responses. For pure electrolyte and for diet foodstuff samples, i.e., were there is not expectation for d-glucose or d-fructose existence, it was detected the lack of the voltammetric peak associated with the mediator oxidation. In non-diet samples, a pronounced voltammetric peak was obtained, testifying the presence of sugar in the electrolytes under study. The matrix effect was verified by means of an analytical curve obtained for both analytes (d-glucose and d-fructose), in diet and sweeteners samples, properly spiked with known amounts of each analyte. It can be concluded that the utilization of the biosensor based in GOx and FDH showed to be efficient for d-glucose and d-fructose determinations in the analysed samples, with a fast response time and elimination of the matrix effect. The mediator promoted the electrochemical reaction to occur in potentials very close to zero, minimizing the interferences or the enzyme denaturation.

As peçonhas de serpentes contêm uma mistura complexa de substâncias farmacologicamente ativas, como metaloproteases, fosfolipases A2, serino-proteases, L-aminoácido oxidase (LAAO), além de outros importantes compostos sem ação enzimática. LAAOs são flavoproteínas que catalisam a desaminação oxidativa de L-aminoácidos e produzem o -cetoácido correspondente, com a concomitante liberação de amônia e peróxido de hidrogênio. A peçonha de Lachesis muta (L. muta) contém L-aminoácido oxidase, a qual pode contribuir com o envenenamento. Portanto, o objetivo deste trabalho é a purificação da L-amino acido oxidase de peçonha de Lachesis muta (LmLAAO) e a sua caracterização bioquímica, estrutural e funcional. Para isso, foram desenvolvidos dois protocolos distintos de purificação, os quais forneceram LmLAAO com grande pureza. No primeiro protocolo, 20 mg de peçonha bruta de L. muta foram submetidos a uma gel filtração em Sephacryl S100®. Das dez frações obtidas, a primeira fração apresentou atividade L-aminoácido oxidase e foi submetida a mais um passo cromatográfico em Mono Q®. A homogeneidade da fração com atividade L-aminoácido oxidase após a troca iônica foi comprovada por presença de banda única com 60,2 kDa em SDS-PAGE. O segundo protocolo de purificação foi uma sequência de três passos cromatográficos, na qual 200 mg de peçonha bruta de L. muta foram submetidos a gel filtração em Sephacryl S200®, seguido por interação hidrofóbica em Phenyl Sepharose® e Affi- gel Blue Gel®. Da mesma forma, a pureza da enzima obtida depois desses passos cromatográficos foi comprovada por presença de banda única com 64 kDa em SDS-PAGE. Em ambos os protocolos de purificação, LmLAAO manteve sua atividade enzimática. A massa molar de LmLAAO foi determinada por espectrometria de massas (MALDI-TOF) e apresentou valor de 60,85 kDa. Além disso, foi determinado o valor do ponto isoelétrico da LmLAAO como 5,1. A LmLAAO mostrou preferência catalítica por aminoácidos hidrofóbicos (L-Metionina L-Leucina e L-Fenilalanina) e apresentou perda de atividade catalítica quando submetida à altos valores de pH ou de temperatura. Os parâmetros cinéticos foram determinados e a constante de Michaelis-Menten para o substrato L-Leucina foi de 0,9737 mmol/L e a velocidade máxima de reação foi de 0,06345 mol peróxido de hidrogênio/min. A sequência N-terminal dos 40 primeiros resíduos da LmLAAO purificada foi determinada por degração de Edman e a sua estrutura primária completa foi deduzida da sequência do cDNA obtido da glândula de peçonha. Verificou-se uma grande identidade entre as sequências em aminoácidos da LAAO de L. muta e as de outros viperídeos. A estrutura da LmLAAO foi resolvida por substituição molecular usando as coordenadas atômicas da LAAO de Agkistrodon halys pallas (PDB 1REO). As atividades farmacológicas da LmLAAO foram determinadas in vivo e in vitro. A injeção da enzima (10 µg) não induziu edema de pata em camundongos, nem hemorragia (50 µg) e nem toxicidade sistêmica (100 µg). No entanto, provocou uma leve mionecrose (100 µg) e edema em músculo quadríceps de camundongo, aumentando a creatina quinase plasmática. In vitro, foram testadas as atividades citotóxicas da LmLAAO em células de carcinoma. Os dados obtidos mostram IC50 de 22,70 µg/mL, para linhagem AGS (carcinoma de estômago), e IC50 de 1,41 µg/mL linhagem MCF-7 (carcinoma de mama). Para a atividade antiparasitária, foi determinada uma IC50 de 2,22 µg/mL para a forma promastigota de Leishmania brasiliensis. No entanto, a LmLAAO (32 µg/mL) não apresentou toxicidade relevante para a forma tripomastigota de Tripanosoma cruzi. Concluindo, este trabalho descreve o isolamento e a caracterização estrutural e funtional de uma nova LAAO da peçonha de L. muta. A enzima mostrou efeitos antitumorais e leishmanicida, sem toxicidade sistêmica relevante, mas apresentou significativa ação edematogênica e miotóxica local. Este estudo é relevante não apenas por contribuir para uma melhor compreensão do papel da LAAO no envenenamento, mas também por demonstrar seu potencial biotecnológico como agente terapêutico. / Snake venoms comprise a complex mixture of pharmacologically active substances, such as metalloproteases, phospholipase A2, serine proteases and L-amino acid oxidases (LAAOs) other compounds showing no enzymatic activity. LAAOs are flavoproteins catalyzing the oxidative deamination of L-amino acids to produce the corresponding -keto acid with the concomitant release of ammonia and hydrogen peroxide. Lachesis muta (L. muta) venom contains L-amino acid oxidase which may contribute to the envenomation. The aim of this study is the purification of an L-amino acid oxidase from Lachesis muta venom (LmLAAO) and its structural and functional characterization. For that, two purification protocols were performed and both provided highly pure LmLAAO. In the first protocol, 20 mg of crude venom of L. muta were submitted to a gel filtration on Sephacryl S100® and yielded ten fractions, whose were tested for L-amino acid oxidase activity. The first fraction showed L-amino acid oxidase activity and it was submitted to a further chromatographic step on Mono Q®. The homogeneity of the fraction showing L-amino acid oxidase activity after ion exchange was confirmed by the presence of a single band corresponding to 60.2 kDa by SDS-PAGE. The second purification protocol was a sequence of three chromatographic steps, where 200 mg of crude L. muta venom were submitted to gel filtration on Sephacryl S200, followed by hydrophobic interaction on Phenyl Sepharose® and Affi-gel-Blue Gel. For the second protocol, the purity of LmLAAO was confirmed by the presence of a single band with 64 kDa as determined by SDS-PAGE. In both purification protocols LmLAAO kept its enzymatic activity. The molar mass of LmLAAO was determined by mass spectrometry (MALDI-TOF) and showed a value of 60.85 kDa. Moreover, the isoelectric point was 5.1. In addition, LmLAAO showed a catalytic preference for hydrophobic amino acids (L-methionine, L-leucina and L-phenylalanine) and lost its catalytic activity when subjected to high pH or temperature. The kinetic parameters for LAAO were determined and the Michaelis-Menten constant for the substrate L-leucine was 0.9737 mmol/L, and the maximum reaction velocity was 0.06345µmol hydrogen peroxide/min. Furthermore, the sequence of the first forty residues was determined by Edman degradation and the complete sequence of LmLAAO was resolved by cloning cDNA obtained from the venom glands. The amino acid sequence of LmLAAO showed a great identity with sequences of LAAOs from other viper snakes. The LmLAAO structure was solved by molecular replacement using the the atomic coordinates of the LAAO from Agkistrodon halys pallas (PDB 1REO). In addiction, LmLAAO pharmacological activities were determined in vivo and in vitro. Thus, LmLAAO (10 µg) did not induce paw edema in mice, neither hemorrhage (50 µg) nor systemic toxicity (100 µg). However, it caused a mild myonecrosis (100 µg) and edema in the quadriceps muscles of mice, increasing plasma creatine kinase. In vitro activities of LmLAAO in carcinoma cells was assayed. The IC50 of LmLAAO on AGS cell line (stomach cancer) was 22.70 µg / mL, and the IC50 of LmLAAO on MCF-7 cell line (breast carcinoma) was 1.41 µg/mL. Moreover, antiparasitic activity of LmLAAO was determined on promastigote of Leishmania brasiliensis and an IC50 of 2.22 µg/mL was found, whereas on trypomastigote form Trypanosoma cruzi LmLAAO showed no toxicity at doses of 32 µg/mL. In conclusion, this work reports the isolation and the structural and funtional characterization of a new LAAO from L. muta snake venom. The enzyme showed antitumoral and leishmanicidal effects, without relevant systemic toxicity, but presented a significant local edema inducing and myotoxic action. This study is relevant not only for contributing to a better understanding of LAAO role in envenomation, but also for demonstrating its biotechnological potential as a therapeutic agent.

Neste trabalho descrevemos o isolamento e a caracterização bioquímica, estrutural e funcional de uma L-aminoácido oxidase isolada do veneno da serpente Bothrops jararacussu, proteína esta denominada BjussuLAAO. O isolamento foi realizado pela combinação de três etapas cromatográficas, utilizando filtração molecular em Sephadex G-75, seguida de cromatografia de afinidade em Benzamidina-Sepharose, seguida pela última etapa cromatográfica, realizada com interação hidrofóbica em Fenil-Sepharose. A BjussuLAAO é uma proteína com massa molecular de 61 kDa e pI 5,8, e apresentou alta similaridade sequencial com as LAAOs já isoladas dos venenos de serpentes. A enzima BjussuLAAO induziu edema apenas na maior dose (100 ?g/animal), não apresentou atividade miotóxica, também não apresentou atividade hemorrágica, mesmo nas doses mais elevadas. A BjussuLAAO, demonstrou ter efeito coagulante e ação fibrinogenolítica e, mesmo utilizando inibidores de metaloproteases e serino proteases, continuou apresentando tal atividade, demonstrando assim não existir contaminantes destas classes de proteínas na amostra. As atividades mais interessantes do ponto de vista farmacológico, onde podemos visualizar a BjussuLAAO como um futuro fármaco, foram as atividades antitumoral, bactericida e antiparasitária. Esta apresentou, em baixas concentrações, citotoxicidade sobre células tumorais, ação leishmanicida e tripanocida, demonstrando assim ser uma substância candidata a fármaco multifuncional. / In this research we described the isolation and biochemical, structural and functional characterization of an L-amino acid oxidase from Bothrops jararacussu venom, named BjussuLAAO. The purification was carried out through three chromatography steps, using a molecular filtration on Sephadex G-75, followed by an affinity chromatography on Benzamidine-Sepharose, and finally a hydrophobic chromatography on Phenyl-Sepharose. BjussuLAAO is a protein with a molecular mass of 61 kDa and pI 5.8. This protein showed high sequencial similarity with other LAAOs from snake venoms. BjussuLAAO induced edema only in the highest dose (100 ?g/animal), did not show any myotoxic or hemorrhagic activity. BjussuLAAO, showed clotting and fibrinogenolitic activity, even in the presence of metalloproteases and serino-proteases inhibitors. The more interesting pharmacological activities, where from we can look a future application, were the anti-tumoral, bactericide, leishmanicidal and tripanocidal actions. The enzyme displayed a bactericide effect too, showing to be a multifunctional drug.

A análise da estruturação populacional de espécies codistribuídas permite a comparação de padrões de estruturação, fornecendo informações acerca dos fatores que influenciam a diferenciação em espécies pertencentes ao mesmo ecossistema. Este projeto teve como objetivo principal analisar a variabilidade intraespecífica em caranguejos habitantes de manguezais, codistribuídos ao longo do Oceano Atlântico Ocidental, por meio de ferramentas moleculares e morfológicas, visando testar a hipótese de elevada estruturação populacional em manguezais. Para este fim, cinco espécies foram utilizadas como modelo (Aratus pisonii, Goniopsis cruentata, Sesarma rectum, Uca thayeri e Ucides cordatus) e avaliadas por meio de marcadores mitocondriais COI e 16S e nuclear H3 e análises morfológicas comparativas e de morfometria. Os dados moleculares revelaram dois padrões, indicando elevada estruturação populacional para as espécies A. pisonii e U. thayeri e ausência de estruturação para G. cruentata, S. rectum e U. cordatus. Os dados morfológicos, no entanto, não acompanham esses padrões, já que não foram encontradas diferenças morfológicas ou morfométricas associadas aos grupos evidenciados pelas análises moleculares. A ausência de fluxo gênico entre regiões para algumas espécies deve-se, muito provavelmente, à existência de fatores que não se limitam ao isolamento por distância, mas também devido a diferenças na duração do estágio larval e a diferenças bruscas em alguns fatores abióticos, como a salinidade, por exemplo, que, associados às diferentes características do desenvolvimento larval de cada espécie, culminam na existência de estruturas populacionais diferentes. Além disso, os padrões de diferenciação genética observados concordam com os cenários biogeográficos propostos para o Atlântico Ocidental, no qual mudanças e flutuações geológicas, climáticas e oceanográficas, resultantes do fechamento do Istmo do Panamá e de ciclos glaciais na América do Norte, promoveram divergência genética. / The analysis of population structure of codistributed species allows the comparison of patterns of population structuring, providing information on the factors that influence the differentiation in species belonging to the same ecosystem. This project aimed to analyze the intraspecific variability of crabs inhabiting mangroves, codistributed along the western Atlantic Ocean, by means of molecular and morphological tools, in order to test the hypothesis of high populational structure in mangroves. The genetic variability of five species used as models (Aratus pisonii, Goniopsis cruentata, Sesarma rectum, Uca thayeri and Ucides cordatus) was assessed using the mitochondrial genes COI and 16S and the nuclear H3 and comparative morphological analysis and morphometry were performed. The molecular data revealed two patterns, indicating high population structure for the species A. pisonii and U. thayeri and absence of structure for G. cruentata, S. rectum and U. cordatus. The morphological data, however, do not follow these patterns, because there were no morphological or morphometric differences associated with the groups evidenced by the molecular analyzes. Possibly the absence of gene flow between regions for some species is due to factors not limited to isolation by distance, but also because of differences in the larval stage duration and in withstanding some abiotic factors, such as salinity. These factors associated with different characteristics of larval development can culminate in differences on population structure. In addition, the genetic differentiation patterns observed agree with biogeographical scenarios proposed for the western Atlantic, where geological, climate and oceanographic fluctuations, resulting from the Isthmus of Panama closure and cyclical glaciation in North America, promoted genetic divergence.