Cistatinas são um grupo de inibidores de cisteíno proteases que atuam na regulação da proteólise e estão presentes em uma ampla variedade de organismos. Estudos sobre essa classe de inibidores em parasitas têm contribuído para elucidar suas funções na regulação de processos fisiológicos como a digestão do sangue e a supressão da resposta imune do hospedeiro durante a alimentação. Por isso, cistatinas são um alvo interessante na pesquisa para o desenvolvimento de novos métodos de controle de parasitas. Além disso, a caracterização de proteínas compartilhadas por diferentes espécies de parasitas representa uma estratégia viável para encontrar potenciais alvos para uma vacina multi-espécie. Entretanto, as funções das cistatinas nos carrapatos permanecem obscuras, especialmente na espécie Ixodes ovatus. Neste trabalho, foi caracterizado o perfil inibitório de rJpIocys2a, uma cistatina de I. ovatus, para as catepsinas B, C e L. O perfil de inibição enzimática de rJpIocys2a se mostrou variável entre catepsinas envolvidas na digestão do sangue pelo carrapato e na evasão da resposta imune do hospedeiro. Além disso, um peptídeo baseado na sequência de aminoácidos do inibidor JpIocsy2a (STQ-pep) foi sintetizado e utilizado para imunização de coelhos. O soro anti-STQ-pep foi usado para analisar a antigenicidade cruzada entre cistatinas dos carrapatos Rhipicephalus microplus e I. ovatus. A análise da antigenicidade cruzada revelou que anticorpos gerados contra o peptídeo são capazes de reconhecer cistatinas nativas e recombinante de R. microplus. A habilidade de rJpIocys2a de inibir catepsinas relacionadas a diferentes funções sugere múltiplas funções para esse inibidor. Os resultados obtidos neste trabalho forneceram bases para outros experimentos que utilizem esta proteína como antígeno vacinal. / Cystatins are a group of cysteine protease inhibitors that act on the regulation of physiological proteolysis and are present in a wide range of organisms. Researches on this class of inhibitors in parasites have contributed to clarify their roles in the regulation of important physiological processes, such as blood digestion and suppression of the host immune response during blood feeding. Thus, cystatins are a topic of research for the development of new parasite control methods. Additionally, the characterization of proteins shared by different parasite species represents a valuable strategy to identify potential targets for a multi-species vaccine. However, cystatin functions in ticks remain undetermined, especially in Ixodes ovatus. This work characterized the inhibitory profile of rJpIocys2a, an I. ovatus cystatin, to cathepsins B, C, and L. The enzymatic inhibition profile of JpIocys2a shows a distinct modulation of cathepsins related to tick blood digestion and evasion of host immune response. In addition, a peptide from JpIocys2a amino acid sequence (STQ-pep) was synthesized and used for rabbit immunization. Anti-STQ-pep serum was used to analyze the cross-antigenicity between Rhipicephalus microplus and I. ovatus cystatins. Crossantigenicity assays revealed that antibodies against the JpIocys2a peptide are able to recognize native and recombinant R. microplus ticks cystatins. The ability of rJpIocys2a to inhibit cathepsins related to different functions suggests multiple roles for JpIocys2a. The results obtained in this work provided basis for further experiments using this protein as a vaccine antigen.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-01-26. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:04Z : No. of bitstreams: 1 Publico-12577.pdf: 942474 bytes, checksum: fb55d2b7cb3c2b41e6597447daa5d94b (MD5) / Células tumorais expressam um grande numero de proteases que têm importante função no desenvolvimento tumoral e metástases. Algumas destas proteases podem atuar também na regulação da angiogênese. Catepsinas são proteases lisossomais que estão expressas em células tumorais, podendo translocar-se para a superfície da célula e serem secretadas. Inibidores de catepsinas podem então ser potencialmente ativos na terapia anticâncer. Cistatinas são inibidores naturais de cisteíno proteases que podem inibir o desenvolvimento, crescimento e metástases de tumores. Na presente tese avaliamos o potencial uso terapêutico das cistatinas recombinates de cana de açúcar CaneCPI-2, CaneCPI-3 e CaneCPI-4 em um modelo de melanoma de camundongo. Estas cistatinas não foram citotóxicas para células de melanoma ou HUVEC, crescendo in vitro. A CaneCPI-4 inibiu angiogênese de células HUVEC em Matrigel in vitro e o desenvolvimento de células melanoma B16F10-Nex2 in vivo. CaneCPI-2 estimulou angiogênese e também o crescimento da célula tumoral in vitro e o desenvolvimento subcutâneo in vivo. Em contrapartida, a CaneCPI-3 não mostrou qualquer efeito na angiogênese ou crescimento de células tumorais. Estes efeitos opostos na angiogênese e viabilidade de células tumorais apresentados pelas CaneCPI-2 e CaneCPI-4 sugerem que estas cistatinas podem estar agindo sobre diferentes cisteíno proteases, levando a reações que levam a estimulação da progressão tumoral ou efeitos antitumorais. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2016-04-07T13:23:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 leonardo_matilde_ioc_dout_2013.pdf: 10262111 bytes, checksum: 343b14b4b2a15acbb6b250c4067d32ff (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os mosquitos Aedes albopictus (Skuse, 1894) e Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) apresentam significativa importância epidemiológica dentro da família Culicidae por serem os principais vetores da febre amarela e dos quatro sorotipos do vírus da dengue. As peptidases ou proteases são enzimas que clivam ligações peptídicas. No sistema digestivo de invertebrados as peptidases, especificamente aquelas da classe das serino-peptidases, são abundantes e participam de vários processos fisiológicos, desempenhando um papel principal na hidrólise de proteínas destinadas à nutrição. Estas enzimas podem apresentar características espécie-específicas e essas diferenças são respostas adaptativas a diferentes estilos de vida, ambientes e habilidade de sobrevivência entre as espécies. Neste trabalho descreve-se a caracterização das atividades proteolíticas detectadas em extratos totais das formas pré-imaginais de A. aegypti e A. albopictus por enzimografia em uma dimensão. A estabilidade da expressão de peptidases nessas espécies foi avaliada pela comparação do perfil proteolítico de formas larvais obtidas de ovos de insetos recém coletados no ambiente com ovos de insetos mantidos em colônia por longo período. Foram também comparados os perfis proteolíticos das pupas com seus respectivos imagos, bem como a estabilidade térmica das peptidases detectadas. Observaram-se complexos perfis de serino-peptidases do tipo tripsina em ambas as espécies vetoras Contudo esses perfis apresentam diferenças espécie-específicas e também diferenças entre os distintos estágios evolutivos dentro de uma mesma espécie. Também, neste trabalho, descreve-se a caracterização das atividades proteolíticas detectadas no intestino médio de fêmeas de A. albopictus alimentadas com açúcar bem como o primeiro mapa proteô mico e a identificação de peptidases por eletroforese bi-dimensional e espectrometria de massas neste órgão. São discutidas aqui as estratégias usadas para analisar as peptidases expressas nesse tecido. As proteínas expressas no intestino médio de A. albopictus foram identificadas por similaridade com as sequencias de genoma de A. aegypti e distintas ferramentas bioinformáticas foram usadas para obter informação funcional de muitas dessas sequencias que estão pobremente anotadas. Foram identificadas 59 proteínas entre v Resumo as quais três serino-peptidases, e dessas, duas do tipo tripsina e uma quimiotripsina. Os resultados obtidos nos permitiram atribuir de maneira confiável um local de expressão para os genes de tripsina, tripsina alfa e quimotripsina. Em outras palavras, podemos afirmar que os genes acima mencionados se expressam no intestino médio de fêmeas adultas de A. albopictus alimentadas com açúcar. Este achado representa um pequeno, mas importante passo, para a atribuição funcional, ao nível de proteína, de genes codificantes para serino-peptidases do tipo tripsina e quimiotripsina no gênero Aedes / The mosquitoes Aedes albopictus (Skuse, 1894) and Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) have significant epidemiological importance within the family Culicidae because they are the main vectors of the yellow fever virus and the four serotypes of Dengue virus. Peptidases or proteases are enzymes that hydrolyze peptide bonds. In the digestive system of invertebrates, the peptidases, specifically those from the class of serine peptidases, are abundant and participate in various physiological processes, playing a major role in the hydrolysis of proteins destined to nutrition. These enzymes may have species-specific characteristics, and such differences reflect adaptive responses to different lifestyles and environments. In this work we describe the characterization, using zymography, of the proteolytic activities detected in total extracts of larval forms of A. aegypti and A. albopictus. The stability of expression of peptidases in these species was evaluated by comparing the proteolytic profile of larval forms obtained from eggs of newly collected insects to that from eggs of insect kept in colony for a long period. We also compared the proteolytic profiles of pupae as well as the thermal stability of the peptidases detected. Complex profiles of trypsin-like serine peptidases were observed in both species. However, these profiles differ between species and also differences between the different evolutionary stages were detected within the same species. Also, in this work, we describe the characterization of the proteolytic activities detected in the midgut of A. albopictus females fed on sugar as well as the first proteome map and proteomic identification of peptidases in this organ, using two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry. The strategies used to analyze the proteases expressed in this tissue are discussed here. The proteins expressed in the midgut of A. albopictus were identified by similarity with the genome sequences of A. aegypti and various bioinformatic tools were used to obtain functional information for many of these sequences that are poorly annotated. We identified 59 proteins including three serine peptidases, and among these, two types of trypsin-like and one chymotrypsin. The results obtained here allowed us to reliably assign a localization for the expression of trypsin, trypsin-alpha and chymotrypsin genes. In other words, we can say that the above mentioned genes are expressed in the midgut of adult females of A. albopictus fed with sugar. This finding represents a small but important step for the functional assignment, at the protein level, of the genes coding for trypsin-like and chymotrypsin serine peptidases of the Aedes genus.

Orientador : Prof. Dr. Silvio Marques Zanata / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 29/08/2016 / Inclui referências : f. 81-84 / Área de concentração: Patologia / Resumo: USP2a é uma importante enzima deubiquitinase (DUB) capaz de remover a ubiquitina de diferentes substratos, como da enzima FASN e do receptor de fator de crescimento epidermal (EGFR). Em tumores de próstata observa-se uma correlação positiva entre a expressão de USP2a e a tumorigênese, caracterizando-a como uma proteína oncogênica. Essa característica da DUB está principalmente relacionada com sua função estabilizadora da enzima FASN, responsável pela síntese de ácidos graxos na célula. A USP2a também resgata o EGFR da degradação, mantendo seus níveis celulares elevados. Sabe-se que o direcionamento de proteínas da membrana plasmática para a via do corpo multivesicular requer a ação dos complexos proteicos ESCRTs. Um deles, o ESCRT-0, possui duas subunidades: Hrs, responsável por direcionar o complexo aos endossomos precoces, e a subunidade STAM, capaz de interagir com diferentes DUBs. Sabe-se que a USP2a co-localiza com EEA1, um marcador de endossomos precoces, então decidiu-se analisar se a USP2a interage também com STAM, e identificar o sítio dessa interação. Para isso, linhagens celulares normais e tumorais de próstata foram modificadas para expressar permanentemente a forma selvagem e o mutante cataliticamente inativo de USP2a, e também foram silenciadas para a expressão de STAM. As sequências de STAM, de sua região SH3 e do mutante STAM SH3 foram clonadas, com o intuito de se obter plasmídeos de superexpressão para esses construtos. A primeira evidência de interação entre USP2a e STAM foi observada em ensaio de co-imunoprecipitação com células tumorais de próstata superexpressando USP2a, mas esse resultado ainda não foi totalmente confirmado. A região de STAM que pode contribuir para essa interação não foi identificada devido a baixos níveis de expressão dos construtos. Uma relação indireta entre USP2a e STAM foi observada, com o aumento da ubiquitinação de STAM com a superexpressão da forma selvagem da enzima em células de próstata, sem alterar os níveis celulares da proteína. Observou-se também que STAM é capaz de modular a reciclagem de EGFR em linhagens celulares de próstata, uma vez que seu silenciamento aumenta a taxa de degradação de EGFR. Analisou-se também o efeito fenotípico da deleção do gene fasn em camundongos com tumores de próstata induzidos pela perda de Pten. Verificou-se que a inibição genética de FASN reduz a incidência de formas agressivas de tumores de próstata nos animais. Os resultados obtidos sugerem que FASN, assim como USP2a, pode ser um importante alvo farmacológico para o tratamento de tumores de próstata. Palavras-chave: USP2a. ESCRT-0. STAM. EGFR. FASN. / Abstract: USP2a is an important deubiquitinating enzyme (DUB) capable of removing ubiquitin from different substrate proteins, like FASN and epidermal growth factor receptor (EGFR). In prostate tumors there is a positive correlation between USP2a expression level and tumorigenesis, which makes it an oncogenic protein. This characteristic is mainly related with its ability to stabilize FASN, the enzyme that synthesizes fatty acids in cells. USP2a also rescues EGFR from lysosomal degradation, keeping its cellular levels raised. orting of plasma membrane proteins into multivesicular body pathway requires the ESCRTs complexes. One of these, the ESCRT-0, has two subunits: the subunit Hrs, that is responsible for targeting the complex to early endosome, and the subunit STAM, which interacts with different DUBs. -localizes with EEA1, a marker of early endosomes, so we decided to analyze if USP2a also interacts with STAM, whether this interaction is needed to taking USP2a to early endosome and identify the protein site required for this interaction. For this, normal and tumoral prostate cell lines were modified to permanently overexpress USP2a wild type and its catalytically inactive mutant, these cell lines also had the STAM expression knocked down. Molecular cloning of STAM, its SH3 region and a mutant lacking SH3, all tagged with GFP, were performed in order to obtain plasmids for overexpression of this constructs. The first sign of interaction between USP2a and STAM was observed with a co-immunoprecipitation assay in prostate tumoral cells overexpressing USP2a, but it was not fully confirmed. The region of STAM constructs. Indirect relationship between USP2a and STAM was observed, since overexpression of wild type USP2a is related with enhanced ubiquitination of STAM in prostate cell lines, even though the protein level remains the same. STAM is also capable of affect EGFR recycling in prostate cell lines, since STAM knocked down cells shown enhanced degradation of EGFR. It was also analyzed the effect of fasn gene deletion on Pten loss driven prostate tumors. The genetic ablation of FASN reduced the incidence of aggressive prostate tumors in mice, suggesting that FASN, as well as USP2a, could be an important pharmacological target for treatment of prostate cancer. Key words: USP2a. ESCRT-0. STAM. EGFR. FASN.

Metarhizium anisopliae é um fungo filamentoso entomopatogênico muito versátil que infecta, aproximadamente, 300 espécies de artrópodes, e também é adaptado à vida na rizosfera de plantas, sendo de extrema importância para o controle biológico de pragas na agricultura e pecuária. De acordo com o comportamento promíscuo desse fungo, pesquisadores têm identificado um grande número de genes relacionados à interação com o hospedeiro, e que são regulados de acordo com a sua indução. Em sua maioria, são genes que codificam para enzimas hidrolíticas. O número e a diversidade desses genes podem ser a chave para a habilidade desse patógeno em infectar uma larga variedade de artrópodes, podendo expressar genes diferentemente para cada tipo de hospedeiro. M. anisopliae secreta, entre outros, complexos quitinolítico e proteolítico para a degradação da quitina e proteínas presentes na cutícula do hospedeiro.Desse modo, o estudo da regulação dessas enzimas é de fundamental importância para o entendimento do processo de infecção; sendo assim, através desse trabalho foi observada e analisada a especialização na expressão de proteínas, especialmente de quitinases e proteases, secretadas por uma linhagem selvagem de M. anisopliae, na presença de cutículas de diferentes artrópodes, particularmente, de Dysdercus peruvianus, Boophilus microplus, Anticarsia gemmatalis e de quitina cristalina, através de ensaios de detecção enzimática e eletroforese uni e bidimensional. Em todos os experimentos, variando-se as condições de fonte de carbono e tempo de cultivo, a secreção de proteínas se mostrou altamente diferenciada, demonstrando comportamento diferencial do fungo a vários hospedeiros, o que seria um sinal da versatilidade do entomopatógeno, aqui estudado, para a capacidade de infectar centenas de hospedeiros. / Metarhizium anisopliae is a very versatile entomopathogenic filamentous fungus that infects, approximately, 300 species of arthropods, and is also adapted to the life in the rhizosphere of plants, being of extreme importance for the biological control of pests in agriculture and pecuary. In accordance with this promiscuous behavior of this fungus, researchers have identified a great number of genes related to the interaction with the host, and that they are regulated in accordance with its induction. In their majority, these genes encode for hydrolytic enzymes. The diversity of these genes can be the key for the ability of this pathogen in infect a wide variety of arthropods, being able to differently express genes for each type of host. M. anisopliae secretes chitinolytic and proteolytic complexes for the degradation of the chitin and proteins present in the cuticle of the host. In this way, the study of the regulation of these enzymes is of up fundamental importance for the understanding of the infection process. Through this research, the specialization in the expression of proteins, especially chitinases and proteases, secreted by a wild strain of M. anisopliae, in the presence of cuticles of different arthropods, particularly, of Dysdercus peruvianus, Boophilus microplus, Anticarsia gemmatalis and crystalline chitin, was observed and analyzed through enzymatic assays and one- and two-dimensional electrophoresis. In all the experiments, the conditions of the carbon source and time of culture, the protein secretion showed highly differentiated, demonstrating distinguishing fungus behavior to various hosts, which would be a sign of the versatility of this entomopathogen for the capacity of infecting hundreds of hosts.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2016. / Submitted by Aline Mequita (alinealmeida@bce.unb.br) on 2016-11-21T16:28:26Z No. of bitstreams: 1 2016_GabrielaCorezziWerneck.pdf: 1385523 bytes, checksum: c2833d3a8449c2a1c2ac26e1daebbd63 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-01-06T18:37:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_GabrielaCorezziWerneck.pdf: 1385523 bytes, checksum: c2833d3a8449c2a1c2ac26e1daebbd63 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-06T18:37:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_GabrielaCorezziWerneck.pdf: 1385523 bytes, checksum: c2833d3a8449c2a1c2ac26e1daebbd63 (MD5) / Proteases são enzimas, que catalisam a hidrolise das ligações peptídicas. Estas enzimas são aplicadas em diversas indústrias como a alimentícia, farmacêutica, cosmética, de couro e de detergente. São produzidas por animais, plantas e microrganismos. Entre seus produtores encontram-se os fungos endofíticos, que são microrganismos que vivem no interior de plantas de forma simbiótica. Sabendo disso, o objetivo principal deste trabalho foi isolar fungos endofíticos de plantas do cerrado, avalia-los quanto á produção de proteases extracelulares, visando aplicação industrial. Foram isolados 58 fungos de 13 espécies de plantas endêmicas do cerrado. Primeiramente, foi realizada uma triagem para avaliar quais fungos eram produtores de protease, 36 fungos demonstraram halo indicando produção de protease em meio de cultura ágar-leite. Foi realizado ensaio enzimático utilizando azocaseína 0,5% como substrato para avaliar quantitativamente a produção de proteases. Os produtores que demonstraram maior atividade de protease foram os fungos endofíticos codificados como BR, OH03, PT02, PEQ03 e KC01. O fungo BR, apresentou 41 UI/mL de atividade proteolítica, pH ótimo 7,0 e temperatura ótima de 60°C e foi escolhido para dar continuidade ao trabalho. Visando a otimização da produção de protease foram testados meios com diferentes fontes de nitrogênio e carbono, a maior produção de proteases ocorreu no meio contendo peptona, extrato de levedura e glicose. A curva de crescimento mostrou que o melhor dia de produção da enzima foi o 9° dia. A protease foi parcialmente purificada utilizando cromatografia de troca iônica. A fração parcialmente purificada foi caracterizada com atividade ótima em pH 7,0 e 60°C e manteve 100% desta atividade a 60°C por 1 hora. A enzima foi testada como removedor de manchas para a indústria de detergentes melhorando a remoção de manchas quando adicionada a um detergente comercial e demonstrou ser compatível com marcas de detergente para roupas comerciais. ___________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Proteases are enzymes which catalyze the hydrolysis of peptides bonds. These enzymes are applied in various industries such as food, pharmaceutical, cosmetics, leather and detergent. They are produced by animals, plants and microorganisms. Among its producers are the endophytic fungi, which are microorganisms that live inside plants symbiotically. Thus, the aim of this study was to isolate endophytic fungi of the Cerrado biome plants and evaluate the production of extracellular proteases for an industrial application. It was isolated 58 endophytic fungi from 13 different species of endemic plants. First, a screening was performed to evaluate fungi protease producing. 36 fungi has shown halo production using milk agar culture. Enzyme assay was performed using azocasein 0.5% as substrate to evaluate quantitatively the production of proteases. The best producers were endophytes encoded as BR, OH03, PT02, PEQ03 and KC01. Since then BR fungus stood out among them. BR showed 41 IU / mL of proteolytic activity, optimum pH 7.0 and optimum temperature of 60 °C and was chosen. To optimize protease production the medium were tested with different carbon and nitrogen sources. The best production of proteases occurred in a medium containing peptone, yeast extract and glucose. The best day of the enzyme production, based on growth curve curve, was the 9th day. The protease was partially purified using ion exchange chromatography. The partially purified fraction was characterized and showed highest activity at pH 7.0, 60 °C and maintained 100% stability at 60 °C for 1 hour. The enzyme was tested as stain remover detergent industry to improve the spot removal. When added to a commercial detergent, the enzyme demonstrated to be compatible with commercial brands of detergent clothes.

Submitted by MARINA VITTI VIANNA null (marinavvianna@gmail.com) on 2016-07-18T13:13:27Z No. of bitstreams: 1 dissert-Marina-vfinal-Marina-Lara.pdf: 1520355 bytes, checksum: 30f9fad60558010a60aa7aadc9c7f67f (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-07-18T17:06:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 vianna_mv_me_rcla.pdf: 1520355 bytes, checksum: 30f9fad60558010a60aa7aadc9c7f67f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-18T17:06:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 vianna_mv_me_rcla.pdf: 1520355 bytes, checksum: 30f9fad60558010a60aa7aadc9c7f67f (MD5) Previous issue date: 2016-07-04 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Ambientes extremos são fontes potenciais para a descoberta de novos produtos naturais com propriedades específicas para aplicação biotecnológica, devido ao pouco conhecimento sobre a diversidade e os recursos genéticos dos micro-organismos que habitam esses locais. Micro-organismos do ambiente Antártico têm demonstrado potencial para produção de enzimas ativas em temperaturas brandas com aplicação em diversos setores de importância econômica. Neste contexto, o presente trabalho avaliou a produção de L-asparaginase e proteases produzidas por fungos filamentosos (n=161) e leveduras (n=137), isolados de oito diferentes amostras de solos da Antártica (coletados na expedição Antártica de nov/dez de 2013 no âmbito do INCT Criosfera). Os fungos filamentosos e as leveduras encontram-se preservados na coleção de pesquisa vinculada à Central de Recursos Microbianos da UNESP (CRM-UNESP). Um total de 101 (62,7%) fungos filamentosos apresentou potencial para produção da enzima L-asparaginase em meio sólido (triagem qualitativa), porém nos testes quantitativos em meio líquido a enzima não foi produzida nas condições utilizadas. Com relação às proteases, 121 (75,1%) fungos apresentaram halo de degradação em meio sólido e 30 (18.6%) isolados apresentaram resultados de atividade de proteases acima de 45,0 U/mL. Dentre eles, 13 (8,7%) foram capazes de produzir proteases acima 100,0 U/mL: sete isolados apresentaram atividade de proteases alcalina e seis de proteases ácidas. Os isolados 5BI (Aspergillus sp.) e 6 MP (Thelebolus sp.) se destacaram na produção de proteases ácidas e alcalinas, respectivamente, e foram submetidos ao planejamento experimental. Os resultados indicaram um aumento significativo na produção de proteases a 10ºC e 150 rpm: 7,41 vezes para a produção de proteases ácidas pelo fungo 5BI (1.810,0 U/mL) e 5,38 vezes (1.542,5 U/mL) para a produção de proteases alcalinas pelo fungo 6MP. Para ambos os isolados as condições aplicadas que resultaram nos valores máximos de produção de proteases foram validadas. Os resultados da avaliação da diversidade das 137 leveduras (MSP-PCR) revelaram a ocorrência de 22 táxons distintos distribuídos em 8 gêneros, com predominância de Cryptococcus (21,1%), Rhodotorula e Candida (20,4%). Outros gêneros menos predominantes encontrados foram: Cystofilobasidium (13,8%), Rhodosporidium (13,1%), Leucosporidium (8,7%), Guehomyces (6,5%), Debaryomyces (3,6%), Bulleromyces (2,9%) e Malassezia (2,1%). Com base nos índices de Simpson, Shannon e Chao o solo BI (solo de biofilme, Deception) foi o mais diverso e o que apresentou a maior riqueza. Análises dos parâmetros físico-quimicos dos solos e de diversidade revelaram proximidade entre os solos MP (solo embaixo de madeira podre, Deception), FE (solo embaixo de barra de ferro, Deception) e CG 4.0 (solo embaixo de camada de gelo, Rei George). O presente trabalho apresenta uma visão geral da diversidade de leveduras nos diferentes tipos de solos de Ilhas Antárticas e revela o potencial biotecnológico de fungos filamentosos para produção de proteases ácidas e alcalinas. / Extreme environments are potential sources for the discovery of new natural products with specific properties for biotechnological applications due to little knowledge about the diversity and genetic resources of microorganisms that inhabit these places. Microorganisms from the Antarctic environment have shown potential for producing active enzymes in mild temperatures with application in various sectors of economic importance. In this context, the present study evaluated the production of proteases and L-asparaginase by filamentous fungi (n= 161) and yeasts (n= 137) isolated from seven different samples of the Antarctic soils (collected in the Antarctic expedition Nov/Dec 2013 - INCT Cryosphere Project). The isolates are being maintained in the research collection linked to the Microbial Resource Center of UNESP (CRM-UNESP). A total of 101 (62.7%) filamentous fungi showed potential for production of L-asparaginase on solid medium (qualitative screening), but in the quantitative screening in liquid medium the enzyme was not produced. Concerning proteases production, 121 (75.1%) filamentous fungi presented halo of degradation on solid medium and 30 (18.6%) isolates showed protease activity above 45.0 U/mL Among them, thirteen (8.7%) isolates were able to produce protease above 100.0 U/mL: seven isolates produced alkaline proteases and six acid proteases. The isolates 5BI (Aspergillus sp.) and 6 MP (Thelebolus sp.) showed the best results in the production of acid and alkaline proteases, respectively, and were submitted to the experimental design. Results indicated a significant increase in protease production at 10 °C and 150 rpm: 7.41 times for the production of acid proteases by the fungus 5BI (1,810.0 U/mL) and 5.38 times (1,542.5 U/mL) for the production of alkaline proteases by the fungus 6MP. For both isolates the conditions applied for the maximum production of proteases were validated. Results related to the assessment of the diversity of the 137 yeasts (MSP-PCR) revealed the presence of 22 different taxa, especially the genera Cryptococcus (21.1%), Rhodotorula e Candida (20.4%). Other less prevalent genera found were: Cystofilobasidium (13.8%), Rhodosporidium (13.1%), Leucosporidium (8.7%), Guehomyces (6.5%), Debaryomyces (3.6%), Bulleromyces (2.9%), and Malassezia (2.1%). Based on the Simpson, Shannon and Chao indexes, the soil BI (biofilm soil, Deception Island) was the most diverse and presented the greatest richness. Analysis of physicochemical parameters of the soils and their diversity revealed that MP (soil under rotten wood, Deception), FE (soil under iron bar, Deception), and GC 4.0 (soil under layer ice, King George) are closed related. The present work presents an overview of the diversity of yeast in different types of soils from Antarctic Islands and reveals the biotechnological potential of filamentous fungi for the production of acid and alkaline proteases. / FAPESP: 2014/10207-4

Cistatinas são um grupo de inibidores de cisteíno proteases que atuam na regulação da proteólise e estão presentes em uma ampla variedade de organismos. Estudos sobre essa classe de inibidores em parasitas têm contribuído para elucidar suas funções na regulação de processos fisiológicos como a digestão do sangue e a supressão da resposta imune do hospedeiro durante a alimentação. Por isso, cistatinas são um alvo interessante na pesquisa para o desenvolvimento de novos métodos de controle de parasitas. Além disso, a caracterização de proteínas compartilhadas por diferentes espécies de parasitas representa uma estratégia viável para encontrar potenciais alvos para uma vacina multi-espécie. Entretanto, as funções das cistatinas nos carrapatos permanecem obscuras, especialmente na espécie Ixodes ovatus. Neste trabalho, foi caracterizado o perfil inibitório de rJpIocys2a, uma cistatina de I. ovatus, para as catepsinas B, C e L. O perfil de inibição enzimática de rJpIocys2a se mostrou variável entre catepsinas envolvidas na digestão do sangue pelo carrapato e na evasão da resposta imune do hospedeiro. Além disso, um peptídeo baseado na sequência de aminoácidos do inibidor JpIocsy2a (STQ-pep) foi sintetizado e utilizado para imunização de coelhos. O soro anti-STQ-pep foi usado para analisar a antigenicidade cruzada entre cistatinas dos carrapatos Rhipicephalus microplus e I. ovatus. A análise da antigenicidade cruzada revelou que anticorpos gerados contra o peptídeo são capazes de reconhecer cistatinas nativas e recombinante de R. microplus. A habilidade de rJpIocys2a de inibir catepsinas relacionadas a diferentes funções sugere múltiplas funções para esse inibidor. Os resultados obtidos neste trabalho forneceram bases para outros experimentos que utilizem esta proteína como antígeno vacinal. / Cystatins are a group of cysteine protease inhibitors that act on the regulation of physiological proteolysis and are present in a wide range of organisms. Researches on this class of inhibitors in parasites have contributed to clarify their roles in the regulation of important physiological processes, such as blood digestion and suppression of the host immune response during blood feeding. Thus, cystatins are a topic of research for the development of new parasite control methods. Additionally, the characterization of proteins shared by different parasite species represents a valuable strategy to identify potential targets for a multi-species vaccine. However, cystatin functions in ticks remain undetermined, especially in Ixodes ovatus. This work characterized the inhibitory profile of rJpIocys2a, an I. ovatus cystatin, to cathepsins B, C, and L. The enzymatic inhibition profile of JpIocys2a shows a distinct modulation of cathepsins related to tick blood digestion and evasion of host immune response. In addition, a peptide from JpIocys2a amino acid sequence (STQ-pep) was synthesized and used for rabbit immunization. Anti-STQ-pep serum was used to analyze the cross-antigenicity between Rhipicephalus microplus and I. ovatus cystatins. Crossantigenicity assays revealed that antibodies against the JpIocys2a peptide are able to recognize native and recombinant R. microplus ticks cystatins. The ability of rJpIocys2a to inhibit cathepsins related to different functions suggests multiple roles for JpIocys2a. The results obtained in this work provided basis for further experiments using this protein as a vaccine antigen.

Cistatinas são um grupo de inibidores de cisteíno proteases que atuam na regulação da proteólise e estão presentes em uma ampla variedade de organismos. Estudos sobre essa classe de inibidores em parasitas têm contribuído para elucidar suas funções na regulação de processos fisiológicos como a digestão do sangue e a supressão da resposta imune do hospedeiro durante a alimentação. Por isso, cistatinas são um alvo interessante na pesquisa para o desenvolvimento de novos métodos de controle de parasitas. Além disso, a caracterização de proteínas compartilhadas por diferentes espécies de parasitas representa uma estratégia viável para encontrar potenciais alvos para uma vacina multi-espécie. Entretanto, as funções das cistatinas nos carrapatos permanecem obscuras, especialmente na espécie Ixodes ovatus. Neste trabalho, foi caracterizado o perfil inibitório de rJpIocys2a, uma cistatina de I. ovatus, para as catepsinas B, C e L. O perfil de inibição enzimática de rJpIocys2a se mostrou variável entre catepsinas envolvidas na digestão do sangue pelo carrapato e na evasão da resposta imune do hospedeiro. Além disso, um peptídeo baseado na sequência de aminoácidos do inibidor JpIocsy2a (STQ-pep) foi sintetizado e utilizado para imunização de coelhos. O soro anti-STQ-pep foi usado para analisar a antigenicidade cruzada entre cistatinas dos carrapatos Rhipicephalus microplus e I. ovatus. A análise da antigenicidade cruzada revelou que anticorpos gerados contra o peptídeo são capazes de reconhecer cistatinas nativas e recombinante de R. microplus. A habilidade de rJpIocys2a de inibir catepsinas relacionadas a diferentes funções sugere múltiplas funções para esse inibidor. Os resultados obtidos neste trabalho forneceram bases para outros experimentos que utilizem esta proteína como antígeno vacinal. / Cystatins are a group of cysteine protease inhibitors that act on the regulation of physiological proteolysis and are present in a wide range of organisms. Researches on this class of inhibitors in parasites have contributed to clarify their roles in the regulation of important physiological processes, such as blood digestion and suppression of the host immune response during blood feeding. Thus, cystatins are a topic of research for the development of new parasite control methods. Additionally, the characterization of proteins shared by different parasite species represents a valuable strategy to identify potential targets for a multi-species vaccine. However, cystatin functions in ticks remain undetermined, especially in Ixodes ovatus. This work characterized the inhibitory profile of rJpIocys2a, an I. ovatus cystatin, to cathepsins B, C, and L. The enzymatic inhibition profile of JpIocys2a shows a distinct modulation of cathepsins related to tick blood digestion and evasion of host immune response. In addition, a peptide from JpIocys2a amino acid sequence (STQ-pep) was synthesized and used for rabbit immunization. Anti-STQ-pep serum was used to analyze the cross-antigenicity between Rhipicephalus microplus and I. ovatus cystatins. Crossantigenicity assays revealed that antibodies against the JpIocys2a peptide are able to recognize native and recombinant R. microplus ticks cystatins. The ability of rJpIocys2a to inhibit cathepsins related to different functions suggests multiple roles for JpIocys2a. The results obtained in this work provided basis for further experiments using this protein as a vaccine antigen.

Submitted by Luiz Felipe Barbosa (luiz.fbabreu2@ufpe.br) on 2015-04-17T14:49:01Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Janilson Felix.pdf: 2886747 bytes, checksum: 655fb97010872b0b61680f88cdeefff8 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T14:49:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Janilson Felix.pdf: 2886747 bytes, checksum: 655fb97010872b0b61680f88cdeefff8 (MD5) Previous issue date: 2013-07-30 / FACEPE CAPES / No presente estudo foram avaliados os desempenhos zootécnicos e as atividades das enzimas digestórias do hepatopâncreas do Litopenaeus vannamei em diferentes condições de cultivo. Três experimentos foram desenvolvidos. No primeiro (E1), adotaram-se três unidades experimentais, sendo um sistema água clara com aplicação de ração e dois sistemas com bioflocos, um com adição de ração e outro sem alimentação. O segundo experimento (E2) consistiu num delineamento inteiramente casualizado, com quatro tratamentos envolvendo diferentes concentrações de proteínas na ração comercial (20%, 25%, 30% e 35%). Por fim, no terceiro experimento (E3), os camarões foram submetidos às dietas com diferentes níveis de substituição da farinha de peixe (0% (C), 30% (S30), 60% (S60) e 100% (S100)) por concentrado protéico de soja (SPC). Para a análise das enzimas digestivas presentes nos extratos enzimáticos realizou-se ensaios in vitro na presença dos substratos de cadeia longa (azocaseína 1% e amido 2%), p-nitroanilide (BApNA, SApNA e Leu-p-Nan) e β-naphthylamide (alanina, arginina, leucina, tirosina, serina, glicina, isoleucina e histidina). Além disso, foram realizados SDS-PAGE e zimogramas de atividade proteolítica e amilolítica. Ao final dos experimentos, observou-se no E1 que os sistemas de bioflocos aumentaram as atividades das proteases digestórias quando comparadas às apresentadas pelo sistema autotrófico. No E2 não foram evidenciadas diferenças estatísticas (P<0,05) entre os animais, tanto no ganho de peso e biomassa final quanto na taxa de sobrevivência. Maior atividade proteolítica total (1,54 ± 0,11U·mg-1) e tríptica (15,00 ± 0,75 mU·mg-1) foram observadas para o tratamento 20%. Para quimotripsina, a atividade no tratamento 35% (0,16 ± 0,03 mU·mg-1) foi consideravelmente maior que as dos demais grupos. Em relação às leucineaminopeptidases foi observada maior atividade no grupo 30% (0,26 ± 0,03 mU·mg-1). Em relação às atividades enzimáticas do E3, ocorreram maiores atividades de enzimas quimotripsina (13,78±1,61 U.mg-1) e leucine aminopeptidase (0,45±0,03 U.mg-1) foram observadas para o grupo controle (C). Enquanto que a mais elevada atividade tríptica (13,13±0,53 U.mg-1) foi constatada para o tratamento S30. Entre os substratos β-naphthylamide analisados, verificou-se valores mais altos de atividade aminopeptídica para arginina e alanina em todos os tratamentos, principalmente no S30 que também obteve maior atividade na presença da glicina (1,05±0,08 U.mg-1). Notou-se que para a serina, a atividade das aminopeptidases sofreu uma redução gradativa à medida que aumentou o nível de SPC na dieta dos camarões. O tratamento S60 apresentou maior atividade aminopeptídica para isoleucina (0,69±0,02 U.mg-1) e histidina (0,85±0,04 U.mg-1). Em relação à leucina e tirosina, a atuação das aminopeptidases mostrou-se indiferente estatisticamente às variações dietárias. De acordo com o perfil eletroforético através de SDS-PAGE, observaram-se 17 bandas nas dietas 35%, 30% e 20% e 16 bandas para 25% no tratamento E2, enquanto que no E3 foram observadas vinte e seis bandas protéicas, compreendidas entre 6,9 e 198,8 KDa, para todos os tratamentos. Os zimogramas revelaram seis bandas com alta intensidade para os sistemas de bioflocos e três nos autototrófico no E1. E2 apresentou 12 bandas com atividades proteolíticas para 35% e 30% e 9 bandas para 25% e 20%. Em E3, o zimograma de protease exibiu dois perfis semelhantes, um com 18 (C e S30) e outro com 12 bandas proteolíticas (S60 e S100). Enquanto que o zimograma de amilase revelou cinco bandas com atividade amilolítica para todos os tratamentos. Com os resultados expostos, observou-se que os sistemas de bioflocos, proporcionou um efeito positivo na performance dos animais, mesmo reduzindo o teor de proteína nas dietas, bem como na substituição da farinha de peixe por SPC em 30, 60 e 100%.