Orientador: Paula Rahal / Coorientador: Mânlio Tasso de Oliveira Mota / Banca: Carolina Colombelli Pacca / Banca: Silvana Gisele Pegorin de Campos / Resumo: O carcinoma epidermóide de pênis (CEP) é um tumor epitelial invasivo relativamente raro com alta morbidade, decorrente da própria doença ou de seu tratamento. Pacientes sem tratamento geralmente vão a óbito dentro de dois anos após o diagnóstico, devido o descontrole loco-regional ou a metástases distantes. Nos últimos anos, tem sido constatado que a infecção pelo vírus do papiloma humano (HPV), de alto risco, é um dos principais fatores de risco para o desenvolvimento do CEP. Sabe-se que duas proteínas virais, E6 e E7, estão associadas ao desenvolvimento tumoral em outros tipos de carcinomas causados por HPV. Porém, no CEP, os mecanismos moleculares envolvidos na replicação viral e suas interações com a célula hospedeira ainda não estão bem esclarecidos. A proteína viral E6 está associada à degradação de p53 enquanto a proteína E7 está associada à desestabilização da via de fosforilação da proteína Rb, na qual a ciclina D1 e a proteína p16 estão estreitamente relacionadas. O objetivo deste projeto foi correlacionar a presença de HPV de alto risco com os níveis de expressão das proteínas celulares p53, p16 e ciclina D1 em amostras de CEP. Foi realizado estudo comparativo com 61 amostras de pacientes infectados por HPV de alto risco e pacientes sem infecção. Observou-se que em tecidos com HPV de alto risco há diminuição da expressão de p53 e ciclina D1 e aumento de expressão de p16 em relação às amostras negativas (p<0,05). Não existem muitos estudos sobre este tumor. O presente trabalho pode contribuir para uma maior compreensão deste tumor e permitindo melhores tratamentos e prognósticos do paciente, além de contribuir para a definição de novas metodologias para a distinção entre lesões associadas ou não ao HPV de alto risco / Abstract: Squamous cell carcinoma of the penis (SCCP) is a relatively rare invasive epithelial tumor with high morbidity due to the disease itself or its treatment. Untreated patients usually die within two years after diagnosis, due to the uncontrolled locoregional recurrence or distant metastases. In the last years, it has been observed that infection by the high risk human papilloma virus (HPV) is one of the main risk factors for SCCP development. It is known that the E6 and E7 viral proteins are associated with tumor development in other HPV associated carcinomas. However, about SCCP, the molecular mechanisms involved in viral replication and its interactions with the host cell are not well understood. The E6 viral protein is linked to the p53 cellular degradation whereas the E7 is linked with destabilization via phosphorylation of Rb protein, in which cyclin D1 and p16 are closely related. The goal of this project was to correlate the high-risk HPV presence with the expression levels of cellular proteins p53, p16 and cyclin D1 in SCCP samples. Comparative study was conducted with 61 samples from patients infected or not with high-risk HPV. It was observed that in high-risk HPV tissues there is down expression of p53 and cyclin D1 and overexpression of p16 when compared to negative samples (p <0.05). There are not many studies on this tumor. This study may contribute to a greater understanding of this tumor, allowing better treatments and prognoses for patients, and contribute to the development of new methodologies for the distinction between lesions associated or not with high-risk HPV / Mestre

Orientador: Paula Rahal / Coorientador: Marilia de Freitas Calmon / Coorientador: Luis Octavio Regasini / Banca: Ana Paula Girol / Banca: Aripuanã Sakurada Aranha Watanabe / Resumo: Os Papilomavírus humanos (HPVs) são vírus de DNA divididos em dois grupos. O de baixo risco, associado a lesões benignas, e o de alto risco, associado a diversos tipos de câncer. As oncoproteínas E6 e E7 são as principais proteínas envolvidas no processo de carcinogênese decorrente da infecção por esses vírus, de forma que compostos naturais têm sido utilizados na busca por drogas que inibam a expressão viral. Paralelamente, devido aos diversos efeitos colaterais e alto índice de reincidência dos tratamentos tradicionais contra o câncer, a procura por agentes antitumorais é intensa. Nesse contexto, diversas pesquisas estão sendo realizadas afim de explorar as inúmeras propriedades da curcumina, uma substância que apresenta atividade antiinflamatória, imuno-modulatória, antioxidante, anti-angiogênica, quimioprotetora, antiproliferativa, antitumoral e antimicrobiana. Assim, uma estratégia promissora utilizada é a busca por análogos de curcumina que consigam aumentar a eficácia terapêutica desse fitoterápico. Dessa forma, o objetivo desse trabalho é analisar in vitro a ação de diferentes derivados semi-sintéticos de curcumina (AC1, AC2, AC7, AC10 E AC13) sobre a expressão dos oncogenes virais E6 e E7 em linhagem de carcinoma cervical HPV-16 positiva (CasKi) e a atividade antitumoral do composto AC13 em diferentes linhagens tumorais (CasKi, HeLa, MDA-MB- 231, MCF-7 e 786-O). Para isso, após a incubação com os compostos em diferentes concentrações, a viabilidade das células foi analisada por ensaio MTT e uma linhagem imortal transformada de queratinócito humano (HaCaT) foi utilizada como controle para análise da citotoxicidade. Posteriormente, a avaliação da expressão do RNAm de E6 e E7 foi realizada por PCR em tempo real, a determinação da expressão da proteína p53 por Western Blotting e a detecção da atividade das caspases 3 e 7 foi... / Abstract: High risk Human Papilomavírus (HPVs) are DNA vírus divided in two groups. Low risk, associated with benign lesions, and high risk, associated with several types of cancer. Oncoproteins HPV E6 and E7 are the main proteins involved in the carcinogenesis process due to infection by this virus, so that natural coumponds have been used in the search for drugs that inhibit viral expression. At the same time, due to various side effects and high relapse rate of traditional cancer treatments, the search for antitumor agents is intense. In this context, several studies are being conducted in order to explore the numerous properties of curcumin, a substance that has anti-inflammatory, immune-modulatory, anti-oxidant, anti-angiogenic, chemoprotective, anti-proliferative, anti-tumor and anti-microbial properties. Thus, a promising strategy used is the search for curcumin analogues which are able to increase the therapeutic efficacy of phytotherapy. Thus, the aim of this study is to analyze the action of different semi-synthetic derivatives of curcumin (AC1, AC2, AC7, AC10 and AC13) on the E6 and E7 viral oncogenes expression in positive HPV-16 cervical carcinoma cell line (CasKi) and the antitumor activity of AC13 compound in different tumor cell lines (CasKi, HeLa, MDA 231, MCF-7 and 786-O). For this, after incubation with the compounds at different concentrations, cell viability was analyzed by MTT assay and a spontaneously transformed immortal keratinocyte cell line (HaCaT) was used as a control to analyze the cytotoxicity. Subsequently, E6 and E7 mRNA expression evaluation was performed by real-time PCR, p53 protein expression determination was analyzed by Western Blotting, and detecting the caspases 3 and 7 activity was analyzed using the luminescent assay of apoptosis. Although no compound has inhibited E6 and E7 expression in the CasKi cell line, AC13 cytotoxicity analyzes suggest ... / Mestre

Orientador: Glauco Issamu Miyahara / Coorientador: Sandra Helena Penha de Oliveira / Coorientador: Daniel Galera Bernabé / Banca: Fábio de Abreu Alves / Banca: Éder Ricardo Biasoli / Resumo: O papilomavírus humano (HPV) vem sendo associado ao carcinoma espinocelular (CEC) de orofaringe, como um possível fator etiológico. As oncoproteínas virais E6 e E7 são capazes de inibir a produção de citocinas do padrão Th1 e iniciar a produção de citocinas do padrão Th2, prejudicando a resposta celular frente à infecção. O propósito deste trabalho é avaliar o efeito das oncoproteínas virais E6 e E7 do HPV-16 sobre a resposta de células T (CD4 e CD8) de pacientes com e sem CEC de cabeça e pescoço. Foram recrutados para o estudo 20 indivíduos, sendo 10 pacientes com diagnóstico de CEC de cabeça e pescoço e 10 indivíduos sem câncer. Para avaliar a proliferação celular e liberação de citocinas (TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-4 e IL-10) das células T CD4 e CD8 frente ao estímulo com os peptídeos sintéticos dos genes E6 e E7 do HPV-16, a técnica ELISA foi utilizada. O mapeamento do DNA do HPV-16 foi realizado em amostras de plasma e saliva pela técnica de PCR em tempo real. Os resultados mostraram que o peptídeo E7 do HPV-16 inibiu a produção das citocinas pelas células T CD4 e CD8 derivadas dos indivíduos sem câncer (6/10) e pacientes com CEC de cabeça e pescoço (5/10) (p<0,05). A proteína Concanavaliana A induziu a proliferação das células T CD4 e CD8 dos indivíduos sem câncer e pacientes com CEC de cabeça e pescoço (p<0,05). As respostas celulares quanto à atividade proliferativa e a produção de citocinas dos pacientes com CEC de cabeça e pescoço foram semelhantes às respostas dos indivíduos sem câncer / Abstract: The human papillomavirus (HPV) has been associated with squamous cell carcinoma (SCC) of the oropharynx, as a possible etiologic factor. The viral oncoproteins, E6 and E7 are able to inhibit the production of Th1 cytokines and initiate the production of Th2 cytokines, damaging the cellular response to infection. The purpose of this study is to evaluate the effect of viral oncoproteins E6 and E7 of HPV-16 on the response of T cells (CD4+ and CD8+) in patients with or without SCC of the head and neck. It was recruited for the study, 20 individuals, 10 patients with SCC of the head and neck and 10 individuals without cancer. To assess cell proliferation and cytokine release (TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-4 and IL-10) of CD4 and CD8 stimulation against synthetic peptides of the HPV-16 E6 and E7 genes, ELISA technique was used. The mapping of the HPV-16 DNA was performed in plasma and saliva samples by real time PCR. The results showed that the HPV-16 E7 peptide inhibited the production of cytokines by CD4 and CD8 T cells derived from subjects without cancer (6/10) and patients with SCC of the head and neck (5/10) (p <0, 05). The concavaline A protein induced proliferation of CD4 and CD8 T cells from individuals without cancer and patients with SCC of the head and neck (p <0.05). Cellular responses as to proliferative activity and cytokine production in patients with SCC of the head and neck were similar to the responses of individuals without cancer / Mestre

Resumo não disponível

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Orientador: Paulo Cesar Giraldo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-05T02:47:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jacyntho_ClaudiaMarciadeAzevedo_D.pdf: 1490520 bytes, checksum: b7e0bab3cdc415c99c264ee227a0a4e9 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: A lesão escamosa intra-epitelial anal (ASIL) vem aumentando significativamente sua incidência nos últimos anos em pacientes masculinos com infecção pelo vírus da imunodeficiência adquirida humana (HIV), e mais recentemente em mulheres também HIV-positivas. Não se sabe, entretanto, se ASIL está em processo concomitante de crescimento em mulheres portadoras de lesões escamosas intra-epiteliais genitais (GSIL), independentemente da positividade para o HIV ou outros estados imunossupressivos. O objetivo desta pesquisa foi verificar a prevalência de ASIL em mulheres com GSIL, utilizando anuscopia e histopatologia. Trata-se de estudo de corte transversal, observacional, que comparou 211 mulheres com GSIL, cujo diagnóstico foi firmado por citopatologia, colposcopia e histopatologia, com outras 80 mulheres com exames citocolposcópicos normais, que foram assistidas no Ambulatório de Colposcopia do Hospital dos Servidores do Estado do Rio do Janeiro - Ministério da Saúde, no Ambulatório de Infecções Genitais do Centro de Atenção Integral à Saúde da Mulher do Departamento de Tocoginecologia da Unicamp e no Ambulatório de Colposcopia do Hospital Nossa Senhora da Saúde - Universidade Souza Marques - Rio de Janeiro. _Após anamnese dirigida foram realizados exames clínico geral, ginecológico e colposcópico. Foram também colhidas células esfoliadas do ânus para estudo citopatológico e realizadas anuscopias de alta resolução usando-se soluções contrastantes de ácido acético a 2% e de lugoL Biópsias com estudo histopatológico foram realizadas quando existiram lesões. Para a análise estatística foram empregados testes qui-quadrado ou exato de Fisher, a fim de estabelecer possíveis diferenças entre os grupos estudados. Empregaram-se análises bi e multivariada com regressão logística passo a passo para identificar fatores associados. O estudo teve a duração de 14 meses. Observou-se 19,5% de ASIL no grupo de mulheres com GSIL, ao passo que no grupo-comparativo, a prevalência de ASIL foi 2,5%. As ASIL de alto grau foram somente observadas no grupo-estudo, com 4,3% de prevalência. A persistência das GSIL mostrou-se um fator de associação com a presença de ASIL, RP=14,8 [IC(95%) 3,2; 68,2]. A multicentricidade de GSIL também se mostrou um fator relacionado à presença de ASIL, RP= 13,1[IC(95%) 2.7; 63.3]. Concluiu-se que o grupo de mulheres com GSIL persistente e/ou multicêntrica apresentou significativa associação com AS I L / Absrtact: Anal squamous intra-epitheliallesion (ASIL) has been significantly increased in the last decades, mainly among HIV-positive population. It is important to define other risk groups for ASIL, like genital squamous intra-epithelial lesion GSIL positive women. The goal of this study was to verify ASIL prevalence in women with GSIL, by anoscopy and histopathology. In this descriptive cross-sectional study, 291 women were evaluated. They answered a questionary and were submitted to a clinical exam, including anoscopy and biopsies if anal lesions were seen. It was a comparative study among 211 GSIL-positive women, confirmed by cytology, colposcopy and histopatology and 80 GSIL-negative women, confirmed by two consecutives normal Pap smears and normal colposcopy. This study was performed at Servidores do Estado do Rio de Janeiro Hospital Department of Colposcopy; Women's Health Center of the State University of Campinas- UNICAMP-Department of Genital Infectious Diseases and Nossa Senhora da Saúde Hospital - Souza Marques University/Rio de Janeiro Department of Colposcopy. The ASIL prevalence in the two groups was compared Lusing prevalence ratio, calculated with 95% confidence interval, p-value and stepwise logistic regression analysis. Comparing ASIL prevalence in the two groups, 19.5% ASIL in the GSIL-positive group and 2.5% in the other were found. Ali of high grade ASIL were only observed in the GSIL-positive group (4.3%). The persistence of GSIL was associated with ASIL, PR=14,8 [IC (95%) 3,2; 68,2]. The multicentric GSIL was also related to ASIL, PR=13.1 [IC (95%) (2.7; 63.3)]. In conclusion, persistent and multicentric GSI L showed significative association with ASIL / Doutorado / Tocoginecologia / Doutor em Tocoginecologia

Orientador: Eliana Amaral / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-08T19:54:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Campos_AngelaBorgesdeCarvalho_M.pdf: 1116989 bytes, checksum: 86a785222163ae5f264dc20b018e039f (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: OBJETIVO: Estudar os fatores associados à detecção de HPV e HIV na vagina, incluindo sua correlação. MÉTODOS: Trata-se de um estudo de corte transversal em mulheres infectadas por HIV. Excluíram-se gestantes e aquelas com antecedente de histerectomia, em uso de medicações vaginais nas últimas 48h, que tiveram relação sexual desprotegida havia menos de 72h ou com sangramento genital. Utilizou-se amostra endocervical para realização de teste de Captura Híbrida II® (HPV por CH II) para detecção de HPV (alto e baixo risco), clamídia e gonococo. Os tipos de HPV foram identificados por Linear Array®, Roche, após amplificação do DNA viral. Colheu-se lavado vaginal para determinação de RNA-HIV livre (utilizando-se 10 mL de solução salina). As cargas virais vaginal e plasmática de HIV foram mensuradas utilizando-se o kit HIV Monitor v1.5 Cobas Amplicor®. Calcularam-se as razões de prevalência e respectivos intervalos de confiança a 95%. RESULTADOS: Entre as 201 mulheres, das quais 73,6% em uso de TARV identificou-se o HPV de alto ou baixo risco pela CH II em 37,3% delas. O RNA-HIV livre foi detectável no lavado vaginal em 9% dos casos. Houve maior detecção de HPV por CH II com HIV plasmático detectável, menores valores de linfócitos T CD4, uso de contraceptivo combinado e tabagismo, mas não houve associação com RNA-HIV vaginal. O HPV pela CH II também foi mais prevalente quando havia alteração citológica e colposcópica, mas não ectopia, ulceração genital, monilíase ou vaginose bacteriana. Em mais de 80% das amostras, detectou-se algum tipo de HPV (em média, três tipos). Os tipos mais prevalentes foram HPV 62 (24,9%), 6 (19,4%), 53 (17,4%), 51 (14,9%), 61 (13,9%), 16 (12,9%) e HPV 84 (11,4%). HPV 53, 51 e 16 (alto risco) e HPV 84 (indeterminado) foram associados à maior detecção pela CH II. A presença de mais de três tipos de HPV foi o único fator que aumentou a prevalência de HPV por CH II na análise multivariada. Não usar TARV, carga viral plasmática detectável, CD4 reduzido e vaginose bacteriana aumentaram a prevalência de RNA-HIV vaginal, mas carga viral plasmática foi a única variável significativa na análise multivariada. Conclusão: O HPV foi detectável em 37,5% dos casos, quando se usou CH II, e em 80% dos casos quando se usou tipagem por Linear Array®. Ter RNA HIV vaginal detectável não aumentou a prevalência da detecção de HPV. A prevalência de RNA HIV vaginal foi 9%, bem abaixo dos valores da literatura e associada à carga viral plasmática / Abstract: Aim: To study factors associated to HPV and HIV vaginal viral load, including their correlation. Methods: This is a cross-sectional study with HIV- infected women. Those who were pregnant, had undergone histerectomy, using vaginal medication within the last 48 hours, had had unprotected sex less than 72 hours before, or had genital bleeding were excluded. An endocervical sample was used for Hybrid Capture II (HPV by HC II) to detect HPV (high and low risk), Chamydia trachomatis and N. gonorrhoeae. HPV types were identified by Linear Array (Roche), after viral DNA amplification. A cervico-vaginal lavage sample was obtained to determine free RNA-HIV load, using 10 mL of sterile normal saline. HIV vaginal and plasmatic viral loads were measured by HIV Monitor V 1.5 Cobas Amplicor. Prevalence ratios and respective 95% confidence intervals were calculated. RESULTS: Out of 201 women, 73.6% using ARV, 37.3% of women were identified with high or low risk HPV by HC II. Free HIV-RNA was detectable in cervical vaginal lavage of 9% of the cases. Higher HPV prevalence was associated with plasmatic HIV, lower T CD4 lynphocytes, combined hormonal contraceptives and cigarette smoking, but not with vaginal HIV-RNA. HPV by HC II was more prevalent in cases of cytologic or colposcopic abnormalities, but not ectopy, genital ulcerations, candidiasis or bacterial vaginosis. In over 80% of the samples, some type of HPV was detected (on average 3 types). The most prevalent types were HPV 62 (24.9%), 6 (19.4%), 53 (17.4%), 51 (14.9%), 61 (13.9%), 16 (12.9%) and 84 (11.4%). HPV 53, 51 and 16 (high risk) and 84 (undetermined) were associated to higher detection by HC II. The presence of more than three HPV types was the only factor which increased the prevalence of HPV by HC II in multivariate analysis. Using no ART, reduced CD4, plasma HIV viral load, and bacterial vaginosis increased the prevalence of vaginal HIVRNA, but plasmatic viral load was the only significant variable lin the multivariate analysis. CONCLUSIONS: HPV by HC II was detected in 37.5% of samples, and in 80% of the cases when Linear Array typing washed used. Having detectable vaginal RNA-HIV has not increased the prevalence of HPV detection. The prevalence of vagina RNA-HIV was 9%, well below the values found in the medical literature and associated to plasmatic viral load / Mestrado / Tocoginecologia / Mestre em Tocoginecologia

Orientadores: Sophie Françoise Mauricette Derchain, Luis Otavio Sarian / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T00:16:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moraes_DenisedaRochaPittaLimade_M.pdf: 959384 bytes, checksum: dcd7eaa366994d0d3d606ecc04a19503 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Introdução: Este estudo faz parte de uma linha de pesquisa cuja finalidade é avaliar testes de detecção de papilomavírus humano (HPV) envolvidos na carcinogênese e rastreamento de câncer cervical. Até recentemente, a captura híbrida 2 (HC2) para detecção de um pool de HPV de alto risco oncogênico foi o método clínico mais estudado por este grupo. Entretanto, frente à evidente diferença no risco de evolução das lesões cervicais, a genotipagem do HPV através de análise do ácido nucléico passou a ser relevante. Objetivo: Avaliar a distribuição de infecções simples e múltiplas de diferentes tipos de HPV em mulheres com neoplasia intra-epitelial cervical de alto grau (NIC2 e NIC3). Sujeitos e Métodos: Foram avaliados os genótipos específicos de HPV da amostra cervical de 106 mulheres utilizando Roche Linear Array® human papillomavirus (LA-HPV) genotyping assay (Roche Diagnostics,USA). O material foi coletado antes da conização cervical. Foram comparadas as proporções de NIC2 e NIC3 em grupos de mulheres infectadas com tipos de HPV dos grupos filogenéticos Alfa7 (A7) e Alfa9 (A9). Três situações foram consideradas: mulheres com 1) infeccão simples; 2) infecção múltipla; 3) infecção simples e múltipla. Foram comparadas as proporções de diferentes combinações de tipos de HPV em grupos de mulheres com NIC2 e NIC3. Resultados: Pelo menos um tipo de HPV foi detectado em 99% das amostras. Infecções múltiplas foram detectadas em 68 (64,7%) das amostras. Os genótipos de alto risco mais freqüentemente detectados em infecção simples ou múltipla foram HPV16 (57,1%), HPV58 (24,7%), HPV33 (15,2%), HPV52 (13,3%), HPV31 (10,4%) e HPV51 (7,6%) e HPV18 (6,6%). A probabilidade de mulheres com NIC3 serem infectadas com HPV da espécie A9 foi maior. Os HPV 16 e ou 18, associados ou não com outros tipos virais foram mais frequentemente encontrados nas mulheres com NIC3 do que naquelas com NIC2. Conclusão: A severidade da NIC esteve associada com a presença de tipos de HPV incluídos na classificação filogenética A9 e por infecções que incluem HPV16 e 18 combinados ou não com outros genótipos de HPV / Abstract: Objective: To evaluate the distribution of single and multiple infections of different human papillomavirus (HPV) types in women with high grade cervical intraepithelial neoplasia (CIN2 and CIN3) and to assess the relation of the various combinations of virus with the severity of CIN. Subject and methods: Cervical samples from 106 women treated due to CIN2 (18) or CIN3 (88) were examined for specific HPV genotypes using Roche Linear Array® Human Papillomavirus (LA-HPV)(Roche Diagnostics, USA). The material was collected immediately before cervical conization. The proportion of CIN2 and CIN3 in groups of women infected with varying HPV phylogenetic groups Alpha7 (A7) and Alpha9 (A9) was compared. Three situations were considered: women with 1) single infection; 2) multiple infections; 3) the whole sample. The proportions of CIN2 and CIN3 in groups of women with different combinations of HPV types were compared. Results: At least one HPV type was detected in 99% of the whole series. Multiple infections were detected in 68 (64.7%) samples. The most frequent high-risk genotypes detected (single/multiple) were HPV16 (57.1%), HPV58 (24.7%), HPV33 (15.2%), HPV52 (13.3%), HPV31 (10.4%), HPV51 (7.6%) and HPV18 (6.6%). Women with CIN3 were more infected with HPV of species A9. HPV16 and/or HPV18, associated or not with other viral types, were more frequently found in specimens of women with CIN3 than in those of women with CIN2. Conclusions: the severity of high-grade CIN may be associated by the presence of HPV types included in the A9 phylogenetic classification and by infections including HPV16 and 18 combined or not with other HPV genotypes / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Tocoginecologia

As proteínas E7 (HPV), p24 (HIV) e gD (HSV) são exclusivamente expressas por células infectadas ou tumorais e, por isso, são utilizadas como alvos para vacinas com características terapêuticas. Foram desenvolvidas duas vacinas de DNA capazes de expressar as três proteínas virais por meio de um vetor de expressão bicistrônico baseado na sequência IRES. As vacinas, denominadas pIRES I e pIRES II, diferem entre si por transportarem os genes que codificam as proteínas E7 do HPV-16 e p24 do HIV fusionadas à proteína gD do HSV-1 em ordem inversa. Células COS-7 transfectadas com os plasmídeos vacinais expressaram as proteínas alvo, como determinado por imunofluorecência com anticorpos específicos para as proteínas gD, p24 e E7. As vacinas foram testadas em modelo murino quanto à capacidade de gerar anticorpos e células T CD8+ específicas. Observamos que animais vacinados desenvolveram baixas taxas de anticorpos contra gD, p24 e E7. Em contrapartida, demonstramos a indução de células T CD8+ específicas para os três antígenos testados. Os plasmídeos vacinais foram capazes de proteger camundongos inoculados com células tumorais TC-1 (que expressam a proteína E7 do HPV-16), embora apresentando diferentes níveis de proteção em ensaios profiláticos e terapêuticos. As formulações foram testadas em relação à capacidade de proteger animais frente a desafio com o HSV-1 sendo que apenas um deles gerou efeito protetor. Em conclusão, os resultados demonstram que vacinas voltadas para o controle terapêutico de infecções ou processos tumorais associados aos vírus HPV, HIV e HSV representam uma meta viável e promissora. / The proteins E7 (HPV), p24 (HIV) and gD (HSV) are exclusively expressed by infected cells or tumors and therefore are used as targets for vaccines with therapeutic characteristics. We developed two DNA vaccines capable of expressing these three viral proteins using a bicistronic expression vector based on IRES sequence. The plasmid vaccines, named pIRES I and pIRES II, differ by carrying the genes that encode proteins of HPV-16 E7 and p24 fused to the HIV protein gD of HSV-1 in reverse order. Transfected COS-7 cells expressed the target proteins, as determined by immunofluorescence with specific antibodies for gD, p24 and E7. The vaccines were tested in mice for their ability to generate antibodies and specific CD8+ T cells. We observed that vaccinated animals developed low levels of antibodies against gD, E7 and p24. In contrast, we demonstrate the induction of specific CD8+ T cells for the three antigens. The plasmid vaccines were able to protect mice inoculated with TC-1 tumor cells (which express the E7 protein of HPV-16), although with different levels of protection in prophylactic and therapeutic trials. The formulations were tested for ability to protect animals against challenge with HSV-1 and only one of them generated a protective effect. In conclusion, the results show that vaccines directed to therapeutic control of infections or tumor process associated with HPV, HSV or HIV represents a promising and viable goal.

Introdução: O tumor de canal anal é raro, sendo a histologia epidermóide a mais frequente. A quimio-radioterapia é capaz de curar a maioria dos casos de câncer de canal anal localizado, entretanto, um grupo de pacientes apresenta resistência primária ao tratamento multimodal. Métodos: Estudo de coorte prospectivo desenhado para avaliar a influência de biomarcadores (HIV, Ki-67, PD-L1, HPV e mutações no DNA tumoral) na resposta do câncer de canal anal ao tratamento com quimio-radioterapia. Resposta completa aos 6 meses após tratamento foi o desfecho primário. O DNA tumoral foi avaliado por sequenciamento genético, através do painel TruSight Tumor 26®. HPV foi testado pelo teste PapilloCheck®. Ki-67 e PD-L1 foram avaliados por imunoistoquímica. Sorologia para HIV foi realizada em todos os pacientes antes do início do tratamento. Resultados: Os pacientes foram recrutados de outubro/2011 a dezembro/2015 e 75 foram avaliados para resposta após o tratamento. A idade mediana foi de 57 anos, a maioria dos pacientes apresentou estadio III ao diagnóstico 65% (n=49) e 12% (n=9) tinha sorologia positiva para HIV. Aos 6 meses após término da quimio-radioterapia 62,7% (n=47) dos pacientes apresentou resposta completa, 24% (n=18) resposta parcial e 13,3% (n=10) progressão de doença. HPV foi avaliado em 67 amostras e encontrado em 70,1%, sendo o HPV 16 o tipo mais frequente. A pesquisa de PD-L1 foi realizada em 61 amostras e 16,4% (n=10) apresentou expressão > 1%. Idade, estadio clínico, HIV, expressão de Ki-67, presença de HPV, expressão de PD-L1 e interrupção de tratamento foram avaliados como preditores de resposta, aos 6 meses após o término do tratamento, por meio de regressão logística multivariada. Pacientes com estadio II apresentaram 4,7 vezes mais chance de resposta completa que pacientes com estadio III (OR=4,70; IC95%=1,36-16,30; p=0,015). Quando considerada resposta completa e/ou parcial, a presença do vírus HIV foi associada a pior resposta: pacientes HIV negativo apresentaram 5,7 vezes mais chance de resposta completa e/ou parcial que pacientes HIV positivo (OR=5,72; IC95%=2,5-13,0; p < 0,001). Foi possível a realização de sequenciamento do DNA tumoral em 25 pacientes avaliáveis para resposta, sendo as mutações mais frequentes encontradas nos genes PIK3CA (n=6) e MET (n=6). Não houve diferença em resposta de acordo com presença dessas mutações. Conclusões: Aos 6 meses após término do tratamento com quimio-radioterapia a expressão de Ki-67, PD-L1, presença de HPV e mutações em PIK3CA e MET não foram associadas com resposta ao tratamento. Pacientes com estadio III e pacientes portadores do vírus HIV apresentaram pior resposta ao tratamento / Background: While chemoradiation is the curative treatment for squamous cell carcinoma of the anal canal, some patients present primary resistance. As a rare tumor, predictors of response remain unknown. Patients and Methods: Prospective cohort study aimed at evaluating biomarkers (Ki-67, PD-L1, Human papillomavirus (HPV), tumor mutations and HIV) possibly associated with tumor response to chemoradiation. Complete response at 6 months was the primary endpoint. Tumor DNA was analyzed by next-generation sequencing (TruSight Tumor 26 ®). HPV was tested by PapilloCheck®. KI-67 and PD-L1 were evaluated by immunohistochemistry. Results: Seventyeight patients were recruited from October/2011 to December/2015, and 75 were evaluable for response. Median age was 57 years, 65% (n=49) were stage III, and 12% (n=9) were HIV positive (HIV+). At 6 months 62.7% (n=47) presented complete response, 24% (n=18) partial response and 13.3% (n=10) disease progression. HPV was evaluated in 67 and found in 70.1%, the majority being HPV 16. PD-L1 was tested in 61 being 16.4% (n=10) positive. Age, clinical stage, HIV status, KI-67, HPV, PD-L1 and treatment interruption were tested as predictive factors for complete response at 6 months by logistic regression. On multivariate analyses, stage II patients were 4.7 more likely to achieve complete response than stage III (OR=4.70; IC95%=1.36-16.30; p=0.015). When we considered patients with complete and partial response, HIV+ was associated with a worse response (OR=5.72; IC95%=2.5-13.0; p < 0.001). Twenty-five patients had samples proper for NGS and 17 had at least one mutation, with PIK3CA (n=6) and MET (n=6) being the most common mutated genes. There were no differences in response according to MET or PIK3CA status. Conclusions: At 6 months after chemoradiation Ki-67, PD-L1, HPV and mutations in PIK3CA and MET were not associated with response. Patients with stage III disease and patients HIV+ had a significantly poor response