Made available in DSpace on 2014-06-12T23:02:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8615_1.pdf: 6293444 bytes, checksum: ef55c32ba2fb6d933976fd76fc675119 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Recentemente, a quitosana vem despertando bastante interesse em relação às suas aplicações em produtos alimentícios e farmacêuticos. Entre outras, a atividade antimicrobiana deste biopolímero tem sido apontada como uma das suas mais interessantes propriedades. O objetivo deste estudo foi extrair e caracterizar a quitosana da biomassa de Mucor circinelloides (UCP 050) e avaliar a efetividade desta na inibição do crescimento in vitro de cepas de bactérias patogênicas/deteriorantes de interesse em alimentos. Quitosana proveniente de caranguejo foi utilizada para comparação. A fim de determinar as concentrações mínimas bacteriostáticas e bactericidas das quitosanas foi realizado o teste de Heilman. Foi utilizada fermentação submersa para produção de quitosana por Mucor circinelloides (UCP 050) utilizando como substrato meio de cultura alternativo a partir de Jacatupé (Pachyrhizus erosus, (L) URBAN). Avaliou-se, ainda, o crescimento de M. circinelloiodes em diferentes tempos (24, 48, 72 e 96 horas), incubado a 28ºC e 150 rpm. Quitina e quitosana foram extraídas por tratamento álcali-ácido e a quitosana caracterizada por espectroscopia ao raio de Infravermelho, viscosidade, análise térmica e difração de raio X. M. circinelloides crescido em meio de cultura jacatupé apresentou rendimento de biomassa máximo (20.7 g.L-1) em 96 horas, enquanto a maior produção de quitosana (64 mg.g-1) e quitina (500 mg.g-1) foram observadas em 48 e 72 horas de crescimento, respectivamente. A quitosana caracterizada apresentou grau de deacetilação de 83% e massa molecular de 2,6 x 104 g/mol. A difração de raio X apresentou um pico de maior intensidade próximo ao angulo de 20.0- 2θ (d = 4.4534 Å) e a análise termogravimétrica demonstrou um processo de desidratação, seguido da decomposição do polímero, com geração de material carbonizado. As curvas de calorimetria apresentaram um pico largo endotérmico e um segundo pico endotérmico. A quitosana microbiológica e de crustáceo demonstraram concentração mínima inibitória idênticas para todas as bactérias ensaiadas, de 1,50 mg.mL-1 para Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica, Escherichia coli e Yersinia enterocolitica e 0,625 mg.mL-1 para Pseudomonas aeruginosa. Nenhuma concentração de ambas quitosanas demonstrou ação bactericida para a cepa de S. entérica. A quitosana microbiológica apresentou menor concentração mínima bactericida frente P. aeruginosa quando comparada com a quitosana de crustáceo, sendo de 2,5mg.mL-1 e 5,0 mg.mL-1, respectivamente. Os resultados obtidos destacam a quitosana como um promissor agente de conservação de alimentos de origem natural

As plantas expressam diferentes mecanismos de defesa em resposta a patógenos. Em geral, ocorre o reconhecimento de padrões moleculares associados ao patógeno (PAMPs) por receptores específicos das plantas, desencadeando as respostas de defesa através das vias de sinalização mediadas por jasmonato (JA), etileno (ET) e ácido salicílico (AS). Além disso, a descoberta de sinais endógenos como AtPep1 que regulam a expressão de genes de defesa em Arabidopsis thaliana tem auxiliado na compreensão dos mecanismos de defesa. No entanto, os mecanismos de defesa de plantas a patógenos necrotróficos como Pythium spp. são pouco conhecidos. Desta forma, o desenvolvimento de estratégias para identificar e caracterizar genes de resistência à Pythium spp. pode auxiliar na compreensão dos mecanismos de defesa, possibilitando a obtenção de cultivares resistentes. Uma das estratégias empregadas para a identificação de genes de resistência a patógenos do gênero Pythium consistiu na construção de uma biblioteca de cDNAs diferencialmente expressos em A. thaliana susperexpressando AtPROPEP1, que são mais resistentes à P. irregulare e a P. deliense. Paralelamente, foi realizada a busca de um gene ortólogo ao AtPROPEP1 de A. thaliana em diferentes espécies de solanáceas. Outra estratégia utilizada envolveu a avaliação do efeito da aplicação dos hormônios JA e AS e do regulador de crescimento etefon na resistência de plantas de tomate à P. dissotocum. Posteriormente foi realizado o silenciamento dos genes CTR1, ERF1 e SlPROPEP em plantas de tomate a fim de verificar o papel dos mesmos na resistência das plantas à P. dissotocum. Os resultados obtidos na biblioteca subtrativa indicam que A. thaliana superexpressando AtPROPEP1 pode induzir a expressão não somente da defensina PDF1.2, mas também de GRP3, outro gene envolvido na defesa de plantas contra patógenos. Através da busca de ortólogos de AtPROPEP1 em diferentes solanáceas foi possível identificar um ortólogo em Solanum lycopersicum - SlPROPEP. O tratamento com etefon aumentou a resitência das plantas à P. dissotocum comparado com as plantas não tratadas. Este tratamento também induziu a expressão relativa de SlPROPEP, PR-1, PR-5 e da defensina DEF2. Assim como o tratamento com etefon o silenciamento do gene CTR1, que atua como um regulador negativo da via de sinalização de defesa por ET aumentou a resistência das plantas à P. dissotocum. Enquanto que as plantas silenciadas para os genes ERF1 e SlPROPEP foram mais suscetíveis. O silenciamento de SlPROPEP reprimiu a expressão relativa dos genes PR-1, PR-5, ERF1, LOX-D e DEF2 envolvidos na defesa de plantas à patógenos. Estes resultados, em conjunto com o aumento da resistência nas plantas tratadas com etefon, sugerem que a via de sinalização de ET atua na resistência de tomate à P. dissotocum sendo que esta resistência possivelmente é mediada por SlPROPEP. / Plants express different defense mechanisms in response to pathogens. In general, specific receptors in plants reconize pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), triggering the response defenses by signaling pathways mediated by jasmonate (JA), ethylene (ET) and salicylic acid (SA). Furthermore, the discovery of endogenous signals, as AtPep1, which regulate defense genes expression in Arabidopsis thaliana, has aided the understanding of the defense mechanisms. However, the defense mechanisms of plants to necrotrophic pathogens such as Pythium spp. are poorly known. Thus, development of strategies to identify and characterize the resistance genes to Pythium spp. can help the understand of defense mechanisms, allowing the obtainance of resistant cultivars. One of the strategies used for the identification of resistance genes to pathogens within the genus Pythium consisted to construct a cDNA library of differentially expressed genes in plants overexpressing AtPROPEP1, which are more resistant to P. irregulare and P. deliense. Simultaneously, a search for orthologous genes to AtPROPEP1 from A. thaliana in different species of Solanaceae was performed. Another strategy used involved the evaluation of application of JA and AS and of the growth regulator ethephon on the resistance of tomato plants to P. dissotocum. Then, the silencing of the genes CTR1, ERF1 and SlPROPEP was performed in tomato plants in order to check the role of the tomato resistance to P. dissotocum. The results obtained from subtractive cDNA library indicate that A. thaliana plants overexpressing AtPROPEP1 may induce expression not only of the PDF1.2 defensin but also the GRP3 expression, another gene involved in plant defense against pathogens. By the search for orthologous genes to AtPROPEP1 in different species of Solanaceae was possible to identify an ortholog in Solanum lycopersicum - SlPROPEP. The ethephon treatment increased resistance of plants to P. dissotocum compared to untreated plants. This treatment also induced the expression of SlPROPEP, PR-1, PR-5 and DEF2 defensin. As ethephon treatment, the silencing of CTR1 gene, which acts as a negative regulator of defense signaling pathway by ET, increased plant resistance to P. dissotocum. Whereas the plants containing ERF1 and SlPROPEP genes silenced were more susceptible. SlPROPEP silencing repressed the relative expression of the genes PR-1, PR-5, ERF1, LOX-D e DEF2 involved in plant defense to pathogens. These results, together with increased resistance in the plants treated with ethephon, suggest that ET signaling pathway acts in tomato to resistance P. dissotocum and this resistance is likely mediated by SlPROPEP.

Acanthamoeba spp. são patógenos protistas de vida livre, capazes de causar ceratite grave e encefalite granulomatosa fatal. Trofozoíto é a forma infectiva de Acanthamoeba spp. e pode provocar infecções em uma variedade de hospedeiros mamíferos e seres humanos, como resultado da complexa interação patógeno-hospedeiro. O dano causado por trofozoítos em infecções da córnea ou do cérebro é o resultado de vários mecanismos patogênicos diferentes não elucidados a nível molecular até agora. Neste trabalho, descrevemos os resultados da caracterização genotípica de isolados ambientais de Acanthamoeba spp. e a identificão por análises proteômicas do repertório de proteínas expressas por trofozoítos de Acanthamoeba polyphaga. Nossos resultados permitiram a caracterização de 13 isolados ambientais de Acanthamoeba spp. obtidos da água de piscinas, que foram classificados em nível de genótipo com base na análise da sequência do gene da subunidade menor do rDNA. Nove dos 13 isolados foram identificados como pertencentes ao genótipo T5, três ao genótipo T4 e um ao genótipo T3. Vários genótipos têm sido relatados em todo o mundo como agentes causadores de ceratite amebiana, incluindo os genótipos T3, T4 e T5. O presente estudo indica que o genótipo T5 é um contaminante comum na água de piscinas. Este trabalho também estabeleceu uma ampla análise do repertório de proteínas expressas por trofozoítos de A. polyphaga, baseado no conjunto de estratégias por 2-DE MS/MS e LC-MS/MS. Foram identificadas 192 proteínas não redundantes. Um mapa proteômico de referência de A. polyphaga na faixa de pH 3-10 foi produzido e de 370 spots resolvidos, 136 proteínas foram identificadas. A classificação funcional das proteínas revelou diversas proteínas com relevância potencial para a sobrevivência do parasita e infecção de hospedeiros mamíferos, incluindo proteínas de superfície e proteínas relacionadas aos mecanismos de defesa. Este estudo descreveu a primeira análise proteômica abrangente do estágio de trofozoíto de Acanthamoeba spp. e fornece bases para estudos prospectivos, comparativos e funcionais de proteínas envolvidas nos mecanismos moleculares de sobrevivência, desenvolvimento e patogenicidade de Acanthamoeba spp. / Acanthamoeba spp. are free-living protist pathogen, capable of causing a blinding keratitis and fatal granulomatous encephalitis. Trophozoite is the form infective of Acanthamoeba spp. and can provoke infections in a variety of mammalian hosts and humans, as result of complex interaction host-pathogen. The damage caused by trophozoites in human corneal or brain infections is the result of several different pathogenic mechanisms not elucidated at the molecular level so far. Here, we describe the results of the characterization genotypic of environment isolates of Acanthamoeba spp. and we performed proteomic analysis to identify the repertoire of proteins expressed by trophozoites of an environmental strain of Acanthamoeba polyphaga. Our results allowed the characterization of 13 Acanthamoeba isolates from swimming pools water that were classified at the genotype level based on the sequence analysis of the small-subunit rDNA gene. Nine of the 13 isolates were genotype T5, three were genotype T4, and one was T3. Several genotypes have been reported worldwide as causative agents of keratitis, including genotypes T3, T4, and T5. The present study indicates that genotype T5 is a common contaminant in swimming-pool water. This work also established a comprehensive analysis of the proteins expressed by A. polyphaga trophozoites based on complementary 2-DE MS/MS and gel-free LC-MS/MS approaches. Overall, 192 nonredundant proteins were identified. An A. polyphaga proteomic map in pH range 3-10 was produced, with protein identification for 136 out of 370 resolved spots. Functional classification of identified proteins revealed several proteins with potential relevance for parasite survival and infection of mammal hosts, including surface proteins and proteins related to defense mechanisms. This study describes the first comprehensive proteomic survey of the trophozoite infective stage of an Acanthamoeba species, and provides foundations to prospective, comparative and functional studies of Acanthamoeba proteins involved in molecular mechanisms of survival, development, and pathogenicity.

Protozoários do gênero Acanthamoeba estão presentes nos mais variados ambientes, sendo esta a ameba mais isolada entre as amebas de vida livre (AVL). Acanthamoeba spp. pode causar encefalomielite e outras doenças graves em animais e seres humanos. Os fatores que contribuem para infecções por Acanthamoeba incluem biologia parasitária, diversidade genética, propagação no meio ambiente e suscetibilidade do hospedeiro. Acanthamoeba pode hospedar diversos microrganismos como: algas, bactérias, fungos, protozoários e vírus. Os estudos sobre as interações entre Acanthamoeba e microrganismos tem aumentado nos últimos anos, principalmente para entender como certas bactérias resistem à fagocitose de seus hospedeiros. Existem poucos estudos sobre adesão e a interação in vitro de Acanthamoeba com macrófagos, que são a primeira linha de defesa em doenças infecciosas. Neste trabalho foi proposto o isolamento de AVL do gênero Acanthamoeba de amostras clínicas de cães. Os resultados deste trabalho foram: 14 isolados de Acanthamoeba confirmados pela PCR, sendo o alvo o gene do 18S rDNA, de mucosa nasal e lesões cutâneas de 96 amostras coletadas de 48 cães. Destes, 13 isolados de Acanthamoeba foram sequenciados, o genótipo foi determinado e o potencial de patogenicidade em células VERO de 8 isolados foi avaliado. Os isolados eram pertencentes aos genótipos T3 (3 amostras), T4 (5 amostras), T5 (4 amostras) e T16 (1 amostra). Os 14 isolados de Acanthamoeba continham pelo menos uma espécie bacteriana internalizada e um isolado continha todas as espécies de endossimbiontes pesquisados. Observou-se que 79% dos isolados de Acanthamoeba hospedavam Legionella pneumophila, 50% Mycobacterium, 79% Pseudomonas e 57% Enterobacteriaceae. Os isolados de Acanthamoeba foram co-cultivados com macrófagos e observou-se à aderência em apenas 1h de contato, confirmando que Acanthamoeba é contato dependente. Este estudo descreveu os primeiros isolados de Acanthamoeba de amostras clínicas provenientes de cães. Também foi o primeiro relato da presença de endossimbiontes neste tipo de isolado realizado na América Latina. Neste estudo foi isolado pela primeira vez o genótipo T16 de amostra clínica. A importância deste estudo está no fato de verificar a presença de Acanthamoeba potencialmente patogênica em amostras clínicas de animais e pesquisar bactérias patogênicas internalizadas nestas amebas. Podendo estes microrganismos estar envolvidos em doenças infecciosas e futuras complicações como doenças graves em mamíferos. / Protozoa of the genus Acanthamoeba are present in diverse environments and are the most common free-living amoeba (FLA). Acanthamoeba spp. cause encephalitis and can cause severe illness in animals and humans. The factors that contribute to infections include Acanthamoeba parasite biology, genetic diversity, spreading in the environment and host susceptibility. Acanthamoeba may host various microorganisms such as algae, bacteria, fungi, protozoa and viruses. Studies regarding the interactions between Acanthamoeba and microorganisms have increased in recent years, mainly to understand how certain bacteria resist phagocytosis by their hosts. There are few studies on adherence and in vitro interaction of Acanthamoeba with macrophages, which are the first line of defense in infectious diseases. In this study, we proposed the isolation of the FLA Acanthamoeba from clinical samples from dogs. We found 14 Acanthamoeba isolates confirmed by PCR and by the 18S gene target rDNA in nasal mucosa and skin lesions out of 96 samples collected from 48 dogs. From this 14 isolates, 13 Acanthamoeba isolates were sequenced and the genotype was determined. Regarding the potential for pathogenicity in VERO cells, 8 isolates was assessed. The isolates belonged to genotype 3 (3 samples), T4 (5 samples), T5 (4 samples) and T16 (1 sample). The 14 isolates of Acanthamoeba contained at least one bacterial species internalized and one isolate contained all endosymbionts species studied. It was observed that 79% of isolates of Acanthamoeba carryng Legionella pneumophila, Mycobacterium 50%, 79% Pseudomonas and 57% Enterobacteriaceae. Acanthamoeba isolates were co-cultured with murine macrophages and adherence was observed in 1h of contact, confirming that Acanthamoeba interact with defense cells in a contact-dependent manner. This study describes the first clinical isolates of Acanthamoeba samples from dogs. It was also the first report of the presence of this type of endosymbionts isolated held in Latin America. As far as we know, this is the first study to isolate a T16 genotype amoeba from clinical sample. The importance of this study lies on the fact verify the presence of potentially pathogenic Acanthamoeba in samples from animals and search pathogenic bacteria internalized by these amoebae. These microorganisms may be involved in infectious diseases in mammals.

En este trabajo de Tesis nos hemos propuesto investigar el efecto de alteraciones estructurales en el LPS sobre la integridad de la membrana externa, la síntesis y secreción de otros componentes bacterianos y en particular sobre la patogenicidad y persistencia de la bacteria en el hospedador. El estudio de esta molécula resultó ser un verdadero desafío ya que es una de las moléculas menos caracterizadas dentro del género Bordetella. Esto se debe quizás a que durante muchos años las investigaciones sobre Bordetella estuvieron focalizadas fundamentalmente sobre los factores de virulencia de naturaleza proteica. Así, las propiedades del LPS en el entorno natural de la bacteria y su interacción con otros componentes bacterianos constituyen aspectos muy poco explorados. En relación a este último punto existen numerosos estudios que sugieren una conexión entre toxinas de la familia RTX (repetición en toxina) y el LPS. Se ha reportado que mutaciones específicas que modifican el ensamblaje del core interno del LPS (cluster rfa, 17, 48, 312) afectan la secreción y la biosíntesis de la toxina RTX-Hemolisina (Hly) de <i>Escherichia coli</i>. <i>Bordetella spp.</i> sintetiza una toxina RTX, la AC-Hly (136,154). En estudios de la secreción hemos determinado que la secreción de esta toxina en medios de cultivo suplementados con un agente derivado de las ciclodextrinas se ve incrementada correlativamente con un incremento en la liberación de LPS al medio extracelular. Se ha podido determinar además la presencia de vesículas de membrana externa en sobrenadantes de cultivo, las cuales contienen LPS y AC-Hly. En este marco no sólo abordaremos el rol del LPS y el de su variabilidad estructural en la patogénesis y persistencia en el hospedador en sí mismo sino también su posible relación con la expresión de otros factores de virulencia y en particular se analizará si el fenómeno observado para la hemolisina de E.coli puede ser extendido a la AC-Hly de Bordetella spp. Para esclarecer estos aspectos hemos dirigido nuestras investigaciones hacia la construcción y caracterización tanto in vitro como in vivo de mutantes en B. bronchiseptica que presentan un fenotipo de LPS alterado, en particular un fenotipo "deep rough". La elección de este tipo de alteración se basó por un lado, en la necesidad de obtener un mutante con una modificación profunda en la estructura del LPS que posibilite la adjudicación de algún rol de esta molécula en el curso de la infección; y por otro lado, en que diferentes aislamientos de pacientes con infección crónica de B. bronchiseptica presentaron un fenotipo de LPS del tipo deep rough o rugoso profundo. / Tesis digitalizada en SEDICI gracias a la Biblioteca Central de la Facultad de Ciencias Exactas (UNLP).

SILVA, Fredy Davi Albuquerque. Homeostase redox, genes associados e a resistência do feijão-de-corda [Vigna unguiculata (L.) Walp.] ao fungo hemibiotrófico Colletotrichum gloeosporioides [(Penz) Penz & Sacc.]. 2015. 145 f. Tese (Doutorado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2015. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-07-28T15:47:22Z No. of bitstreams: 1 2015_tese_fdasilva.pdf: 13172308 bytes, checksum: eec041dd293481a11b32a2b64584598a (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T14:43:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_tese_fdasilva.pdf: 13172308 bytes, checksum: eec041dd293481a11b32a2b64584598a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T14:43:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_tese_fdasilva.pdf: 13172308 bytes, checksum: eec041dd293481a11b32a2b64584598a (MD5) Previous issue date: 2015 / Colletotrichum gloeosporioides is an important hemibiotrophic pathogen with a broad host range that causes substantial crop losses. Recent data have shown that the hypersensitive response (HR) is one event involved in the resistance of cowpea (V.unguiculata) genotype BR-3 against C.gloeosporioides (LPVD-1 isolate). Several studies have been undertaken on the defense mechanism of plant to hemibiotrophic pathogen, but overall they remain poorly understood. Previously, we have compared changes in protein expression induced in resistant cowpea genotype after infection with C.gloeosporioides using a proteomic approach. Based on these results, in the present study, we evaluated the defense responses induced by C.gloeosporioides in V.unguiculata associated with oxidative burst, accumulation of reactive oxygen species (ROS) such as superoxide anion (O2•-), hydrogen peroxide (H2O2) as well expression of antioxidant genes using RT-qPCR analysis. At the same time, we analyzed the C.gloeosporioides infection kinetics by optical microscopy (OM) and scanning electron microscopy (SEM). Increased O2•- and H2O2 was detected in cowpea 2 hours after inoculation (hai) using NBT and DAB staining, respectively. Spectrophotometric measurements showed two peaks H2O2 production, 2 and 12 hai, showing a biphasic kinetics. The increase of H2O2 was accompanied by lipid peroxidation 2 and 48 hai. OM and SEM analyzes showed that C.gloeosporioides was able to generate germ tubes and structures such as apressoria and develop under the surface of the leaves. However, despite of the development and attempt to infection, ultra-structural changes were observed on the surface of conidia and hyphae, 8 hai led to no infection of host cells. Analysis by RT-qPCR demonstrated that the genes VuFeSODI and VuCuZnSODII are up- regulated in chloroplasts at 4 hai, while the gene VuCuZnSODI was well up-regulated 12 hai. In relation to genes associated to scavenging of H2O2, VuPrxIIBCD showed a strong up-regulated of transcript at 2 hai while that VuAPXI showed up-regulated only 12 hai. VuCATI and VuCATII showed that the quantitative level of transcript expression was up- regulated 12 hai, indicating that they are important in the maintenance of H2O2 in peroxisomes. Contrarily, VuPrxIIE transcript was down-regulated in the early hours after inoculation, but showed increased expression levels at 48 hai suggesting participate in the regulation of H2O2 in chloroplasts. The present study indicates that H2O2 has an important role in the initial defense strategies of cowpea acting against C.gloeosporioides and functioning as a signaling molecule. Furthermore, genes associated with antioxidant defenses studied here seem to be involved, in combination with other molecules, in the regulation of H2O2 levels toward preventing cell death and regulating the cell redox homeostasis, important events in the resistance mechanisms of plants to pathogens. / Colletotrichum gloeosporioides é um importante patógeno hemibiotrófico com uma ampla gama de hospedeiros que causa perdas substanciais de colheitas. Dados recentes mostraram que a resposta hipersensitiva (HR) é um evento envolvido na resistência do feijão-de-corda (V.unguiculata) genótipo BR-3 contra C.gloeosporioides (isolado LPVD-1). Vários estudos têm sido realizados sobre os mecanismos de defesa de plantas a patógenos hemibiotróficos, mas em geral eles continuam a ser mal compreendidos. Anteriormente, comparamos mudanças na expressão de proteínas induzidas em genótipos resistentes de feijão-de-corda após a infecção com C. gloeosporioides utilizando uma abordagem proteômica. Com base nesses resultados, no presente estudo, avaliamos as respostas de defesa induzidas por C.gloeosporioides em V.unguiculata associadas com a explosão oxidativa, o acúmulo de espécies reativas de oxigênio (EROs), como o ânion superóxido (O2•-), e o peróxido de hidrogênio (H2O2), bem como a expressão de genes antioxidantes, utilizando análise por RT-qPCR. Ao mesmo tempo foi analisada a cinética de infecção de C.gloeosporioides por microscopia óptica (MO) e microscopia eletrônica de varredura (MEV). O aumento de O2•- e H2O2 foi detectado em feijão-de-corda, 2 horas após a inoculação (hai) utilizando coloração por NBT e DAB, respectivamente. A quantificação espectrofotométrica demonstrou dois picos de produção de H2O2, 2 e 12 hai, mostrando uma cinética bifásica. O aumento de H2O2 foi acompanhado por peroxidação lipídica 2 e 48 hai. As análises de MO e MEV mostraram que C.gloeosporioides foi capaz de gerar estruturas tais como tubos germinativos e apressórios e se desenvolver sob a superfície das folhas. No entanto, apesar do desenvolvimento e tentativa de infecção, alterações ultra-estruturais foram observadas na superfície de conídios e hifas 8 hai levando a não infecção de células hospedeiras. Análise por RT-qPCR demonstrou que os genes VuFeSODI e VuCuZnSODII apresentaram aumento de expressão 4 hai, enquanto que o gene VuCuZnSODI foi bem expresso 12 hai. Em relação aos genes associados à regulação de H2O2, VuPrxIIBCD mostrou uma forte aumento de transcristos em 2 hai enquanto que, VuAPXI mostrou aumento de expressão apenas 12 hai. VuCATI e VuCATII mostram aumento de expressão quantitativa dos transcritos 12 hai, indicando que eles são associados a manutenção de H2O2 em peroxissomos. Contrariamente, a expressão dos transcritos de VuPrxIIE foi reprimida nas primeiras horas após a inoculação, contudo, apresentaram níveis aumentados de expressão em 48 hai, sugerindo participar na regulação de H2O2 nos cloroplastos. O presente estudo indica que H2O2 tem um papel importante nas estratégias de defesa iniciais de feijão-de-corda, agindo contra C.gloeosporioides e funcionando como uma molécula sinalizadora. Além disso, os genes associados com defesas antioxidantes estudados parecem estar envolvidos, em combinação com outras moléculas, na regulação dos níveis de H2O2 para prevenir a morte celular e regular a homeostase redox, eventos importantes nos mecanismos de resistência de plantas a patógenos.

Made available in DSpace on 2015-10-23T12:45:30Z (GMT). No. of bitstreams: 2 thiago_pinto_ioc_mest_2013.pdf: 2486105 bytes, checksum: 868a236b9a638adc77cfb2312e1f391d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A indução da via de interferon (IFN) do tipo I (IFN-\03B1 e -\03B2) é crucial para uma resposta protetora contra infecções virais. Entretanto, estudos recentes demonstraram que esta classe de IFNs tem a ativação mediada por receptores citoplasmáticos de DNA e regula negativamente a resposta protetora contra a infecção por bactérias intracelulares, com destaque para o Mycobacterium tuberculosis, criando um nicho favorável para a replicação micobacteriana. Um estudo anterior do nosso grupo, utilizando uma abordagem de expressão gênica global por microarranjos, demonstrou que a infecção de células de Schwann com Mycobacterium leprae induz genes ativados por IFN do tipo I, com destaque para o gene OASL, o qual codifica a proteína 2\2019 5\2019 oligoadenilato sintetase like. No presente estudo, esses resultados foram estendidos e validados utilizando o modelo de macrófagos derivados de célulasTHP-1. Nossos dados demonstram que a OASL foi induzida por M. leprae vivo, mas não M. bovis BCG ou M. leprae morto. Adicionalmente, a transfecção de DNA de M. leprae, mas não de RNA, induziu a produção de OASL. Em nosso modelo, a infecção por M. leprae não foi capaz de induzir a produção de IFN-\03B1, assim como o tratamento CpG não induziu OASL, excluindo assim a sinalização de DNA mediada por TLR9 Além disso, mostramos evidências da permeabilização fagossomal mediada pelo fator de virulência micobacteriano ESAT-6, a qual permite acesso do conteúdo do fagossomo ao citoplasma e, consequente, produção de IFN-\03B2. O bloqueio farmacológico de TBK1 foi capaz de inibir a produção de OASL mediada pela infecção com M. leprae, indicando, dessa forma, que a indução de IFN-\03B2 e seus genes a jusante, como o OASL, ocorre através do eixo de sinalização STING/TBK1/IRF3. Interessantemente, o silenciamento gênico de OASL resultou na redução da viabilidade intracelular do M. leprae juntamente com redução da liberação da quimiocina CCL2/MCP-1 induzida por M. leprae. Entretanto, a transfecção de DNA seguida por infecção com M. bovis BCG foi capaz de reverter o fenótipo avirulento dessa bactéria, aumentado sua viabilidade intracelular e induzindo altos níveis de CCL2/MCP-1. Dessa maneira, nossos dados sugerem que a ativação da via de IFN tipo I é, de fato, capaz de inibir a reposta protetora do hospedeiro contra micobactérias, criando um ambiente favorável para a sobrevivência da micobactéria no ambiente intracelular, representando assim um potencial alvo para intervenções farmacológicas e/ou prevenção / The induction of interferon pathway (IFN) type I (IFN - α and - β ) is crucial for a protective response against viral infections. However, emergent research has shown that type I IFNs and cytoplasmic DNA signaling ar e negative regulators of the protective response against infection by in tracellular bacteria, such as Mycobacterium tuberculosis , and provide a favorable niche for mycobacterial replication. Recently, using an approach of global gene expression by microar r ay, our group showed that Schwann cells infection with Mycobacterium leprae induced genes activated by IFN type I, highlighting the OASL gene, which encodes the 2 '5' oligoadenylate synthetase like protein. In the present work , these results were extended and validated using the THP - 1 - derived macrophages m odel . Our data demonstrate that OASL and type I IFN pathway was upregulated by M. leprae , but not M. bovis BCG or dead M. leprae , in macrophage - like THP - 1 infected cells. In addition, M. leprae DNA transfection but not RNA, was able to induce OASL production . In our model, M. leprae infection was not able to induce IFN - α and OASL was not induced by CpG, therefore excluding a TLR9 dependent pathway. Furthermore, we show evid ence of fagossomal permeabilization mediated by mycobacterial virulence factor ESAT - 6, which enables access of contents of the phagosome to host cytoplasm and subsequent induction of IFN - β. Pharmacological blockag e of TBK1 was able to inhibit M. leprae - ind uced OASL mRNA expression, indicating thereby that the IFN - β induction and its downstream genes, such as OASL occur through the STING/TBK1/IRF3 pathway . Interestingly, OASL targeted silencing directly decreased intracellular M. leprae survival and impaired the CCL2/MCP - 1 secretion. Furthermore, M. leprae DNA transfection followed by infection with M. bovis BCG has reverted the avirulent infection phenotype of this mycobacteria, increasing its intracellular viability and inducing high levels of CCL2/ MCP - 1. Together , these results suggest that OASL plays an important role in the response to mycobacteria and provide a potential pharmacological target for prevention or intervention

As plantas expressam diferentes mecanismos de defesa em resposta a patógenos. Em geral, ocorre o reconhecimento de padrões moleculares associados ao patógeno (PAMPs) por receptores específicos das plantas, desencadeando as respostas de defesa através das vias de sinalização mediadas por jasmonato (JA), etileno (ET) e ácido salicílico (AS). Além disso, a descoberta de sinais endógenos como AtPep1 que regulam a expressão de genes de defesa em Arabidopsis thaliana tem auxiliado na compreensão dos mecanismos de defesa. No entanto, os mecanismos de defesa de plantas a patógenos necrotróficos como Pythium spp. são pouco conhecidos. Desta forma, o desenvolvimento de estratégias para identificar e caracterizar genes de resistência à Pythium spp. pode auxiliar na compreensão dos mecanismos de defesa, possibilitando a obtenção de cultivares resistentes. Uma das estratégias empregadas para a identificação de genes de resistência a patógenos do gênero Pythium consistiu na construção de uma biblioteca de cDNAs diferencialmente expressos em A. thaliana susperexpressando AtPROPEP1, que são mais resistentes à P. irregulare e a P. deliense. Paralelamente, foi realizada a busca de um gene ortólogo ao AtPROPEP1 de A. thaliana em diferentes espécies de solanáceas. Outra estratégia utilizada envolveu a avaliação do efeito da aplicação dos hormônios JA e AS e do regulador de crescimento etefon na resistência de plantas de tomate à P. dissotocum. Posteriormente foi realizado o silenciamento dos genes CTR1, ERF1 e SlPROPEP em plantas de tomate a fim de verificar o papel dos mesmos na resistência das plantas à P. dissotocum. Os resultados obtidos na biblioteca subtrativa indicam que A. thaliana superexpressando AtPROPEP1 pode induzir a expressão não somente da defensina PDF1.2, mas também de GRP3, outro gene envolvido na defesa de plantas contra patógenos. Através da busca de ortólogos de AtPROPEP1 em diferentes solanáceas foi possível identificar um ortólogo em Solanum lycopersicum - SlPROPEP. O tratamento com etefon aumentou a resitência das plantas à P. dissotocum comparado com as plantas não tratadas. Este tratamento também induziu a expressão relativa de SlPROPEP, PR-1, PR-5 e da defensina DEF2. Assim como o tratamento com etefon o silenciamento do gene CTR1, que atua como um regulador negativo da via de sinalização de defesa por ET aumentou a resistência das plantas à P. dissotocum. Enquanto que as plantas silenciadas para os genes ERF1 e SlPROPEP foram mais suscetíveis. O silenciamento de SlPROPEP reprimiu a expressão relativa dos genes PR-1, PR-5, ERF1, LOX-D e DEF2 envolvidos na defesa de plantas à patógenos. Estes resultados, em conjunto com o aumento da resistência nas plantas tratadas com etefon, sugerem que a via de sinalização de ET atua na resistência de tomate à P. dissotocum sendo que esta resistência possivelmente é mediada por SlPROPEP. / Plants express different defense mechanisms in response to pathogens. In general, specific receptors in plants reconize pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), triggering the response defenses by signaling pathways mediated by jasmonate (JA), ethylene (ET) and salicylic acid (SA). Furthermore, the discovery of endogenous signals, as AtPep1, which regulate defense genes expression in Arabidopsis thaliana, has aided the understanding of the defense mechanisms. However, the defense mechanisms of plants to necrotrophic pathogens such as Pythium spp. are poorly known. Thus, development of strategies to identify and characterize the resistance genes to Pythium spp. can help the understand of defense mechanisms, allowing the obtainance of resistant cultivars. One of the strategies used for the identification of resistance genes to pathogens within the genus Pythium consisted to construct a cDNA library of differentially expressed genes in plants overexpressing AtPROPEP1, which are more resistant to P. irregulare and P. deliense. Simultaneously, a search for orthologous genes to AtPROPEP1 from A. thaliana in different species of Solanaceae was performed. Another strategy used involved the evaluation of application of JA and AS and of the growth regulator ethephon on the resistance of tomato plants to P. dissotocum. Then, the silencing of the genes CTR1, ERF1 and SlPROPEP was performed in tomato plants in order to check the role of the tomato resistance to P. dissotocum. The results obtained from subtractive cDNA library indicate that A. thaliana plants overexpressing AtPROPEP1 may induce expression not only of the PDF1.2 defensin but also the GRP3 expression, another gene involved in plant defense against pathogens. By the search for orthologous genes to AtPROPEP1 in different species of Solanaceae was possible to identify an ortholog in Solanum lycopersicum - SlPROPEP. The ethephon treatment increased resistance of plants to P. dissotocum compared to untreated plants. This treatment also induced the expression of SlPROPEP, PR-1, PR-5 and DEF2 defensin. As ethephon treatment, the silencing of CTR1 gene, which acts as a negative regulator of defense signaling pathway by ET, increased plant resistance to P. dissotocum. Whereas the plants containing ERF1 and SlPROPEP genes silenced were more susceptible. SlPROPEP silencing repressed the relative expression of the genes PR-1, PR-5, ERF1, LOX-D e DEF2 involved in plant defense to pathogens. These results, together with increased resistance in the plants treated with ethephon, suggest that ET signaling pathway acts in tomato to resistance P. dissotocum and this resistance is likely mediated by SlPROPEP.

Acanthamoeba spp. são patógenos protistas de vida livre, capazes de causar ceratite grave e encefalite granulomatosa fatal. Trofozoíto é a forma infectiva de Acanthamoeba spp. e pode provocar infecções em uma variedade de hospedeiros mamíferos e seres humanos, como resultado da complexa interação patógeno-hospedeiro. O dano causado por trofozoítos em infecções da córnea ou do cérebro é o resultado de vários mecanismos patogênicos diferentes não elucidados a nível molecular até agora. Neste trabalho, descrevemos os resultados da caracterização genotípica de isolados ambientais de Acanthamoeba spp. e a identificão por análises proteômicas do repertório de proteínas expressas por trofozoítos de Acanthamoeba polyphaga. Nossos resultados permitiram a caracterização de 13 isolados ambientais de Acanthamoeba spp. obtidos da água de piscinas, que foram classificados em nível de genótipo com base na análise da sequência do gene da subunidade menor do rDNA. Nove dos 13 isolados foram identificados como pertencentes ao genótipo T5, três ao genótipo T4 e um ao genótipo T3. Vários genótipos têm sido relatados em todo o mundo como agentes causadores de ceratite amebiana, incluindo os genótipos T3, T4 e T5. O presente estudo indica que o genótipo T5 é um contaminante comum na água de piscinas. Este trabalho também estabeleceu uma ampla análise do repertório de proteínas expressas por trofozoítos de A. polyphaga, baseado no conjunto de estratégias por 2-DE MS/MS e LC-MS/MS. Foram identificadas 192 proteínas não redundantes. Um mapa proteômico de referência de A. polyphaga na faixa de pH 3-10 foi produzido e de 370 spots resolvidos, 136 proteínas foram identificadas. A classificação funcional das proteínas revelou diversas proteínas com relevância potencial para a sobrevivência do parasita e infecção de hospedeiros mamíferos, incluindo proteínas de superfície e proteínas relacionadas aos mecanismos de defesa. Este estudo descreveu a primeira análise proteômica abrangente do estágio de trofozoíto de Acanthamoeba spp. e fornece bases para estudos prospectivos, comparativos e funcionais de proteínas envolvidas nos mecanismos moleculares de sobrevivência, desenvolvimento e patogenicidade de Acanthamoeba spp. / Acanthamoeba spp. are free-living protist pathogen, capable of causing a blinding keratitis and fatal granulomatous encephalitis. Trophozoite is the form infective of Acanthamoeba spp. and can provoke infections in a variety of mammalian hosts and humans, as result of complex interaction host-pathogen. The damage caused by trophozoites in human corneal or brain infections is the result of several different pathogenic mechanisms not elucidated at the molecular level so far. Here, we describe the results of the characterization genotypic of environment isolates of Acanthamoeba spp. and we performed proteomic analysis to identify the repertoire of proteins expressed by trophozoites of an environmental strain of Acanthamoeba polyphaga. Our results allowed the characterization of 13 Acanthamoeba isolates from swimming pools water that were classified at the genotype level based on the sequence analysis of the small-subunit rDNA gene. Nine of the 13 isolates were genotype T5, three were genotype T4, and one was T3. Several genotypes have been reported worldwide as causative agents of keratitis, including genotypes T3, T4, and T5. The present study indicates that genotype T5 is a common contaminant in swimming-pool water. This work also established a comprehensive analysis of the proteins expressed by A. polyphaga trophozoites based on complementary 2-DE MS/MS and gel-free LC-MS/MS approaches. Overall, 192 nonredundant proteins were identified. An A. polyphaga proteomic map in pH range 3-10 was produced, with protein identification for 136 out of 370 resolved spots. Functional classification of identified proteins revealed several proteins with potential relevance for parasite survival and infection of mammal hosts, including surface proteins and proteins related to defense mechanisms. This study describes the first comprehensive proteomic survey of the trophozoite infective stage of an Acanthamoeba species, and provides foundations to prospective, comparative and functional studies of Acanthamoeba proteins involved in molecular mechanisms of survival, development, and pathogenicity.

Protozoários do gênero Acanthamoeba estão presentes nos mais variados ambientes, sendo esta a ameba mais isolada entre as amebas de vida livre (AVL). Acanthamoeba spp. pode causar encefalomielite e outras doenças graves em animais e seres humanos. Os fatores que contribuem para infecções por Acanthamoeba incluem biologia parasitária, diversidade genética, propagação no meio ambiente e suscetibilidade do hospedeiro. Acanthamoeba pode hospedar diversos microrganismos como: algas, bactérias, fungos, protozoários e vírus. Os estudos sobre as interações entre Acanthamoeba e microrganismos tem aumentado nos últimos anos, principalmente para entender como certas bactérias resistem à fagocitose de seus hospedeiros. Existem poucos estudos sobre adesão e a interação in vitro de Acanthamoeba com macrófagos, que são a primeira linha de defesa em doenças infecciosas. Neste trabalho foi proposto o isolamento de AVL do gênero Acanthamoeba de amostras clínicas de cães. Os resultados deste trabalho foram: 14 isolados de Acanthamoeba confirmados pela PCR, sendo o alvo o gene do 18S rDNA, de mucosa nasal e lesões cutâneas de 96 amostras coletadas de 48 cães. Destes, 13 isolados de Acanthamoeba foram sequenciados, o genótipo foi determinado e o potencial de patogenicidade em células VERO de 8 isolados foi avaliado. Os isolados eram pertencentes aos genótipos T3 (3 amostras), T4 (5 amostras), T5 (4 amostras) e T16 (1 amostra). Os 14 isolados de Acanthamoeba continham pelo menos uma espécie bacteriana internalizada e um isolado continha todas as espécies de endossimbiontes pesquisados. Observou-se que 79% dos isolados de Acanthamoeba hospedavam Legionella pneumophila, 50% Mycobacterium, 79% Pseudomonas e 57% Enterobacteriaceae. Os isolados de Acanthamoeba foram co-cultivados com macrófagos e observou-se à aderência em apenas 1h de contato, confirmando que Acanthamoeba é contato dependente. Este estudo descreveu os primeiros isolados de Acanthamoeba de amostras clínicas provenientes de cães. Também foi o primeiro relato da presença de endossimbiontes neste tipo de isolado realizado na América Latina. Neste estudo foi isolado pela primeira vez o genótipo T16 de amostra clínica. A importância deste estudo está no fato de verificar a presença de Acanthamoeba potencialmente patogênica em amostras clínicas de animais e pesquisar bactérias patogênicas internalizadas nestas amebas. Podendo estes microrganismos estar envolvidos em doenças infecciosas e futuras complicações como doenças graves em mamíferos. / Protozoa of the genus Acanthamoeba are present in diverse environments and are the most common free-living amoeba (FLA). Acanthamoeba spp. cause encephalitis and can cause severe illness in animals and humans. The factors that contribute to infections include Acanthamoeba parasite biology, genetic diversity, spreading in the environment and host susceptibility. Acanthamoeba may host various microorganisms such as algae, bacteria, fungi, protozoa and viruses. Studies regarding the interactions between Acanthamoeba and microorganisms have increased in recent years, mainly to understand how certain bacteria resist phagocytosis by their hosts. There are few studies on adherence and in vitro interaction of Acanthamoeba with macrophages, which are the first line of defense in infectious diseases. In this study, we proposed the isolation of the FLA Acanthamoeba from clinical samples from dogs. We found 14 Acanthamoeba isolates confirmed by PCR and by the 18S gene target rDNA in nasal mucosa and skin lesions out of 96 samples collected from 48 dogs. From this 14 isolates, 13 Acanthamoeba isolates were sequenced and the genotype was determined. Regarding the potential for pathogenicity in VERO cells, 8 isolates was assessed. The isolates belonged to genotype 3 (3 samples), T4 (5 samples), T5 (4 samples) and T16 (1 sample). The 14 isolates of Acanthamoeba contained at least one bacterial species internalized and one isolate contained all endosymbionts species studied. It was observed that 79% of isolates of Acanthamoeba carryng Legionella pneumophila, Mycobacterium 50%, 79% Pseudomonas and 57% Enterobacteriaceae. Acanthamoeba isolates were co-cultured with murine macrophages and adherence was observed in 1h of contact, confirming that Acanthamoeba interact with defense cells in a contact-dependent manner. This study describes the first clinical isolates of Acanthamoeba samples from dogs. It was also the first report of the presence of this type of endosymbionts isolated held in Latin America. As far as we know, this is the first study to isolate a T16 genotype amoeba from clinical sample. The importance of this study lies on the fact verify the presence of potentially pathogenic Acanthamoeba in samples from animals and search pathogenic bacteria internalized by these amoebae. These microorganisms may be involved in infectious diseases in mammals.