Submitted by THAÍSA ZANETONI MARTINS null (thaisa_martins00@hotmail.com) on 2016-05-02T21:00:40Z No. of bitstreams: 1 Dissertação completa e corrigida em pdf.pdf: 3120972 bytes, checksum: 2a88d2765e9af6b31401eaf64047de8a (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-05-04T19:30:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 martins_tz_me_jabo.pdf: 3120972 bytes, checksum: 2a88d2765e9af6b31401eaf64047de8a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-04T19:30:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 martins_tz_me_jabo.pdf: 3120972 bytes, checksum: 2a88d2765e9af6b31401eaf64047de8a (MD5) Previous issue date: 2016-04-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O cancro cítrico tem como agente causal a bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), que afeta diferentes espécies de citros economicamente importantes. É uma doença ainda sem método curativo, e pela sua relevância e dano econômico, faz-se necessário o entendimento em termos moleculares da interação Xac-citros para o desenvolvimento de estratégias que controlem a doença. O objetivo do presente trabalho foi investigar os efeitos da deleção da ORF XAC0024 presente no genoma da Xac isolado 306, que codifica uma proteína hipotética conservada e que apresenta vários domínios putativos, entre eles o domínio peptidase M23. A hipótese é que esta proteína pode estar envolvida com a patogenicidade e/ou virulência da bactéria. Para obter o mutante ΔXAC0024 foi utilizada a técnica de mutagênese sítio-dirigida, seguida de recombinação homóloga com o vetor suicida pOK1. O mutante ΔXAC0024 foi analisado em relação às características de patogenicidade, crescimento in vivo e in vitro, capacidade de autoagregação, produção de biofilme e produção de goma xantana. O teste de patogenicidade e a curva de crescimento in vivo foram realizados em limão cravo utilizando o método de infiltração por seringa para a inoculação da bactéria. Os sintomas do desenvolvimento da doença foram registrados por fotografia digital até o 25º dia após a inoculação (dai) e a curva de crescimento in vivo também foi determinada até o 25º dai. A curva de crescimento in vitro e a agregação célula-a-célula foram analisadas em meio de cultura líquido NB. O ensaio de produção de biofilme foi feito em meio de cultura líquido XVM2 em superfície abiótica empregando cristal violeta para sua visualização e espectrofotometria para sua quantificação. A extração da goma xantana foi realizada por meio da precipitação com isopropanol após dissolução de KCl em meio goma com as bactérias multiplicadas em 96 horas. Verificou-se que o mutante ΔXAC0024 foi menos virulento em relação à Xac selvagem e que o seu desenvolvimento in planta é limitado; porém, em meio nutritivo NB apresenta crescimento similar à Xac selvagem. O mutante ΔXAC0024 apresentou ainda maior formação de goma xantana, diminuição na capacidade de se autoagregar e inalterabilidade na formação de biofilme em relação à Xac selvagem. Essa é a primeira evidência de que a ORF XAC0024 interfere na virulência da bactéria, afeta a produção de goma xantana e a agregação celular de Xac 306. A hipótese é de que a proteína codificada pela ORF XAC0024 participe do sistema de degradação do peptideoglicano na divisão celular em Xac, sendo que experimentos adicionais são necessários para confirmar esta hipótese. / The bacteria Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) is the causal agent of citrus canker, a disease that affects different species of economically important citrus. There is no a curative method for this disease, and do to its relevance and economic damage, it is necessary to understand at molecular level the Xac-citrus interaction in order to develop strategies to control the disease. The objective of this study was to investigate the effects of the deletion of the ORF XAC0024 present in the genome of Xac strain 306, which encodes a conserved hypothetical protein and has several putative domains, including peptidase M23 domain. It is hypothesized that this protein may be involved in the pathogenicity and / or virulence of the bacterium. For the ΔXAC0024 mutant was used for site-directed mutagenesis technique, followed by homologous recombination with the suicide vector pOK1. The ΔXAC0024 mutant was analyzed in relation to pathogenicity characteristics, growth in vivo and in vitro, self-aggregation capacity, biofilm production and production of xanthan gum. The pathogenicity test and in vivo growth curves were performed on Rangpur lime using syringe-infiltration method for the inoculation of bacteria. Symptoms of the disease development were recorded by digital photography to the 25° day after inoculation (dai) and in vivo growth curve was also determined to give the 25°. The growth curve in vitro and cell-to-cell aggregation were analyzed in liquid culture medium NB. Biofilm production test was done in a liquid culture medium XVM2 on abiotic surface using crystal violet for your viewing and spectrophotometry for its quantification. The extraction of xanthan gum was performed by isopropanol precipitation after dissolving KCl among gum with bacteria grown in 96 hours. It was found that the ΔXAC0024 mutant was less virulent compared to the wild Xac and its development in planta is limited; however, in nutrient medium NB presents similar growth to the wild Xac. The ΔXAC0024 mutant also showed increased formation of xanthan gum, decreased ability to self-aggregation and inviolability in biofilm formation compared to wild Xac. This is the first evidence that ORF XAC0024 interfere with bacterial virulence affects the production of xanthan gum and cell aggregation Xac 306. The hypothesis is that the protein encoded by ORF XAC0024 participate in the peptidoglycan degradation in division system cell in Xac, and further experiments are needed to confirm this hypothesis.

Submitted by Rosana Amâncio (rosana.amancio@ufcg.edu.br) on 2018-07-11T20:50:26Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Thamara - Capa Dura.pdf: 2260125 bytes, checksum: 530ae87f1e4a9200aafe1cb3102cff39 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-11T20:50:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Thamara - Capa Dura.pdf: 2260125 bytes, checksum: 530ae87f1e4a9200aafe1cb3102cff39 (MD5) Previous issue date: 2016-08-19 / CNPq / A gomose, provocada principalmente pelo oomiceto Phytophthora parasitica, é uma das mais graves doenças que acometem culturas de citros no âmbito mundial. Durante a interação, plantas induzem cascatas de sinalização a fim de induzir respostas de defesa. Contudo, P. parasitica secreta proteínas efetoras capazes de modular estas respostas por parte do hospedeiro, a fim de promover a infecção. No gênero Citrus, espécies comercialmente importantes são suscetíveis a infecção por este patógeno e a resistência a gomose é encontrada na espécie de citros Poncirus trifoliata. Considerando a escassez de informações acerca do patossistema citros-P. parasitica, o presente trabalho objetivou analisar, por meio de RT-qPCR, a expressão quantitativa de genes efetores apoplásticos e citoplasmáticos de P. parasitica e da cascata de defesa em citros, durante interações com espécies suscetíveis e resistentes, Citrus sunki e P. trifoliata, respectivamente. Dos 17 genes efetores estudados, 10 apresentaram expressão quantitativa relativa diferencial ao nível de significância induzida em P. parasitica após inoculação em raízes de P. trifoliata, sendo 06 apoplásticos e 04 citosólicos. Os perfis de expressão dos 17 genes efetores de P. parasitica apresentaram dois picos máximos de expressão, indicativos da síntese de novo desses genes ao longo dos pontos temporais de interação, sendo o acúmulo dos transcritos mais precoce sobre P. trifoliata (as 6 h.a.i.) e mais tardio sobre C. sunki (as 96 h.a.i.). Os elevados níveis de expressão de genes efetores em P. parasitica induzidos por C. sunki as 96 h.a.i. devem corresponder a fase necrotrófica de vida do oomiceto, consequentemente devido ao sucesso na penetração das células vegetais suscetíveis e acúmulo de biomassa do patógeno. A presença de hifas intracelulares no córtex de raízes de C. sunki foi abundantemente visualizada em micrografias as 96 h.a.i., a qual deve ocorrer como consequência da suscetibilidade da planta ao patógeno. Seis grupos hierárquicos de genes co-regulados foram formados a partir dos perfis de expressão dos 17 genes efetores em P. parasitica, os quais são reagrupados de modo diferente de acordo com a interação com C. sunki ou com P. trifoliata, indicando que o patógeno foi capaz de reconhecer entre hospedeiros suscetível ou resistente e sintetizar seletivamente quais efetores e em que intensidade devem ser segregados. As raízes de C. sunki expressaram 10 componentes de cascatas de resistência mediada pelo SA em resposta não bem-sucedida a infecção por P. parasitica. A supressão por P. parasitica da expressão de 05 genes de cascatas de resistência mediada pelo SA foi observada em raízes de P. trifoliata e deve indicar tentativas do patógeno de burlar com a imunidade da planta. Entretanto, a resistência de P. trifoliata a P. parasitica não deve utilizar genes envolvidos na cascata de resistência mediada pelo SA, mas sim genes PR-5 e calose sintase, envolvendo barreiras bioquímicas e estruturais. Portanto, o presente trabalho fornece uma nova visão para o entendimento acerca do processo de modulação de efetores de P. parasitica em interações suscetíveis e resistentes e, a maneira como estes hospedeiros respondem mediante interação / The gummosis, mainly caused by the oomycete Phytophthora parasitica, is one of the most serious diseases affecting citrus crops worldwide. During the interaction, plants induce signaling cascades in order to induce defense responses. However, P. parasitica secrets effector proteins capable of modulating these host responses in order to promote the infection. In Citrus genus, commercially important species are susceptible to infection by this pathogen and the gummosis resistance is achieved in Poncirus trifoliata citrus species. Considering the lack of information on citrus-P. parasitica pathosystem, this study aimed to analyze, through RT-qPCR, the quantitative expression of P. parasitica effector and citrus defense genes during citrus-P. parasitica susceptible and resistant interactions, with Citrus sunki and P. trifoliata, respectively. As results, P. parasitica was able to recognize among susceptible or resistant host and selectively synthesize which effectors and in that intensity should be expressed. Of the 17 studied effector genes, 10 showed quantitative relative differential expression at significance level induced in P. parasitica after inoculation in trifoliate orange roots, being 06 apoplastics and 04 cytosolics. The expression profiles for the 17 effector genes in P. parasitica had two maximum peaks of expression, that are indicative of de novo synthesis of these genes along the time points of interaction, showing transcript accumulation earlier on P. trifoliata (at 6 h.a.i.) and later on C. sunki (at 96 h.a.i.). High levels of the effector gene expression in P. parasitica induced by C. sunki at 96 h.a.i. must match the necrotrophic phase of life of this oomycete, consequently due to their successful penetration into the susceptible plant cells and pathogen biomass accumulation. The presence of intracellular hyphae in cortex of C. sunki roots was abundantly visualized in the micrographs at 96 h.a.i., which may occur as a result of the plant susceptibility to the pathogen. Six hierarchical groups of co-regulated genes were formed from the expression profiles of the 17 effector genes in P. parasitica, which are grouped differently according to interact with C. sunki or P. trifoliata, indicating that the pathogen was able to recognize between susceptible or resistant host and selectively synthesize which effectors and in that intensity should be segregated. The roots of C. sunki expressed 10 components of the cascade resistance mediated by SA in response not successful to P. parasitica infection. The suppression by P. parasitica of the expression of 05 genes of the cascade resistance mediated by SA was found in P. trifoliata roots, and must indicate pathogen attempts to circumvent with the immunity of the plant. However, P. trifoliata resistance to P. parasitica should not use genes involved in the resistance cascade mediated by SA, but instead PR-5 and callose synthase genes, involving biochemical and estructural barriers. In conclusion, this study provides a new insight into the understanding of the effectors of modulation process of P. parasitica in susceptible and resistant interactions and how these hosts respond through interaction.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-07Bitstream added on 2014-06-13T19:35:21Z : No. of bitstreams: 1 braga_gl_me_jabo.pdf: 800422 bytes, checksum: 8c818bf680f780fe0fe026c87dafb42e (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O cancro cítrico é uma das mais graves doenças da cultura dos citros e seu agente causal (Xanthomonas citri subsp. citri) encontra-se distribuído em dezenas de países localizados na Oceania, Ásia e América. Poucas informações estão disponíveis na literatura científica concernente à caracterização e clonagem de genes de resistência ao cancro cítrico. Sessenta um genótipos, desde altamente suscetíveis até os de plantas não hospedeiras, foram utilizados no presente estudo na tentativa de identificar possíveis R-genes envolvidos na resistência a essa doença. Quatro oligonucleotídeos, desenhados com base em R-genes de Arabdopsis thaliana e Malus floribunda, foram empregados na amplificação de amostras de DNA, clonagem e sequenciamento. Algumas sequências foram amplificadas unicamente em fenótipos altamente resistentes ou de plantas não hospedeiras, ou apresentaram homologia com sequências de genes envolvidas na resistência de plantas a estresses bióticos e abióticos. Algumas sequências traduzidas, encontradas em Citrus mitis, Citrus reticulata e Poncirus trifoliata, apresentaram mesmos aminoácidos presentes em domínios conservados de R-genes do tipo NBS-LRR. / Citrus canker is one of the most important citrus diseases worldwide. Its pathogen is the bacterium Xanthomonas citri subsp. citri that is presented in Ocean, Asia and America continents. Almost no information is available in the scientific literature about the genetic resistant against citrus canker. In the present work we developed and used primers in the tentative identification of genes involved in the resistance of citrus and other rutaceous genotypes against this disease. Sixty one genotypes, presenting complete resistant or extremely susceptible phenotypes, were tested with four primers developed based on R-genes from Arabdopsis thaliana and Malus floribunda. Some cloned sequences were identified only in resistant or non-host phenotypes or were similar with translated sequences homologues from genes involved in responses against biotic and abiotic stresses. Other traduced sequences, identified in Citrus mitis, Citrus reticulata and Poncirus trifoliata species, presented some predicted aminoacids from conserved domains of R-genes type NBS-LRR.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-02-28Bitstream added on 2014-06-13T20:56:16Z : No. of bitstreams: 1 jaciani_fj_me_jabo.pdf: 302453 bytes, checksum: 1fb27cbd11729232d8b900ef7c2e8c3c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A caracterização da estrutura genética de populações clonais de patógenos bacterianos tem sido feita, entre outros métodos, por “Southern blot” empregando-se como sondas seqüências de inserção ou genes avr. O presente trabalho objetivou o desenvolvimento de oligonucleotídeos iniciadores e sondas de DNA baseadas em genes de patogenicidade para estudo da diversidade genética de isolados de Xanthomonas citri subsp. citri, Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii e Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis. Observou-se a presença dos genes avrXacE1, avrXacE2 e lrp em todos isolados das subsp. citri e aurantifolii e a ausência do gene avrXacE2 no isolado da subsp. citrumelonis. Os perfis de restrição gerados por PCR-RFLP não revelaram polimorfismo nos genes amplificados e o uso de genes avr como sondas para “Southern blot” mostrou-se efetiva na diferenciação das espécies de Xanthomonas patogênicas a citros e na identificação de relativo polimorfismo entre isolados da mesma espécie. A diversidade haplotípica foi maior com o gene avrXacE1. Com exceção à sonda correspondente ao gene lrp, o número de haplótipos identificados (17) variou de acordo com a endonuclease utilizada em “Southern blot”. Os isolados da subsp. citri apresentaram um maior número de cópias dos genes avr em comparação com isolados das subsp. aurantifolii e citrumelonis. O estado de São Paulo, que adota uma campanha de erradicação do cancro cítrico, apresentou a menor diversidade haplotípica, provavelmente em decorrência do curto período em que o patógeno interage com o hospedeiro. / The genetic structure of clonal populations of bacterial pathogens has been characterized, among other methods, by Southern blot using insertion sequences or avr genes as probes. The present work aimed the development of DNA primers and probes based on pathogenicity genes to study the genetic diversity of Xanthomonas citri subsp. citri, Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, and Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis strains. The presence of avrXacE1, avrXacE2 and leucine rich protein (lrp) genes was observed in all citri and aurantifolii strains, as well as the absence of the avrXacE2 gene in citrumelonis isolate. The restriction profiles generated by PCR-RFLP did not show polymorphism in the amplified genes and the use of avr genes as Southern blot probes showed to be effective to differentiate Xanthomonas species pathogenic to citrus and to identify a relative polymorphism between strains belonging to the same species. The haplotype diversity was higher with the avrXacE1 gene. Excepting the probe corresponding to lrp gene, the number of haplotypes identified (17) varied according to the endonuclease used on Southern blot. The strains of the citri species presented a higher number of copies of the avr genes compared to aurantifolii and citrumelonis. The state of São Paulo, that adopts a campaign of eradication of the citrus canker, presented the smaller haplotype diversity, probably as result of the short period where the pathogen interacts with the host.

Submitted by ELKIN FERNANDO RODAS MENDOZA null (elferodas@yahoo.es) on 2016-09-24T23:11:18Z No. of bitstreams: 1 Tese Final.pdf: 4482779 bytes, checksum: 749ee0c558bf2e2ec8bbdc14d079523e (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-09-27T14:22:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 mendoza_efr_dr_jabo.pdf: 4482779 bytes, checksum: 749ee0c558bf2e2ec8bbdc14d079523e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-27T14:22:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 mendoza_efr_dr_jabo.pdf: 4482779 bytes, checksum: 749ee0c558bf2e2ec8bbdc14d079523e (MD5) Previous issue date: 2016-08-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) é o agente causal do cancro cítrico, uma das principais doenças que acometem a citricultura mundial. Atualmente não há uma maneira eficiente de controle do cancro, e novos métodos devem ser desenvolvidos para o tratamento desta doença. Assim, o estudo dos mecanismos utilizados pela Xac durante o processo infeccioso pode revelar novos alvos para o desenvolvimento de compostos farmacológicos que possam eliminar ou controlar o patógeno. Neste estudo, a técnica de RNA-Seq foi utilizada para a identificação de genes diferencialmente expressos (GDE) na Xac em condições in vivo e in vitro. Para isso, cinco variedades de citros com níveis diferentes de suscetibilidade ao cancro cítrico, e meios de cultura indutores de fatores de virulência foram utilizados. Muitos dos genes que codificam para proteínas relacionadas ao sistema de secreção tipo 3 (T3SS), enzimas extracelulares, resposta ao estresse oxidativo, transportadores de ferro e fósforo foram induzidos pela Xac nas condições in vivo. No entanto, in vitro, os perfis de expressão para estes mesmos genes foram diferentes. Estes dados permitiram compreender melhor o ambiente intracelular do hospedeiro, e como este se relaciona com os mecanismos de ativação dos fatores de virulência e patogenicidade de Xac. Neste sentido, os dados apresentados neste estudo mostraram que o T3SS é o principal fator de virulência expresso por esta bactéria em condições in vivo. Além disso, nossos resultados sugerem também que as baixas concentrações de fósforo inorgânico (Pi) e nitrogênio que a bactéria percebe no apoplasto das plantas, são interpretadas como sinais para a ativação do T3SS. Mutações realizadas em genes relacionados com o transporte de Pi (∆phoR e ∆pstB) em Xac demostraram a perda de virulência por alteração na expressão dos genes do T3SS. Assim, estes dados demostram pela primeira vez em Xac um possível mecanismo de regulação entre o sistema de transporte de Pi e o T3SS. Este estudo revelou diferentes fatores de virulência e patogenicidade utilizados pela Xac para vencer as defesas da planta, o que permitirá levantar hipóteses sobre a identificação de possíveis alvos quimioterapêuticos para o tratamento do cancro. / Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) is the causal agent of citrus canker, a major disease affecting citrus worldwide. Currently there is no effective way of cancer control, and new methods must be developed for the treatment of this disease. Thus, the study of the mechanisms used by Xac during the infectious process can reveal new targets for the development of pharmacologic compounds that can eliminate or control the pathogen. In this study, RNA-Seq technique was used to identify Xac differentially expressed genes (DEG) in vivo and in vitro conditions. For this purpose, five citrus varieties with different levels of susceptibility to citrus canker and culture mediums inducing virulence factors were used. Many of the genes encoding proteins of the type 3 protein secretion system (T3SS), extracellular enzymes, oxidative stress response, iron and phosphorus transport were induced in Xac in vivo conditions. However, the expression profiles for these same genes were different than observed in vitro conditions. These data allowed us to better understand the intracellular environment of the host, and how this relates to the activation mechanisms of pathogenicity and virulence factors in Xac. In this context, the data presented in this study show the T3SS as the main virulence factor expressed by the bacteria in vivo conditions. Furthermore, our results also suggest that low concentrations of inorganic phosphorus (Pi) and nitrogen, that bacteria sense in the plant apoplast, are interpreted as signals to activation of the T3SS. In this respect, mutations carried out in genes related to the transport of Pi (ΔphoR and ΔpstB) in Xac demonstrated loss of virulence by altering the expression of T3SS genes. Thus, these data identifies for the first time in Xac a possible regulatory mechanism between Pi transport system and T3SS. This study revealed different virulence and pathogenicity factors used by Xac to overcome the plant defenses. These discoveries allow raise hypotheses about the identification of potential chemotherapeutic targets to canker treatment.

A incidência de ceratite infecciosa relacionada a lentes de contato ocasionada por espécies de Acanthamoeba e Fusarium tem aumentado nos últimos anos. Esses organimos compartilham vários ambientes e casos de coinfecção foram relatados. Interações entre amebas e outros micro-organismos podem resultar em mudanças significativas para ambos, como o aumento da virulência em hospedeiros mamíferos. Neste estudo, foi avaliada a interação das cepas Neff, T4 e T4 pulmão de Acanthamoeba castellanii com Fusarium solani, bem como as possíveis implicações no desenvolvimento de ceratite. A. castellanii foi capaz de fagocitar F. solani e os conídios foram capazes de germinar dentro da ameba. A cocultura com ameba viva, bem como o sobrenadante da cultura e o lisado amebiano aumentaram significativamente o crescimento do fungo. Além disso, F. solani vivo e o seu sobrenadante de cultura aumentaram a sobrevivência da ameba, mas de forma diferente em cada cepa amebiana. A presença do fungo resultou em aumento de encistamento das cepas amebianas T4 pulmão e T4, bem como aumentou a resistência da cepa Neff à clorexidina. Curiosamente, a passagem pela ameba aumentou o efeito citopático de F. solani em células de mamíferos. Esses resultados mostram que A. castellanii e F. solani têm uma relação de protocooperação, com benefícios para ambos, e especialmente, indicam um possível efeito sobre as características de virulência de ambos os organismos. Assim a interação entre A. castellanii e F. solani pode resultar em impactos graves nos casos de ceratite. / The incidence of Acanthamoeba and Fusarium species has increased in contact lens-related infectious keratitis. They share several environments and cases of co-infection have been reported. The interaction between the amoeba and other microorganisms may result in significant changes for both, like increased virulence in mammalian hosts. In this study, we evaluated the interaction of Neff, T4 and T4 lung strains of Acanthamoeba castellanii with Fusarium solani and the implications in keratitis. A. castellanii phagocyted the fungi, and conidia were able to germinate inside the amoeba. The co-culture with live amoeba as well as the amebic culture supernatant and lysate significantly increased fungal growth. Moreover, live F. solani and the its culture supernatant enhanced the survival of amoeba, but differently in each A. castellanii strain. The presence of fungi resulted in increased amoebal encystment of T4 and T4 lung strains, end increased the resistence of Neff strain to chlorhexidine. The encystment of T4 and T4 lung strains was increased by the fungi. Interestingly, the passage by Neff amoeba increased the cytophatic effect of F. solani on mammalian cells linage. These results show that A. castellanii and F. solani have a protocooperation relationship, with benefits for both, and especially indicate a possible effect on virulence characteristics of both organisms. These data suggest that the A. castellanii-F. solani interaction may cause severe impacts in keratitis.

A doença vassoura-de-bruxa do cacaueiro (Theobroma cacao L.), causada pelo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa consiste numa importante enfermidade e apenas o uso de variedades resistentes representa uma solução econômica e ambientalmente viável. Os hormônios vegetais são imprescindíveis na rede de sinalização envolvida na resposta contra uma grande variedade de estresses bióticos e abióticos, sendo bem reconhecido o papel crucial do ácido salicílico (AS), etileno (ET) e os jasmonatos (JA) na interação planta-patógeno. O mecanismo de resistência observado em T. cacao contra o fungo hemibiotrófico M. perniciosa parece não envolver resposta de hipersensibilidade mediada pela sinalização por AS, e caracteriza-se pela menor incidência de sintomas e atenuação do crescimento micelial no material resistente. A resposta regulada por JA e/ou ET é determinada pela contenção e redução da colonização de tecidos infectados pelo patógeno, com atenuação dos sintomas manifestados, e está associada com a indução e produção de inibidores de protease, enzimas líticas da parede de fungos e enzimas do metabolismo secundário e cujo os genes demonstraram indução diferencial em amostras inoculadas com M. perniciosa. Recentemente, foi demonstrada a produção de AS pelo fungo M. perniciosa, o que poderia estar associado a um desarranjo hormonal na planta, auxiliando o pátogeno no processo infectivo. A partir destas evidências este trabalho teve como hipótese que JA e/ou ET estaria regulando a interação T. cacao e M. perniciosa. Sabe-se que a transcrição de genes codificantes das enzimas da via de biossíntese de JA é induzida por aplicação exógena de metil-jasmonato (MJ) e por patógenos, assim para verificar a participação de JA na resposta de defesa de cacau, seqüências de genes que codificam para enzimas da via de biossíntese foram identificadas, classificadas e confirmados sua identidade por seqüenciamento. A indução e expressão quantitativa destes, além dos genes Samsi, Accox, Pal, Jaz e Della, foram avaliadas entre o acesso susceptível à M. perniciosa (\'P7\') e o resistente (\'CAB 214\') de T. cacao, em experimentos de aplicação de indutores (AS, ET e MJ) e inoculação com M. perniciosa. As análises de expressão gênica relativa por RT-qPCR foram conduzidas e a resposta dos genes de biossíntese de JA, quando tratado com MJ no \'P7\' pareceu ser mais intensa e mais específica, enquanto que o acesso \'CAB 214\' apresentou resposta com menor intensidade, porém com resposta mais precoce, demonstrando que o mecanismo de regulação positiva pela aplicação exógena de MJ também ocorre em T. cacao. Em relação à inoculação, os resultados de expressão gênica sugerem uma diferença na resposta transcricional dos genes analisados sob inoculação de M. perniciosa entre o \'P7\' e o \'CAB 214\' onde os transcritos de Aos, Kat, Samsi e Jaz apresentaram elevação significativa somente no \'CAB 214\' em comparação ao \'P7\'. Em acessos resistentes, como \'CAB 214\', o efeito de AS produzido pelo fungo poderia não estar surtindo efeitos antagônicos, como indicado pelo aumento transcricional de Aos, gene codificador da principal enzima envolvida na biossíntese de JA, e embora os demais genes da via estejam sendo reprimidos, muito possivelmente a sinalização da resposta de defesa do acesso resistente \'CAB 214\' seja desencadeada por JA, devido ao papel central de AOS na sua biossíntese, e de maneira sinérgica ET estaria participando do mecanismo de resposta, indicado pela alta indução de Samsi no acesso resistente / Witches broom disease of cacao (Theobroma cacao L.), caused by the basidiomycete Moniliophthora perniciosa is an important disease and the use of resistant varieties is the only economic and environmental long-term solution. Plant hormones are essential in the signaling network involved in the response against a variety of biotic and abiotic stresses. It is well recognized the crucial role of salicylic acid (SA), ethylene (ET) and jasmonate (JA) in plant-pathogen interactions. The mechanism of resistance observed in Theobroma cacao against M. perniciosa does not appear to involve hypersensitivity response mediated by AS signaling, and it is characterized by lower incidence of symptoms and reduction of mycelial growth in resistant material. The response regulated by JA and/or ET is determined by the growth inhibition and a reduction of the colonization of infected tissues by the pathogen, together with an attenuation of symptoms. It is also associated with an induction and production of the protease inhibitors, lytic enzymes and enzymes of secondary metabolism and the genes enconding these enzymes have shown differential expression patterns in samples inoculated with M. perniciosa. It has been recently demonstrated that the production of AS by the fungus M. perniciosa could be associated with a hormonal disorder in the plant, which could therefore help the pathogen in the infective process. Considering this, the hypothesis that JA and/or ET would regulate the interaction of T. cacao with M. perniciosa was formulated in order to be tested by this research work. It is known that the transcription of genes encoding the enzymes of the JA biosynthesis pathway is induced by exogenous application of methyl jasmonate (MJ) and by pathogen, thus, in order to verify the involvement of JA in defense response of cocoa, sequences of genes that encode the enzymes of the JA biosynthesis pathway were isolated, identified, classified and had their identity confirmed by sequencing, and relative quantitative gene expression were evaluated in susceptible \'P7\' and resistant \'CAB 214\' plants of T. cacao. In addition genes Sams, Accox, Pal , Jaz and Della, were evaluated in experiments with application of inducers (AS, ET and MJ) and inoculation with M. perniciosa. Analysis of relative gene expression by RT-qPCR were conducted and \'P7\' seems to have the expression of jasmonate biosynthesis genes in a more intense and more specific manner when treated with MJ, while \'CAB 214\' shows an earlier yet lower response suggesting that the mechanism of positive regulation by the exogenous application of MJ also occurs in T. cacao. For the inoculation, the gene expression results suggest a difference in the transcriptional response from inoculation with M. perniciosa between \'P7\' and \'CAB 214\' in T. cacao. The effect of AS produced by the fungus may not have antagonistic effects in resistant materials such as \'CAB 214\', as indicated by the increase of the transcription of Aos gene that encodes the main enzyme involved in JA biosynthesis, so the defense responses of \'CAB 214\' is possibly triggered by JA signaling, because the central role of AOS in its biosynthesis, and may be part of synergistic ET signaling, indicated by high Samsi expression in resistance material

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-06-12T12:43:24Z No. of bitstreams: 1 Monique Monteiro Pinto Mariz.pdf: 880990 bytes, checksum: 394e31e628ac14413343b6929c523ac5 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-12T12:43:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Monique Monteiro Pinto Mariz.pdf: 880990 bytes, checksum: 394e31e628ac14413343b6929c523ac5 (MD5) Previous issue date: 2018-03-07 / The use of herbal products in animal production has shown to be promising because they are natural products, biodegradable and with antimicrobial activity against several pathogens, including fish. The objective of this work was to test the action of the crude ethanolic extract (CEE) of the Hymenaea martiana leaf on the formation and consolidation of the in vitro biofilm, its performance on the adhesion factors produced by Aeromonas spp. and to evaluate its toxicity, proposing an ex vivo model, using as substrate Nile Tilapia epithelium (Oreochromis niloticus) cultivated. The bacterial samples were submitted to a molecular test to detect five possible genes (aer-aerolysin, lip-lipase, ahy-elastase, fla- flagellin and ast-enterotoxins) involved in the production of virulence factors and in the formation of biofilms by the microorganism studied. The isolates were classified in strong, moderate and weak biofilm formers through the Elisa reader, after staining of gentian violet. They were analyzed in vitro against the bactericidal action of the extract and then to test the potential of the extract in the formation and consolidation of the biofilm of the aeromonas. Important factors such as capsule production and motility of the isolates were observed in tests such as red congo and motility assay respectively to understand the relation of genotypic factors to phenotypic responses. In the ex vivo evaluation, the action of the extract on its toxicity was observed with naked eye and optical microscope, presence of A. spp. adhered to the skin of tilapia. and possible morphological changes occurred. Regarding the results: The isolates presented seventeen different genetic combinations besides absence, in three isolates of the studied genes. This did not interfere in the biofilm production in any of the thirty isolates tested, where 100% were biofilm formers, with 13.3% as strong adherents. The extract obtained relevant results in vitro, inhibiting the action of the biofilm in formation and consolidation, besides inhibiting the motility, producing migration zones smaller than the control samples, without extract. In the ex vivo model the extract showed no toxicity in the group exposed only to it. In the group where the samples were submitted to the action of BSE + Inoculum there was degrading action of the bacterium on the epithelium, but in a smaller amplitude when compared with Group B, only with the presence of the inoculum in the epithelium. The phytotherapic presented promising in the fight against factors such as biofilm and bacterial adherence that increases the microbial pathogenicity, besides not being toxic in the ex vivo model. / O uso de fitoterápicos na produção animal tem se mostrado promissor por serem produtos naturais, biodegradáveis e com atividade antimicrobiana contra diversos patógenos, inclusive de peixes. Objetivou-se testar a ação do extrato etanólico bruto (EEB) da folha de Hymenaea martiana na formação e consolidação do biofilme in vitro, sua atuação quanto fatores de aderência produzida por Aeromonas spp. e avaliar sua toxidade, propondo um modelo ex vivo, utilizando como substrato epitélio de Tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus). As amostras bacterianas foram submetidas a teste molecular para determinação de seu potencial patogênico pela detecção de cinco genes (aer-aerolisina, lip-lipase, ahy-elastase, fla- flagelina e ast-enterotoxinas) envolvidos na produção de fatores de virulência e na formação de biofilmes pelo micro-organismo estudado. Os isolados foram quantificados em forte, moderado e fraco formadores de biofilme através de leitor de microplacas do tipo ELISA, após coloração com violeta de genciana. Foram analisados in vitro quanto a ação bactericida e em seguida quanto ao seu potencial na formação e consolidação do biofilme. Fatores importantes como produção de cápsula e motilidade dos isolados foram observados em testes como vermelho congo e ensaio de motilidade em meio semi-sólido respectivamente para a compreensão da relação de fatores genotípicos com as respostas fenotípicas. Na avaliação ex vivo foi observado a olho nu e microscópio óptico a ação do extrato quanto a sua toxidade, presença da A. spp. aderida a pele de tilápia e possíveis modificações morfológicas. Os isolados apresentaram 17 combinações genéticas, sendo ausente em 3 isolados dos genes pesquisados, não interferindo na produção do biofilme em nenhum dos 30 isolados testados, onde 100% foram formadores de biofilme, com 16,6% como fortes aderentes. Os resultados foram relevantes in vitro, inibindo a ação do biofilme em formação e consolidado, além de inibir a motilidade, produzindo zonas de migração menores que as amostras controle, sem extrato. No modelo ex vivo não ficou demonstroda toxidade no grupo exposto somente ao extrato. No grupo onde as amostras foram submetidas ao EEB+Inóculo houve ação degradante no epitélio, porém em menor amplitude quando comparada com o Grupo B, apenas com a presença do inóculo no epitélio. O uso fitoterápico se apresentou promissor contra a formação e consolidação do biofilme e aderência bacteriana, além de não ter se mostrado tóxico no modelo ex vivo.

Made available in DSpace on 2016-02-26T12:59:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 GilbertoFloresSouza.pdf: 4776672 bytes, checksum: b8aabb595b89b1322dab91e3d6af328d (MD5) Previous issue date: 2007-03-29 / Soybean yield has been the main culture in Brazil for its cultivation area and grain yield, which puts Brazil in the second place in world greatest yield and in the first place in country exporter. Although, the potential of productive efficiency of that culture of 4,000 kg hectare, it is hart to reach. Among main factors, diseases predominated, with great importance for Asian rust that is caused by Phakopsora pachyrhizi Syd. & Syd. That disease is considered as one of the most destroyer disease due to its aggressively and rapid dissemination. As it is a biotrophic pathogen, multiplication and surviving of that fungus only occur in live tissues of plants, this way, tiguera soybean and alternative hosts can allow the surviving of the pathogen, which produces the initial inoculum for subsequent epidemicals. The present work aimed to evaluating the susceptible of nine species of leguminous as alternative hosts of P. pachyrhizi Syd. & P. Syd, the fungus that causes Asian rust. This work was carried out in two periods, one in B.O.D. chamber, temperature of 25ºC and R.H. 93%, and other at laboratory at 20(+ or -2)°C, both two periods at Unit II of the Federal University of Great Dourados, Agrarian Science Institute, from March, 2006, to February, 2007. The following species were evaluated as green manure: common vetch (Vicia sativa L), green bean (Vigna unguiculata L.) Walp, fedegoso (Senna occidentalis) L., sunnhep (Crotalaria juncea L.), common bean (Phaseolus vulgaris L.), velvetbean (Mucuna aterrima L.) lablab bean (Dolichos lablab L.), jack bean (Canavalia ensiformes D.C.) and pea (Pisum sativum L). Every species that were inoculated with uredospore of P. pachyryhizi Syd. & P. Syd developed the symptoms; although, some species showed varied symptoms regarding to the number of harms and the presence of uredospore. Soybean, common bean, lablab bean and velvetbean showed fungal structures (uredospore) in both two conditions that the experiment was carried out, which shows that they have potential to hosting P. pachyrhizi Syd. & Syd. Jack bean, sunnhep, green bean and common vetch were considered susceptible plants, although those species showed be more exigent for sporulation of fungus / A produção de soja (Glycine max (L) Merrill) se tornou a principal cultura brasileira em área cultivada e produção de grãos, colocando o Brasil na posição de segundo maior produtor mundial e primeiro país exportador. Não obstante, o potencial de rendimento dessa cultura de 4.000 kg por hectare, é dificilmente alcançado. Dentre os principais fatores destacam-se as doenças; com elevado destaque para a ferrugem asiática causada por Phakopsora pachyrhizi Syd. & Syd. Essa doença é considerada como uma das mais destrutivas, devido sua agressividade e rápida disseminação. Por se tratar de um patógeno biotrófico, a multiplicação e sobrevivência do fungo só ocorrem em tecidos vivos de plantas, assim sendo, a soja tigüera e os hospedeiros alternativos podem permitir a sobrevivência do patógeno, produzindo o inóculo inicial para as epidemias subseqüentes. O presente trabalho objetivou avaliar a suscetibilidade de nove espécies de leguminosas como hospedeiras alternativas do P. pachyrhizi Syd. & P. Syd, o fungo causador da ferrugem asiática. Este trabalho foi desenvolvido em duas etapas, uma em B. O. D., temperatura de 25° C e U. R. 93% , e a outra no laboratório a 20 (+ ou -2) ° C, ambas na Unidade II da Universidade Federal da Grande Dourados, dependências da Faculdade de Ciências Agrárias, no período de março 2006 a fevereiro de 2007. Foram avaliadas as seguintes espécies utilizadas como adubo verde: ervilhaca (Vicia sativa L), feijão miúdo (Vigna unguiculata L). Walp, fedegoso (Senna occidentalis) L, crotalária (Crotalaria juncea L.), feijão comum (Phaseolus vulgaris L.), mucuna preta (Mucuna aterrima L.), labe-labe (Dolichos lablab L.), feijão de porco (Canavalia ensiformes D.C.) e ervilha (Pisum sativum L). Todas as espécies inoculadas com uredosporos do P. pachyrhizi Syd. & P. Syd, desenvolveram sintomas; no entanto, algumas espécies apresentaram sintomatologia variada quanto ao número de lesões e a presença de uredosporos. A soja, feijão comum, labe-labe e mucuna preta apresentaram estruturas fúngicas (uredosporos), nas duas condições em que foi desenvolvido este experimento, demonstrando terem potencial para hospedar o P. pachyrhizi Syd. & Syd. O feijão de porco, crotalária, feijão miúdo e ervilha foram considerados plantas suscetíveis, porém, estas espécies demonstraram serem mais exigentes para a esporulação do fungo

Made available in DSpace on 2016-02-26T12:59:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 GilbertoFloresSouza.pdf: 4776672 bytes, checksum: b8aabb595b89b1322dab91e3d6af328d (MD5) Previous issue date: 2007-03-29 / Soybean yield has been the main culture in Brazil for its cultivation area and grain yield, which puts Brazil in the second place in world greatest yield and in the first place in country exporter. Although, the potential of productive efficiency of that culture of 4,000 kg hectare, it is hart to reach. Among main factors, diseases predominated, with great importance for Asian rust that is caused by Phakopsora pachyrhizi Syd. & Syd. That disease is considered as one of the most destroyer disease due to its aggressively and rapid dissemination. As it is a biotrophic pathogen, multiplication and surviving of that fungus only occur in live tissues of plants, this way, tiguera soybean and alternative hosts can allow the surviving of the pathogen, which produces the initial inoculum for subsequent epidemicals. The present work aimed to evaluating the susceptible of nine species of leguminous as alternative hosts of P. pachyrhizi Syd. & P. Syd, the fungus that causes Asian rust. This work was carried out in two periods, one in B.O.D. chamber, temperature of 25ºC and R.H. 93%, and other at laboratory at 20(+ or -2)°C, both two periods at Unit II of the Federal University of Great Dourados, Agrarian Science Institute, from March, 2006, to February, 2007. The following species were evaluated as green manure: common vetch (Vicia sativa L), green bean (Vigna unguiculata L.) Walp, fedegoso (Senna occidentalis) L., sunnhep (Crotalaria juncea L.), common bean (Phaseolus vulgaris L.), velvetbean (Mucuna aterrima L.) lablab bean (Dolichos lablab L.), jack bean (Canavalia ensiformes D.C.) and pea (Pisum sativum L). Every species that were inoculated with uredospore of P. pachyryhizi Syd. & P. Syd developed the symptoms; although, some species showed varied symptoms regarding to the number of harms and the presence of uredospore. Soybean, common bean, lablab bean and velvetbean showed fungal structures (uredospore) in both two conditions that the experiment was carried out, which shows that they have potential to hosting P. pachyrhizi Syd. & Syd. Jack bean, sunnhep, green bean and common vetch were considered susceptible plants, although those species showed be more exigent for sporulation of fungus / A produção de soja (Glycine max (L) Merrill) se tornou a principal cultura brasileira em área cultivada e produção de grãos, colocando o Brasil na posição de segundo maior produtor mundial e primeiro país exportador. Não obstante, o potencial de rendimento dessa cultura de 4.000 kg por hectare, é dificilmente alcançado. Dentre os principais fatores destacam-se as doenças; com elevado destaque para a ferrugem asiática causada por Phakopsora pachyrhizi Syd. & Syd. Essa doença é considerada como uma das mais destrutivas, devido sua agressividade e rápida disseminação. Por se tratar de um patógeno biotrófico, a multiplicação e sobrevivência do fungo só ocorrem em tecidos vivos de plantas, assim sendo, a soja tigüera e os hospedeiros alternativos podem permitir a sobrevivência do patógeno, produzindo o inóculo inicial para as epidemias subseqüentes. O presente trabalho objetivou avaliar a suscetibilidade de nove espécies de leguminosas como hospedeiras alternativas do P. pachyrhizi Syd. & P. Syd, o fungo causador da ferrugem asiática. Este trabalho foi desenvolvido em duas etapas, uma em B. O. D., temperatura de 25° C e U. R. 93% , e a outra no laboratório a 20 (+ ou -2) ° C, ambas na Unidade II da Universidade Federal da Grande Dourados, dependências da Faculdade de Ciências Agrárias, no período de março 2006 a fevereiro de 2007. Foram avaliadas as seguintes espécies utilizadas como adubo verde: ervilhaca (Vicia sativa L), feijão miúdo (Vigna unguiculata L). Walp, fedegoso (Senna occidentalis) L, crotalária (Crotalaria juncea L.), feijão comum (Phaseolus vulgaris L.), mucuna preta (Mucuna aterrima L.), labe-labe (Dolichos lablab L.), feijão de porco (Canavalia ensiformes D.C.) e ervilha (Pisum sativum L). Todas as espécies inoculadas com uredosporos do P. pachyrhizi Syd. & P. Syd, desenvolveram sintomas; no entanto, algumas espécies apresentaram sintomatologia variada quanto ao número de lesões e a presença de uredosporos. A soja, feijão comum, labe-labe e mucuna preta apresentaram estruturas fúngicas (uredosporos), nas duas condições em que foi desenvolvido este experimento, demonstrando terem potencial para hospedar o P. pachyrhizi Syd. & Syd. O feijão de porco, crotalária, feijão miúdo e ervilha foram considerados plantas suscetíveis, porém, estas espécies demonstraram serem mais exigentes para a esporulação do fungo