Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007. / Submitted by mariana castro (nanacastro0107@hotmail.com) on 2009-12-21T21:02:30Z No. of bitstreams: 1 2007_SocratesSouzaOrnelas.pdf: 1031960 bytes, checksum: 7298f63db3d5c6d38aeb1eadc285547c (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2009-12-22T14:57:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_SocratesSouzaOrnelas.pdf: 1031960 bytes, checksum: 7298f63db3d5c6d38aeb1eadc285547c (MD5) / Made available in DSpace on 2009-12-22T14:57:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_SocratesSouzaOrnelas.pdf: 1031960 bytes, checksum: 7298f63db3d5c6d38aeb1eadc285547c (MD5) Previous issue date: 2007-03-06 / A diminuição da expressão do receptor CD4 da superfície celular é um dos eventos mais importantes durante a infecção pelo vírus da Imunodeficiência Adquirida (HIV-1). Dentre as três proteínas virais que participam neste processo, Nef, Vpu e Env, a primeira se apresenta como a mais relevante. Estudos realizados por outros grupos e o nosso, evidenciaram claramente a relação entre a capacidade em diminuir a expressão da molécula CD4, a capacidade replicativa e a infectividade viral, sugerindo a participação deste evento na patogênese e progressão à doença. Resultados encorajadores obtidos por nosso grupo demonstraram que o bloqueio da modulação de CD4 mediada por Nef em células infectadas pode ser uma boa abordagem terapêutica. Baseados nestes resultados e com o intuito de identificar novos alvos e abordagens terapêuticas, traçamos como principal objetivo neste estudo determinar o real papel fisiológico da tioesterase humana II (hTE) na modulação do receptor CD4 mediada por Nef. Esta proteína foi descrita como um dos principais parceiros celulares de Nef neste processo fisiopatológico. Utilizando a ferramenta molecular do RNA de interferência (RNAi) para bloquear a expressão de proteínas celulares e virais envolvidas neste fenômeno, foi possível observar que hTE não desempenharia um papel relevante na modulação de CD4, contrariamente ao assinalado em trabalhos prévios. Porém, esta proteína mostrou participar na regulação dos níveis de CD4, possivelmente através da despalmitoilação do receptor viral na superfície celular, levando a internalização da molécula independentemente da presença de Nef. Outros resultados obtidos neste estudo também indicam que ao menos em variantes de Nef que se ligam a esta proteína, como a presente na cepa NL43, a ação da enzima celular poderia ser potencializada pela proteína viral. No entanto a confirmação desta como outras hipóteses relacionadas às possíveis conseqüências biológicas da interação entre hTE e Nef requerem estudos adicionais. _________________________________________________________________________________________ Abstract / The down-modulation of CD4 receptor expression is one of the most important events during the HIV-1 infection. Among the three viral proteins involved in this process Nef, Env and Vpu, the first one is the most relevant. Results obtained by our group and others showed a clear relationship between the virus mediated receptor down-modulation, the increasing of infectivity and viral replication of HIV-1, suggesting a pathogenic role in this phenomenon and disease progression. More recently, we provided proof-of-concept that specific inhibition of Nef mediated CD4 down-modulation could be a good therapeutical strategy. Based on these results and aiming to identify new targets and therapeutical strategies, we investigated the physiological role of the human tioesterase II (hTE) in the down-modulation of CD4 receptor mediated by Nef. The hTE was described as one of the main cellular partners of Nef in this process. Using the interference RNA (RNAi) mechanism, as a molecular tool to block cellular and viral proteins expression involved in this phenomenon, we observed that hTE does not play a relevant role on Nef-CD4 modulation, as assigned by previous works. We showed here that the participation in the regulation of cellular surface CD4 levels possibly by a depalmitolation process, making the internalization independent of Nef. The hTE enzymatic action on Nef-NL43 transfected cells showed a probably synergism between Nef and hTE. The confirmation of these preliminary findings as well as, a more thoroughly understanding of the general biological consequences arising from the interaction between hTE and Nef, requires additional studies.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2010-05-06T12:46:44Z No. of bitstreams: 1 2006_Joaquim Xavier da Silva.pdf: 1330147 bytes, checksum: 83e57b736c0b34631ffca17bf6b58d06 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-05-06T16:44:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_Joaquim Xavier da Silva.pdf: 1330147 bytes, checksum: 83e57b736c0b34631ffca17bf6b58d06 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-06T16:44:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_Joaquim Xavier da Silva.pdf: 1330147 bytes, checksum: 83e57b736c0b34631ffca17bf6b58d06 (MD5) Previous issue date: 2006-04 / A diminuição da expressão do receptor CD4 da superfície da célula infectada é um dos mais importantes eventos durante a infecção pelo vírus da Imunodeficiência Adquirida (HIV-1). Três proteínas virais, Nef, Env e Vpu, participam neste processo, sugerindo que a remoção do receptor viral possui um papel crítico no ciclo de vida destes retrovírus. Dentro deste contexto, estudos descritos por outros grupos e o nosso, mostraram claramente a relação entre a capacidade de diminuir a expressão do receptor viral e o aumento de infectividade e capacidade replicativa do HIV-1, o que sugere a participação deste fenômeno na patogênese e progressão à doença. Baseado nestes dados, este estudo propõe investigar a presença de possíveis mutações nas seqüências de alelos de vpu, presente em diferentes estágios clínicos da infecção. Por outro lado, aproveitando a abordagem de PCR utilizada, foram também analisadas as seqüências dos alelos do exon 1 do gene rev e do peptídeo sinal do gene env. Na análise dos alelos de vpu em amostras de DNA genômico de células de sangue periférico de 12 pacientes, nos estágios inicial e tardio da infecção, foram detectadas 37 mutações (P3S, -L, I4Q, V6L, I8P, I26F, L41I, L45I, I46R, E59D, - QEE, A74P, W75G, V6I, A7T, V60L, I4E, V6F, I15A, V20I, I26L, R36K, M66T, E50D, -V, I4V, V6S, A14V, S23T, I24L, I26G, R29S, M69L, I78V, D79V, I27G e D79A) nos alelos presentes no estágio inicial, sendo que oito mutações (P3S, -L, L45I, I46R, E59D, -QEE, I15A, M66T) apresentaram diferenças estatisticamente significativas (p<0,05). Após análise dos alelos do exon 1 de rev, foram detectadas seis mutações no estágio inicial da infecção (S5R, E11D, I13L, R14K, L18V e L21F) e uma (I19T) no estágio tardio, sendo que três das presentes no estágio inicial (I13L, R14K, L21F) apresentaram um valor de p<0,05, e a presente no estágio tardio um p>0,05. Finalmente, no peptídeo sinal da proteína Env, foi detectado seis mutações (IRKN, IRRNC, GIKKNC, IRMSC, IRKNC e TLL) no estágio inicial e uma (K16E) no estágio tardio, porém essas mutações, não apresentaram diferenças estatisticamente significativas (p>0,05). A localização das mutações detectadas, assim como, sua possível correlação com os estágios clínicos da infecção, sugerem que estas possam vir a desempenhar importante papel na função das proteínas analisadas e conseqüentemente no curso da infecção. Dessa forma, espera-se que as informações obtidas neste estudo nos permitam posteriormente junto com testes funcionais "in vitro", determinar a relevância fisiológica da proteína Vpu, como das outras regiões analisadas, na patogênese da AIDS. _________________________________________________________________________________________ Abstract / Down-modulation of CD4 receptor expression is one of the most important events during the HIV-1 infection. Three viral proteins, Nef, Env and Vpu participate in this process, suggesting that viral receptor removal from the cell surface exerts a critical role in the retroviral life cycle. In this context, results achieved by for our group and others clearly showed a relationship between the infected cells viral receptor down-modulation and the increased infectivity and viral replication of HIV-1. These data suggest participation of this phenomenon in the pathogenesis and progression to the syndrome. Based on these data, it was investigated the presence of possible mutations in the alleles sequences of vpu, present in different clinical stages of HIV-1 infection. On the other hand, and taking advantage of the PCR approach utilized it was also analysed the allelic sequences of exon 1 rev gene and of env gene signal peptide. The analysis of genomic DNA obtained from peripheral blood samples of 12 patients, in the early and late stage of infection, detected 37 mutations (P3S, -L, I4Q, V6L, I8P, I26F, L41I, L45I, I46R, E59D, - QEE, A74P, W75G, V6I, A7T, V60L, I4E, V6F, I15A, V20I, I26L, R36K, M66T, E50D, -V, I4V, V6S, A14V, S23T, I24L, I26G, R29S, M69L, I78V, D79V, I27G e D79A) in the vpu alleles present in the early stage of infection, of these, eight mutations (P3S, -L, L45I, I46R, E59D, -QEE, I15A, M66T) showed statistically differences significant (p<0,05). Analysis of alleles of exon 1 rev gene, showed six mutations were detected in the initial stage of infection (S5R, E11D, I13L, R14K, L18V e L21F). Of them three (I13L, R14K, L21F), were statistically significant (p<0.05), one mutation (I19T) in late stage was also statistically significant with p>0.05 value. Finally, in the env peptide signal, six mutations were detected (IRKN, IRRNC, GIKKNC, IRMSC, IRKNC e TLL) in the initial stage and one (K16E) in the late stage of infection. Nevertheless, these mutations did not show statistical differences (p>0.05). Mapping of detected mutations, as well as, the possible correlation with different clinical infection stages of AIDS, suggests that Vpu and Env peptide signal could play an important function in the disease evolution. Therefore, we hope these informations, related to mutations in different alleles, would allow us in the near future; allied with in vitro experiments, contribute to the elucidatation the physiological relevance of Vpu protein as also, the other analyzed regions, in the pathogenic mechanisms of AIDS.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-16T23:23:41Z No. of bitstreams: 1 2010_BrunaCarolinaCastroBatista.pdf: 4362150 bytes, checksum: 854cb36bf2a23c796b0a170ab50d7866 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-16T23:24:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_BrunaCarolinaCastroBatista.pdf: 4362150 bytes, checksum: 854cb36bf2a23c796b0a170ab50d7866 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-04-16T23:24:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_BrunaCarolinaCastroBatista.pdf: 4362150 bytes, checksum: 854cb36bf2a23c796b0a170ab50d7866 (MD5) / O vírus causador da febre amarela (YFV) é um membro da família Flaviviridae e importante arbovírus patogênico ao homem. O diagnóstico da febre amarela é importante tanto para medidas de saúde pública como também para o tratamento adequado dos pacientes, já que os sintomas iniciais são típicos de outras doenças virais infecciosas. A glicoproteína do envelope (E) desse vírus é a maior determinante da imunogenicidade viral e da resposta imunológica do hospedeiro. Neste trabalho, a proteína do envelope do vírus da febre amarela foi expressa fusionada com a proteína poliedrina (POLH) dos corpos de oclusão do baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) em células de inseto pela infecção com um baculovírus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) recombinante. Primeiramente, foi construído um vetor baculoviral modificado para expressão de proteínas heterólogas fusionadas à POLH, o pFastAgPol. O fragmento de DNA contendo o gene da poliedrina (polh) do AgMNPV foi amplificado e, em seguida, transferido para o plasmídeo comercial pFASTBac1¿ (Invitrogen). Utilizando o sistema Bac-to-Bac (Invitrogen), o AcMNPV recombinante contendo o gene polh de AgMNPV foi construído (vAcPolAg). Células de inseto foram infectadas pelo vAcPolAg, e a expressão da proteína recombinante analisada por microscopia de luz, SDS-PAGE e Western blot. A proteína foi detectada por Western-blot, mas não houve a formação de corpos de oclusão. Um fragmento de DNA contendo o gene do envelope do YFV foi clonado no vetor de transferência pFastAgPol, em fase com o gene polh, para ser expresso como uma proteína de fusão e inserido no genoma do AcMNPV. Células de inseto também foram infectadas com o AcMNPV recombinante (vAcPolAgEnv) e a expressão da proteína recombinante foi analisada por SDS-PAGE e Western blot, que detectou um polipeptídeo de aproximadamente 88 kDa, correspondente à fusão da proteína E do vírus amarílico com a POLH de AgMNPV. Entretanto, também não ocorreu a formação de corpos de oclusão. As células infectadas com os dois recombinantes também foram analisadas por microscopia de luz, de transmissão e pelo microscópio confocal. A não formação de corpos de oclusão pode ter sido causada, no caso do vAcPolAg, pela substituição do sítio de terminação do gene polh por um sítio de clonagem para a fusão do gene E, o que resultou na introdução de 41 amino ácidos no C-terminal da POLH. No caso do vírus contendo a proteína de fusão, POLHENV, a própria fusão pode ter resultado na formação de uma proteína incapaz de formar corpos de oclusão pelas mudanças conformacionais. A construção dos vírus recombinantes, vAcPolAg e vAcPolAgEnv, e a expressão das proteínas fusionadas foram bem sucedidas demostrando o potencial do sistema baculoviral para o desenvolvimento de técnicas alternativas de diagnóstico e produção de vacinas utilizando partes virais. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The yellow fever virus (YFV), a member of the family Flaviviridae, is an important arbovirus pathogenic to humans. The yellow fever diagnosis its important not only to public health measures but also to patients proper treatment, once the initial symptoms are similar to others viral infectious diseases. The envelope glycoprotein (E) of this virus is the major imunogenicity and host immune response determinant. In this work, the yellow fever virus envelope protein was expresse fused to the protein polyhedrin (POLH) of the baculovirus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) occluded bodies in insect cells by the infection of a baculovirus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) recombinant. First, was constructed a modified baculoviral vector (pFastAgPol) for heterologous protein expression fused to POLH. The DNA fragment containing the AgMNPV polyhedrin gene (polh) was amplified and then transferred to a commercial plasmid pFASTBac1™ (Invitrogen).Using the Bac-to-Bac system (Invitrogen), the AcMNPV recombinant containg the AgMNPV polh gene was constructed (vAcPolAg). Insect cells were infected with vAcPolAg and the protein expressed was analyzed by light microscopy, SDS-PAGE and Western blot. The protein was detected by Western-blot but was not capable of forming occlued bodies. A DNA fragment containing the envelope gene of YFV was cloned into the transfer vector pFastAgPol, in frame with the polh gene, in order to be expressed as a protein fusion, and inserted into the AcMNPV genome. Insect cells were also infected with the AcMNPV recombinant (vAcPolAgEnv) and recombinant protein expression was analyzed by SDS-PAGE and Western-blot which detected a polypeptide around 88kDa, corresponding to the fusion of the yellow fever virus protein E with the AgMNPV POLH. However, threre were no formation of occlusion bodies either. Infected cells with the two recombinants also were analyzed by light, electron and confocal microscopy. The lack of occlusion body formation, in the case of vAcPolAg, could have been due to the substitution of the stop codon of the polh gene by a restriction site for the fusion with the E gene which resulted in the introduction of 41 amino acids to the C-terminal end of POLH. In the case of virus containing the fusion protein POLHF, the fusion itself could be responsible for the formation of a protein uncapable of forming occlusion bodies due to conformational changes. The construction of recombinant viruses, vAcPolAg vAcPolAgEnv, and expression of fused proteins were successful, demonstrating the potential of the baculoviral system for the development of alternative techniques of diagnosis and production of viral vaccines using parts of it.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2011. / Submitted by Shayane Marques Zica (marquacizh@uol.com.br) on 2011-10-13T20:26:55Z No. of bitstreams: 1 2011_MarcosViniciusPereiraGondim.pdf: 3114682 bytes, checksum: d7d4bbec765d574cd1538ad404d8cd94 (MD5) / Approved for entry into archive by Leila Fernandes (leilabiblio@yahoo.com.br) on 2011-10-17T14:16:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_MarcosViniciusPereiraGondim.pdf: 3114682 bytes, checksum: d7d4bbec765d574cd1538ad404d8cd94 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-10-17T14:16:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_MarcosViniciusPereiraGondim.pdf: 3114682 bytes, checksum: d7d4bbec765d574cd1538ad404d8cd94 (MD5) / A diminuição da expressão do receptor CD4 na superfície das células infectadas é um dos mais importantes eventos durante a infecção pelo HIV-1. Foi observada uma clara relação entre a degradação do receptor viral, o aumento da infectuosidade e a replicação viral, sugerindo a participação deste fenômeno na patogênese e progressão da infecção. Para vencer os efeitos negativos exercidos pela expressão da molécula CD4, o HIV possui três proteínas: Nef, Vpu e Env, sendo Nef a proteína mais relevante neste fenômeno. Nef agiria na superfície celular como um conector da cauda citoplasmática da molécula CD4, com membros do complexo adaptador heterotetramérico de clatrina, redirecionando a molécula CD4 para vesículas endocíticas. Uma bomba de prótons vacuolar (V-ATPase) e a proteína Epsn15 foram envolvidas no aumento da força de ligação entre Nef e a subunidade μ2 de AP-2. Com a finalidade de evitar a reciclagem de CD4 para a superfície celular, uma segunda conexão entre CD4 e a proteína β-COP é estabelecida por Nef, o que permite direcionar o receptor para degradação lisossômica. Adicionalmente, duas proteínas foram também envolvidas no mecanismo a tioesterase humana II (hTE-II) e a dinamina 2 (Dyn2). Experimentos para validar o papel dessas proteínas celulares e sua relevância fisiológica não foram conclusivos. Por esse motivo nos propomos neste trabalho a caracterizar as interações entre algumas das proteínas celulares e diferentes alelos da proteína Nef. Os níveis de interação entre as proteínas celulares hTEII, CD4, V1H, β-COP, AP1σ, AP2μ e AP2σ e diferentes alelos da proteína Nef do HIV-1 e de SIV (Nef.NA7, NL4.3 e Mac239, respectivamente), assim como mudança de localização intracelular foram avaliados pelas técnicas de transferência relativa de energia de fluorescência (FRET) e microscopia confocal. As proteínas hTEII, AP2μ e β-COP, embora tenham mostrado elevados níveis de interação com os alelos de Nef NL4.3, NA7 e Mac239, demonstraram importantes diferençaspor FRET e confirmados por microscopia confocal, sendo que algumas proteínas tiveram também sua localização intracelular alterada. Resultados similares foram observados quando analisadas as interações entre as proteínas celulares e o alelo Mac239 de SIV, detectando-se elevados níveis de interação entre este alelo e a proteína celular AP2μ, assim como uma mudança na localização da proteína celular. Já as proteínas V1H, AP1σ e AP2σ AP1 não evidenciaram níveis significativos de interação com os alelos de Nef por ambas as técnicas. As proteínas AP2μ e β-COP e o receptor CD4 mostraram uma significativa interação, mas não foi observado mudanças na localização das mesmas. Adicionalmente, foram construídos vetores lentivirais codificando RNAs de interferência (RNAis) contra as diferentes proteínas celulares e virais, com o intuito de avaliar o impacto fisiológico das mesmas na degradação de CD4 no contexto da infecção viral. A eficiência dos diferentes vetores no silenciamento gênico foi confirmada, entretanto, experimentos exploratórios para avaliar o impacto da inibição da expressão das proteínas celulares na degradação de CD4 mediada por Nef não foram conclusivos, precisando–se realizar experimentos adicionais com mudança nas condições experimentais. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The reduction of the receiver’s expression CD4 in the infected cells surfasse is one of the most importante events during the infectious process by HIV-1. It was observed a clear relationship among the viruses’ receiver degradation, the increase of infectious and virus’ replication, suggesting the participation of this phenomenon in infection pathogenesis and progress. To overcome the negative effects carried on by the molecular expression. CD4, HIV has three proteins: Nef, Vpu and Env, being Nef the most relevant protein in this phenomenon. Nef could act in cell surfasse as a link of the molecular cytoplasmic tail CD4 with the members of the complex adapter hetero tatrameter of clathrin, redirecting the CD4 molecule to the endocytic vesicles. A bomb of vacuole prótons (V- ATPase) and the protein Espn 15 were involved in the increase of bond strength between Nef and the subunit μ2 of AP-2. In order to avoid CD4 recycling to cell surfasse, another connection between CD4 and β-COP proteins is stabilished by Nef, which allows direct the receiver to the lysosomal degradation. Additionally, two proteins were also involved in this mechanism, human tioesterase II (hTEII) and the dynamin 2 (Dyn2). Experiments to validate the role of these cell proteins and its physiological relevance were not conclusive. For this reason we propose in this work characterize the interactions between some cell proteins and Nef’s protein diferente alleles. In both, the interactions and the location levels among some cell proteins as: hTEII, CD4, V1H,β- COP, AP1α, AP2μ and AP2α and diferente alleles of Nef protein of HIV-1 and SIV (Nef. NA7, NL4.3 and Mac 234, respectively), were evaluated by the techniques Relative transference of fluorescence energy (FRET) and Confocal microscopy. The proteins hTEII, Ap2μ and β- COP, although have shown high levels of interaction with Nef NL 4.3, NA7 and mac 239 alleles, demonstrated importante diferences among them. These levels of interaction were detected by FRET and confirmed by Confocal microscopy, of which some proteins also had their intracelular locations changed. Similar results were observed when interactions have happened between cell proteins and similar alleles Mac 239 of SIV, detecting high levels between this allele and the cell protein AP2μ, observing a change in the location of the protein, too. On the other hand, the proteins V1H, AP1α and AP2α, AP1 did not evidence significant levels of interaction with Ned alleles for both techniques. The analysis of interactions between cell proteins and CD4 receiver showed a significant interaction with AP2μ and β- COP proteins, but they did not induce changes in their location. Furthermore, there were lentiviral vectors encoding Interference RNAs (RNAis) against different cell proteins and viral. For the purposes of evaluate the physiological impact of CD4 degradation in viral infection context. The efficiency of different vectors in gene sileencing was confirmed, however, exploratory experiments to rate the impact of inibition in cell protein expression. in CD4 degradation, mediated by Nef, were not conclusive. It is necessary carry out additional experiments with change of experimental conditons.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde. / Submitted by Shayane Marques Zica (marquacizh@uol.com.br) on 2011-11-08T19:34:30Z No. of bitstreams: 1 2011_AnaCarolinaOliveiradeAraújo.pdf: 3209514 bytes, checksum: ae2cd9ee0a8a8200911cb3ad232d7e29 (MD5) / Approved for entry into archive by Leila Fernandes (leilabiblio@yahoo.com.br) on 2011-12-20T12:52:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_AnaCarolinaOliveiradeAraújo.pdf: 3209514 bytes, checksum: ae2cd9ee0a8a8200911cb3ad232d7e29 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-12-20T12:52:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_AnaCarolinaOliveiradeAraújo.pdf: 3209514 bytes, checksum: ae2cd9ee0a8a8200911cb3ad232d7e29 (MD5) / As Hepatites virais são doenças causadas por diferentes agentes etiológicos, que possuem distribuição universal e têm em comum o hepatotropismo. Em todo mundo, as hepatites A e B continuam a ser um grande problema de saúde pública. A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que 170 milhões de pessoas estejam infectadas com o vírus da hepatite C (HCV) e que 300 milhões vivam com o vírus da hepatite B (HBV). O vírus da hepatite B está classificado na família Hepadnavirus, contém características como o tropismo pelas células hepáticas e material genético constituído por uma molécula de DNA com fita parcialmente dupla. O diagnóstico de qualquer uma das formas clínicas da Hepatite B realiza-se através de técnicas sorológicas. Tais técnicas revelam-se fundamentais não apenas para o diagnóstico, mas também mostram-se muito úteis no acompanhamento da infecção viral, na avaliação do estado clínico do paciente e na utilização de terapêutica específica. As importantes descobertas realizadas nas áreas da virologia e da biologia molecular desses vírus, nos últimos anos, foram progressivamente sendo incorporados à rotina diária dos laboratórios de patologia clínica, permitindo aos profissionais da área de saúde acesso às modernas técnicas capazes de avaliar a carga viral presente no indivíduo, o índice de replicação do agente infeccioso e a eficácia de novas medicações utilizadas no tratamento dessa virose. O HBsAg é uma glicoproteína antigênica exposta na superfície do envelope do HBV cuja presença no soro do paciente indica uma infecção ativa . Capaz de ativar uma resposta imunológica, o HBsAg é utilizado na confecção de vacinas e Kits diagnósticos. Este trabalho descreve a construção de um baculovírus recombinante contendo o gene do antígeno HBsAg de HBV fusionado ao gene da poliedrina do Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus (AcMNPV). O vírus reecombinante foi usado para infectar células de insetos e insetos e sua expressão analisada por SDS-PAGE. A proteina recombinante foi expressa em grande quantidade, purificada por centrifugação em gradiente de sacarose e usada como antígeno em um teste de diagnóstico comumente utilizado em latoratórios clínicos. A proteina recombinante foi reconhecida pelo soro de pacientes infectados pelo HBV e desta forma, possui potencial para ser usada em testes de diagnóstico dessa importante doença viral humana. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Viral hepatitis are diseases caused by different etiologic agents, that have worldwide distribution and have in common hepatotropism. Worldwide, hepatitis A and B remains a major public health problem . The World Health Organization (WHO) estimates that 170 million people are infected with hepatitis C virus (HCV) and 300 million are living with hepatitis B virus (HBV). Hepatitis B is classified in the Hepadnavirus family, contains commun features such as tropism for liver cells and its genetic material consists of a partial double stranded DNA molecule. The diagnosis of a clinical form of hepatitis B is carried out by serological techniques. These techniques are not only important for diagnosis but are also very useful in monitoring viral infection, in assessing the patient's clinical status and in the use of specific therapy. Important developments derived from research in virology and molecular biology of these viruses in recent years, have gradually been incorporated into the daily routine of clinical pathology laboratories, allowing healthcare professionals to access modern techniques to evaluate the viral load present the individual, the replication of the infectious agent and effectiveness of new medications used to treat this viral infection. HBsAg is a glycoprotein antigen exposed on the surface of the envelope of HBV, whose presence in the serum of the patient indicates an active infection. HBSAg is able to activate a human immune response and is used in the production of vaccines and diagnostic kits. This work shows the construction of a recombinant baculovirus containing the HBsAg gene (from HBV) fused to the polyhedrin gene of the Autographa californica multicapsid Nucleopolyhedrovirus virus (AcMNPV). The recombinant virus was used to infect insect cells and insects and the expression of the recombinant protein was analysed by SDS-PAGE. The recombinant protein was highly expressed, purified by sucrose gradient centrifugation, and used as antigen in a diagnostic test commonly used in clinical laboratories m(ELISA). The recombinant protein was shown to be recognized by serum of HBV-infected patients and therefore, have the potential to be used in diagnosis of this important human viral disease.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-10-31T11:53:56Z No. of bitstreams: 1 2013_ThaisAlvesCostaLamounier.pdf: 11004578 bytes, checksum: 32671399d4110aa92de56af574a0a267 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-11-04T10:30:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_ThaisAlvesCostaLamounier.pdf: 11004578 bytes, checksum: 32671399d4110aa92de56af574a0a267 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-11-04T10:30:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_ThaisAlvesCostaLamounier.pdf: 11004578 bytes, checksum: 32671399d4110aa92de56af574a0a267 (MD5) / Os Norovírus (NV) são responsáveis pela maioria das gastroenterites humanas não bacterianas em todo o mundo. Devido ao fato das estirpes de NV humanos não possuírem a capacidade de replicação em culturas celulares, a utilização de Virus like particles (VLPs) na compreensão dos fatores imunológicos e físico-químicos torna-se uma boa alternativa para o estudo do genogrupo II genótipo 4 que é considerado o mais prevalente e está associado à epidemia global. O objetivo deste estudo foi produzir VLP de NV variante 2006b e selecionar anticorpos monoclonais humanos a partir de biblioteca apresentada em fagos após a purificação das proteínas. A maior vantagem em utilizar a técnica de Phage Display é a possibilidade da seleção de fragmentos de anticorpos monoclonais totalmente humanos que podem ser utilizados em ensaios clínicos. Foram comparados os métodos de purificação de cloreto de césio (CsCl) e cromatografia de troca iônica, sendo que esta última apresentou um melhor rendimento no que diz respeito à quantidade e pureza das proteínas de capsídeo obtidas. Dos 58 clones analisados após 4 ciclos de seleção utilizando VLP de NV como antígeno, dez foram analisados com Sfi I e BstO I com relação ao perfil e diversidade. Porém, as possíveis recombinações existentes determinaram a esperada diminuição da diversidade da biblioteca ao longo dos ciclos de seleção apesar dos Fabs reconhecerem especificamente o antígeno diferentemente da diversidade inicial, ou seja, na construção da biblioteca. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The Norovirus (NV) are responsible for most human nonbacterial gastroenterites worldwide. Because human strains of NV do not have the ability to replicate in cell cultures, the use of virus-like particles (VLPs) in understanding the immunological and physicochemical aspects becomes a good alternative for the study of genogroup II genotype 4, which is considered the most prevalent and is associated with the global epidemic. The aim of this study was to produce VLPs NV 2006b variant and select human monoclonal antibodies from phage-displayed library after purification of proteins. The major advantage in using the technique of phage display is the possibility of selecting fragments of fully human monoclonal antibodies that can be used in clinical trials. The methods of purification of cesium chloride (CsCl) and ion exchange chromatography were compared and the latter had a better performance as regards the amount and purity of the capsid proteins obtained. Of the 58 clones analyzed after 4 cycles of selection using the NV VLP as antigen, ten were analyzed with Sfi I and BstO I with respect to the profile and diversity. However, the possible existing recombinations led to an expected decrease of the library’s diversity during the selection cycles, though Fabs specifically recognized the antigen differently from the initial variety, that is on the construction of the library.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós Graduação em Patologia Molecular, 2010. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-04-28T13:58:54Z No. of bitstreams: 1 2010_IzabelCristinaRodriguesSilva.pdf: 2079351 bytes, checksum: 6440cd8bd00b2f9ab6e391d2898211ba (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2011-05-25T11:52:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_IzabelCristinaRodriguesSilva.pdf: 2079351 bytes, checksum: 6440cd8bd00b2f9ab6e391d2898211ba (MD5) / Made available in DSpace on 2011-05-25T11:52:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_IzabelCristinaRodriguesSilva.pdf: 2079351 bytes, checksum: 6440cd8bd00b2f9ab6e391d2898211ba (MD5) / O Z-DNA é uma estrutura energeticamente desfavorável do DNA que pode ser formada sob certas condições fisiológicas e é conhecida por estar envolvida em uma série de atividades biológicas como a regulação da transcrição. O presente estudo teve como objetivo identificar regiões genômicas em conformação de Z-DNA no genoma humano. Para a pesquisa destas regiões na conformação Z no núcleo da célula, um vetor que contêm informação genética para a expressão de um fragmento de anticorpo que reconhece Z-DNA (pMACIA scFvZ22NLS) foi transfectado em linhagens celulares humanas MCF-7 e A549, anteriormente a imunoprecipitação de cromatina com uso de agente fixador (XChIP) e clonagem. Outra estratégia substituiu a transfecção por um anticorpo monoclonal anti-Z-DNA, em uma estratégia ChIP sem o uso de fixadores (NChIP). Poucas sequências foram recuperadas destes experimentos e foram analisadas conforme seu conteúdo. Análise de dados por ferramentas de bioinformática mostraram três regiões no cromossomo 1 e uma no cromossomo 12 que contêm sequências potenciais formadoras de Z-DNA e foram confirmadas pelos programas Z-Catcher e Z-Hunt. Dentre elas, uma no cromossomo 1 contêm região repetitivas identificadas pelo programa Repeat Masker do tipo SINE/Alu , e tem similaridade com o segundo intron do gene TMCC2 (transmembrane and coiled-coil domain family 2), que codifica a proteína cerebral n.11. A quantificação, por meio da PCR quantitativa em tempo Real, dos fragmentos recuperados pela estratégia de ChIP, revelou que independente do tipo celular, na mesma região, a recuperação foi estatisticamente igual, porém a estratégia ChIP livre de formaldeído recuperou uma maior quantidade de cada sequência formadora de Z. Estes dados sugerem a presença de sequências potenciais formadoras de Z-DNA que podem ser investigadas como potenciais elementos regulatórios. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Left handed Z-DNA is an energetically unfavorable DNA structure that could be formed under certain physiological conditions and is involved in a number of cellular actives, such as transcription regulation. The present study focuses on identifying the distributions of Z-DNA regions in the human genome. To search for Z-DNA regions in the cell nucleus, a vector that codes for an antibody fragment that recognize Z-DNA (pMACIA scFvZ22NLS) was transfected into human cancers MCF7 and A549 cell lines, prior to a chromatin immunoprecipitation with fixeR agent (XChIP) and cloning approach. Another strategy used a monoclonal antibody against Z-DNA in a ChIP without fixer agents (NChIP). Few sequences were recovered from these experiments and they were analyzed for their nucleotide sequences. Bioinformatics analysis pointed three regions at chromosome 1 and one at chromosome 12 that presented potential Z- regions and these results were corroborated by the Z-Hunt and Z-Catcher softwares. Among them, one located at human chromosome 1, identified by the Repeat Masker software for harboring SINE/Alu repetitive elements, has similarity with the second intronic region of the TMCC2 (transmembrane and coiled-coil domain family 2) gene, which encondes for the cerebral protein n. 11. The quantification, through Real time quantitative PCR, of the fragments recovered by ChIP strategy, revealed that independently of cell type the Z-DNA conformation was present in the same region of the genome. The recovery of these segments was statistically similar in both strategies used; nevertheless the one free from formaldehyde ChIP recovered quantitatively most sequences. These data suggest the presence of physiologically relevant Z-DNA forming sequences in the human genome which may potentially play a role as regulatory elements. Hence, further investigations to determine its function are required.

A adrenoleucodistrofia ligada ao X (X-ALD) é a doença peroxissomal mais freqüente, com uma incidência de 1:20.000 homens na população geral, sendo identificada em todos os grupos étnicos. O gene envolvido na X-ALD é o gene ABCD1 (ATP-Binding Cassette transporter subfamily D member 1), que codifica uma proteína de membrana peroxissomal, ALDP. Mutações nesse gene são relacionadas ao acúmulo de ácidos graxos de cadeia muito longa (very long chain fatty acids – VLCFA) em todos os tecidos e fluidos corporais, especialmente no sistema nervoso e glândulas adrenais. Até o momento, mais de 1200 mutações já foram descritas neste gene. Três fenótipos principais são claramente identificados entre homens afetados: a forma cerebral (CALD), caracterizada por resposta inflamatória no SNC, a forma não inflamatória, AMN e a insuficiência adrenal isolada, também chamada de Addison-only. Não há correlação entre o tipo de mutação e o fenótipo clínico e uma possível explicação para essa alta variabilidade fenotípica poderia ser a ação de fatores ambientais e genes modificadores. Nesta tese está descrita, provavelmente, a primeira série de casos de pacientes sul-americanos com X-ALD. Foram avaliados aspectos moleculares da X-ALD em uma série de 38 famílias procedentes desde a Argentina até o Amazonas, relacionando-os com dados epidemiológicos e com a avaliação da taxa de sensibilidade e especificidade da análise de VLCFA em mulheres; e foi realizada a busca por potenciais genes modificadores que atuem, por CNV, na variabilidade fenotípica da X-ALD. Encontraram-se 36 mutações diferentes: apenas uma delas recorreu em 3 famílias. Doze destas mutações foram novas: a sua morbidade foi sustentada principalmente pelos graves rearranjos ou códons de parada prematuros por elas produzidos (p.Pro623Leu, p.Glu577X, p.Tyr33_Pro34fsX34, p.Arg538fs, p.Ala232fsX64, p.Trp137fsX57, p.Leu628Glu, p.Ile481Phe, p.Ala95fsX11, p.Gln55X, p.Arg401Gly e p.Ser358fsX42). Quatro situações (ou 10% da série) foram documentadas como mutações de novo. Como era de se esperar, não foi possível determinar nenhuma correlação entre genótipos e fenótipos. Uma das famílias foi identificada a partir de uma menina com CALD e desvio completo da inativação do X. Através da curva de Kaplan-Meyer, descrevemos a idade média de início das três formas principais nos homens: o início do Addison–only foi em média (IC de 95%) aos 7,4 (5,4-9,4) anos, da CALD, aos 10,9 (9,1-12,7) anos, e da AMN, aos 26,4 (20,3-32,5) anos. Descrevemos também a sobrevida média da CALD como de 24,7 (19,8-29,6) anos. Na presente série, 54 dos 87 afetados (ou 62%) apresentavam o fenótipo CALD, uma taxa maior do que a descrita na literatura (de 45 a 57%). Procuramos alguma evidência que vinculasse esse aparente excesso de formas desmielinizantes com a latitude de origem dos casos, à semelhança da esclerose múltipla: nossos resultados foram negativos. Em um subgrupo de famílias foi possível comparar o status genético final de 50 mulheres (heterozigotas versus normais) decorrente da investigação molecular, com os diagnósticos prévios levantados pela investigação bioquímica dos VLCFA. Encontramos uma elevada taxa de casos VLCFA falso-negativos, de 72,5%, muito maior do que a descrita na literatura (20%) e encontramos também dois casos de mulheres com VLCFA falso-positivos. Concluímos que o uso dos VLCFA deve ser evitado no aconselhamento genético. Finalmente, voltamos aos hemizigotos, em busca de genes candidatos a modificadores de fenótipos, através da associação dos mesmos com específicas variações no número de cópias (copy number variation - CNV) em 29 genes selecionados por seu papel na inflamação, metabolismo dos lipídios ou regeneração do sistema nervoso. A estratégia foi investigar CNVs destes genes através da técnica da Multiple Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) em um grupo de 85 pacientes espanhóis e brasileiros: 39 com AMN e 46 com CALD. Conseguimos identificar CNVs em nove destes genes. Interações potenciais entre estes genes foram inferidas a partir da ferramenta da web Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING) versão 9. A análise das redes criadas identificou três nódulos principais, com a POMC (Proopiomelanocortina) sendo a proteína central. Nós então sugerimos estes genes e a própria POMC como genes candidatos a modificadores do fenótipo X-ALD. / The X-ALD is the most frequent peroxisomal disease with a pan-ethnic incidence of 1:20,000 males in the general population. The gene involved in X-ALD is the ABCD1, which encodes a protein of the peroxisomal membrane, ALDP. Mutations in this gene are related to the accumulation of VLCFA in all tissues and body fluids, especially in the nervous system and adrenal glands. To date, more than 1200 mutations have been described in the gene. Three phenotypes are clearly identified among affected men: the cerebral form (CALD), characterized by inflammation in the CNS, the non-inflammatory form, adrenomyeloneuropathy (AMN), and Addison-only. There is no genotype-phenotype correlation, in spite of the high phenotypic variability observed in affected relatives. This thesis probably describes the first case series of South American patients with X-ALD. We have evaluated the molecular features of X-ALD, correlating them with epidemiological data in a series of 38 South American families. We have also evaluated the sensitivity and specificity of VLCFA in women, and have searched potential modifier genes that may act by CNV in the male phenotypic variability of X-ALD. We found 36 different mutations, only one recurring in three families. Twelve were new mutations: its morbidity was sustained mainly by major rearrangements or stop codons produced by them (p.Pro623Leu, p.Glu577X, p.Tyr33_Pro34fsX34, p.Arg538fs, p.Ala232fsX64, p.Trp137fsX57, p.Leu628Glu, p.Ile481Phe, p.Ala95fsX11, p.Gln55X, p.Arg401Gly and p.Ser358fsX42). Four (or 10% of the series) were documented as de novo mutations. As was expected, no genotype-phenotype correlation was found. One family was identified from a girl with CALD and complete deviation of X inactivation. By Kaplan-Meyer analysis, we have described the onset of the three main forms in men: the mean (95% CI) age at onset of Addison-only was 7.4 (5.4 - 9.4) years, of CALD, 10.9 (9.1 - 12.7) years, and of AMN, 26.4 (20.3 - 32.5) years. We have also estimated the survival of CALD as 24.7 (19.8 to 29.6) years. In this series, 54 of the 87 affected male (or 62%) had the phenotype CALD, a rate higher than that described in the literature (45-57%). We look for any evidence that relates the apparent excess of demyelinating forms with latitude of origin of cases, like multiple sclerosis: the results were negative. In a subgroup of families, the molecular analyses allowed us to compare the genetic status of 50 women (heterozygous versus normal) with the previous biochemical diagnoses raised up by VLCFA. A high rate of false negative VLCFA was disclosed, of 72.5%, significantly greater than the 20% described in literature. We have also found two false positives VLCFA results in females. We conclude that the use of VLCFA should be avoided in genetic counseling. Finally, we turned to hemizygotes, in search of candidate genes that could modify the X-ALD phenotype, chosen by for their role in inflammation, lipid metabolism or in the regeneration of the nervous system. The strategy was to investigate CNVs of these genes through the technique of Multiple Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) in a group of 85 Spanish and Brazilian patients: 39 with AMN and 46 with CALD. We have identified nine CNVs in these genes. Potential interactions between these genes were inferred from the tool Web Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes / Proteins (STRING) version 9. The analysis of network nodes identified three key created, with POMC (proopiomelanocortin) being the core protein. We then suggested they own and POMC genes as candidate genes modifying the phenotype of X-ALD.

A mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é uma doença genética autossômica recessiva, causada pela deficiência da enzima lisossomal α-L-iduronidase (IDUA), envolvida na degradação de dermatan e heparan sulfato. O acúmulo desses substratos nas células provoca inúmeras e variadas manifestações clínicas, acarretando diferentes formas da doença, as quais estão divididas de acordo com a sua gravidade: forma atenuada (Síndrome de Scheie – MPS I S), forma intermediária (Síndrome de Hurler-Scheie – MPS I SH) e forma grave (Síndrome de Hurler – MPS I H). O diagnóstico molecular precoce e preciso pode ser feito pela análise de DNA. Entretanto, como essa abordagem despende bastante tempo e recursos, procurou-se estabelecer uma estratégia mais eficiente de diagnóstico molecular. Inicialmente foi feita a comparação entre a metodologia tradicional e a análise por RNA através de levantamentos comparativos de tempo e custos de ambas as metodologias. A seguir, foi realizada a padronização e a validação dessa técnica. A padronização foi realizada em plasmídeo contendo cDNA de IDUA e a sua validação foi feita utilizando-se sangue e/ou fibroblastos de pacientes com diagnóstico molecular já estabelecido pela metodologia tradicional. Finalmente, foi sugerida uma nova abordagem otimizada de análise de DNA através da análise das freqüências de mutações descritas na literatura. O estudo do RNA pareceu, num primeiro momento, bastante vantajoso, sendo realizado em menos tempo e com custo reduzido para a genotipagem completa do gene. Para pesquisa das mutações comuns, a análise por RNA teve um custo mais alto, porém uma redução de 60% no tempo de processamento. Passou-se para a padronização da técnica, que foi realizada com sucesso. Entretanto, na etapa de validação observou-se que em pacientes com mutações sem sentido ou que alteram o sítio de splice, não são corretamente diagnosticados através dessa metodologia. Apenas as mutações com sentido trocado aparecem claramente, porém ainda assim pacientes heterozigotos compostos para essas mutações e uma mutação sem sentido são incorretamente diagnosticados como homozigotos, devido à falha de amplificação do alelo com mutação sem sentido. Como a abordagem proposta inicialmente não foi satisfatória, procurou-se uma estratégia otimizada de análise de DNA através do seqüenciamento direto de éxons com maior freqüência de mutações. Essa nova abordagem utilizando DNA ainda necessita ser validada em uma amostra de pacientes para que se possa conhecer o seu real impacto no tempo e custo do diagnóstico molecular de pacientes com MPS I. / Mucopolisaccharidosis type I (MPS I) is an autosomal recessive genetic disorder caused by the deficiency of the lysosomal enzyme α-L-iduronidase (IDUA), responsible for the degradation of dermatan and heparan sulfate. The storage of these undegraded or partially degraded substrates causes the various clinical manifestations of the disease that can be classified into three main forms: Scheie Syndrome (MPS I S), the attenuated form; Hurler- Scheie Syndrome (MPS I HS), the intermediate form; and Hurler Syndrome (MPS I H), the severe form. Early and precise molecular diagnosis can be performed by DNA analysis. However, as this methodology is time and resource-consuming, more efficient approaches are needed. Initially, a comparison between the traditional DNA analysis and RNA-based analysis was performed for each step of both techniques. Then, the RNA-based technique was set up using a plasmid with IDUA cDNA and validated on patients with molecular diagnosis already performed by DNA analysis. Finally, an optimized strategy for DNA-based analysis based on the mutation frequencies was proposed. In comparison with DNA-based analysis, RNA studies seem more advantageous, as it is less expensive and faster for whole gene sequencing. For the screening of common mutations it is more expensive but 60% less time-consuming. This technique was successfully set-up. However, at the validation step it was noticed that nonsense and splice site mutations are not correctly diagnosed by this methodology. Missense mutations can be clearly identified even though compound heterozygotes with nonsense mutations are wrongly diagnosed as homozygotes due to amplification failure of the nonsense carrying allele. As this approach was considered unsuitable for the analysis of MPS I patients, a new optimized strategy based on direct sequencing of selected exons was suggested. This approach still needs to be validated in a sample of patients so that its real impact on molecular diagnosis of MPS I can be established.

Introdução:Mucopolissacaridose tipo II é uma doença lisossômica causada pela deficiência da enzima idounato-2-sulfatase. A incidência de MPS II é muito baixa, geralmente menos de 1 caso para cada 1.000.000 recém-nascidos. Até o presente momento, cerca de 340 mutações foram identificadas no gene da idorunatosulfatase. Objetivo: O presente trabalho teve como objetivo principal identificar as alterações moleculares presentes em 149 pacientes brasileiros e sul americanos com diagnóstico bioquímico de MPS II. Métodos: Após a realização do protocolo inicial proposto e que incluía o sequenciamento completo do gene IDS, alguns pacientes não apresentaram alterações e foram incluídos num protocolo adicional para casos “especais”. Resultados: Uma deleção de 178pb foi encontrada na região promotora do gene, em 2 pacientes que não apresentaram alterações em região codificante, bem como outros 2 pacientes apresentaram um polimorfismo na mesma região, que nunca havia sido relatado em pacientes com MPS II. A detecção de uma deleção em 3 pacientes através da técnica de PCR convencional,exon por exon, nos mostrou que a deleção se estendia da região proximal do gene IDS até a região dos genes FRAXA e FRAXE, contudo análises adicionais, através de SNP-array, confirmaram a deleção restrita a estas regiões em 2 pacientes e identificaram a deleção total retrita ao gene IDS em outro. Após a análise de 105 pacientes com MPS II, 30 novas mutações foram encontradas o que demonstra uma grande heterogeneidade genica. Conclusão: Tais análises são importantes para elucidar o defeito básico e assim poder identificar portadoras nas famílias, o que tem uma importância fundamental para o aconselhamento genético, diagnóstico pré-natal e prevenção de novos casos. Adicionalmente, a informação sobre o defeito genéticomolecular é muito importante para a predição do fenótipo e consequentemente para a definição da melhor estratégia de tratamento. / Background: Mucopolysaccharidosis type II is a lysosomal disease caused by deficiency of the enzyme idounate-2-sulfatase. The incidence of MPS II is very low, usually less than 1 case per 1 million newborns. To date, about 340 mutations have been identified in the IDS gene. Objective: This study aimed to identify the molecular alterations present in 149 Brazilian and South American patients with biochemical diagnosis of MPS II. Methods: After molecular analysis using the initial protocol proposed, wich included complete sequencing of the IDS gene, someof the patients showed no DNA alterations of the gene coding region and were included an additional protocol for “special” cases. Results: A deletion of 178pb was found in the promoter region of the gene in two patients. An other 2 patients had a polymorphism in the same region, which had never been reported in patients with MPS II. A deletion was observed in 3 patients by conventional PCR, exon by exon, which extended from the proximal IDS gene until the fagile sites FRAXA and FRAXE. Additional analyzes using SNP-array confirmed the deletion of those regions in two patients and have identified the full deletion restricted to IDS in another. After analysis of 105 patients with MPS II, 30 new mutations were found which shows a broad genomic heterogeneity. Conclusion: Such analyzes are important to elucidate the basic defect and thus enable to identify carriers in families, which is of fundamental importance for genetic counseling, prenatal diagnosis and prevention of new cases. In addition, information about the molecular genetic defect is very important for the prediction of phenotype and thus for defining the best tstrategy for treatment.