As espécies Aspidosperma polyneuron Muell. Arg. e Aspidosperma cylindrocarpon Muell. Arg. pertencentes à família Apocynaceae, de ocorrência natural no estado de São Paulo, foram objeto de investigação química e estabelecimento de culturas in vitro. Como não havia relatos da composição dos alcalóides presentes nas folhas de ambas as espécies, nossos estudos foram concentrados nessa parte do vegetal. Adicionalmente, foi analisado a composição dos óleos voláteis destas espécies. Como são descritas diversas atividades biológicas para os alcaloides indólicos, foram analisados as atividades antitumoral, antimicrobiana e antimalárica dos extratos de alcalóides totais. Os alcalóides das folhas de A. polyneuron foram obtidos através de partição ácido-base com solventes orgânicos e foram isolados por técnicas cromatográficas de adsorção, sendo analisadas por CG/MS. Na espécie A. polyneuron foram identificados 5 alcalóides indólicos do tipo aspidospermatano: aspidospermina, desmetil-aspidospermina, desmetóxi-aspidospermina, cilindrocarina e pirifolidina. O estudo químico das folhas de A. cylindrocarpon, através de técnicas cromatográficas e CG/MS permitiu a identificação de alcalóides indólico do tipo aspidospermatano (aspidospermina, N-benzoíl-cilindrocarina, N-benzoíl-20-hidróxi-cilindrocarina, N-cinamoíl-20-hidróxi-cilindrocarina) do tipo erbunano (16-epi-vincamina) e do tipo hetero-ioimbano (tetra-hidro-alstonina). Os óleos voláteis foram obtidos das folhas por destilação por arraste a vapor. O óleo de A. polyneuron apresentou um constituinte majoritário, o diterpeno caureno (73,7%), e aldeídos de cadeia longa. No óleo volátil das folhas de A cylindrocarpon foram identificados 25 constituintes que correspondem a 96,1 % do óleo bruto. Principalmente sesquiterpenos hidrocarbonados (germacreno-D, β-cariofileno) e sesquiterpenos oxigenados (espatulenol, epi-globulol e globulol), além de monoterpenos hidrocarbonados (α-pineno) e oxigenado (linalol) e aldeídos de cadeia longa. Na cultura de células in vitro de A. polyneuron, foi possível apenas a indução de calos friávies. A cultura de células da A. cylindrocarpon foi estabelecida desde as células não diferenciadas. Dos calos até as suspensões celulares. As culturas apresentram fase lag com aproximadamente 4 dias, seguida de uma fase de crescimento exponencial e de uma fase com crescimento linear, com duração de 15 dias. Após essa fase as células entram numa fase estacionária de crescimento. Nos ensaios de autobiografia para determinação da atividade antifúngica frente aos fungos Clasdosporium cladosporiodes e Clasdosporium sphaerospermum, ambos extratos de alcalóides totais apresentaram respostas positivas. A atividade antimalárica foi avaliada em cepas mutantes de Saccharomyces cerevisiae deficientes em sistema de reparo do DNA (RS321, Rad 52Y). Neste ensaio, apenas os alcalóides das folhas de A. cylindrocarpon apresentaram atividade. A atividade antitumoral foi determinada in vitro com isolados de Plasmodium falciparum sensíveis a cloroquina (K1) e resistentes (Palo Alto). Como havia relato dessa atividade para A. polyneuron foram feitos testes apenas para A. cylindrocarpon (folhas e ramos). Os extratos alcaloídicos apresentaram uma forte inibição do desenvolvimento dos parasitas. A Cl50 para o isolado K1 foi de 9,0µg/ml para os ramos e folhas 8,0µg/ml e para o isolado Palo Alto, ramos foi de 13,3µg/ml e folhas 10,5µg/ml. / Aspidosperma polyneuron Muell. Arg. and Aspidosperma cylindrocarpon Muell. Arg. belong to Apocynaceae and naturally occur in São Paulo State (Brazil). Both species were chemically investigated and in vitro cultures established. As there were no previous studies concerning the alkaloid composition from the leaves, our studies were focused on this plant part. Moreover, the volatile oil composition was determined for both species. As several biological activities have been described for indole alkaloids, the antimicrobial, antitumor and antimalarial activities were assayed for the total alkaloids. The leaf alkaloids were extracted by acid/base partitioning with organic solvents and isolated by adsorption chromatography techniques. The isolated alkaloids were analysed by GC-MS. A. polyneuron leaves afforded 5 aspidospermatane alkaloids: aspidospermine, demethoxy-aspidospermine, demethylaspidospermine cylindrocarine and pyrifolidine. In A. cylindrocarpon leaves different indole alkaloid skeletons were identified, 4 aspidospermatanes (aspidospermine, N-benzoyl-cylindrocarine, N-benzoyl-20-hydroxy-cylindrocarine, N-cynamoyl-20-hydroxy-cylindrocarine), 1 eburnane (16-epi-vincamine) and 1 heteroyohimbane (tetrahydroalstonine). The volatile oils were extracted from the leaves by steam distillation. A. polyneuron oil consisted of one single major compound, the diterpene kaurene (73,7%), and several long chain aldehydes. On the other hand, from the A. cylindrocarpon oil 25 constituents could be identified corresponding to 96.1 % of the crude oil. The major components were sesquiterpene hydrocarbons (germacreno-D, β-caryophyllene), oxygenated sesquiterpenes (spathulenol, epi-globulol, globulol), a monoterpene hydrocarbon (α-pinene), an oxygenated monoterpene (linalool) and also several long chain aldehydes. For A. polyneuron, callus cultures were induced, while for A. cylindrocarpon was also possible the establishment of cell suspension cultures. A. cylindrocarpon cell suspension cultures showed a lag phase of growth for approximately 4 days. The lag phase was followed by a growth phase for 15 days. After 20 days of culture the cells showed a stationary growth. Alkaloid extract from both species showed a antifungal activity in the bioautography assay with Clasdosporium cladosporiodes and C. sphaerospermum. The antitumor activity was evaluated with mutant Saccharomyces cerevisiae strains deficient in the DNA repair system (RS321 and Rad 52Y). In this assay, only the leaf alkaloids of A. cylindrocarpon presented activity. In vitro antimalarial assay were performed with Plasmodium falciparum chloroquine sensitive (K1) and resistant (Palo Alto). As such an activity was previously reported for A. polyneuron, only A. cylindrocarpon alkaloid extracts from leaves and stems were tested. Both alkaloid extracts showed strong inhibition of the parasite development. The IC50 for the K1 isolate were 9.0 µg/ml for the leaves and 8,0 µg/ml for the stems. The Palo Alto isolated presented a higher IC50, 13,3 µg/ml stems and 10,5 µg/ml.

Este trabalho objetivou o estudo de rotas de formação de metabólitos secundários utilizando precursores isotopicamente marcados com 13C. Os experimentos de crescimento com adição de [1-13C]acetato, [1,2-13C2]acetato e [U-13C315N1]-L-cisteína para o fungo do ambiente marinho Penicillium sp. DRF2 mostrou que as ciclotiocurvularinas são provenientes da rota de formação de policetídeos e pela incorporação de L-cisteína, depois da transformação desta em 3-mercaptopiruvato. Os resultados sugerem que a formação das ciclotiocurvularinas provém de um processo de detoxificação da α,β-desidrocurvularina. O estudo do metabolismo secundário de Aspergillus sp. DLM3-8, também do ambiente marinho, mostrou que o seu perfil metabólico produzido em experimentos de crescimento sob diferentes condições é constante. Os experimentos de incorporação de precursores isotopicamente marcados com 13C na naftoquinonaimina, produzida por Aspergillus sp. DLM3-8 foram inconclusivos, indicando que outras abordagens experimentais devem ser realizadas para se investigar a biossíntese deste metabólito. / This investigation aimed investigated the formation routes of secondary metabolites using 13C-labelled precursors. Feeding experiments with [1-13C]acetate, [1,2-13C2]acetate and [U-13C315N1]-L-cysteine within the growth medium of the marine-derived fungi Penicillium sp. DRF2 showed that cyclothiocurvularins are derived from polyketides and from the incorporation of a L-cysteine residue, after its transformation into 3-mercaptopyruvate. The results suggest that the formation of cyclothiocurvularins is derived from a detoxification process ofα,β-dehydrocurvularin. Investigation of the secondary metabolism of a marine-derived Aspergillus sp. DLM3-8 indicated a stable metabolic profile under a variety of growth conditions. Feeding experiments with 13C-labelled precursors for the biosynthesis investigation of naphthoquinoneimine were inconclusive, indicating that other methodologies should be envisaged in order to investigate the biosynthesis of this metabolite.

Submitted by Edineia Teixeira (edineia.teixeira@unioeste.br) on 2018-03-05T14:21:12Z No. of bitstreams: 2 Juliete_Souza2017.pdf: 1034930 bytes, checksum: b1f11241cc86452c59ec27f91ef18252 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-05T14:21:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Juliete_Souza2017.pdf: 1034930 bytes, checksum: b1f11241cc86452c59ec27f91ef18252 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-03-08 / The genus Zanthoxylum comprises species distributed throughout tropical regions and temperate regions mainly. The plants of this genus are of great ethnobotanical, phytochemical importance. Z. caribaeum species are popularly known as thorn-billed thorns, thorny thorns, black hawthorn, stinky mammals, and stalks, and require further studies on its biological potential. In this study, the chemical composition, antimicrobial, antioxidant and acaricidal activities from different vegetal extracts (aqueous, ethanol, methanol, hexane, acetonide, dichloromethane and ethyl acetate) and from this species essencial oil were investigated. It was also determined the chemical composition of the essential oil of Z. caribaeum leaves through gas chromatography coupled to mass spectrometry (CG/MS), the antimicrobial activity of the extracts and of the essential oil was determined by measuring the Minimal Inhibitory Concentration (MIC) and Minimal Bactericidal Concentration (MBC) using broth dilution technique against pathogenic microorganisms such as Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium (ATCC 14028), Salmonella enterica subspecies enterica serovar Enteretidis (ATCC 13076), Escherichia coli (ATCC 25922), Klebsiella pneumoniae ATCC 13883), Proteus mirabilis (ATCC 25933), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228), Enterococcus faecalis (ATCC 19433), Bacillus subtilis subspecies spizizenii (CCCD B005), yeast Candida albicans (ATCC 10231) and against different serotypes of Salmonella enterica, occuring isolated in the western region of Paraná, Brazil. It was also evaluated the antioxidant activity of the essential oil by the DPPH (2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl) free radical capture method, as well as its repellent capacity against Dermanyssus gallinae (Panzer) (Acari: Dermanyssidae), using Y-olfactometer. In general, the GC/MS of the essential oil was dominated by terpenes, the major compounds being Germacrene-D, -Panasinsene, -Selinene, Varidiflorene and -Elemene. Regarding the antimicrobial activity, except for the aqueous extract, all the extracts showed antimicrobial activity, in addition, the essential oil was effective against all the Gram-positive and Gram-negative bacteria tested and some different serotypes of Salmonella enterica. In relation to the antioxidant activity, the essential oil presented high antioxidant capacity, besides a repellent action of 79% against the mite D. gallinae. Thus, it is concluded that the results contribute to the chemical and biological characterization of the species Z. caribaeum, being a promising source of secondary metabolites with biological activities. / O gênero Zanthoxylum compreende espécies distribuídas mundialmente, principalmente em regiões tropicais e regiões temperadas. As plantas deste gênero têm grande importância etnobotânica, fitoquímica e a espécie Z. caribaeum é conhecida popularmente por espinho-de-barrão, espinho cheiroso, espinheiro-preto, mamiqueira-fedorenta, pau-de-barrão e necessita de mais estudos a respeito de seu potencial biológico. Diante disto, esta espécie foi o objeto de estudo, na qual foi investigada a composição química e as atividades biológicas antimicrobiana, antioxidante e acaricida dos diferentes extratos vegetais (aquoso, etanolico, metanolico, hexanico, acetonico, diclorometanico e de acetato de etila) e do óleo essencial. Também foi determinada a composição química do óleo essencial das folhas de Z. caribaeum através de cromatografia gasosa acoplada a espectofometria de massas (CG/EM), a atividade antimicrobiana dos extratos e do óleo essencial foi realizada pela determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM) utilizando a técnica de diluição em caldo frente microrganismos patogênicos como Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Typhimurium (ATCC 14028), Salmonella entérica subespécie enterica sorovar Enteretidis (ATCC 13076), Escherichia coli (ATCC 25922), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883), Proteus mirabilis (ATCC 25933), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228), Enterococcus faecalis (ATCC 19433), Bacillus subtilis subespécie spizizenii (CCCD B005), a levedura Candida albicans (ATCC 10231) e frente a diferentes sorotipos de Salmonella enterica, de maior ocorrência e isoladas na região oeste do Paraná, Brasil. Avaliou-se também a atividade antioxidante do óleo essencial pelo método de captura de radicais livres DPPH (2,2difenil-1-picril-hidrazil), bem como, a sua capacidade repelente ao ácaro Dermanyssus gallinae (Panzer) (Acari: Dermanyssidae) pela utilização de olfatômetro em Y. De maneira geral, a CG/EM do óleo essencial verificou-se o predomínio de terpenos, sendo os compostos majoritários o Germacreno-D, -Panasinseno, -Selineno, Varidifloreno e -Elemeno. Em relação a atividade antimicrobiana, com exceção do extrato aquoso, todos os extratos vegetais apresentaram atividade antimicrobiana, além disto, o óleo essencial foi efetivo frente a todas as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas testadas e alguns diferentes sorotipos de Salmonella enterica. Em relação a atividade antioxidante, o óleo essencial apresentou elevada capacidade antioxidante, além de ação repelente de 79% frente ao ácaro D. gallinae. Desta forma, conclui-se que os resultados contribuem para a caracterização química e biológica da espécie Z. caribaeum, sendo uma fonte promissora de metabolitos secundários com atividades biológicas.

Os organismos marinhos constituem uma fonte potencial de metabólitos secundários biologicamente ativos. Neste contexto, os micro-organismos isolados de algas marinhas, dentre eles fungos endofíticos, representam alvos para a pesquisa de novas substâncias com potencial farmacológico pronunciado. Substâncias naturais provenientes de espécies de fungos associados às algas marinhas vêm sendo bastante utilizadas em formulações fotoprotetoras devido à ação antioxidante e ao potencial contra a radiação solar. Deste modo, o presente trabalho teve como objetivo a investigação biológica e química dos fungos endofíticos marinhos pertencentes à família Xylariaceae, o Annulohypoxylon stygium, o Cladosporium sp. e o Acremonium implicatum (Hypocreaceae). A princípio, foi realizado um screening para avaliar a absorção de luz ultravioleta na faixa do UVA e UVB pelos extratos obtidos em escala piloto destes fungos endofíticos associados às algas marinhas. O extrato do fungo A. stygium apresentou intensa absorção na região do UV, mostrando-se promissor para a produção de metabólitos secundários com ação fotoprotetora. Além do ensaio proposto, foi realizada a avaliação do potencial antibacteriano e antifúngico da espécie A. stygium. O estudo químico em escala ampliada deste fungo proporcionou o isolamento e identificação de uma substância inédita da classe derivada da 2,5- dicetopiperazina, 3-benzilideno-2-metil-hexahidro-pirrolo [1,2-?] pirazina-1,4-diona (Sf3), e além desta, foram isolados mais quatro metabólitos como, os diasteroisômeros 1-fenil-1,2- propanediol (Sd2) e 1-fenil-1,2-propanediol (Sd3), 1,3-benzodioxole-5-metanol (Sc1), 1,2- propanodiol-1-(1,3-benzodioxol-5-il) (Se1). Ainda foi possível a desreplicação de substâncias via cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM), entre elas o ácido palmítico, palmitato de metila, ácido metil linoléico, ácido oléico, álcool benzílico e o piperonal. Quanto ao estudo da atividade biológica, não foi observado potencial antibacteriano e antifúngico para os extratos e frações do fungo. Entretanto, notouse um potencial como fotoprotetor in vitro para as frações n-Hexano/AcOEt (2:3) e n- Hexano/AcOEt (1:4) obtidas a partir do extrato do cultivo de 28 dias do fungo A. stygium, extraído com solventes diclorometano/metanol (CH2Cl2/MeOH 2:1) e para a substância (Sf3) isolada do mesmo. Desta forma, o estudo químico e biológico do fungo Annulohypoxylon stygium demonstrou potencial para a produção de metabólitos secundários com atividade fotoprotetora, visto que uma estrutura inédita com esta atividade foi isolada e identificada como produto natural. / Marine organisms consist of a potential source of biologically active secondary metabolites. In this context, the microorganisms isolated from marine algae, including fungal endophytes represent targets for the search of new substances with pronounced pharmacological potential. Natural substances from fungal species associated with marine algae, have been widely used in sunscreens formulations due to the antioxidant action and the potential against solar radiation. Thus, this study aimed to research biological and chemical profile of marine endophytic fungi belonging to the Xylariaceae family, the Annulohypoxylon stygium, the Cladosporium sp. and Acremonium implicatum (Hypocreaceae). First of all, a screening was performed to evaluate the absorption of ultraviolet light in the range of UVA and UVB by extracts obtained in pilot scale of these endophytic fungi associated with seaweed. The fungus extract A. stygium showed intense absorption in the UV region, being promising for the production of secondary metabolites with sunscreen action. In addition to the proposed test was performed to evaluate the antibacterial and antifungal potential of the species A. stygium. The chemical studies on increased scale of this fungus provided the isolation and identification of a novel compound of the class derived from 2,5-diketopiperazine, 3- benzylidene-2-methylhexahydropyrrolo [1,2-?] pyrazine-1,4-dione (Sf3), and beyond, four metabolites were isolated like of the diasteroisomers 1-phenyl-1,2-propanediol (Sd2) and 1- phenyl-1,2-propanediol (Sd3), 1,3-benzodioxole-5-methanol (Sc1), 1,2-propanodiol-1-(1,3- benzodioxol-5-il) (Se1). Furthermore was possible to dereplicate substances by means of gas chromatography-mass spectrometry (CG-MS) analyses: palmitic acid, methyl palmitate, methyl linoleic acid, oleic acid, benzyl alcohol and piperonal. Regarding to biological activity evaluation, it was not observed antibacterial and antifungal potential for extracts and fractions of the fungus. However, it was observed as a potential sunscreen in vitro for fractions n-Hexane/AcOEt (2:3) and n-Hexane/AcOEt (1:4) obtained from extract after 28 days growth culture of the fungus A. stygium. The mycelia were extracted with solvents dichloromethane/methanol (CH2Cl2/MeOH 2:1) and the compound Sf3 was isolated from the same extract. Thus, the chemical and biological study of the fungus Annulohypoxylon stygium demonstrated the potential for production of secondary metabolites with sunscreen activity, since a novel structure displaying this potential was isolated and identified as a natural product.

O ambiente marinho, pela própria diversidade orgânica que representa, tem sido reconhecido como fonte promissora de metabólitos secundários biologicamente ativos. Algas marinhas produzem grande variedade de substância terpenoídicas, aromáticas e de origem policetídica, e bioensaios têm demonstrado importante potencial biológico relativo a estes metabólitos. Micro-organismos associados às algas, tais como fungos endofíticos, também representam importante e promissora fonte de produtos naturais com esqueletos estruturalmente diversos. Bostrychia é um gênero algal fisiológica e biogeograficamente bem estudado mas são escassas as informações quanto à sua composição química, predominando a descrição de polióis e de moléculas de baixo peso molecular. Neste trabalho, os resultados da comparação dos perfis cromatográficos de espécies de Bostrychia representam uma primeira abordagem qualitativa dos constituintes polares do conjunto de espécies desse gênero ocorrentes no litoral norte do estado de São Paulo, e deverá ser complementado por meio do isolamento e identificação estrutural de seus constituintes majoritários. O isolamento de fungos endofíticos a partir de B. radicans (coletadas em ambiente de costão rochoso e manguezal) e B. tenella (coletadas no costão rochoso) possibilitou a preservação de 135 linhagens disponíveis para estudos posteriores. Dentre as linhagens isoladas de B. radicans costão, dez foram selecionadas para cultivo em meio sólido e entre estas três (C75, C81 e C82) foram selecionadas para estudos químicos e biológicos. As linhagens C81 e C82 foram identificadas por dados moleculares como Phomopsis longicolla e Penicillium brevicompactum, respectivamente. Foram isoladas e identificadas três substâncias conhecidas a partir de P. longicolla (18-deoxicitocalasina H, ácido micofenólico e dicerandrol C) e duas a partir de P. brevicompactum (ácido micofenólico e seu derivado metilado). Nos ensaios biológicos, a fração hexânica de P. longicolla apresentou alta atividade antimicrobiana (abaixo de 100g.mL-1), bem como um de seus metabólitos isolados (atividade abaixo de 10g.mL-1), frente às bactérias Staphylococcus aureus e S. saprophyticus. Esse mesmo metabólito também apresentou potencial de inibição de degranulação de mastócitos e atividade citotóxica, reforçando o potencial dos micro-organismos endofíticos na biossíntese de compostos que possam auxiliar no desenvolvimento de novos fármacos. Em conjunto, os resultados obtidos mostram que algas marinhas e fungos endofíticos associados representam uma importante área a ser explorada em relação ao potencial biológico de produtos naturais. / The marine environment, due to its organic diversity, has been recognized as a promising source of new biologically active secondary metabolites. Seaweeds produce a large variety of terpenoidic, aromatic and poliketids substances. Bioassays have been demonstrated significant biological potential concerning these metabolites. Microorganisms associated with algae, such as endophytic fungi, also represent important and promising source of natural products with molecularly-diverse structures. Bostrychia is an ecophysiology, biogeographically well-studied algal genus, but information about its chemical composition is scarce, prevailing reports about its polyol and low-molecular-weight contents. In this work, the results of the comparison of the chromatographic profiles of Bostrychia species growing in the north coast of São Paulo State represent a first qualitative approach of the polar constituent in this genus, and may be complemented by isolation and identification of their majority constituents. The isolation of endophytic fungi from B. radicans (collected in rocky shore and mangrove environment) and B. tenella (collected in the rocky shore) allowed the preservation of 135 strains available for posterior studies. Among the strains isolated from B. radicans rocky shore, ten were selected for cultivation in solid medium and three (C75, C81 e C82) were selected for chemical and biological studies. C81 and C82 strains were identified by molecular data as Phomopsis longicolla and Penicillium brevicompactum, respectively. Three known substances were isolated and identified from P. longicolla (18-deoxycytochalasin H, mycophenolic acid and dicerandrol C) and two from P. brevicompactum (mycophenolic acid and its methyl derivative). Biological assays revealed the hexanic fraction of P. longicolla presenting high antimicrobial activity (below of 100g.mL-1) against Staphylococcus aureus and S. saprophyticus, as well as one of its isolated metabolites (activity below of 10g.mL-1). This metabolite also presented mast cell degranulation inhibition and cytotoxic activity, reinforcing the potential of endophytic microorganisms in the byosinthesis of compounds that can be useful in the new drugs development. As a summary, the results show that algae and their endophytic fungi associated represent an important field to be explored in terms of biological potential of natural products.

Macroalgas vermelhas da espécie Bostrychia radicans (Rhodomelaceae) foram coletadas em diferentes ecossistemas de Ubatuba, litoral norte do Estado de São Paulo, mais especificamente nos costões rochosos da Praia Dura e no manguezal do Rio Escuro. Os extratos e frações obtidos dos espécimes, provenientes das duas regiões, expressaram diferentes respostas quando avaliadas as atividades tripanocida, leishmanicida, antitumoral, antifúngica e citotóxica. Estes resultados nos levaram a inferir que há uma possível relação entre as variações ambientais e a produção de metabólitos secundários biologicamente ativos nesta espécie. Concomitantemente ao estabelecimento do potencial biológico de extratos e/ou frações, foram realizadas avaliações comparativas do perfil químico da espécie B. radicans, coletada nos diferentes ecossistemas citados anteriormente. Através da comparação dos constituintes voláteis destas amostras, obtidos por microextração em fase sólida, foi possível observar diferenças significativas entre estas; sendo que a amostra proveniente dos costões apresentou uma maior diversidade de metabólitos. Em contrapartida, as análises comparativas dos constituintes apolares, realizadas por CG-EM, não revelaram diferenças significativas quanto à composição química da espécie. Com relação ao perfil cromatográfico das substâncias polares, obtido via CLAE, também foi observada semelhança quanto aos constituintes presentes em ambas as amostras. Ainda, a partir dos estudos químicos desta espécie foi possível o isolamento do colesterol e 4-hidroxi-N-(2-hidroxietil)-benzamida, além de outras substâncias isoladas em mistura, tais como: heptadecano, esqualeno, ácidos tetradecanóico e hexadecanóico, ésteres 9-octadecenoato e hexadecanoato de metila, os diterpenos trans-fitol e neofitadieno; além das substâncias aromáticas: 4-metoximetilfenol, 4-hidroxibenzaldeído, 4-hidroxibenzenoacetato de metila, 4-hidroximandelato de metila, 4-diidroxibenzenopropanoato de metila, hidroquinona, 4-hidroxibenzoato de metila, ácido 4-hidroxibenzenoacético e 4-formilcarbonilfenol. / Red macroalgae from Bostrychia radicans (Rhodomelaceae) species were collected in different ecosystems in Ubatuba, north littoral of São Paulo state, more specifically in Praia Dura rocky shores and Rio Escuro mangrove. The extracts and fractions obtained from specimens, of the two regions, expressed different responses when the trypanocide, leishmanicide, antitumoral, antifungic and citotoxic activities were evaluated. Based on these results, we could infer that there is a possible relation between the environmental variations and the production of secondary metabolites with biological activity, in this specie. At the same time, comparative analyses of chemical profiles of B. radicans from the different ecosystems were done in order to stabilish the influence of the habitat. The chemical profile of volatile compounds of B. radicans, obtained by solid phase microextraction, diverged significantly according to their habitat (mangrove or rocky shore) and the rocky shore specimens showed more variability of compounds. On the other hand, the chemical profile of apolar constituents, performed by GC-MS, were not significantly different in their midst. Concerning the chromatographic profile of polar constituents, obtained by HPLC, it was observed that these compounds were very similar. Moreover the chemical study of this species led to the isolation of cholesterol, and 4-hydroxy-N-(2-hydroxyethyl)-benzamide, and other constituents isolated together, like: heptadecane, squalene, tetradecanoic and hexadecanoic acids, methyl 9-octadecenoate and methyl hexadecanoate, trans-phytol e neophytadiene; behind the phenols: 4-metoxymethylphenol, 4-hydroxybenzaldehyde, methyl 4-hydroxybenzeneacetate, methyl 4-hydroxymandelate, methyl 4-dihydroxybenzenepropanoate, hydroquinone, methyl 4-hydroxybenzoate, 4-hydroxybenzeneacetic acid and 4-fomylcarbonyl-phenol.

O ambiente marinho tem sido reconhecido como uma importante fonte de metabólitos secundários biologicamente ativos. Neste contexto, fungos endofíticos associados a algas ganharam importância nas últimas décadas, como alvos alternativos para a pesquisa de produtos naturais. O presente trabalho teve como o objetivo o estudo químico e biológico de duas linhagens de fungos endofíticos associados à alga vermelha Bostrychia radicans. Inicialmente foi realizada a triagem química e biológica (atividade antitumoral e antimicrobiana) dos extratos brutos das duas linhagens selecionadas, linhagens M20 (Hypocrea lixii) e M23 (Eutypella sp), obtidos a partir de cultivos em escala piloto, tanto variando-se os meios de cultivo e bem como períodos de crescimento. O extrato da linhagem M20 cultivada em arroz apresentou potencial citotóxico interessante quando submetido a ensaios utilizando células tumorais HCT-116. Ainda, após a análise química, esta linhagem foi selecionada para o cultivo em escala ampliada, visando o isolamento e elucidação estrutural dos metabólitos secundários presentes neste fungo. O estudo químico em escala ampliada da linhagem M20, espécie Hypocrea lixii, proporcionou o isolamento e identificação de quatro metabólitos: ácido 3-hidroxi-5-metóxi-6-metil-1,3-diidro-isobenzofurano-4- carboxílico (S1), 3,7-dimetóxi-6-metil-1-oxo-1,3-diidro-isobenzofurano-4-carbaldeído (S3), galactitol (S4), convolvulol (S5), além do isolamento de dois metabólitos que ainda não foram completamente elucidados, S2 e S6. Os metabólitos S1 e S3 são metabólitos inéditos como produtos naturais. Além disso, foi possível a identificação de 14 substâncias via cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM), entre elas hidrocarbonetos, ácidos graxos, inclusive insaturados, aldeídos, aldeídos ?,?-insaturados e esteróide. As substâncias S1 e S4 foram submetidas à avaliação de atividade biológica (atividade antibacteriana, antifúngica, anticolinesterásica e antitumoral), porém nenhum resultado positivo foi constatado. Foi realizada avaliação da atividade tumoral das frações da linhagem M20, e as frações M20F e M20H apresentaram atividade citotóxica seletiva para linhagens de células tumorais. Em um segundo momento foi realizado o cultivo em escala ampliada da linhagem M23 (Eutypella sp) que proporcionou o isolamento da R-5-metilmeleína (S7). Dessa forma, o estudo químico de fungos endofíticos associados à alga Bostrychia radicans mostrou-se promissor na busca de novas estruturas químicas, visto que já foram isoladas e identificadas duas estruturas inéditas como produtos naturais. / The marine environment has been recognized as an important source of biologically active secondary metabolites. In this context, endophytic fungi associated with algae gained importance in recent decades, as alternative to natural products research targets. The present work had as goal the chemical and biological study of two strains of endophytic fungi associated with red algae Bostrychia radicans. The chemical and biological screening (antimicrobial and antitumor activity) of the crude extracts of two selected strains, M20 (Hypocrea lixii) and M23 (Eutypella sp), were obtained from pilot-scale cultivation, by means of culture media and growth period variation. The M20 strain extract, grown in rice, showed an interesting cytotoxic potential front HCT -116 tumor cells and after chemical analysis, this strain was selected for cultivation on a large scale, with the purpose of secondary metabolites isolation. Chemical studies of M20 species strain Hypocrea lixii, performed on an enlarged scale, afforded the isolation and identification of four metabolites: 3-hydroxy-5-methoxy-6- methyl-1,3-dihydro-isobenzofuran-4-carboxylic acid (S1), 3,7 dimethoxy-6-methyl-1-oxo- 1,3-dihydro-isobenzofuran-4-carbaldehyde (S3), galactitol (S4), convolvulol (S5), in addition the isolation of two metabolites which have not yet been fully elucidated, S2 and S6. The S1 and S3 metabolites are novel metabolites as natural products. Furthermore, it was possible to identify 14 compounds by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS), including hydrocarbons, fatty acids, besides unsaturated ones, aldehydes, ?,?-unsaturated aldehydes and steroid. The S1 and S4 compounds were subjected to biological activity evaluation (antibacterial, antifungal, antitumor and acetylcholinesterase potential), but without any positive result. Assessment of tumor activity of fractions of the M20 strain was performed, and the M20F and M20H fractions showed selective cytotoxicity to tumor cell lines. In a second step, the M23 strain (Eutypella sp) was grown on a large scale, resulting in the R-5-metilmeleina (S7) isolation. Thus, the chemical study of endophytic fungi associated to Bostrychia radicans algae proved to be promising concerning the search for new chemical compounds discovery, since it yielded two new structures as natural products.

A piplartina é um alcaloide natural conhecido por apresentar diversas atividades biológicas, onde se destaca a ação anticancerígena. Esse produto natural apresentou atividade seletiva frente a vários tipos de células cancerígenas, sendo assim considerado promissor para o desenvolvimento de fármacos. O conhecimento do metabolismo de produtos naturais bioativos é uma importante e necessária etapa para avaliar a eficácia e segurança dessas substâncias. Os micro-organismos são amplamente utilizados em estudos de metabolismo, uma vez que catalisam reações quimio-, régio-, e estereoespecíficas, que muitas vezes são semelhantes às catalisadas pelos seres humanos. Nesse contexto, esse trabalho teve o objetivo de estudar o metabolismo microbiano da piplartina pelos fungos endofíticos Papulaspora immersa SS13 e Penicillium crustosum VR4, de solo Mucor rouxii NRRL 1894, e de coleção comercial Cunninghamella echinulata ATCC 8688a e Beauveria bassiana ATCC 7159. Os experimentos de biotransformação foram monitorados por UPLC-DAD-MS e UPLC-DAD-MS/MS. Todos os fungos utilizados biotransformaram a piplartina, sendo que 14 substâncias majoritárias foram identificadas como produtos de biotransformação nos experimentos em pequena escala. A piplartina e seus derivados apresentaram fragmentações características em IES-EM/EM que foram explicadas utilizando cálculos computacionais. O estudo dessas fragmentações permitiu a identificação e proposição das alterações estruturais que ocorreram nos metabólitos formados. Os fungos P. crustosum VR4 e B. bassiana ATCC 7159 foram selecionados para realizar os experimentos de biotransformação em escala ampliada, pois foram capazes de formar a maior diversidade de derivados da piplartina. Cinco substâncias foram isoladas e identificadas por RMN de 1H, RMN de 13C, HMQC, HMBC, COSY e HRESIMS. Essas substâncias não tinham sido obtidas por biotransformação microbiana anteriormente, sendo que uma ainda não foi descrita na literatura. Foram identificados principalmente produtos formados a partir de reações semelhantes às do metabolismo humano de fase I, como reduções, hidroxilações e hidrólises. Dessa forma, podemos concluir que as culturas microbianas são uma ferramenta útil para estudos preliminares de metabolismo, e para obter padrões de metabólitos que podem ser formados pelo metabolismo humano. / Piplartine is a natural alkaloid recognized by its biological properties, especially the anticancer activity. This natural product showed selective activity against several cancer cells lines, thus being considered a promising hit for drug development. Studies of bioactive natural products metabolism are an important and necessary step for the evaluation of their efficacy and safety. Microorganisms have been widely employed in metabolism studies, since they may catalyze chemo-, regio- and stereospecific reactions that are similar to human metabolism. This work aimed to study the microbial metabolism of piplartine by different fungal strains: the endophytes Penicillium crustosum VR4 and Papulaspora immersa SS13, the soil strain Mucor rouxii NRRL 1894, and the commercial collection strains Cunninghamella echinulata ATCC 8688a and Beauveria bassiana ATCC 7159. Biotransformation experiments were monitored by UPLC-DAD-MS and UPLC-DADMS/ MS. All the screened fungi were able to biotransform piplartine, and 14 compounds were identified as major biotransformation products in the small scale experiments. Piplartine and its derivatives showed characteristics fragmentations on ESI-MS/MS, which were explained using computer calculations. These fragmentation studies allowed the identification and structural proposition of piplartine metabolites. The fungi P. crustosum VR4 and B. bassiana ATCC 7159 were selected to perform the large scale biotransformation experiments, since they were capable to produce a large diversity of piplartine derivatives. Five compounds were isolated and identified by 1H NMR, 13C NMR, HMQC, HMBC, COSY and HRESIMS data. The isolated products had never been previously identified by microbial biotransformation, and one of them was found to be novel in the literature. All the identified and isolated compounds have been produced by reactions similar to those that occur in phase I of human metabolism, such as reduction, hydroxylation and hydrolysis reactions. Thus, we can conclude that the microbial cultures are useful tools for preliminary metabolism studies, and to obtain chemical standards similar to those produced by human metabolism

Submitted by Geandra Rodrigues (geandrar@gmail.com) on 2018-10-11T14:08:37Z No. of bitstreams: 1 jessicaleirasmotaconegundes.pdf: 1763849 bytes, checksum: 374bcafcbd3cb3795cf0a0c6af6419ee (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-10-16T14:06:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 jessicaleirasmotaconegundes.pdf: 1763849 bytes, checksum: 374bcafcbd3cb3795cf0a0c6af6419ee (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-16T14:06:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 jessicaleirasmotaconegundes.pdf: 1763849 bytes, checksum: 374bcafcbd3cb3795cf0a0c6af6419ee (MD5) Previous issue date: 2017-06-28 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A espécie Siparuna guianensis Aublet. (Siparunaceae), conhecida como negramina, capitu, folha santa e limão-bravo, é amplamente distribuída no território nacional. A espécie tem sido tradicionalmente utilizada no combate de sintomas de algumas patologias como febre, inflamação, dores de cabeça e no corpo. O presente estudo teve como objetivos avaliar a atividade antioxidante, antinociceptiva, anti-inflamatória e toxidez oral aguda da partição em diclorometano (PDCM) das folhas de S. guianensis, bem como determinar o perfil químico de PDCM e suas frações. Para tal, as folhas secas foram submetidas à extração em metanol por maceração estática. O extrato metanólico foi então particionado, primeiramente com hexano, seguido de diclorometano, obtendose a PDCM que, por sua vez, foi fracionada e forneceu 14 frações (FD1 a FD14). O perfil químico da PDCM e suas frações foi determinado por cromatografia em camada delgada (CCD) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), possibilitando a identificação de constituintes terpênicos e flavonoides. Com relação à atividade antioxidante in vitro, a PDCM foi eficaz em reduzir o radical DPPH (CI50 25 μg/mL); no método do fosfomolibidênio foi encontrado o valor de 0,34 mg/mg de PDCM em equivalentes de ácido ascórbico; no método do TBA a amostra na concentração de 7,5 mg foi capaz de inibir a peroxidação lipídica de forma estatisticamente igual à substância de referência (BHT), na mesma concentração. In vivo, a atividade anti-inflamatória foi avaliada em camundongos pelo método do edema de orelha induzido pelo óleo de cróton e pelo modelo de peritonite induzida por LPS. No primeiro modelo PDCM administrada por via oral (v.o.) foi capaz de reduzir significativamente o edema nas doses de 100 e 300 mg/kg em 54 e 52%, respectivamente. Enquanto que no segundo ensaio, PDCM na dose de 100 mg/kg foi capaz de inibir a migração leucocitária em 53%. O estudo toxicológico agudo, durante 14 dias, mostrou que esta amostra é segura para administração por via oral. PDCM v.o. apresentou ação antinociceptiva em dois dos três modelos utilizados. No modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético, as doses de 100, 200 e 300mg/kg foram capazes de inibir o número de contorções em 67, 71 e 83%, respectivamente. No teste da formalina, foi observada atividade tanto na nocicepção neurogênica, quanto na nocicepção inflamatória. Na primeira, todas as doses (100, 200 e 300 mg/kg) foram eficazes reduzindo em 56, 54 e 48%, respectivamente, o tempo de lambida. Do mesmo modo, na segunda fase todas as doses foram eficazes, porém de forma menos significativa que na primeira fase, reduzindo o tempo de lambida em 29, 38 e 44%, respectivamente. Devido à natureza comportamental dos ensaios antinociceptivos, o teste do campo aberto mostrou que a amostra não tem atividade sobre a locomoção dos animais. Os resultados indicam que a PDCM de S. guianensis possui potencial antioxidante, antinociceptiva e anti-inflamatória, provavelmente relacionados aos constituintes terpênicos e flavonoides presentes na espécie. / The species Siparuna guianensis Aublet. (Siparunaceae), known as negramina, capitú, folha-santa e limão-bravo, is widely distributed around the national territory. Species have traditionally been used to combat the symptoms of some pathologies fever, inflammation, headaches and body aches, and other disorders. The present study aimed to evaluate the antioxidant, antinociceptive and anti-inflammatory activities and acute oral toxicity profile of the dichloromethane partition (PDCM), as well as to determine the chemical profile of PDCM and its fractions. For this, the dry leaves were subjected to methanol extraction by static maceration. The methanolic extract was subject to liquidliquid partition, firstly with hexane, followed by dichloromethane, to obtain the dichloromethane partition (PDCM). Then, PDCM was fractionated, and 14 fractions (FD1 – FD14) were collected. The PDCM and fractions chemical profiles was performed using thin layer chromatography (TLC) and high performance liquid chromatography (HPLC), which allowed the identification of terpenes and flavonoids. According to the in vitro tests, PDCM was effective in reducing the DPPH radical (IC50 25 μg/mL); the value of 0.34 mg/mg of PDCM in ascorbic acid equivalents was determined using the fosfomolybdenium assay; the sample at 7.5 mg was able to inhibit lipid peroxidation with no statistical difference compared to the reference substance (BHT) at the same concentration in the TBA assay. Besides, the in vivo anti-inflammatory activity was investigated in mice by the cróton oil-induced ear edema and by the model of peritonitis induced by LPS. PDCM was capable to reduce the ear edema at 100 and 300 mg/kg by 54% and 52%, respectively. Also, PDCM inhibited the leucocyte migration by 53% at 100 mg/kg. The acute toxicological evaluation, during 14 days, suggested that the oral administration of this sample is safe. PDCM also showed antinociceptive action in two of the three models used. The number of writhing was reduced by 67%, 71% and 83% at 100, 200 and 300 mg/kg, respectively, in acetic acid-induced writhing test. The neurogenic and inflammatory antinociceptive activity was also observed by the formalin test. All doses (100, 200 and 300 mg/kg) were effective, reducing by 56%, 54% e 48% the licking time during the neurogenic inflammation, respectively. All doses (100, 200 and 300 mg/kg) were also effective in the second phase, however in a less significant manner, reducing the licking time by 29%, 38%, and 44%, respectively. Due to the behavioral nature of the antinociceptive assays, the open field test was carried out to ensure that the sample has no interference on animal locomotion. The results indicated that PDCM from S. guianensis is endowed with antioxidant, antinociceptive and antiinflammatory potential, probably related to the terpenes and flavonoids presented in this species.

Orientador: Anita Jocelyne Marsaioli / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-23T22:59:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rocha_DanieleFernandadeOliveira_D.pdf: 6414836 bytes, checksum: 154b421c3fabef860e5439b2a47d4972 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Opiliões são aracnídeos encontrados em todos os continentes, com mais de 6000 espécies descritas, e secretam uma mistura de compostos voláteis que atuam principalmente como defesa contra predadores naturais. A família Gonyleptidae, pertence à subordem Laniatores, é a mais diversa química e morfologicamente e está presente em todo o território brasileiro. Assim, o estudo da identidade e da origem biossintética dos compostos presentes no exudato de espécimes desta família fornece informações filogenéticas, além de ser uma fonte de novos produtos naturais. Neste trabalho foram caracterizados os exudatos de cinco espécies de opiliões de diferentes subfamílias. As espécies Cobania picea, Roeweria virescens e Serracutisoma proximum secretam uma mistura benzoquinonas. Por outro lado, Iporangaia pustulosa e Neosadocus maximus produzem 1-hepten-3-ona e 1-(6-butil-3,4-diidro-2H-piran-2-il)-pentan-1-ona. Este último foi descrito pela primeira vez na literatura, revelando uma nova classe de compostos com esqueleto piranil em opiliões, originados da reação de hetero-Diels-Alder in vivo de duas moléculas de vinil cetona. Também foi determinada a configuração absoluta da (R)-4-metil-1-hexen-3-ona produzida por Acanthogonyleptes pulcher e Gonyleptes saprophilus. Outras 4-metil-3-cetonas de insetos possuem configuração (S). Adicionalmente foi realizado o primeiro estudo biossintético com opiliões através da incorporação de precursores marcados com C e espectroscopia de RMN de C. Foram estudados I. pustulosa, que produz vinil cetona, e Magnispina neptunus, que produz benzoquinona, revelando que ambas as classes químicas são formadas através de unidades acetato e propionato pela via policetídica / Abstract: Harvestmen are arachnids widespread in all continents, with more than 6,000 described species. They secrete a mixture of volatiles compounds with the main function of defense against natural predators. The family Gonyleptidae belongs to the suborder Laniatores, is the most diverse in chemistry and morphology and is predominant in Brazil. Therefore, studying the identity and biosynthetic origin of this family exudate components gives phylogenetic information and is a source of new natural products. In this work five species exudate from different subfamilies were characterized. The species Cobania picea, Roeweria virescens and Serracutisoma proximum secrete a mixture of benzoquinones, while Iporangaia pustulosa and Neosadocus maximus produce 1-hepten-3-one and 1-(6-butil-3,4-dihydro-2H-piran-2-yl)-pentan-1-one. The latter was described for the first time, and belongs to a new class of harvestman metabolites with piranyl moiety in harvestmen, which were rationalized as the hetero-Diels-Alder adduct of two vinyl ketone molecules. Additionally the absolute configuration of (R)-4-methyl-1-hexen-3-one from Acanthogonyleptes pulcher and Gonyleptes saprophilus was determined. Analogous 4-methyl-3-cetones from insects have S configuration. It was also performed the first biosynthetic investigation with harvestmen by C labeled precursors incorporation and C NMR. The studied species were /.pustulosa and Magnispina neptunus, which produce vinyl ketones and benzoquinones, respectively. The results revealed that these chemical classes are biosynthesized with acetate and propionate units via polyketide pathway / Doutorado / Quimica Organica / Doutora em Ciências