Durante as últimas décadas a incidência de obesidade e diabetes tipo 2 vem aumentando assustadoramente, principalmente, em crianças. Recentes estudos sugerem que a hiperglicemia crônica, situação comum em diabéticos sem controle sobre a glicemia, altera mecanismos intracelulares, incluindo aumento na via dos polióis, ativação da proteína quinase C, aumento da via das hexosaminas e aumento na formação de produtos finais da glicação avançada (AGEs). Complicações vasculares como a nefropatia e a neuropatia são comumente encontradas em pacientes diabéticos, assim como falha na função cardíaca e hepática. Os AGEs estão relacionados com o aumento de: estresse oxidativo, dano ao ADN, citocinas pró-inflamatórias e resistência à insulina. Nos últimos anos muitas drogas têm sido testadas para prevenção ou diminuição dos efeitos das glicotoxinas, principalmente no diabetes, entretanto poucas obtiveram sucesso. Na presente tese, demonstramos que as glicotoxinas endógenas e exógenas afetam o metabolismo de alguns aminoácidos e o metabolismo energético do sistema nervoso central de maneira a prejudicar sua homeostase. Podemos concluir, também, que os Ω3- PUFAs demonstraram melhorar o estado redox no fígado e no rim de ratos diabéticos alimentados com uma dieta hiperlipídica aquecida. Estes resultados podem sugerir que os ácidos graxos poli-insaturados Omega 3 (Ω3-PUFAs) possam ser adjuvante no tratamento de algumas doenças como diabetes mellitus e resistência à insulina. / During the last decades the incidence of obesity and type 2 diabetes has increased alarmingly, especially in children. Some studies suggest that chronic hyperglycemia, a situation common in diabetics with no control over blood glucose levels, alters intracellular mechanisms, including increased polyol pathway, activation of protein kinase C, increased of Hexosamines pathway and increased formation of advanced glycation end products (AGEs). Vascular complications such as nephropathy and neuropathy are commonly found in diabetic patients, as well as cardiac and liver failure. AGEs are related to the increase: oxidative stress, DNA damage, proinflammatory cytokines and insulin resistance. In recent years several drugs have been tested for preventing or mitigating the effects of glycotoxins, especially in diabetes, but few have succeeded. In this thesis, we demonstrate that endogenous and exogenous glycotoxins affect metabolism of some amino acids and energy metabolism of the central nervous system in a manner detrimental homeostasis. We can also conclude that Ω3-PUFAs shown to improve the redox state in liver and kidney of diabetic rats fed a heated fat diet. These results may suggest that polyunsaturated fatty acids Omega 3 (Ω3-PUFAs) can be used as adjuvant in the treatment of some diseases such as diabetes mellitus and insulin resistance.

O diabetes mellitus é uma doença metabólica caracterizada por níveis elevados de glicose no jejum e está associada com a perda da função cognitiva e um maior risco de desenvolvimento de doenças neurodegenerativas, tais como a Doença de Alzheimer (DA). As complicações do diabetes estão relacionadas com a hiperglicemia, níveis elevados de compostos reativos, como o metilglioxal (MG) e a formação de produtos finais de glicação avançada (do inglês Avanced Glycation End Products - AGEs). Os AGEs e o MG - um aldeído reativo envolvido no estresse dicarbonil e na formação de AGEs – encontram-se elevados em pacientes com diabetes e DA e têm sido sugeridos como mediadores do declínio cognitivo observado nessas patologias. Estudos indicaram que os astrócitos possuem o sistema glioxalase mais efetivo que os neurônios e, portanto, podem proteger os neurônios do estresse dicarbonil. Entretanto, as reações de glicação estão associadas com o prejuízo no funcionamento dos astrócitos, que, desta forma, comprometem a atividade neuronal. Tendo em vista que as reações de glicação estão exacerbadas no diabetes e em doenças neurodegenerativas sugere-se que nestas situações o dano neuronal seja ainda maior. Este trabalho teve como objetivo avaliar a suscetibilidade ao dano induzido pelo MG em culturas de astrócitos e de glioma C6 e examinar o efeito da alta concentração de glicose, do MG e da carboxietil-lisina (CEL), um AGE derivado da reação do MG com a lisina, em parâmetros oxidativos, metabólicos e específicos de astrócitos em fatias de hipocampo in vitro. Além disso, verificar se a administração intracerebroventricular (ICV) de MG causa alterações comportamentais, relacionadas com declínio cognitivo e ansiedade, e alterações bioquímicas em hipocampo, córtex cerebral e líquido cefalorraquidiano (LCR) ex vivo. Em culturas de células observou-se uma alta eficiência do sistema glioxalase em astrócitos em comparação com células C6. O conteúdo de glutationa diminuiu a partir de 1 hora após a exposição ao MG apenas em C6. A captação de glutamato reduziu em astrócitos e aumentou em C6, sendo que este efeito estava relacionado com reações de glicação, mas não com a expressão de transportadores de glutamato analisados. A formação de espécies reativas, a secreção de S100B e o conteúdo da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) não foram modificados pelo tratamento com MG nas células estudadas. Em fatias de hipocampo (in vitro) verificou-se que a glicose, o MG e a CEL não alteraram a formação de espécies reativas, a captação de glicose e a atividade da glutamina sintetase. No entanto, a captação de glutamato e a secreção de S100B diminuiram após o tratamento com MG e CEL. Estas mudanças não foram mediadas pela ativação de RAGE e por reações de glicação. A partir do estudo in vivo verificou-se que o MG não causou deficiência nos processos de aprendizagem e memória investigados pelas tarefas de habituação, labirinto em Y e reconhecimento de objetos e não alterou a atividade locomotora dos animais. Contudo, o aumento agudo dos níveis exógenos de MG diminuiu o comportamento do tipo ansiedade, observado através do teste de campo aberto. Em relação às análises ex vivo, o MG induziu alterações persistentes relacionados com a atividade da glioxalase 1, conteúdo de AGEs e captação de glutamato no hipocampo. A formação de espécies reativas, o conteúdo de glutationa, o conteúdo tecidual de GFAP e S100B e a atividade da glutamina sintetase não foram alterados com a administração ICV de MG. É possível concluir que a exposição aguda, in vitro, de fatias de hipocampo ao MG e CEL, mas não à glicose, foi capaz de induzir efeitos semelhantes em fatias de hipocampo, sugerindo que a alta concentração de glicose é tóxica principalmente por elevar a concentração de compostos glicantes, como o MG, e gerar ligações cruzadas com proteínas. O MG foi capaz de induzir prejuízo na captação de glutamato em culturas de astrócitos e fatias de hipocampo, indicando que o MG gera alterações na homestase cerebral através do comprometimento da remoção do glutamato da fenda sináptica, deste modo, contribuindo com as alterações neurológicas relacionadas com o diabetes mellitus. Em suma, as concentrações exógenas de MG e o tempo de exposição a elevadas concentrações deste composto determinam as diferentes características que podem ser observadas em pacientes diabéticos. / Diabetes mellitus is a metabolic disease characterized by high fasting-glucose levels and is associated with loss of cognitive function and a higher risk of developing neurodegenerative diseases, such as Alzheimer's disease (AD). Diabetic complications have been associated with hyperglycemia, high levels of reactive compounds, such as methylglyoxal (MG) and advanced glycation end products (AGEs) formation. AGEs and MG - a reactive aldehyde, involved in dicarbonyl stress and AGEs formation - are elevated in diabetes and AD and have been suggested as mediators of cognitive decline observed in these pathologies. Astrocytes are impaired to glycation processes, although, they have an improved glyoxalase system compared to neurons that protect them from dicarbonyl stress, suggesting that damage to neuronal functions could be increased under diabetes and neurodegenerative diseases. This study aimed to evaluate the susceptibility of astrocytes and C6 glioma cells cultures to MG damage and to examine the effect of high glucose, MG and carboxyethyllysine (CEL), a MG-derived AGE of lysine, on oxidative, metabolic and astrocyte-specific parameters in hippocampal slices in vitro. Furthermore, verify if intracerebroventricular (ICV) administration of MG cause behavioral changes, related to cognitive decline and anxiety, and biochemical alterations in the hippocampus, cerebral cortex and cerebrospinal fluid ex vivo. Since our cultures studies we observed a high efficiency of the glyoxalase system in astrocytes compared to C6 cells. The content of glutathione decreased from 1 hour after MG exposure only in C6 cells. Glutamate uptake was decreased in astrocytes and increased in C6 cells and this effect is related to glycation processes, but not to glutamate transporters expression. The reactive species formation, S100B secretion and glial fibrillary acidic protein (GFAP) content were not modified by MG treatment in either culture studied. With hippocampal slices inbucation (in vitro) it was found that glucose, MG and CEL did not alter reactive species formation, glucose uptake or glutamine synthetase activity. However, glutamate uptake and S100B secretion were decreased after MG and CEL exposure. RAGE activation and glycation reactions did not mediate these changes. From in vivo research it was found that MG did not cause impairment in learning-memory processes investigated by habituation, Y-maze and object recognition tasks and did not alter locomotion behavior of animals. However, the acute increase of MG exogenous levels reduced anxiety-related behavior evaluated in the open field test. Ex vivo findings support that MG induced persistent alterations related to glyoxalase 1 activity, AGEs content and glutamate uptake in hippocampus. The reactive species formation, glutathione content, GFAP and S100B content, as well as glutamine synthetase activity were not altered by MG ICV administration. It is possible conclude that acute MG and CEL exposure, but not glucose, were able to induce similar effects on hippocampal slices in vitro, suggesting that conditions of high glucose concentrations are primarily toxic by elevate the rates of these glycation compounds, as MG, and generate protein cross-links. MG-induced astrocyte glutamate uptake impairment was seen in astrocyte cultures and hippocampal slices, indicating that MG produces changes in brain homeostasis by the impairment of glutamate removal of the synaptic cleft, thus contributing to neurological changes related to diabetes mellitus. The exogenous concentrations of MG and the time of exposure to high concentrations of this compound determine the different features that can be seen in diabetic patients.

Durante as últimas décadas a incidência de obesidade e diabetes tipo 2 vem aumentando assustadoramente, principalmente, em crianças. Recentes estudos sugerem que a hiperglicemia crônica, situação comum em diabéticos sem controle sobre a glicemia, altera mecanismos intracelulares, incluindo aumento na via dos polióis, ativação da proteína quinase C, aumento da via das hexosaminas e aumento na formação de produtos finais da glicação avançada (AGEs). Complicações vasculares como a nefropatia e a neuropatia são comumente encontradas em pacientes diabéticos, assim como falha na função cardíaca e hepática. Os AGEs estão relacionados com o aumento de: estresse oxidativo, dano ao ADN, citocinas pró-inflamatórias e resistência à insulina. Nos últimos anos muitas drogas têm sido testadas para prevenção ou diminuição dos efeitos das glicotoxinas, principalmente no diabetes, entretanto poucas obtiveram sucesso. Na presente tese, demonstramos que as glicotoxinas endógenas e exógenas afetam o metabolismo de alguns aminoácidos e o metabolismo energético do sistema nervoso central de maneira a prejudicar sua homeostase. Podemos concluir, também, que os Ω3- PUFAs demonstraram melhorar o estado redox no fígado e no rim de ratos diabéticos alimentados com uma dieta hiperlipídica aquecida. Estes resultados podem sugerir que os ácidos graxos poli-insaturados Omega 3 (Ω3-PUFAs) possam ser adjuvante no tratamento de algumas doenças como diabetes mellitus e resistência à insulina. / During the last decades the incidence of obesity and type 2 diabetes has increased alarmingly, especially in children. Some studies suggest that chronic hyperglycemia, a situation common in diabetics with no control over blood glucose levels, alters intracellular mechanisms, including increased polyol pathway, activation of protein kinase C, increased of Hexosamines pathway and increased formation of advanced glycation end products (AGEs). Vascular complications such as nephropathy and neuropathy are commonly found in diabetic patients, as well as cardiac and liver failure. AGEs are related to the increase: oxidative stress, DNA damage, proinflammatory cytokines and insulin resistance. In recent years several drugs have been tested for preventing or mitigating the effects of glycotoxins, especially in diabetes, but few have succeeded. In this thesis, we demonstrate that endogenous and exogenous glycotoxins affect metabolism of some amino acids and energy metabolism of the central nervous system in a manner detrimental homeostasis. We can also conclude that Ω3-PUFAs shown to improve the redox state in liver and kidney of diabetic rats fed a heated fat diet. These results may suggest that polyunsaturated fatty acids Omega 3 (Ω3-PUFAs) can be used as adjuvant in the treatment of some diseases such as diabetes mellitus and insulin resistance.

A vitamina A e seus derivados, os retinóides, participam de processos celulares tais como desenvolvimento, proliferação, diferenciação e apoptose. Os efeitos da vitamina A, em sua maior parte, são atribuídos à ativação de receptores nucleares da família dos receptores esteróides, conhecidos como receptores de ácido retinóico (RAR) e receptores de retinóides (RXR). No entanto, o excesso de vitamina A, ou de retinóides, na dieta, ou devido a uso terapêutico, pode ser teratogênico. Diversos trabalhos tem demonstrado "in vitro" e "in vivo" que a vitamina A e seus metabólitos são moléculas redox ativas, isto é, podem agir como pró-oxidantes ou antioxidantes, dependendo da concentração e do ambiente em que se encontram. Nesse trabalho nós demonstramos que o tratamento com retinol, o qual é considerado o principal metabólito da vitamina A, em células da linhagem A549, a qual é derivada de um carcinoma de pulmão de não-pequenas células, levou a uma diminuição da expressão e do imunoconteúdo do receptor para produtos finais avançados de glicação (RAGE). O RAGE é constutivamente expresso nas células pulmonares, sendo que qualquer alteração na sua expressão ou imunoconteúdo induz alterações na homeostase do tecido pulmonar. Nós verificamos que a modulação do RAGE induzida pelo tratamento com retinol em nosso modelo foi redox dependente. O tratamento das células A549 com retinol induziu um aumento na produção de espécies reativas do oxigênio, o qual por consequência tornou o ambiente celular próoxidativo favorecendo a indução de danos a biomoléculas como lipídeos e proteínas. Além disso, o aumento na produção de espécies reativas do oxigênio levou a ativação da MAPK p38, por um mecanismo redox-dependente. A ativação da p38 subsequentemente levou à ativação do fator de transcrição NF-kB, o qual por consequência acabou por modular a expressão e imunoconteúdo do RAGE nessas células. Todos os efeitos ocasionados pelo tratamento com retinol foram bloqueados com o co-tratamento com Trolox® (análogo hidrofílico da vitamina E), o qual é uma molécula antioxidante. Portanto, nossos resultados demonstraram que o tratamento com retinol é capaz de induzir um estado pró-oxidativo nas células A549, o qual por consequência acaba por modular a expressão do RAGE de maneira redox-dependente e via a ativação da rota de sinalização da p38 - NF-kB. Então, a partir destes resultados e de outros dados já reportados na literatura, acreditamos que é necessário uma maior cautela no uso de vitamina A tanto a nível de suplementação quanto a nível terapêutico. / Vitamin A and its derivatives, the retinoids, participate in cellular processes such as growth, cell division and apoptosis. The effects of vitamin A, in part, are ascribed to gene transcription mediated by nuclear receptors from the family of the steroid receptors, known as retinoic acid receptors (RARs) and retinoid receptors (RXRs). However, excessive vitamin A, or retinoids, in the diet, or by therapeutic use, may be theratogenic. Several studies have shown "in vitro" and "in vivo" that vitamin A and its metabolites are redox active molecules, that is, may act as pro-oxidants and antioxidants, depending on the concentration and the environment in which they are. In this study we demonstrated that treatment with retinol, which is considered to be the principal metabolite of vitamin A, in cell lines of non-small cells lung carcinoma A549 led to a decrease in the expression and immunocontent of receptor for advanced glycation endproducts (RAGE). The RAGE is constitutively expressed in lung cells; a modulation in expression or immunocontent of RAGE is associated with alterations on homeostasis of lung tissue. Here, we found that the modulation of RAGE induced by retinol treatment in our model was redox dependent. Retinol treatment of A549 cells induced an increase in the production of reactive oxygen species, which consequently become the pro-cellular environment favoring the induction of oxidative damage to biomolecules such as lipids and proteins. Furthermore, the increase in production of reactive oxygen species led to activation of p38 MAPK by a redox-dependent mechanism. Activation of p38 subsequently led to activation of the transcription factor NF-kB, which consequently modulates the expression of RAGE in these cells. All effects caused by retinol treatment were blocked with Trolox ® (hydrophilic analogue of Vitamin E) co-treatment, which is an antioxidant molecule. Therefore, our results demonstrated that retinol treatment is able to induce a pro-oxidative status in A549 cells, and that modulation of RAGE expression by retinol is mediated by the redox-dependent activation of p38/NF-kB signaling pathway. Then, based on these results and other data already reported in the literature, we believe that greater care is needed in the use of vitamin A supplementation as therapeutic level.

Produtos de glicação avançada (AGE) são prevalentes no diabete melito e alteram o metabolismo de lípides e lipoproteínas. Neste estudo, avaliou-se a influência da albumina, isolada do soro de indivíduos controles (C, n =12) e de portadores de diabete melito tipo 1 (DM 1, n=13) e tipo 2 (DM 2, n=11), com controle glicêmico inadequado, sobre a remoção de colesterol de macrófagos, o acúmulo intracelular de lípides, o conteúdo do receptor de HDL, ABCA-1 e a captação seletiva de colesterol esterificado de HDL. Além disso, foi determinada a expressão diferencial de genes em macrófagos tratados com albumina C, DM 1 ou DM 2. A concentração plasmática de albumina glicada foi superior no grupo DM 1 e DM 2 em relação ao C e correlacionou-se positivamente com glicemia, hemoglobina glicada e frutosamina. Albumina sérica foi isolada por cromatografia para separação rápida de proteínas e purificada por extração alcoólica. Albumina DM 1 e DM 2 apresentaram maior conteúdo de carboximetil-lisina e apo A-I quando comparada à albumina C. Macrófagos enriquecidos com LDL acetilada e 14C-colesterol foram tratados com albumina C, DM 1 ou DM 2 e, a seguir, incubados na presença ou ausência de apo A-I, HDL3 ou HDL2 para determinação do efluxo de colesterol. Apesar de removerem maior quantidade de colesterol celular, as albumina DM 1 e DM 2 reduziram o efluxo de colesterol mediado por apo A-I (70% e 45%, respectivamente) e HDL2 (55% e 54%, respectivamente) em comparação à albumina C. Com HDL3, a queda no efluxo de colesterol só foi observada em macrófagos expostos à albumina DM 2 (55%). Macrófagos incubados apenas com albumina C, DM 1 ou DM 2 apresentaram conteúdo lipídico semelhante, evidenciado por coloração com Oil Red O. A adição de apo A-I, HDL3 ou HDL2 reduziu o conteúdo lipídico apenas nas células tratadas com albumina C, mas não com albumina DM 1 ou DM 2. A expressão de ABCA-1 foi diminuída 82% e 25% em macrófagos expostos, respectivamente, à albumina DM 1 e DM 2, em comparação às células tratadas com albumina C. As albuminas DM 1 e DM 2 reduziram a captação de 3H colesteril oleoil éter de HDL por células que superexpressam o receptor SR-BI. Estes resultados também foram obtidos com albumina humana modificada in vitro por glicação avançada. As albuminas isoladas dos pacientes diabéticos aumentaram a expressão de receptores envolvidos na captação de LDL modificadas e de proteínas que modulam vias da homeostase do colesterol. Os resultados deste estudo evidenciaram que a modificação in vivo da albumina por glicação avançada prejudica o transporte reverso de colesterol no diabete melito, por reduzir a expressão de ABCA-1 e a remoção de colesterol de macrófagos, bem como a captação seletiva de colesterol esterificado de HDL pelo SR-BI. Independentemente de variação na concentração e composição de HDL, a glicação da albumina pode contribuir para o acúmulo de lípides em macrófagos e gênese da aterosclerose no diabete melito / Advanced glycation end products are prevalent in diabetes mellitus and alter lipids and lipoprotein metabolism. In this study we analyzed the role of albumin, isolated from control individuals (C, n = 12) and uncontrolled type 1 (DM 1, n = 13) and type 2 (DM 2, n = 11) diabetes mellitus patients on macrophage cholesterol removal, intracellular lipid accumulation, expression of the HDL receptor protein level, ABCA-1and the uptake of esterified cholesterol from HDL. It was also investigated the differential gene expression in macrophages treated with C, DM 1 or DM 2 albumin. Glycated albumin was higher in DM 1 and DM 2 groups as compared to C and was positivetly correlated with glycemia, glycated hemoglobin and fructosamine. Serum albumin was isolated by fast protein liquid chromatography and alchoolic extraction. DM 1 and DM 2 albumin presented a higher amount of carboxymethyllysine and apo A-I as compared to C albumin. In order to determine cholesterol efflux acetylated LDL and 14C-cholesterol enriched J- 774 macrophages were treated with C, DM 1 or DM 2 albumin and then incubated in the absence or presence of apo A-I, HDL3 or HDL2. Although presenting a higher ability to remove cell cholesterol by itself, DM 1 and DM 2 albumin reduced cholesterol efflux mediated by apo A-I (70% e 45%, respectively) and by HDL2 (55% e 54%, respectively) as compared to C albumin. With HDL3 the reduction of the cholesterol efflux was only observed in macrophages treated with DM 2 albumin (55%) in comparison to C albumin. Macrophages incubated with C, DM 1 or DM 2 albumin alone presented similar amount of intracellular lipids as assessed by Oil Red O staining. The addition of apo A-I, HDL3 or HDL2 reduced the lipid content in cells treated with C albumin, but not in those exposed to DM 1 or DM 2 albumin. The expression of ABCA-1 was reduced 82% and 25% in macrophages treated, respectively, with DM 1 or DM 2 albumin, in comparison to C albumin. DM 1 and DM 2 albumin reduced the uptake of 3H colesteril oleoyl ether from HDL by SR-BI overexpressing cells. These findings also were obtained when cells were treated in vitro with human serum albumin submitted to advanced glycation. DM 1 and DM 2 albumin enhanced the expression of receptors involved in the uptake of modified LDL and cholesterol homeostasis. Our findings showed that the advanced glycation of albumin that takes place in diabetes mellitus impairs the reverse cholesterol transport efficiency by reducing the ABCA-1 expression and cholesterol exportation to HDL and also by diminishing the uptake of esterified cholesterol from HDL. Independently of changes in HDL composition and concentration, advanced glycated albumin contributes to cholesterol accumulation in macrophages and atherogenesis in diabetes mellitus

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:02Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-03-26Bitstream added on 2014-06-13T19:15:56Z : No. of bitstreams: 1 frasnelli_sct_me_arafo.pdf: 758242 bytes, checksum: fc10d5e79dcb4b386aacc5d2776f572c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Diabetes mellitus se caracteriza pelo acúmulo de produtos finais da glicação avançada (AGEs) que ativam seu receptor RAGE. Entre as complicações associadas ao diabetes está a modulação da resposta imune, evidenciada pela maior susceptibilidade à infecção em diabéticos. O sistema imune percebe e reaje aos microrganismos por meio de receptores de padrões moleculares (receptores semelhantes à Toll, TLRs). Lipopolissacarídeo da parede celular (LPS) é um dos principais fatores de virulência de microrganismos Gramnegativos e é reconhecido principalmente por TLR4. A hipótese deste trabalho é que a ativação de RAGE e TLR4 por seus ligantes pode resultar em efeito sinérgico na modulação da proliferação, morte celular e expressão de citocinas inflamatórias por células mononucleares do sangue periférico (PBMC). Foram selecionados 7 indivíduos não diabéticos e 6 indivíduos portadores de diabetes tipo 2 para coleta de PBMCs. Estas células foram estimuladas com LPS bacteriano e BSA glicado, isoladamente e combinados, na presença e na ausência de inibidores dos receptores RAGE e TLR4. Proliferação e morte celular foram avaliadas por contagem direta em hemocitômetro e citometria de fluxo, respectivamente. A expressão de citocinas e quimiocinas inflamatórias foi avaliada por RT-qPCR, enquanto a modulação do padrão de resposta imune adaptativa foi estudada por meio de citometria de fluxo. Os resultados mostram 18 18 que PBMCs de pacientes portadores de diabetes tendem a ser mais resistentes à indução de morte celular. De um modo geral, a inibição dos receptores RAGE e TLR4 não interfere na atividade metabólica e viabilidade celular em diabéticos e não diabéticos. A expressão gênica de CCL3 e CCR5 não foi regulada pelos receptores RAGE e TLR, sendo discretamente mais elevada em pacientes não diabéticos. A expressão de TNF-α e IL-10 foi regulada... / Diabetes mellitus is characterized by the progressive accumulation of advanced glycation end-products (AGEs), which bind and activate their membrane-bound receptor (RAGE) on a variety of target cells. Modulation of the immune response is one of the diabetes-associated complications and is reflected on the increased susceptibility of diabetes patients to infections and sepsis. The immune system senses and reacts to microorganisms by pattern-recognition receptors, such as Toll-like receptors (TLRs). Bacterial lipopolysaccharide (LPS) is a major virulence factor of Gram-negative microorganisms, which is recognized mainly by TLR4. The hypothesis of this study is that of a synergism between activated TLR4 and RAGE that modulates the response of cells of innate and adaptive immunity in the circulation (peripheral blood monocytic cells, PBMCs). PBMCs were collected from 13 volunteers (7 with type 2 diabetes and 6 systemically-healthy controls). The cells were stimulated with bacterial LPS and glycated bovine serum albumin (AGE-BSA), both independently and in association. To study the role of TLR4 and RAGE signaling, these stimulations were performed in the presence and absence of specific inhibitors of RAGE and TLR4. We used direct counting in a hemocytometer and flow cytometry, respectively, to assess cell proliferation and 20 20 death. The expression of selected cytokines and receptors was studied by RTqPCR, whereas the effect of these stimuli on the modulation of T helper-type response was determined by flow cytometry. We observed increased cell survival in PBMCs from diabetic patients. Inhibition of RAGE and TLR4 had no marked effect on cell proliferation, metabolic activity and survival. Gene expression of CCL3 (MIP-1alpha) and CCR5 was discretely higher in PBMCs from non-diabetic patients and was not affected by RAGE or TLR4 signaling... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Carlos Rossa Junior / Coorientador: Silvana Regina Perez Orrico / Banca: José Eduardo Cezar Sampaio / Banca: Sandra Helena Penha de Oliveira / Resumo: Diabetes mellitus se caracteriza pelo acúmulo de produtos finais da glicação avançada (AGEs) que ativam seu receptor RAGE. Entre as complicações associadas ao diabetes está a modulação da resposta imune, evidenciada pela maior susceptibilidade à infecção em diabéticos. O sistema imune percebe e reaje aos microrganismos por meio de receptores de padrões moleculares (receptores semelhantes à Toll, TLRs). Lipopolissacarídeo da parede celular (LPS) é um dos principais fatores de virulência de microrganismos Gramnegativos e é reconhecido principalmente por TLR4. A hipótese deste trabalho é que a ativação de RAGE e TLR4 por seus ligantes pode resultar em efeito sinérgico na modulação da proliferação, morte celular e expressão de citocinas inflamatórias por células mononucleares do sangue periférico (PBMC). Foram selecionados 7 indivíduos não diabéticos e 6 indivíduos portadores de diabetes tipo 2 para coleta de PBMCs. Estas células foram estimuladas com LPS bacteriano e BSA glicado, isoladamente e combinados, na presença e na ausência de inibidores dos receptores RAGE e TLR4. Proliferação e morte celular foram avaliadas por contagem direta em hemocitômetro e citometria de fluxo, respectivamente. A expressão de citocinas e quimiocinas inflamatórias foi avaliada por RT-qPCR, enquanto a modulação do padrão de resposta imune adaptativa foi estudada por meio de citometria de fluxo. Os resultados mostram 18 18 que PBMCs de pacientes portadores de diabetes tendem a ser mais resistentes à indução de morte celular. De um modo geral, a inibição dos receptores RAGE e TLR4 não interfere na atividade metabólica e viabilidade celular em diabéticos e não diabéticos. A expressão gênica de CCL3 e CCR5 não foi regulada pelos receptores RAGE e TLR, sendo discretamente mais elevada em pacientes não diabéticos. A expressão de TNF-α e IL-10 foi regulada... (Resumo completo, clicar acesso eletr^ônico abaixo) / Abstract: Diabetes mellitus is characterized by the progressive accumulation of advanced glycation end-products (AGEs), which bind and activate their membrane-bound receptor (RAGE) on a variety of target cells. Modulation of the immune response is one of the diabetes-associated complications and is reflected on the increased susceptibility of diabetes patients to infections and sepsis. The immune system senses and reacts to microorganisms by pattern-recognition receptors, such as Toll-like receptors (TLRs). Bacterial lipopolysaccharide (LPS) is a major virulence factor of Gram-negative microorganisms, which is recognized mainly by TLR4. The hypothesis of this study is that of a synergism between activated TLR4 and RAGE that modulates the response of cells of innate and adaptive immunity in the circulation (peripheral blood monocytic cells, PBMCs). PBMCs were collected from 13 volunteers (7 with type 2 diabetes and 6 systemically-healthy controls). The cells were stimulated with bacterial LPS and glycated bovine serum albumin (AGE-BSA), both independently and in association. To study the role of TLR4 and RAGE signaling, these stimulations were performed in the presence and absence of specific inhibitors of RAGE and TLR4. We used direct counting in a hemocytometer and flow cytometry, respectively, to assess cell proliferation and 20 20 death. The expression of selected cytokines and receptors was studied by RTqPCR, whereas the effect of these stimuli on the modulation of T helper-type response was determined by flow cytometry. We observed increased cell survival in PBMCs from diabetic patients. Inhibition of RAGE and TLR4 had no marked effect on cell proliferation, metabolic activity and survival. Gene expression of CCL3 (MIP-1alpha) and CCR5 was discretely higher in PBMCs from non-diabetic patients and was not affected by RAGE or TLR4 signaling... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Produtos de glicação avançada (AGE) são prevalentes no diabete melito e alteram o metabolismo de lípides e lipoproteínas. Neste estudo, avaliou-se a influência da albumina, isolada do soro de indivíduos controles (C, n =12) e de portadores de diabete melito tipo 1 (DM 1, n=13) e tipo 2 (DM 2, n=11), com controle glicêmico inadequado, sobre a remoção de colesterol de macrófagos, o acúmulo intracelular de lípides, o conteúdo do receptor de HDL, ABCA-1 e a captação seletiva de colesterol esterificado de HDL. Além disso, foi determinada a expressão diferencial de genes em macrófagos tratados com albumina C, DM 1 ou DM 2. A concentração plasmática de albumina glicada foi superior no grupo DM 1 e DM 2 em relação ao C e correlacionou-se positivamente com glicemia, hemoglobina glicada e frutosamina. Albumina sérica foi isolada por cromatografia para separação rápida de proteínas e purificada por extração alcoólica. Albumina DM 1 e DM 2 apresentaram maior conteúdo de carboximetil-lisina e apo A-I quando comparada à albumina C. Macrófagos enriquecidos com LDL acetilada e 14C-colesterol foram tratados com albumina C, DM 1 ou DM 2 e, a seguir, incubados na presença ou ausência de apo A-I, HDL3 ou HDL2 para determinação do efluxo de colesterol. Apesar de removerem maior quantidade de colesterol celular, as albumina DM 1 e DM 2 reduziram o efluxo de colesterol mediado por apo A-I (70% e 45%, respectivamente) e HDL2 (55% e 54%, respectivamente) em comparação à albumina C. Com HDL3, a queda no efluxo de colesterol só foi observada em macrófagos expostos à albumina DM 2 (55%). Macrófagos incubados apenas com albumina C, DM 1 ou DM 2 apresentaram conteúdo lipídico semelhante, evidenciado por coloração com Oil Red O. A adição de apo A-I, HDL3 ou HDL2 reduziu o conteúdo lipídico apenas nas células tratadas com albumina C, mas não com albumina DM 1 ou DM 2. A expressão de ABCA-1 foi diminuída 82% e 25% em macrófagos expostos, respectivamente, à albumina DM 1 e DM 2, em comparação às células tratadas com albumina C. As albuminas DM 1 e DM 2 reduziram a captação de 3H colesteril oleoil éter de HDL por células que superexpressam o receptor SR-BI. Estes resultados também foram obtidos com albumina humana modificada in vitro por glicação avançada. As albuminas isoladas dos pacientes diabéticos aumentaram a expressão de receptores envolvidos na captação de LDL modificadas e de proteínas que modulam vias da homeostase do colesterol. Os resultados deste estudo evidenciaram que a modificação in vivo da albumina por glicação avançada prejudica o transporte reverso de colesterol no diabete melito, por reduzir a expressão de ABCA-1 e a remoção de colesterol de macrófagos, bem como a captação seletiva de colesterol esterificado de HDL pelo SR-BI. Independentemente de variação na concentração e composição de HDL, a glicação da albumina pode contribuir para o acúmulo de lípides em macrófagos e gênese da aterosclerose no diabete melito / Advanced glycation end products are prevalent in diabetes mellitus and alter lipids and lipoprotein metabolism. In this study we analyzed the role of albumin, isolated from control individuals (C, n = 12) and uncontrolled type 1 (DM 1, n = 13) and type 2 (DM 2, n = 11) diabetes mellitus patients on macrophage cholesterol removal, intracellular lipid accumulation, expression of the HDL receptor protein level, ABCA-1and the uptake of esterified cholesterol from HDL. It was also investigated the differential gene expression in macrophages treated with C, DM 1 or DM 2 albumin. Glycated albumin was higher in DM 1 and DM 2 groups as compared to C and was positivetly correlated with glycemia, glycated hemoglobin and fructosamine. Serum albumin was isolated by fast protein liquid chromatography and alchoolic extraction. DM 1 and DM 2 albumin presented a higher amount of carboxymethyllysine and apo A-I as compared to C albumin. In order to determine cholesterol efflux acetylated LDL and 14C-cholesterol enriched J- 774 macrophages were treated with C, DM 1 or DM 2 albumin and then incubated in the absence or presence of apo A-I, HDL3 or HDL2. Although presenting a higher ability to remove cell cholesterol by itself, DM 1 and DM 2 albumin reduced cholesterol efflux mediated by apo A-I (70% e 45%, respectively) and by HDL2 (55% e 54%, respectively) as compared to C albumin. With HDL3 the reduction of the cholesterol efflux was only observed in macrophages treated with DM 2 albumin (55%) in comparison to C albumin. Macrophages incubated with C, DM 1 or DM 2 albumin alone presented similar amount of intracellular lipids as assessed by Oil Red O staining. The addition of apo A-I, HDL3 or HDL2 reduced the lipid content in cells treated with C albumin, but not in those exposed to DM 1 or DM 2 albumin. The expression of ABCA-1 was reduced 82% and 25% in macrophages treated, respectively, with DM 1 or DM 2 albumin, in comparison to C albumin. DM 1 and DM 2 albumin reduced the uptake of 3H colesteril oleoyl ether from HDL by SR-BI overexpressing cells. These findings also were obtained when cells were treated in vitro with human serum albumin submitted to advanced glycation. DM 1 and DM 2 albumin enhanced the expression of receptors involved in the uptake of modified LDL and cholesterol homeostasis. Our findings showed that the advanced glycation of albumin that takes place in diabetes mellitus impairs the reverse cholesterol transport efficiency by reducing the ABCA-1 expression and cholesterol exportation to HDL and also by diminishing the uptake of esterified cholesterol from HDL. Independently of changes in HDL composition and concentration, advanced glycated albumin contributes to cholesterol accumulation in macrophages and atherogenesis in diabetes mellitus

Feridas nos membros inferiores são a principal causa de hospitalização e morbidade nos pacientes portadores de diabetes mellitus (DM). Atualmente, atribuem-se as complicações tardias do DM ao acúmulo de produtos finais de glicação avançada (AGE) nos diversos órgãos-alvo, incluindo a pele. Já foi demonstrado que a função deficitária dos fibroblastos de diabéticos está relacionada diretamente ao acúmulo de AGEs. Neste cenário, o uso de células-tronco mesenquimais tem ganhado destaque, tendo sido demonstrado, na literatura, que células-tronco derivadas de medula óssea (BMSC) produzem lisozima, um anti-AGE fisiológico. As células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSC) são de fácil captação e apresentam melhor rendimento em cultura celular quando comparadas às BMSC. Neste estudo, investigamos se as ADSC sintetizam lisozima e avaliamos se o produto das ADSC tem a capacidade de diminuir os efeitos deletérios dos AGEs nos fibroblastos. Para esse fim, foram cultivadas ADSC provenientes de lipoaspiração de pacientes hígidos, fibroblastos provenientes de feridas de pacientes diabéticos e fibroblastos provenientes de pacientes hígidos. Os fibroblastos de pacientes diabéticos ou hígidos foram submetidos a três meios de cultura diferentes: normoglicêmico (controle), contendo AGE ou contendo AGE mais o meio de cultura proveniente de ADSC (eluato) e, nesses grupos, foi feito ensaio de migração de fibroblastos. Observamos que, nos meios contendo AGE, não ocorreu migração dos fibroblastos, e na cultura contendo AGE mais eluato, os fibroblastos apresentaram migração semelhante à do grupo controle. Concluímos que as ADSC produzem lisozima e que os produtos sintetizados por essas células têm a capacidade de inibir os efeitos deletérios dos AGEs em fibroblastos in vitro / Lower limb ulcers are one of the major causes of morbidity and hospital admission in diabetic patients. Current researches indicate that diabetes mellitus (DM) complications are related to the accumulation in target organs, including the skin of advanced glycation end products (AGEs). It has been shown that cutaneous fibroblasts dysfunction in DM patients is directly dependent on AGE accumulation. In this context, the use of mesenchymal stem cells has been proposed, since bone marrow stem cells (BMSC) produce lysozyme, a physiological anti-AGE enzyme. Adipose tissue derived stem cells (ADSC) are easier to harvest and proliferate faster in cell cultures compared to BMSC. In this study, we investigated whether ADSC are able to produce lysozyme and also the ability of those stem cells to reduce the deleterious effects of AGEs in fibroblasts. ADSC were isolated and cultured from liposuction samples from non diabetic patients; fibroblasts were also isolated and cultured from wounds of diabetic patients and from non diabetic patients\' skin. Fibroblasts were maintained in three different conditions: in normoglycemic culture medium (control), a culture medium containing AGE or a culture medium previously in contact with ADSC for 24 hours (eluate) with addition of AGE. A fibroblast migration assay was performed. There was a lack of fibroblast migration in fibroblast culture with AGE-supplemented medium, whereas fibroblast culture containing ADSC\'s eluate and AGE showed fibroblast migration similar to the control group. Our study demonstrates that ADSC can synthesize lysozyme and we infer that the products of ADSC are able to inhibit in vitro AGE deleterious effects in fibroblas

Produtos de glicação avançada (AGE) contribuem para o estresse oxidativo e inflamatório, os quais constituem as bases celulares para as complicações a longo prazo do diabete melito (DM). A albumina é a principal proteína sérica modificada por AGE e afeta adversamente o metabolismo de lípides e a resposta infamatória em macrófagos, a função das ilhotas pancreáticas e a sensibilidade insulínica no músculo. Neste estudo, avaliamos o efeito da administração crônica de albumina AGE, associada ou não ao tratamento com N-acetilcisteína (NAC), sobre a sensibilidade periférica à insulina, infiltrado total e perfil de macrófagos, transcriptoma do tecido adiposo periepididimal e padrão de diferenciação de macrófagos peritoneais em ratos saudáveis. Albumina AGE foi produzida pela incubação de albumina de rato com glicolaldeído 10 mM, durante 4 dias a 37 °C, em agitação, no escuro. Albumina controle (C) foi preparada na presença de PBS apenas. Ratos Wistar com 4 semanas de idade foram divididos aleatoriamente em quatro grupos experimentais (n = 7-8), os quais receberam injeção intraperitoneal diária de albumina C ou albumina AGE (20 mg/Kg/dia) concomitantemente ou não a administração da NAC (600mg/L de água) (grupos albumina C + NAC e albumina AGE + NAC), durante 90 dias consecutivos. Parâmetros bioquímicos foram determinados por técnicas enzimáticas, peroxidação lipídica, pela medida de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) na urina, expressão gênica, por RT-qPCR, e conteúdo proteico, por imuno-histoquímica. AGE total foi determinado por ELISA, carboximetil-lisina (CML) e pirralina (PYR), por cromatografia líquida/espectrometria de massa. O tecido adiposo periepididimal foi analisado por estereologia. A concentração de AGE total, CML e PYR foi, respectivamente, 9,2, 7000 e 235 vezes maior na albumina AGE em comparação à C. Consumo de ração, massa corporal, pressão arterial sistólica e concentração plasmática de colesterol total, triglicérides, ácidos graxos livres, glicose, insulina, ureia, creatinina, alanina aminotransferase, aspartato aminotransferase e excreção urinária de proteínas (24 h) foram semelhantes entre os grupos. A NAC reduziu em 1,4 e 1,6 vezes a concentração urinária de TBARS nos animais tratados com albumina AGE + NAC, em comparação aos grupos AGE e C+NAC, respectivamente. A albumina AGE reduziu em, aproximadamente, 1,4 vezes a sensibilidade à insulina em comparação ao C, o que foi prevenido pela NAC. O peso relativo do tecido adiposo periepididimal, a fração de área e o volume dos adipócitos foram semelhantes entre os grupos experimentais. Maior infiltrado macrofágico, (células F4/80 positivas), foi observado nos animais tratados com albumina AGE (1,3 x), o que também foi prevenido pela NAC. CD11b e CD206 permaneceram inalterados. O tratamento com albumina AGE também não alterou a expressão do mRNA de Ager (RAGE), Ddost (AGE-R1), Cd36, Nfkb1, Il6, Il10, Tnf, Nos2, Il12. No entanto, Itgam (CD11b - M1) e Mrc foram reduzidos no grupo AGE + NAC em comparação a C + NAC (2 e 1,9 x) e AGE (1,8 e 1,5 x, respectivamente). Aumento do mRNA de Slc2a4 (GLUT-4) e Ppara foi observado nos animais tratados com albumina AGE + NAC em comparação a C + NAC (Slc2a4: 1,6; Ppara 2,2 x) e AGE (2,3; 3,3 x). A albumina AGE contribuiu para maior expressão do Col12a1 (3,1 x) em relação ao C. Análise de macrófagos isolados da cavidade peritoneal apontaram elevação no mRNA de Il6 (2,6 x) e Ddost (1,4 x) no grupo AGE em relação ao C. Ddost também foi aumentado (1,2 x) no grupo AGE + NAC quando comparado ao C+NAC. Além disso, a NAC favoreceu o aumento do Arg1 (arginase 1) nos grupos albumina C + NAC (2,5 x) e AGE + NAC (2,6 x) quando comparados aos seus respectivos controles. Em conclusão, a albumina AGE favorece o infiltrado de macrófagos no tecido adiposo o que evidencia a sensibilização deste território à ação dos AGE e pode, a longo prazo, contribuir para piora na resistência à insulina, observada neste modelo animal. A NAC antagoniza os efeitos da albumina AGE e exerce, por si, efeitos benéficos sobre o perfil de diferenciação de macrófagos no tecido adiposo e peritônio, resposta inflamatória, peroxidação lipídica e resistência insulínica. A NAC pode ser uma ferramenta útil na prevenção das ações dos AGE sobre o desenvolvimento de resistência insulínica e complicações do DM / [Thesis]. São Paulo: \"Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, 2016\". Advanced glycation end-products (AGE) contribute to oxidative and inflammatory stress, which constitute the cellular basis for long-term complications of diabetes mellitus (DM). Albumin is the major serum protein modified by AGE and adversely affects macrophage lipid metabolism and inflammatory response, pancreatic islet function and muscle insulin sensitivity. We investigated the effect of chronic administration of AGE-albumin, associated or not with N-acetylcysteine (NAC) treatment, in peripheral insulin sensitivity, macrophage infiltration and polarization and transcriptome of periepididimal adipose tissue and peritoneal macrophage differentiation in healthy rats. AGE-albumin was prepared by incubating rat albumin with 10 mM glycolaldehyde for 4 days, 37 °C, under shaker, in the dark. Control albumin (C) was incubated with PBS alone. Four-weeks old male Wistar rats (n = 7-8/group) were randomized into four groups receiving daily intraperitoneal injections of C or AGE albumin (20 mg/kg/day) alone or together with NAC (600mg/L drinking water) (C + NAC albumin and AGE + NAC albumin), for 90 consecutive days. Biochemical parameters were determined by enzymatic techniques, lipid peroxidation by the measurement of urinary thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), gene expression by RT-qPCR and protein content by immunohistochemistry. Total AGE was determined by ELISA and carboxymethyllysine (CML) and pyrraline (PYR) by liquid chromatography/ mass spectrometry. Periepididimal adipose tissue was analyzed by stereology. Total AGE concentration, CML and PYR were, respectively, 9.2, 7000 and 235 times higher in AGE albumin as compared to C. Food consumption, body weight, systolic blood pressure and plasma total cholesterol, triglycerides, free fatty acids, glucose, insulin, urea, creatinine, alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase and urinary protein excretion (24 h) were similar among groups. NAC reduced urinary TBARS in AGE + NAC group as compared to AGE (1.4 x) and C + NAC (1.6 x), respectively. AGE albumin reduced 1.4 times the insulin sensitivity as compared to C albumin; this was prevented by NAC. Adipose tissue relative weight, adipocyte area fraction and volume were similar among groups. A higher (1.3 x) macrophage infiltrate (F4/80 positive cells) was observed in AGE albumin treated animals in comparison to those treated with C albumin and this was prevented by NAC. CD11b and CD206 were unchanged as well as mRNA de Ager (RAGE), Ddost (AGE-R1), Cd36, Nfkb1, Il6, Il10, Tnf, Nos2 and Il12. Itgam (CD11b - M1) and Mrc (CD206 - M2) were reduced in AGE + NAC group in comparison to C + NAC (2 and 1.9 x, respectively) and AGE (1.8 and 1.5 x, respectively). Increased Slc2a4 (GLUT-4) and Ppara mRNA were observed in AGE + NAC group in comparison to C + NAC (Slc2a4: 1.6 x; Ppara: 2.2 x) and to AGE (Slc2a4: 2.3 x; Ppara: 3.3 x). AGE albumin increased the expression of Col12a1 in 3.1 times as compared to C albumin. In peritoneal macrophages there was an increase in Il6 (2.6 x) and Ddost (1.4 x) in AGE group as compared to C. Ddost was also 1.2 times increased in AGE + NAC as compared to C+NAC. NAC increased Arg1 (arginase 1) in C + NAC (2.5 x) and AGE + NAC (2.6 x) as compared to their respective controls. In conclusion, AGE albumin favors macrophage infiltration in adipose tissue promoting over time tissue sensitization to AGE that may contribute to worsening insulin resistance in this animal model. NAC antagonizes the effects of AGE albumin and by itself has beneficial effects in macrophage differentiation in adipose tissue and peritoneal cavity, inflammatory response, lipid peroxidation and insulin sensitivity. NAC may be a useful tool in the prevention of AGE actions on the development of insulin resistance and long-term complications of DM