O sorotipo O125ac:H6 compreende amostras de Escherichia coli enteropatogênica atípicas que apresentam o padrão de adesão agregativa (AA) em células HEp-2. A construção de um banco de mutantes da amostra protótipo Ec292/84 com o transposon TnphoA gerou quatro mutantes não aderentes. O objetivo deste estudo foi a caracterização genotípica e fenotípica desses mutantes. As regiões adjacentes à inserção do TnphoA no mutante Ec2921/84::01 foram amplificadas, clonadas e seqüenciadas, revelando que a inserção do TnphoA ocorreu no gene secD, parte do sistema de secreção de proteínas do tipo 2 (SST2). O perfil de proteínas de membrana externa (OMP) dos mutantes, em comparação com a amostra selvagem, revelou a ausência de proteínas de 21 e 30 kDa nos mutantes. Um antissoro obtido contra o extrato de OMP da amostra protótipo inibiu o padrão AA e reconheceu a proteína de 30 kDa em immunoblottings com extratos de OMP. Esses dados indicam que esta proteína está envolvida no estabelecimento do padrão AA de E. coli O125ac:H6 e que essa proteína é transportada através do SST2. / The serotype O125ac:H6 comprises atypical Enteropathogenic Escherichia coli strains that express the aggregative adherence (AA) pattern to HEp-2 cells. We obtained four nonadherent mutants using TnphoA insertion in the Ec292/84 strain. The aim of this study was the genetic and phenotypic characterization of these mutants. The genetic analysis of the mutants revealed that the insertion of TnphoA ocurred in the secD gene, part of the bacterial type 2 secretion system (T2SS). The mutant outer membrane proteins (OMP) profile, in comparison to the prototype strain, demonstrated the lack of expression of proteins of 21 and 30 kDa in the mutant profile. An antiserum raised against the OMP extract of the prototype strain, in addition to inhibit the AA pattern, recognized the 30 kDa protein in immunoblotting assays with OMP extract. These data indicate this OMP is involved in the establishment of the AA pattern presented by the atypical EPEC strains of the O125ac:H6 serotype, and that this protein is transported via the T2SS.

Na,K-ATPase é uma proteína de membrana que tem como função manter o equilíbrio osmótico nas células pela hidrólise de ATP. A ouabaína (OUA) se liga a Na,K-ATPase e é capaz de ativar cascatas de sinalização. As subunidades a da Na,K-ATPase possuem 4 isoformas que são distribuídas de forma diferenciada nos tecidos. As células da glia são importantes na resposta contra lesões no cérebro e também controlam a inflamação. Dados na literatura mostram que a OUA tem efeito protetor em alguns tipos de dano. O objetivo do estudo é avaliar a função da isoforma a2 na cultura de células da glia em resposta à OUA e ao LPS. Nós investigamos a ação da OUA em diversas concentrações e LPS (1g/mL) na viabilidade celular (LDH) e proliferação celular (MTT). O LPS foi utilizado como modelo de inflamação e uma das perguntas era se o tratamento prévio com OUA, seria capaz de reverter a ativação do fator de transcrição NF-kB que está envolvido com inflamação. O pré-tratamento com OUA diminuiu a ativação do NF-kB induzida pelo LPS. Após, nós silenciamos a isoforma a2 das células da glia com RNAi. Os nossos dados mostram que o pré-tratamento com OUA reverte o efeito na ativação do NF-kB causado pelo LPS. Provavelmente, a isoforma a2 está relacionada com alguma via de sinalização que interage com a via do LPS. / Na,K-ATPase is a conserved membrane protein which maintains the osmotic balance in the cell by the hydrolysis of ATP. Ouabain (OUA) binds to Na,K-ATPase and it can activate signaling pathways. The a subunits of Na,K-ATPase have 4 isoforms which are distributed in a different pattern in the tissues. Glial cells have an important role in the response against injury and they also control inflammation. Some data have reported that OUA can protect against some types of injury. The aim of this study is to evaluate the role of a2 isoform in glial cells in response to OUA and LPS stimulus. We investigated the action of OUA and LPS in cell viability (LDH) and cell proliferation (MTT). LPS was used as a model of inflammation and one of our questions was if the treatment with OUA before LPS was capable of reduce the activation of the transcription factor NF-kB which is involved in inflammation. The pre-treatment with OUA decreased the NF-kB activation induced by LPS. We also silenced the a2 isoform in culture glial cells with iRNA. Taken together our data showed that OUA pretreatment reversed the NF-kB activation induced by LPS in primary cultures of glial cells from mice. Probably,the a2 isoform is related with some signaling pathway that interacts with the LPS pathway.

A epilepsia é a segunda causa mais freqüente de doenças neurológicas em adultos. A maioria dos pacientes epilépticos apresenta epilepsia do lobo temporal (ELT), cuja zona epileptogênica está localizada no lobo temporal. Altas taxas de psicopatologias são observadas em pacientes com epilepsia, principalmente ELT, quando comparados com a população geral. Uma vez que o neurotransmissor serotonina (5-HT) contribui com o neurodesenvolvimento, funcionalidade e plasticidade do cérebro adulto, alterações na neurotransmissão serotoninérgica poderiam contribuir para a etiologia da epilepsia. Além disso, a disfunção na atividade serotoninérgica no cérebro poderia aumentar a susceptibilidade a psicopatologias nos pacientes com epilepsia. Nesta linha, estudos de PET demonstraram uma diminuição no potencial de ligação dos receptores de serotonina (5-HT1A) em pacientes com epilepsia do lobo temporal, sendo que esta diminuição parece ser mais proeminente em pacientes epilépticos com depressão. Assim, genes relacionados com a neurotransmissão serotoninérgica são importantes candidatos para estudos de associação com a epilepsia. No presente trabalho, nós avaliamos o impacto de polimorfismos no gene do transportador da serotonina (5-HTT) e no gene do receptor 5-HT1A na ELT e em suas comorbidades psiquiátricas. O gene do transportador da serotonina apresenta dois polimorfismos com consequências funcionais na sua expressão: uma inserção/deleção de 44 pares de base na região flanqueadora 5’ (5-HTTLPR), e um número variável de repetições em tandem (VNTR) no intron 2 (5-HTTVNTR). O gene codificador do receptor 5-HT1A contém um polimorfismo de troca única de base (SNP) na região promotora (C-1019G) que altera a expressão gênica. Foram incluídos neste estudo 175 pacientes com ELT, dos quais 155 tinham avaliação neuropsiquiátrica, e 155 controles saudáveis. Primeiramente foi avaliado o impacto dos polimorfismos 5HTTLPR, 5HTTVNTR e C- 1019G na epilepsia do lobo temporal. Analisando os genótipos do 5-HTTVNTR e 5- HTTLPR combinados pela atividade transcricional, os genótipos de baixa expressão gênica foram mais freqüentes nos pacientes com ELT que nos controles saudáveis (O.R.=3.24; 95% I.C.=1.08 a 9.73; p=0.036). Esta associação com genótipos de baixa atividade trascricional do 5-HTT poderia estar relacionada com alterações funcionais do sistema serotoninérgico, aumentando o risco para epilepsia. Entretanto, não foi encontrada associação entre o polimorfismo C-1019G e a ELT. Na segunda parte deste trabalho, nós avaliamos a influência destes polimorfismos nas comorbidades de doenças psiquiátricas, entre elas transtorno de humor e ansiedade, em pacientes com ELT. Não foi encontrada diferença significativa na frequência dos polimorfismos no gene do transportador da serotonina (5-HTT) entre pacientes com ou sem comorbidade psiquiátrica. Entretanto o polimorfismo C-1019G foi associado com transtorno de ansiedade nos pacientes com ELT. Baseado em nossos resultados, sugerimos que alterações em genes relacionados à serotonina, como 5-HTT e 5-HT1A, poderiam estar envolvidas na gênese da ELT e nas características clínicas desta doença. Além disso, nós acreditamos que estudos futuros realizados com essa metodologia serão importantes para o estabelecimento das bases genéticas envolvidas nas manifestações neuropsiquiátricas da epilepsia do lobo temporal. / Epilepsy is the second most frequent cause of neurological disorders in young adults. The majority of the patients suffer from temporal lobe epilepsy (TLE). Higher rates of psychopathology are observed in patients with epilepsy, especially in those with TLE. Since neurotransmitter serotonin (5-HT) contributes to neurodevelopment, functionality and plasticity of the adult brain, serotonin may contribute to the etiology of epilepsy. Moreover, the impairment of serotoninergic activity in the brain may enhance susceptibility to psychopathologies in patients with epilepsy. In this line, PET studies showed a decreased serotonin receptor 1A binding in TLE patients, and this alteration seems to be higher in epileptic patients with depression. In this study we evaluated the impact of serotonin transporter (5-HTT) gene and serotonin receptor 1A (5-HT1A) polymorphisms over TLE and its psychiatric comorbidities. The 5-HTT gene has two polymorphisms with functional consequences: a 44 base pairs insertion/deletion polymorphism in the 5’ flanking region of this gene (5-HTTLPR), and a variable number of tandem repeats in the intron 2 (5-HTTVNTR). The gene encoding serotonin receptor 1A contains a single nucleotide polymorphism (SNP) in the promoter region (C-1019G) that regulates gene expression. In this study, were included 165 TLE patients, 155of these had been evaluated for neuropsychiatric disease, and 110 health controls. We first evaluated the impact of 5HTTLPR, 5HTTVNTR and C-1019G in temporal lobe epilepsy. When 5-HTTVNTR and 5-HTTLPR genotypes were combined by transcriptional efficiency, the low expressing genotypes were more frequent in TLE patients than in healthy controls (O.R.=3.24; 95% I.C.=1.08 a 9.73; p=0.036). This could be related to functional alterations and outgrowth inhibition of the serotonin system, and subsequently enhance the risk to epilepsy in adulthood. However we did not find an association between C-1019G and TLE. In the second part of this work we evaluated the influence of these polymorphisms on the risk for psychiatric diseases in these patients, among them mood and anxiety disorder. There were no significant differences between genotypes frequencies of 5-HTT polymorphisms and presence of any psychiatry disease. However, the C-1019G polymorphism was associated with anxiety disorder in TLE patients. Based in our results, we suggest that alteration in serotonin related genes, such as 5-HTT and 5- HT1A, might be involved in the genesis of TLE and in clinical characteristics of this disease. Moreover we believe that further studies involving molecular methodologies will be important to establish the genetic bases involved in the neuropsychiatric manifestations of TLE.

Introdução: Inúmeros estudos têm associado alterações no sistema serotoninérgico com doenças psiquiátricas como a depressão e os atos suicidas. O polimorfismo funcional no gene transportador da serotonina (5-HTTLPR) é descrito como uma inserção/deleção de 44 pares de base na região polimórfica do gene 5-HTT (5- HTTLPR) tendo dois alelos: "longo"(l) e "curto"(s). Diversos estudos mostraram evidências da associação da variante alélica curta (alelo "s" ou short) com o comportamento suicida. Novas variantes alélicas foram descritas dentro do polimorfismo 5-HTTLPR na forma de um polimorfismo de nucleotídeo único (Single Nucleotide Polymorphism) que gera um funcionamento multialélico na região reguladora do gene (5-HTTLPR). A maioria dos trabalhos envolvendo este polimorfismo analisou os desfechos considerando apenas a forma bialélica. As novas variantes (forma multialélica) foram pouco estudadas associadas ao comportamento suicida. Dessa forma realizamos o estudo 1, que permitiu a análise da forma multialélica deste polimorfismo em pacientes deprimidos que tentaram o suicídio. A enzima catecol-orto-metil-transferase (COMT) aparece em alguns estudos como estando associada ao comportamento suicida. Um polimorfismo (rs165388) no gene que codifica a enzima produz uma substituição de uma valina por metionina no códon 158 (COMT Val158Met) que resulta na distribuição trimodal [AA (Met/Met), AG (Val/Met) e GG (Val/Val)] da atividade da COMT. A variante Val/Met da enzima COMT é um dos mais estudados polimorfismos analisados em pacientes psicóticos e esquizofrênicos embora com poucas evidências de associação com tais doenças. Devido à existência de poucos trabalhos envolvendo este polimorfismo com comportamento suicida decidimos investigar uma possível participação deste polimorfismo em pacientes deprimidos que tentaram o suicídio que está descrita no artigo 2. Métodos: Este foi um estudo caso-controle para de genes candidatos para o comportamento suicida. A amostra foi pareada para sexo e idade e composta por indivíduos caucasianos. No primeiro estudo a amostra foi composta de 94 pacientes deprimidos que tentaram suicídio e 94 controles sem diagnóstico psiquiátrico e no estudo 2 a amostra foi de 88 pacientes e 88 controles também pareados por sexo e idade. Um polimorfismo (rs165388) no gene que codifica a enzima produz uma substituição de uma valina por metionina no códon 158 (COMT Val158Met) que resulta na distribuição trimodal [AA (Met/Met), AG (Val/Met) e GG (Val/Val)] da atividade da COMT. A variante Val/Met da enzima COMT é um dos mais estudados polimorfismos analisados em pacientes psicóticos e esquizofrênicos embora com poucas evidências de associação com tais doenças. Devido à existência de poucos trabalhos envolvendo este polimorfismo com comportamento suicida decidimos investigar uma possível participação deste polimorfismo em pacientes deprimidos que tentaram o suicídio que está descrita no artigo 2. Métodos: Este foi um estudo caso-controle para de genes candidatos para o comportamento suicida. A amostra foi pareada para sexo e idade e composta por indivíduos caucasianos. No primeiro estudo a amostra foi composta de 94 pacientes deprimidos que tentaram suicídio e 94 controles sem diagnóstico psiquiátrico e no estudo 2 a amostra foi de 88 pacientes e 88 controles também pareados por sexo e idade. A avaliação diagnóstica foi feita através de entrevista psiquiátrica clínica e por entrevista diagnóstica padronizada breve Mini International Neuropsychiatric Interview (MINI) para adultos e nos pacientes foi aplicada a escala Suicide Intent Scale (SIS). A região promotora do gene 5-HTT contendo o polimorfismo 5-HTTLPR e a região do gene COMT contendo o polimorfismo Val158Met foram amplificadas através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Os produtos da PCR foram analisados por RFLP e a análise dos fragmentos resultantes foram visualizados por eletroforese em gel agarose 3%. Resultados: No primeiro estudo não foi encontrada associação entre as novas variantes do polimorfismo 5-HTTLPR com tentativas de suicídio em pacientes deprimidos. Em nossa análise também não encontramos uma associação entre o polimorfismo (rs165388) com comportamento suicida. Conclusão: Mesmo com resultados negativos, este trabalho permitiu avaliar pela primeira vez as novas variantes alélicas do polimorfismo do gene transportador da serotonina e analisar o polimorfismo Val158Met do gene da COMT em uma amostra brasileira de pacientes deprimidos que tentaram o suicídio. Sugerimos que novos estudos sejam realizados no sentido compreender o papel destes polimorfismos no comportamento suicida. / Introduction: The serotonergic route has been intensively studied regarding the involvement in several psychiatric disorders including major depression and suicide behavior. The serotonin transporter gene (5-HTT) is one of the most studied candidate genes for suicide behavior. A polymorphism corresponding to an insertion/deletion of 44 base pairs in the promoter region of this gene (5 - HTTLPR), originates two alleles (l- long e s-short). Several studies have demonstrated an evidence for the association among this polymorphism (specially the s variant) and suicide behavior. New allelic variants within the 5-HTTLPR polymorphism were described which generates a multiallelic functioning in the regulatory region of the 5- HTT gene. The analysis of an imbedded SNP (Single Nucleotide Polymorphism) was rarely studied in association with suicide behavior and the vast majority of publications involving this polymorphism analyzed only the biallelic form. Thus, we decided to perform study 1, which allowed a multiallelic analysis of this polymorphism in depressed patients who attempted suicide. The enzyme catechol - o - methyltransferase (COMT) has been shown in a few studies as being associated to such behavior. A polymorphism (rs165388) in the gene that codes for the enzyme produces a substitution of valine for methionine at codon 158 (COMT Val158Met) which results in the trimodal distribution ([AA (Met/Met), AG (Val/Met) e GG (Val/Val)] of the COMT activity. This is one of the most studied polymorphisms in psychotic and schizophrenic patients, although with few evidences of positive association. Because this polymorphism has been poorly studied in non psychotic patients with suicide behavior, we decided to investigate a possible participation of such polymorphism in our sample (study 2). Methods: These are case-control candidate gene studies for suicide behavior. Subjects were cautiously paired for sex and age and all were Caucasians. The sample of the first study consisted of 94 patients and the control group was a convenience sample comprising 94 employees of Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) without psychiatric disorders. The second study comprised the same sample with 176 subjects also paired for sex and age (88 cases and 88 controls). Cases and controls were evaluated by a Psychiatric Interview and the Mini International Neuropsychiatry Interview (MINI). A semi-structured interview was used to access sociodemographic data and clinical history. The Beck’s Suicidal Intention Scale (SIS) was used for the patients interviewed by the psychiatrist. The region of the 5-HTT gene containing the biallelic polymorphism and the region of the COMT gene containing the Val/Met polymorphism were amplified under Polymerase Chain Reaction. The amplified products of 5-HTT polymorphism were determined by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis. The digestion products were visualized by 3% agarose gel electrophoresis stained with ethidium bromide under UV light. Results: In our first study, we did not find an association with the new allelic variants of 5-HTTLPR among depressed patients with suicide attempts. Also we did not find an association with the rs165388 polymorphism (COMT) with suicide attempts in depressed patients. Conclusion: Even with a negative result, this work allowed, for the first time, the new allelic variants of 5-HTT and analyze the COMT Val158Met polymorphism with suicide attempts in depressed patients. We suggest more studies in order to understand the role of these polymorphisms in suicide behavior.

Submitted by Fernanda Rodrigues de Lima (fernanda.rlima@ufpe.br) on 2018-07-27T19:30:43Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Isabeli Lins Pinheiro.pdf: 2366520 bytes, checksum: a21da65bdb7db4555098a8072ac35b29 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-08-07T22:40:33Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Isabeli Lins Pinheiro.pdf: 2366520 bytes, checksum: a21da65bdb7db4555098a8072ac35b29 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-07T22:40:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Isabeli Lins Pinheiro.pdf: 2366520 bytes, checksum: a21da65bdb7db4555098a8072ac35b29 (MD5) Previous issue date: 2017-03-13 / O sistema serotoninérgico apresenta funções no controle de eventos biológicos fundamentais para o desenvolvimento adequado do sistema nervoso. A serotonina (5-HT) e o Transportador de Serotonina (SERT) são indispensáveis para este controle. A disponibilidade destes componentes é precisamente regulada durante o período crítico de desenvolvimento, e podem sofrer interferências provindas do ambiente alterando sua ação sobre o sistema nervoso. Os inibidores seletivos da recaptação de serotonina bloqueiam o SERT e promovem o aumento dos níveis extracelulares da 5-HT. A 5-HT está intimamente relacionada à ingestão alimentar, e parece ter uma relação inversa com o consumo energético, pois promove redução da ingestão alimentar por estimular a saciedade em ratos. Esta ação anorexígena da 5-HT exibe uma resistência quando requisitada por estímulos agudos, demonstrando que os animais desenvolvem adaptações de acordo com os estímulos ambientais sofridos no período de desenvolvimento. Este trabalho avaliou os efeitos da exposição à fluoxetina durante o período de lactação sobre parâmetros morfológicos e moleculares da serotonina e do transportador de serotonina, e seus efeitos sobre a ingestão alimentar de animais jovens. Métodos: Os animais foram divididos em dois grupos de acordo com a manipulação experimental, um grupo fluoxetina (F): filhotes machos que receberam aplicação de fluoxetina (10mg/kg, 10μl/g, s.c.) e um grupo controle (C): filhotes machos receberam aplicação de salina (NaCl 0.9%, 10μl/g, s.c), ambos durante toda a lactação (1º ao 21º dia de vida). Foram avaliados o peso corporal durante a lactação e aos 40 dias, ingestão alimentar e sequência comportamental da saciedade após a lactação, expressão gênica e protéica do SERT e o conteúdo de serotonina no hipotálamo aos 21 e 40 dias, e a imunorreatividade de neurônios ao SERT no hipotálamo e tronco encefálico aos 75 dias de vida. Resultados: A fluoxetina neonatal promoveu redução no peso corporal a partir do 11º dia até os 40 dias (11 dias SAL:34,3±1,8; FLU:30,4±2,7/ 40 dias SAL:166,9±27,2; FLU: 127,3±17,5) e na resposta hipofágica da serotonina (FLU:3,36±0,22; FLU+FLUAGUDA:3,37±0,26), aumento no conteúdo de serotonina aos 21 dias (SAL:4,55±0,55; FLU:7,12±0,96), do gene SERT (21 dias SAL:0,82±0,04; FLU:1,01±0,04/ 40 dias SAL:1,00±0,03; FLU:1,40±0,03) e da proteína SERT (21 dias SAL:100±4,47; FLU:119,25±6,47/ 40 dias SAL:92,29±3,40;FLU:117,96±8,75) no hipotálamo. A quantidade dos neurônios SERT nos núcleos arqueado (ARC) e paraventricular (PVN) do hipotálamo e núcleo dorsal (DR) da rafe no tronco encefálico foi menor nos ratos expostos à fluoxetina neonatal aos 75 dias (ARC SAL: 156,1±20,1; FLU:62±8,5/ PVN SAL:319,3±23,3; FLU:135±35,2/ DR SAL: 139,4±39,4; FLU: 47,4±9,1). Conclusão: Concluímos que a organização do sistema serotoninérgico durante o período crítico de desenvolvimento é fundamental para a programação da ingestão alimentar em roedores. / The serotoninergic system presents control of biological events fundamental to the proper development of the nervous system. A serotonin (5-HT) and the Serotonin Transporter (SERT) are indispensable for this control. The availability of components is precisely regulated during the critical period of development and can interfere with the nervous developmental. Selective serotonin reuptake inhibitors block SERT and promote increased extracellular 5-HT levels. 5-HT is closely related to dietary intake, it seems to be an inverse relation with energy consumption, as it promotes a reduction in food intake by stimulating satiety in rats. This anorectic action of 5-HT shows a resistance when required by a stimulus. This study evaluated the results of the exposure to fluoxetine during lactation on the role of serotonin morphology and serotonin molecules and the transport of serotonin and its effects on food intake of young animals. Methods: The animals were divided in two groups according to an experimental manipulation, a group fluoxetine (FLU): male pups that received application of fluoxetine (10mg/kg, 10μl/g, s.c.) and male pups that received application of saline (NaCl 0.9%, 10μl/g, s.c.), both during all lactation. The body weight during a lactation was evaluated at 40 days, the food intake after lactation, the expression of SERT and the content of hypothalamic serotonin at 21 and 40 days, and the immunoreactivity of the neurons SERT into hypothalamus and brainstem at 75 days of age. Results: Neonatal fluoxetine promoted a reduction in body weight from day 11 to 40 days (11 days SAL: 34,3±1,8; FLU:30,4±2,7/ 40 days SAL: 166,9±27,2; FLU: 127,3±17,5), and the hypophagic response of serotonin (FLU:3,36±0,22; FLU+FLUACUTE:3,37±0,26), increase in the serotonin content 21 days (SAL:4,55±0,55; FLU:7,12±0,96), SERT gene (21 days SAL:0,82±0,04; FLU:1,01±0,04/ 40 days SAL:1,00±0,03; FLU:1,40±0,03) and protein SERT (21 days SAL:100±4,47; FLU:119,25±6,47/ 40 days SAL:92,29±3,40;FLU:117,96±8,75) in the hypothalamus. The amount of SERT neurons in the arched nuclei (ARC) and paraventricular (PVN) of the hypothalamus and dorsal nucleus (DR) in the brainstem were lowers in the rats exposed to neonatal fluoxetine at 75 days (ARC SAL: 156,1±20,1; FLU:62±8,5/ PVN SAL:319,3±23,3; FLU:135±35,2/ DR SAL: 139,4±39,4; FLU: 47,4±9,1). Conclusion: We conclude that an organization of the serotonergic system during the critical period of development is fundamental to food intake programming in rodents.

Orientadores: Aureo Tatsumi Yamada, Wirla Maria da Silva Cunha Tamashiro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T04:32:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bizinotto-Assuncao_MarciaCristina_D.pdf: 17669234 bytes, checksum: 7623e53be29f1a69dba9c95b19066e0e (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O fenômeno da gestação em mamíferos de placentação hemocorial, onde o feto alogênico, apresentando metade dos genes de origem paterna, desenvolve um íntimo contato com o tecido materno sem desencadear uma resposta de rejeição pelo sistema imune materno, é ainda uma questão da imunologia da reprodução não esclarecida completamente. O diálogo na interface materno-fetal do útero gestante envolve uma gama de citocinas da categoria Th1fTh2, bem como de várias populações celulares, onde se destacam as células Natural KiUer uterinas (uNK). As uNK são populações linfocitárias transitórias que migram a partir de progenitores localizados em órgãos linfóides secundários como linfonodo e baço para o útero gestante e, neste proliferam e diferenciam ao longo da gestação. A presença destas células no útero gestante tem sido relacionada com o reconhecimento dos antígenos HLA-G e HLA-E expressos pelos trofoblastos, resultando na inibição tanto da resposta imune inata quanto da adaptativa. Esta atuação peculiar das uNK sugere que a modulação destas células no útero gestante esteja relacionada com a expressão de receptores específicos não compartilhada com células NK circulantes (eNK). Em uNK de camundongos, a lectina DBA (Doliehos biflorus agglutin) identifica glicoconjugados contendo N-acetil D-galactosamina presentes na superfície destas células e que não são expressos por outros linfócitos, corroborando com a hipótese de que as uNK expressam receptores específicos não comuns às eNK Neste trabalho, nós propusemos avaliar a possível expressão de moléculas específicas na superfície das células uNK de camundongos e identificar as proteínas candidatas através de técnicas proteômicas. Para tanto foram inicialmente utilizadas células uNK isoladas e purificadas de úteros de camundongos prenhes como in6culos antigênicos em machos da mesma espécie, para avaliar a capacidade de indução de uma resposta imune com produção de anticorpos reativos a esses antígenos. Outra estratégia utilizada foi o isolamento de proteínas de homogenados uterinos, de células uNK e da membrana destas células, na tentativa de isolar e identificar aquelas reativas à lectina DBA. Como resultado das inoculaçães de células uNK, os camundongos receptores produziram anticorpos séricos que reconheciam células uNK através de reações imunocitoquímicas. Este resultado confirma a expressão de moléculas específicas em células uNK, que por sua vez as caracteriza como uma subpopulação de NK específica da gestação. Dos dois animais com maior nível de anticorpos séricos foram coletados os baços para o preparo das células empregadas em experimentos de fusão celular para a obtenção de hibridomas secretores de anticorpos monoclonais. Um dos anticorpos monoclonais obtidos reconheceu moléculas presentes na superfície e no citoplasma das células uNK de várias linhagens de camundongos, assim como moléculas em células presentes no endométrio de ratas prenhes e no endométrio gestacional de humanos, sugerindo que moléculas homólogas são expressas em uNK de outras espécies. No entanto, este anticorpo monoclonal anti-uNK de camundongo (mamuNK1) apresentou reação cruzada com componentes citoplasmáticos de outras células, sugerindo não serem específicos para uNK Em relação ao isolamento dos glicoconjugados lectina DBA reativos observouse que através da cromatografia de gel filtração o isolamento mostrou-se pouco eficiente para o "pool" de proteínas contidas no homogenado uterino, ou mesmo de homogenado de células uNK, em decorrência da existência de múltiplas frações de proteínas capazes de ligar à lectina DBA. Restringindo-se o "pool" de proteínas àquelas obtidas apenas da membrana de células uNK e, através da eletroforese de duas dimensões pode-se delimitar as proteínas de interesse, as quais foram submetidas à análise proteomica. A identificação das proteínas isoladas das membranas de células uNK através de técnicas proteomicas sugeriram as proteínas Conserved oligomeric Golgí complex component 4 (COG4) e Heat shock 70-líke proteín 1 (Hsp 70 L1) como potenciais candidatas relacionadas com as atividades das células natural kíller no útero gestante / Abstract: The phenomenon of pregnancy in mammalians with hemochorial type placenta ions where the allogeneic fetus presenting the half of gene from paternal origins growth in tight contact with maternal tissues, without triggering the rejections responses of maternal immune system is still a non-solved question of immunology of reproduction. The cross-talk at maternal-fetal interface in the pregnant uterus involves a range of Th1rrh2 cytokines, as well as, several cell populations with accentuated participation of uterine Natural Killer (uNK) Iymphocytes. The uNK .are transient leukocyte population that migrate from precursor cells localized at secondary Iymphoid organs such as Iymph nodes and spleen into the pregnant uterus and proliferate and differentiate during the gestation. The presence of these cells in the pregnant uterus has been related to recognition of the HLAG and HLA-E antigen present in the trophoblast, which results in inhibition of both innate and adaptive immune response. This peculiar activity of uNK suggests that the modulation of such cells in the pregnant uterus should be related with the expression of specific receptors not shared with peripheral blood circulating NK (cNK) cell. In the mouse uNK, the DBA (Dolichos biflorus agglutin) lectin identify n-acetyl D-galactosamine containing glycoconjugates present on the surface of these cells not expressed by other Iymphocytes, which corroborate the hypothesis of uNK expressing specific receptors not shared by cNK. The present work aimed to evaluate the presumed expression of specific molecules on mouse uNK cell surface and identify the candidate proteins by proteomic methods. Initially were used uNK cells isolated and purified from pregnant mice uteri as antigen to be inoculated in the male mice and evaluate the capacity of induction of immune response with production of antibodies reactive to these antigens. Other strategy was to realize procedures of protein isolation from uterine homogenates, uNK cells and the membrane of these cells, in the attempt to isolate and identify those reactive to DBA lectin. As results of inoculation of uNK cells were verified responses in the inoculated males by presence of serum antibodies that recognized uNK with immunocytochemistry. These results confinn the expression of specific molecules in uNK cells which characterize these cells as specific NK subset of pregnancy. From two animaIs with highest levei of antibodies in 1he serum were collected the spleen to isolate the Iymphocytes clones for monoclonal antibodies obtantion. One of these antibodies recognized antigen molecules found on the surface and cytoplasm of the uNK cells of several mice strains, as well as, molecules in cells present in the pregnant rats and human beings endometrium, which suggests the expression of homologous molecules in uNK of other species. However, this mouse anti-mouse uterine NK (mamuNK1) was reactive with citoplasmatic components the other cells, suggesting not be specific to uNK. About the isolation of DBA lectin reactive glycoconjugates by purification in gel filtration chromatography revealed low efficiency to the pool of proteins contained in the uterine homogenate, or even in the homogenate of isolated uNK cells due to the multiple DBA lectin positive protein fractions. By restriction of protein pool to those obtained from the uNK cells membrane and by two dimension electrophoresis was delimited the target proteins that were submitted to the proteomic analysis. The identification of isolated proteins of the membranes of uNK cells with proteomics methods suggested the Conserved proteins oligomeric Golgi complex Component (4 COG4) and Heat shock 7D-like protein 1 (Hsp 70 L1) as potential candidates related to the activity of the natural to killer cells in the pregnant uterus / Doutorado / Histologia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Eneida de Paula / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T08:33:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cunha_ElizabethSousada_M.pdf: 3228323 bytes, checksum: 545a2be4ec32cc1a223c4b4337dc369a (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A mitocôndria é uma organela vital, pois em células aeróbicas, ela é responsável pela produção da maior parte da energia química necessária para a célula. A síntese de ATP ocorre por fosforilação oxidativa na Fo,F1-ATPase, usando a energia gerada pela cadeia de transporte de elétr ons, uma série de enzimas presentes na membrana mitocondrial interna. A análise de proteínas de membrana pode ser feita pela técnica de eletroforese, tanto em condições nativas quanto desnaturantes. Neste trabalho analisamos a solubilização de proteínas da membrana interna de mitocôndria de músculo de rato, através do uso de surfatantes zwiteriônicos (ASB-14, ASB-16, CHAPS), não-iônicos (Digitonina, C12E8, Triton X- 100) e aniônico (Colato de sódio) na separação por eletroforese em gel nativo e bidimensional. Desenvolvemos um novo protocolo para preparo de eletroforese em gel nativo, mantendo o tampão de amostra descrito no procedimento de BN-PAGE e adaptando as demais etapas da técnica de acordo com o protocolo de Laemmli et al (1970). Os géis assim preparados em temperatura ambiente mostraram melhor resolução que os pelo método BN-PAGE, foram obtidos menor tempo de corrida (1- 2 horas), sem troca de tampões e com emprego de reagentes de menor custo. Quanto a eficiência dos diferentes surfatantes, usados em uma mesma concentração (43,2 mM), o zwiteriônico ASB-16 foi o melhor solubilizador das proteínas de MMI, tanto em relação a quantidade total de proteína solubilizada como em relação a número de ¿spots¿ visualizados na eletroforese bidimensional, seguido pelo não-iônico Triton X-100. O surfatante não-iônico dodecil maltosídeo foi usado na preparações dos géis 2D em concentrações menores inferiores (20%) do que as indicadas na literatura (10% ou 195,8 mM), sem prejuízo da eficiência de solubilização protéica. Os resultados obtidos com géis nativos mostraram que todos os surfatantes estudados podem ser usados para separar os complexos protéicos da MMI, mas apresentam seletividade específica pelos complexos da Cadeia Respiratória, devendo esse parâmetro ser melhor estudado futuramente, para a determinação de protocolos específicos para isolamento dos diferentes tipos de complexos / Abstract: The majority of the chemical energy produced inside aerobic cells is a result of the oxidative phosphorylation of ATP, inside the mitochondria. A great part of mitochondria proteins are organized into complexes located in the inner mitochondria membrane. Isolation and identification of those proteins have been conducted by electrophoresis, both in native as in denaturant condition. In this work we analysed solubilization of the inner mitochondrial membrane proteins of rat¿s gastrocnemius muscles, through the use of zwitterionic (ASB-14, ASB-16, CHAPS), non-ionic (Digitonin, C12E8, Triton X-100) and anionic (sodium cholate), by native and two-dimensional electrophoresis. We have developed a new protocol for the native gel electrophoresis, using the buffer sample described in BN-PAGE but changing other steps of the technique according to the protocol of Laemmli et al (1970). With this novel protocol, the gels prepared at ambient temperature had a better resolution than the classic BNPAGE technique; with low costs and short-time runs (1-2 hours). As for the effectiveness of surfactants studied to solubilize inner mitochondrial membrane proteins, when used at the same concentration (43.2 mM), the zwitterionic ASB-16 was the best, both accordingly to the total amount of solubilized protein, as for the number of "spots" detected in the two-dimensional electrophoresis, followed by non-ionic Triton X-100. The non-ionic surfactant dodecyl maltoside was used in the 2D electophoresys preparation at lower concentrations (20%) than that recommended in the literature (10% or 195.8 mM) without prejudice in the efficiency of protein solubilization. The results with native gels proved that all the studied surfactants can be used to separate the proteins of MMI, but with different selectivity for each enzymatic complex. This specificity should be better studied in the future, looking for the determination of specific protocols for better isolation of each types of MMI complex / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Submitted by Franciele Moreira (francielemoreyra@gmail.com) on 2017-08-04T16:47:05Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Juliana Santana de Curcio - 2014.pdf: 2001377 bytes, checksum: 2f9ef22cd0a300cc93ee483fab0fb9c1 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-08-07T15:54:46Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Juliana Santana de Curcio - 2014.pdf: 2001377 bytes, checksum: 2f9ef22cd0a300cc93ee483fab0fb9c1 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-07T15:54:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Juliana Santana de Curcio - 2014.pdf: 2001377 bytes, checksum: 2f9ef22cd0a300cc93ee483fab0fb9c1 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2014-02-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Paracoccidioides spp. represents thermodimorphic fungi that cause paracoccidioidomycosis, the most widespread systemic mycosis in Latin America. During the establishment of the infection, proteins located in cell membranes are responsible for many essential processes for pathogen survival as transport of nutrients, accession, signaling and energy production. Cell membranes are basically composed of a lipid bilayer with proteins associated. The proteins can be associated with the membrane through transmembrane domains, posttranslational added modifications or through electrostatic interactions. Therefore the knowledge of the constitution of the proteins of membranes is important to understand some processes developed by Paracoccidioides sp. for its growth and survival within the host. To this end, two techniques of separation and identification of proteins were employed. The first methodology used two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry, where the extract of membranes proteins was obtained after steps of ultracentrifugation and the second methodology used liquid chromatography coupled with mass spectrometry, to this methodology three protocols were employed to obtain the extract of membranes proteins. The first methodology employed ultracentrifugation, and the second e third methodology used ultracentrifugation/sonication and ultracentrifugation with elevation of pH respectively. After these steps, the extract of membranes proteins was obtained through of ultracentrifugation and elevation of pH with sodium carbonate. Transmission Electron Microscopy (TEM) was performed to confirm the quality of the sample, a fraction enriched in cell membranes of Paracoccidioides sp.. Posteriorly the proteins obtained by standard methodology were subjected to tryptic digestion and analyzed by NanoUPLC-MSE.. In silico analyzes of the identified proteins were performed to determine the location and possible association of the proteins with the cell membranes. From total of proteins identified, one hundred thirty -three proteins were identified as belonging the cell membranes of Paracoccidioides sp.. Eighty-eight proteins showed at least one transmembrane domain and thirteen identified proteins showed a signal peptide at the N-terminus, beyond the transmembrane domain. Different forms of association of the proteins with membranes of Paracoccidioides sp. were detected, including domain transmembrane, GPI anchor, prenylation, myristoylation, palmitoylation. The most of the of integral membrane proteins identified in proteome were annotated in the genome of Paracoccidioides sp. Together these results show the establishment of an experimental protocol for the extraction of membranes proteins of Paracoccidioides spp., as well identify proteins from membrane fractions this fungus. / Paracoccidioides spp. representa um gênero de fungos termodimórficos, agentes etiológicos da paracoccidioidomicose, a micose sistêmica mais comum na América Latina. Durante o processo infeccioso proteínas localizadas em membranas celulares são responsáveis por muitos processos essenciais para a sobrevivência do patógeno, como transporte de nutrientes, adesão, sinalização e produção de energia. Basicamente membranas celulares são constituídas de uma bicamada lipídica com proteínas associadas. As proteínas de membranas associam-se a bicamada lipídica através de domínios transmembrana, por adição de uma modificação pós traducional e por meio de interações eletrostáticas. Portanto, o conhecimento da constituição proteica das membranas de Paracoccidioides sp. permite entender alguns dos processos desenvolvidos pelo fungo para sobrevivência dentro do hospedeiro. Desta forma o presente trabalho teve como objetivo à determinação da metodologia para obtenção de proteínas de membranas e a consequente descrição dessas proteínas. Para este fim, duas técnicas de separação e identificação de proteínas foram empregadas. A primeira metodologia baseava-se em eletroforese bidimensional e espectrometria de massas onde o extrato proteico de membranas foi obtido após duas etapas de ultracentrifugação e a segunda metodologia utilizava cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas, para esta metodologia três protocolos foram empregados no intuito de obter extratos proteicos de membranas. O primeiro protocolo emprega ultracentrifugação e o segundo e terceiro protocolo empregava ultracentrifugação/sonicação e ultracentrifugação combinado com elevação do pH respectivamente. Após as etapas de padronização do protocolo, o extrato proteico de membranas foi obtido através de ultracentrifugação e solubilização com carbonato de sódio em pH elevado. A microscopia eletrônica de transmissão (MET) foi realizada para confirmar a qualidade da amostra enriquecida com a fração de membranas de Paracoccidioides sp.. Posteriormente o extrato proteico de membranas proveniente da metodologia padronizada foi submetido à digestão tríptica e analisado por NanoUPLC-MSE. Análises in silico das proteínas identificadas foram realizadas a fim de se determinar a localização destas proteínas e possíveis associações com as membranas. Do total de proteínas identificadas cento e trinta e três proteínas foram classificadas como pertencentes a membranas celulares de Paracoccidioides sp., oitenta e oito proteínas apresentaram ao menos um domínio transmembrana e treze proteínas, além de domínio transmembrana apresentaram um peptídeo sinal na porção N-terminal da proteína. Diferentes formas de associação com as membranas de Paracoccidioides sp. foram identificadas neste trabalho, incluindo domínio transmembrana, âncora de GPI, prenilação, palmitoilação e miristoilação. A maioria das proteínas integrais de membrana identificadas no proteoma já foram anotadas no genoma deste fungo. Juntos estes resultados demonstram o estabelecimento de um protocolo experimental para a extração de proteínas de membranas de Paracoccidioides spp., bem como identificam as proteínas de frações de membranas do fungo.

Orientador: Marcelo Lancellotti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T07:21:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Varela_JuliaNogueira_M.pdf: 1464845 bytes, checksum: 930cccae996588333b99f1aaa50988c0 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Haemophilus influenzae é uma bactéria causadora de doenças tipicamente associadas ao trato respiratório superior e inferior. Tal bactéria é classificada em linhagens capsuladas e não capsuladas - as não tipadas. As grandes responsáveis por patogenias mais severas são as capsuladas, especialmente as do sorotipo b, a existência de uma vacina para somente esse sorotipo, faz com que ocorra uma emergência de casos com H. influenzae não tipado - NTHi. A crescente resistência a antibióticos dessa bactéria está associada à plasmídios de resistência, bem como sua competência natural. A presença desses patógeno é maior em países nos quais não existe acesso a vacina, devido ao alto custo da mesma, que acabam utilizando antibióticos mais acessíveis como o cloranfenicol no tratamento. Esse trabalho estudou a transferência horizontal do gene ompP2 em diversas cepas de H. influenzae com a ajuda de nanopartículas de óxido de grafeno. Essas nanopartículas mimetizam uma atmosfera rica em partículas suspensas como as grandes cidades e zonas de agricultura precoce, já que, nesses locais ocorrem com maior frequência mutações e adaptações desse patógeno. Quando as nanopartículas encontravam-se no meio de cultura, verificou-se um aumento da taxa de transformação dessas bactérias. Assim como uma modificação no padrão de adesão celular das bactérias mutadas quando comparadas com as selvagens em linhagens celulares distintas e expostas ao antibiótico de resistência, levando a um aumento da taxa de adesão das cepas mutadas com relação às cepas selvagens. Como esse gene é e de possível aquisição entre cepas de H. influenzae em seu ambiente natural seria possível utilizá-lo para obtenção de uma proteína recombinante, com possível antigenicidade. Uma vez que a taxa de adesão aumenta com a presença do mesmo, levando a uma possível nova vacina que também protegeria contra cepas não tipadas e não somente capsuladas / Abstract: Haemophilus influenzae is a bacteria that causes diseases typically associated with the upper and lower respiratory tract. Their strains are divided in capsulated and non-capsulated - the non typable. The major responsible for more severe cases are the capsulated types, specially the b type. The existence of a vaccine for the serotype b, allows the emergence of cases of non typable H. influenzae - NTHi. The growing resistance is associated with resistance plasmids, and with its natural competence, that enables the bacteria to acquire DNA fragments between it's' species. Since this pathogen is common in countries that there is no access to this vaccine, therefore the use of accessible and cheaper antibiotics, such as chloramphenicol for treatment is. This work studied the horizontal transference of the ompP2 gene from multiresistant strains of H. influenzae, with the aid of grafen oxide nanoparticles, that mimesis an atmosphere rich in suspended particles, such as great urban areas and ancient agricultural zones. In these environments a great frequency in mutation and adaptations of these bacteria is verified. When we look at the adhesion patterns of these bacteria we can see that it is modified when they are mutated and exposed to the resistance antibiotic. Leading to an augmentation of the adhesion patterns when we compare to the wild strains. Since this gene was present in all strains and it was of easy acquisition between strains, it would be possible to use it to obtain a recombinant protein with likely antigen properties. Because the adhesion tax enhances with the presence of this gene. Leading to a possible new vaccine target, for NTHi and capsulated strains also / Mestrado / Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde / Mestra em Biociências e Tecnologia de Produtos Bioativos

Entre cepas diferentes de P. falciparum existe uma grande variação entre as sequências das famílias de genes variantes. Um motivo para esta grande variedade é o fato que a maioria dos genes variantes se encontra em regiões subteloméricas e que o parasita é capaz de recombinar telômeros heterólogos durante a meiose (recombinação ectópica), levando a uma nova distribuição e a criação de novos genes variantes. Além desse fenômeno que ocorre durante a fase sexual do parasita, foi considerado que recombinações também podem ocorrer durante a fase mitótica na fase assexuada sanguínea. Neste estudo, procuramos monitorar a importância desta recombinação ectópica na geração de novos genes var em amostras de campo da Amazônia brasileira. Em experimentos paralelos elucidamos se existe recombinação ectópica também durante divisões puramente mitóticas. Observamos que muitos genes var que são compartilhados entre isolados mudam raramente ou não mudam de posição cromossômica. Observamos que no caso de mudança de posição cromossômica muitas vezes ocorreu duplicação do lócus. Muitos dos genes var compartilhados se encontraram em cromossomos 5-6 e 9-7. Por monitoramento de clones de 3D7 após 180 gerações não observamos nenhuma translocação de genes var subtelomérico ou telomérico indicando que a recombinação ectópica em mitoses é de fato um evento raro. / Different strains of the causative agent of malaria, Plasmodium falciparum, possess greatly varying repertoires of variant antigen encoding gene families. One reason for this variety lies in the fact that most of the variant gene families are found in subtelomeric regions. The parasite is able to recombine heterologous telomers during meiosis through a process coined ectopic recombination, potentially leading to a new distribution and creation of variant genes. Due to morphological similarities of chromosome end clustering in sexual as well as in asexual forms, it was hypothesized that ectopic recombination may also occur in mitotic asexual blood stage parasites. Herein we monitor the occurrence of ectopic recombination in field samples from the Brazilian Amazon. In parallel, we elucidated whether ectopic recombination also takes place in purely mitotic divisions. We observed that many var genes which are shared among isolates rarely change their chromosomal position. When a change occurred, we often observed chromosomal locus duplication and many of the shared genes were found on chromosomes 5-9 or 5-10. After outgrowth of the 3D7 strain for 200 generations with intermittent cloning we did not observe any translocation of telomeric or subtelomeric var genes, indicating that ectopic recombination in mitosis is a rare event.