A leptospirose é uma doença sistêmica, causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira. O desenvolvimento de novas estratégias para prevenir a doença é necessário. Vacinas surgem como fortes candidatas para contornar o problema. As pesquisas atuais têm interesse em identificar antígenos conservados que estão envolvidos nas interações patógeno-hospedeiro.O presente projeto selecionou três proteínas hipotéticas de L. interrogans para serem caracterizadas quanto ao seu papel na patogênese e avaliadas quanto ao seu potencial protetor. Os genes foram amplificados por PCR e clonados no vetor de expressão PAE. As proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade e foram reconhecidas por soro de indivíduos infectados. As proteínas LIC13479 e LIC10050 foram capazes de se ligar a laminina, plasminogênio e fibronectina plasmática. Em relação à LIC10537, dois fragmentos recombinantes foram gerados. Apenas o fragmento 2 foi capaz de interagir com PLG. As proteínas que interagiram com o PLG foram capazes de gerar plasmina As proteínas foram capazes de estimular uma resposta imune e LIC13479 e LIC10050 exerceram proteção parcial no modelo de leptospirose em hamsters. / Leptospirosis is a systemic disease caused by pathogenic bacteria of genus Leptospira. The development of new strategies to prevent the disease is needed. Vaccines emerge as strong candidates to fight the problem.Currently research has focused to identify conserved antigens This project selected three hypothetical proteins of L. interrogans. Thesecoding sequences were characterized for their possible role in pathogenesis and their potential to protect animals against challenge with virulent leptospires. Genes were amplified by PCR and cloned into the expression vector pAE. The recombinant proteins were purified by metal affinity chromatography and were recognized by confirmed human leptospirosis serum samples.LIC13479 and LIC10050 proteins were able to bind with laminin, plasminogen and plasma fibronectin. The coding sequence LIC10537 was cloned in two fragments. Fragment 2was able to interact with plasminogen. All proteins were able to generate active plasmin. The recombinant proteins were able of inducing an immune response. Evaluation of immunoprotection in leptospirosis hamster model followed by challenge with virulent bacteria showed that the recombinant proteins conferred partial protection.

Bacillus subtilis é uma alternativa ao emprego de Escherichia coli para a produção de proteínas recombinantes. O principal entrave à utilização de B.subtilis para esse fim é a baixa disponibilidade de sistemas de expressão. Nesse trabalho, testamos diferentes plasmídeos e promotores com o objetivo de desenvolver sistemas de expressão heteróloga eficientes. Ao fim do trabalho, propomos dois novos sistemas de expressão baseados do arcabouço do plasmídeo pMTL500E e nos promotores dos genes cdd e gsiB, ambos de B.subtilis. Os dois plasmídeos construídos apresentam expressão constitutiva e demonstraram desempenho superior no tocante à produção de proteínas heterólogas quando comparados ao único sistema comercialmente disponível, conhecido como pHT01. Em uma segunda parte do trabalho, propomos a utilização de Listeria innocua como veículo de entrega para antígenos vacinais. Por meio de ensaios ex-vivo e in vivo, demonstramos que essa bactéria possui potencial promissor para aplicações vacinais, inclusive quando comparada ao bem estabelecido B.subtilis. / Bacillus subtilis is an alternative to the use of Escherichia coli for the production of recombinant proteins. The main bottleneck to the use of B. subtilis for this purpose is the low availability of expression systems. In this study, we evaluated different plasmids and promoters with the aim of developing efficient heterologous expression systems. At the end of this work, we propose two new expression systems based on plasmid pMTL500E and the promoters from cdd and gsiB genes, both of them from B.subtilis. The two plasmids constructed exhibit constitutive expression and demonstrated superior performance regarding the production of heterologous proteins compared to the unique commercially available system, which is known as pHT01. In a second part of the work, we propose the use of Listeria innocua as a delivery vehicle for vaccine antigens. After ex-vivo and in-vivo experiments, we demonstrated that this bacterium has a promising potential for vaccine applications, even when compared to well established B.subtilis.

O Neospora caninum é um protozoário filogeneticamente relacionado a vários coccídeos de importância em medicina veterinária e humana, além de ser um parasita intracelular obrigatório capaz de causar abortamentos em bovinos e paralisia neuromuscular em cães. O estudo de antígenos e proteínas recombinantes de N. caninum gerou uma série de informações para um melhor diagnóstico e diferenciação deste protozoário e demais agentes a ele relacionados. No presente trabalho, propomos a expressão do clone do gene da proteína interna Nc56 de N. caninum em sistema procarioto (Escherichia coli), para avaliar sua antigenicidade frente a soros de bovinos imunoreativos contra Neospora caninum e Toxoplasma gondii. Para tanto, estabelecemos as condições ideais de expressão da proteína (indução por 4 horas e concentração de L-arabinose de 0,2%) e posteriormente avaliamos duas formas de purificação do produto recombinante (cromatografia de afinidade por metal imobilizado e eluição direta do gel de SDS-PAGE), constatando que a eluição de proteínas recombinantes diretamente do gel de SDS-PAGE mostrou-se o procedimento mais adequado para evitar a presença de proteínas contaminantes advindas do sistema procarioto de expressão. Foi selecionado um painel de soros bovinos (animais de campo), previamente testados pela reação de imunofluorescência indireta (RIFI) para avaliar sua reatividade para Neospora caninum e Toxoplasma gondii. Utilizamos o soro de um bezerro macho da raça Holandesa recém-nascido, colhido antes da administração de colostro materno (mãe soronegativa pela RIFI-Nc e RIFI-Tg) como controle negativo. O controle positivo foi obtido do mesmo bezerro após inoculação experimental de taquizoítos viáveis de N. caninum, quando este animal já apresentava seis meses de idade. O ELISA indireto foi realizado com microplacas de poliestireno com 96 cavidades de fundo chato sensibilizadas com 10 μg/mL de proteína recombinante purificada Nc56 e apresentou altas densidades ópticas tanto para soros bovinos positivos na RIFI para N. caninum quanto para T. gondii, quando comparadas com a densidade óptica do soro controle negativo. A proteína recombinante purificada e o extrato bruto de proteínas solúveis em tampão desnaturante foram submetidos ao teste de Western-blotting, para avaliação de antigenicidade frente a soros de animais positivos e negativos para N. caninum e T. gondii, previamente testados por RIFI. Os resultados apresentados nas duas técnicas (ELISA e Western-blotting) demonstram que a proteína recombinante purificada Nc56 de N. caninum possui reatividade cruzada entre os dois coccídeos, não se prestando, portanto, para uso em sorodiagnóstico da neosporose. / Neospora caninum, a protozoa phylogenetically related to other coccidea, is an obligatory intracellular parasite, able to cause abortions in bovine and neuromuscular paralysis in dogs. Researches with Neospora caninum antigens and recombinant proteins leads to numerous information to a better diagnosis and differentiation of several coccidea. The purposes of this study were expressing the Neospora caninum inner protein Nc56 in a prokaryotic system (Escherichia coli) and evaluate its antigenicity with i>Neospora caninum and Toxoplasma gondii positive bovine sera. It was established the ideal conditions to express the protein (4 hour induction and 0,2% L-arabinose concentration) and, after that, two protein purification systems were assayed (immobilized metal affinity chromatography and elution from polyacrylamide gel) resulting in a better protein recuperation the elution method. A panel of previous RIFI-tested bovine sera was selected to evaluate the immune reactivity of Nc56 protein with Neospora caninum and Toxoplasma gondii positive sera. The negative control was obtained from a Neospora caninum and Toxoplasma gondii negative newborn male bovine and the positive control was obtained from the same animal (6 month old), after the inoculation of live Neospora caninum tachyzoits. The indirect ELISA assay was performed in 96-wells microtiters plates, coated with purified Nc56 recombinant protein (10 µg/mL), resulting in higher optical densities for Neospora caninum and Toxoplasma gondii positive sera, when compared with negative control. The purified recombinant protein and the crude extract of soluble proteins in denaturing binding buffer were submitted to Western-blotting to evaluate its antigenicity with Neospora caninum and Toxoplasma gondii/i> positive sera. The results obtained in both techniques shown that Nc56 purified recombinant protein has cross reactivity between both coccidea, therefore, it is not indicated to be used as antigen in neosporosis serodiagnosis.

A proteína de matriz do Virus Respiratório Sincicial humano foi o foco deste trabalho. Verificamos que o gene de matriz possui sítios internos de poliadenilação, sinais de instabilidade de RNA, baixo índice de adaptação de codons (CAI) e conteúdo GC, que podem impedir a expressão gênica vitro. Quando clonado sob controle do promotor de CMVie, o gene selvagem não apresenta expressão detectável, enquanto um gene sintético com a sequência do gene de matriz otimizada apresenta altos níveis de expressão em células transfectadas. Esse alto nível de expressão permitiu a confirmação da presença da proteína M no núcleo no início de sua expressão, por análise em microscopio confocal de varredura a laser, além de sua associação a membranas em regiões conhecidas como lipid rafts. Também foi observado que a proteína M é capaz de associar à proteína tropomiosina. Ainda foram analisados os possíveis domínios funcionais através de expressão de variantes da proteína M com deleções de trechos da proteína. Finalmente foi analisada a capacidade de indução de resposta imune. / The Human Respiratory Syncytial Vírus was the focus of this work. We found that matrix gene has internal polyadenilation sites, RNA instability motifs, low codon adaptation index (CAI) and GC content, that may impair its expression in vitro. When cloned under control of the ieCMV promoter, the wild-type M gene expression was not detectable, whereas a synthetic optimized matrix gene was highly expressed in transfected cells. This high level of expression made possible to follow M nuclear localization in the beginning of its expression by confocal laser scanning microscopy, and its association with membranes in regions known as lipid rafts. It has also been found that the matrix protein associates with tropomyosin. It was further analyzed the possible functional through expression of deviations of the M protein that lack portions of the protein. Finally it was analyzed its capacity to induce an immune response.

Um importante fator de patogenicidade de P. falciparum, causador da malária, é a presença de antígenos altamente polimórficos, codificados por famílias multigênicas como var e rif. O grande polimorfismo destes genes em isolados de diferentes regiões contrasta com o fato de existirem, em diferentes isolados de campo brasileiros, alelos conservados. Respostas humorais contra estas proteínas são consideradas importantes na aquisição de proteção contra os sintomas da doença em regiões endêmicas. Portanto, medimos a resposta humoral contra antígenos recombinantes PfEMP1 e RIFIN e detectamos níveis baixos de resposta tanto em indivíduos sintomáticos quanto em indivíduos assintomáticos infectados pelo parasita. Estas respostas foram baixas quando comparadas às respostas contra MSP119 da superfície do merozoíta e parecem ser de curta duração. Com base nestes resultados, as respostas contra domínios DBLa, em situações hipoendêmicas, parecem ocorrer em função da presença do parasita circulante, e não são relacionadas à proteção contra os sintomas clínicos da doença. / An important factor in the pathogenicity of P. falciparum, the causing agent of malaria is the expression of highly polymorphic antigens encoded by the multigene families var and rif. The extreme polymorphism of these genes in strains from different geographical regions is in contrast with the observation of a number of conserved alleles found in Amazonian isolates. The humoral response against these proteins is considered an important factor in the immunity against symptomatic infection in áreas with high transmission. We measured the antibody response against recombinant PfEMP1 and RIFIN antigens and detected low responsiveness of symptomatic and asymptomatic malaria infected individuals. These responses were not only weak when compared to the anti-merozoite surface protein 1 response, but also ceased rapidly after the removal of circulating parasites. On the basis of these results, the response against DBLa seems to be dependent on the presence of parasites and not important for the observed protection against symptomatic infection in hypoendemic settings.

ATPDases ou ATP-difosfohidrolases são enzimas que clivam o ATP e o ADP a AMP e Pi e estão envolvidos em inibição da agregação plaquetária. No parasita Schistosoma mansoni nosso grupo identificou e clonou o gene da ATPDase1, e a proteína foi localizada na superfície do tegumento. Recentemente, clonamos o gene da ATPDase2 usando a informação do banco de dados de ESTs de S. mansoni e imunolocalizamos a sua proteína também no tegumento. ATPDase2 foi encontrada em ambas as membranas do tegumento basal e apical juntamente com a ATPDase1, entretanto ATPDase2 somente foi encontrada no espaço sincicial do tegumento. A presença de ambas as enzimas sobre a superfície externa do tegumento sugere um maior papel sobre a regulação de abundância de nucleotídeos. Análise da expressão de ambos os genes foram realizadas por RT- PCR em tempo real usando RNA de ovos, miracídeo, cercária, esquistossômulo e verme adulto. Os resultados mostraram que o gene da ATPDase1 foi mais expresso em ovos (7 vezes), adulto (6 vezes), cercária (3,5 vezes) e esquistossômulo (1,5 vezes) quando comparado ao miracídio, que foi tomado como referência. O gene da ATPDase2 foi mais expresso em ovos (16 vezes), cercária (11 vezes), miracídio (7 vezes) e verme adulto (2 vezes) quando comparado a esquistossômulo, mostrando que ambos os genes são modulados ao longo de seus estágios de ciclo de vida . Para maior caracterização destas enzimas, elas foram expressas heterologamente na levedura Pichia pastoris como proteínas de fusão com cauda de 6 histidinas e as proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade com resina de Ni-NTA. As ATPDases recombinantes foram obtidas de forma ativa e medições de atividade enzimática foram realizadas. ATPDase1 - mostrou atividades ATPásica e ADPásica em torno de 650 e 160 nmoles Pi.min -1. mg-1 , respectivamente. ATPDase2 teve atividades ATPásica e ADPásica na faixa de 1050 e 250 nmoles Pi.min-1.mg-1 , respectivamente. Adicionalmente, atividades UTPásica e UDPásica também foram encontradas nestas enzimas. Estudos de dicroísmo circular com estas duas enzimas elucidaram suas estruturas secundárias. Com isto, ATPDase1 (S66 to Q507 ) teve alfa-hélice (7 %), folha-beta (45 %) e estrutura randômica (48 %), e a ATPDase2 (N83 a K564 ) mostrou conter alfa-hélice (14 %), folha-beta (33 %) e estrutura randômica (53 %). Nós mostramos que a ATPDase2 é secretada pelo parasita no meio, de forma similar como descrito para as ATP-difosfohidrolases humanas CD39L2 e CD39L4. Adicionalmente, em ensaios de inibição de penetração (cercária em camundongo) usando anticorpo anti- ATPDase1 foi mostrada uma redução em 20 % da capacidade de penetração através da pele das cercárias previamente incubadas com o anti-soro. Devido a que a expressão do gene da ATPDase2 estava mais alta em miracídio e cercária, estágios que infectam caramujos e humanos, respectivamente, postulamos que ATPDase2 poderia ajudar no processo de invasão do parasita. No estágio ovo ambos os genes estão altamente expressados sugerindo um possível envolvimento das ATPDases na resposta de proteção contra o sistema imune humano. Ensaios de proteção contra S. mansoni em camundongos, usando as ATPDases 1 e 2 como antígenos, resultaram em uma baixa proteção obtendo-se não mais que 20% na redução da carga parasitária. / ATPDases or ATP-diphosphohydrolases are enzymes that cleave ATP and ADP to AMP and Pi and are involved in inhibition of platelet aggregation. In the parasite Schistosoma mansoni our group had identified and cloned the ATPDase1 gene and localized the protein on the tegument surface. Recently, we cloned the ATPDase2 gene using S. mansoni EST databank information and we immunolocalized it also in the tegument. ATPDase 2 was found on both the apical and basal tegument membranes together with ATPDase1, but only ATPDse2 was found in the syncytium space of the tegument. The presence of both enzymes on the tegumental outer surface suggests a major role in regulation of nucleotides abundance. Expression analysis of both genes was performed by Real Time RT- PCR using RNA from eggs, miracidia, cercariae, schistosomula and adult worms. The results showed that ATPDase1 gene was more expressed in eggs (7-fold), adults (6-fold), cercariae (3.5-fold) and schistosomula (1.5-fold) when compared to miracidia, which was taken as the reference. ATPDase2 gene was more expressed in eggs (16-fold), cercariae (11-fold), miracidia (7-fold) and adult worms (2-fold) when compared to schistosomula, showing that both genes are modulated along the life cycle stages. For further characterization of these enzymes, they were expressed heterologously in the yeast Pichia pastoris as fusion proteins with hexa-histidine tags and the recombinant proteins were purified by Ni-NTA affinity chromatography. The recombinant ATPDases were obtained in active form and activity measurements were performed. ATPDase1 did show ATPase and ADPase activities about 650 and 160 nmoles Pi.min-1.mg-1 , respectively. ATPDase2 had ATPase and ADPase activities in the range of 1050 and 250 nmoles Pi.min-1.mg-1 , respectively. These results were obtained in the presence of calcium as cofactor. Additionally, UTPase and UDPase activities were found for both enzymes. Circular dichroism studies with these enzymes elucidated their secondary structures; ATPDase1 (S66 to Q507 ) has alpha helix (7%), beta sheet (45%) and random coil (48%), whereas ATPDase2 (N83 a K564 ) showed alpha helix (14%), beta sheet (33%) and random coil (53%). We found that ATPDase2 was secreted by the parasite to the medium, similar to what has been described for human CD39-L2 and CD39-L4 ATP-diphosphohydrolases. Additionally, a penetration assay (cercaria to mice) using antibody anti-ATPDase1 did show a decrease of 20% in the penetration capacity through mice skin of cercaria previously incubated with this antiserum. Because ATPDase2 gene expression was increased in miracidia and cercariae, the stages that infect snail and human, respectively, we postulate that ATPDase2 may help the parasite\'s invasion process. In the egg stage both genes were highly expressed suggesting a possible involvement of the ATPDases in the protection response of eggs against the human immune system. Assays of protection against S. mansoni in mice, using recombinant ATPDase1 and 2 as antigens, resulted in low protection obtaining no more than 20% of parasite burden reduction.

Um problema recorrente no desenvolvimento de vacinas de DNA e terapia gênica utilizando vetores não virais é a baixa eficiência de transfecção gênica. Isso ocorre devido às diversas barreiras físicas, enzimáticas e difusionais que o DNA precisa superar para chegar ao núcleo das células. Neste trabalho tem-se por objetivo o desenvolvimento de novos vetores não virais de entrega gênica, formados por DNA plasmidial (pDNA), proteínas (protamina ou T-Rp3) e nanopartículas de ouro (NPAu) na forma de complexos ternários. Para tal, NPAu\'s foram sintetizadas por redução com citrato de sódio, apresentando diâmetros entre 20,3 e 57,3 nm e potencial zeta entre -69,0 e +43,3 mV, dependendo das condições de síntese, a saber, das quantidades de citrato de sódio adicionadas e da ordem de adição dos reagentes. Em seguida, vetores compostos por pDNA-protamina/T-Rp3-NPAu foram formados, transfectados em células HeLa cultivadas in vitro, e a atividade da enzima repórter luciferase foi medida. Deste modo, a partir de variações em proporção mássica e tamanho de nanopartículas, foi possível obter complexos utilizando protamina e ouro com uma eficiência de transfecção 33 vezes melhor do que transfecções utilizando apenas protamina. Por outro lado, complexos contendo T-Rp3 e ouro se mostraram ainda mais eficazes na entrega, apresentando níveis de transfecção próximos ao do reagente comercial Lipofectamina. Ensaios de transfecção utilizando a droga nocodazol indicaram a importância dos microtúbulos no mecanismo de entrega gênica, e ensaios com a droga cloroquina evidenciaram que as nanopartículas de ouro atuam de maneira diferenciada no escape endossomal dos vetores não virais utilizados. Visando relacionar características físico-químicas com a eficiência de transfecção, alguns destes complexos foram caracterizados por espalhamento dinâmico de luz, em que complexos com protamina apresentaram tamanhos entre 116 e 363 nm e complexos com T-Rp3 apresentaram entre 135 e 307 nm e potenciais zeta entre +7,3 e +22,5 mV e +10,6 e +27,2 mV, respectivamente, dependendo das características das NPAu\'s. / A recurrent problem in the development of DNA vaccines and gene therapy using non-viral vectors is the low efficiency of transfection. That is due to the many physical, enzymatic and diffusional barriers that DNA must overcome to reach the cell nucleus. This work aims to develop novel non-viral vectors based on plasmid DNA (pDNA), proteins (protamine or recombinant T-Rp3) and gold nanoparticles (AuNP) as ternary complexes. For such, AuNP\'s were first synthesized via sodium citrate reduction, with diameters varying from 20,3 to 57,3 nm and zeta potentials between -69,0 and +43,3 mV, depending on synthesis conditions, changing the quantities of sodium citrate added and the order of addition of reagents. Vectors formed by pDNA-protamine/T-Rp3-AuNP were then formed, transfected and luciferase activity was measured. Thus, from variations on mass ratios and gold nanoparticle sizes, it was possible to obtain complexes with protamine and gold with a transfection efficiency 33 times higher than analog complexes using only protamine. Also, complexes containing T-Rp3 and gold showed an even higher delivery efficiency, with transfection efficiency close to Lipofectamine. Assays using nocodazole indicated the importance of microtubule in the gene delivery process and, whereas assays with chloroquine showed that gold nanoparticles act in a different way over endossomal escape of used non-viral vectors. Finally, some of these complexes were characterized with dynamic light scattering. Complexes with protamine were within the size ragne of 116 to 363 nm and complexes with T-Rp3 were within the size range of 135 to 307 nm. The zeta potential varied from +7,3 to +22,5 mV and from +10,6 to +27,2 mV, respectively, depending on the gold nanoparticles used.

Um dos principais limitantes do desenvolvimento de protocolos eficientes de terapia gênica e vacinação com DNA provém da baixa eficiência de transferência gênica por parte dos vetores não-virais. Isso surge, principalmente, pela dificuldade de transporte de DNA estrangeiro do exterior para o núcleo das células alvo, devido à presença de inúmeras barreiras. O principal objetivo do trabalho realizado foi o desenvolvimento e caracterização de novos vetores não virais multifuncionais, capazes de realizar eficientemente a entrega de material genético (DNA plasmidial, pDNA) ao núcleo de células de mamífero (HeLa). Para esse fim, complexos binários (CBs) foram formados combinando-se pDNA à protamina ou proteínas recombinantes (TRP3) anteriormente desenvolvidas por nosso grupo. Foi também estudado o encapsulamento destes CBs em lipossomas catiônicos, formados pelos lipídios EPC:DOPE:DOTAP, gerando então complexos pseudo-ternários (CPTs). Os estudos com a protamina revelaram que os CPTs formados apresentavam tamanhos relativamente pequenos (< 123 nm) e com valores de potencial zeta, variando de +22,8 mV a +36,3 mV, nas várias relações mássicas (pDNA:protamina) estudadas (1:0,5; 1:0,7, 1:0,9 e 1:1). Os ensaios de transfecção mostraram que o CPT na relação 1:0,5 (CB) obteve o melhor nível de transfecção das células (17,1%) com um nível de viabilidade celular de 73,2%. Os ensaios utilizando a TRP3 mostraram que os CPTs formados adquiriram tamanhos pequenos (< 134 nm) e valores de potencial zeta entre +36,8 mV e +11,9 mV dependendo da relação mássica do CB (1:1, 1:30 e 1:60). Os ensaios de transfecção mostram que os CPTs formados com a TRP3 aumentaram o nível de transfecção em todas as relações de pDNA-TRP3 usadas (1:1; 1:30 e 1:60). Vale ressaltar que nas relações mássicas 1:30 e 1:60 houve um aumento significativo na transfecção (25,2% e 24,5%, respectivamente). Os ensaios de citotoxicidade mostram que os CBs não afetaram a viabilidade célular, entretanto quando combinada ao lipossoma foi observado aumento da citotoxicidade. Finalmente, os resultados indicam que a TRP3 associada ao lipossoma (CPTs) aumenta a eficiência de entrega de pDNA sugerindo um efeito sinérgico entre essas duas moléculas na superação das várias barreiras físicas, químicas e difusionais encontradas na célula. / One of the major challenges on the development of efficient protocols for gene therapy and DNA vaccination is the low efficiency of gene transfer by non viral vectors. This is mainly attributed to the fact that, during the traffic to target cells nuclei, plasmid vectors must overcome a series of physical, enzymatic and diffusional barriers. The objective of this work was the development and characterization of new multifunctional non-viral vectors, based on lipids and proteins, able to delivery efficiently the foreign pDNA (plasmid DNA) to the nucleus of mammalian cells. A model pDNA containing the reporter gene GFP was complexed to protamine or the recombinant protein (TRP3), forming binary complexes (BC). In addition, we studied the ability of the cationic liposomes (EPC:DOPE:DOTAP) to encapsulate this binary complexes to form pseudo-ternary complexes (PTCs). The studies of size (DLS) and zeta potential revealed that both proteins were able to condense pDNA to form small complexes (BCS and PTCs) (~100 nm) and positively charged (+11,9 mV a +36,8 mV), both interesting characteristics for transfections. However, the CPTs formed by TRP3 was that showed the highest transfections level (25,3%). The cytotoxicity assays indicated the BCs had a low effect on the cell viability. On the other hand, the biggest effect on cell death was found when PTCs were used. The results indicated the TRP3 associated to liposomes (PTCs) increased the delivery efficiency due to differences in the intracellular trafficking, suggesting a synergic effect between these different molecules in the vector in order to overcome the barriers found inside the cell.

A leptospirose é uma zoonose de importância global causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira. Foi avaliado o potencial adjuvante da flagelina FliCi de Salmonella enterica sorovar Thyphimurium na indução de resposta imunoprotetora em uma formulação vacinal acelular composta pela proteína LigAc e por seis prováveis lipoproteínas de membrana externa recombinantes de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni como alternativa profilática. Grupos de hamsters imunizados com LigAc co-administrada com o pool das proteínas acrescidas de FliCi ou Al(OH)3 apresentaram altos títulos de anticorpos contra as proteínas recombinantes e foram protegidos do desafio letal (86-100%). Grupos imunizados com vacina comercial, bacterina ou pool+LigAc+FliCi apresentaram redução na colonização renal (0-28%). Dados sugerem aumento da expressão dos genes das citocinas de resposta Th1/Th2. Os resultados demonstram que novas formulações vacinais, compostas por proteínas recombinantes e flagelina FliCi como adjuvante, é um caminho promissor. / Leptospirosis is a global zoonotic disease caused by pathogenic spirochetes of the genus Leptospira. In the present study, we evaluated the adjuvant activity of Salmonella enterica FliCi flagellin in the protective immunity induced by the LigAc and also by six other novel recombinant leptospiral outer membrane lipoproteins (OMP) of Leptospira interrogans serovar Copenhageni. Immunization of hamsters with LigAc or LigAc coadministered with OMPs cocktail, both with FliCi or Al(OH)3, induced robust antibody responses against recombinant proteins, and conferred protection after challenge (86-100%). Moreover, only groups inoculated with the commercial vaccine, bacterin or LigAc coadministered with OMPs cocktail and FliCi as adjuvant showed reduced bacterial load in kidneys (0-28%) with significant enhancement of gene expression of both Th1 and Th2 cytokines. Taken together, our data pave the way for the development of novel vaccine formulations against leptospirosis, using recombinant proteins and FliCi as adjuvant.

Visando novos estudos com a proteína amilóide sérica A (SAA), propusemos a produção de seu recombinante humano em Escherichia coli, mais especificamente, a isoforma encontrada na fase aguda (A-SAA1) e da constitutivamente expressa (C-SAA4). Realizamos a expressão, identificação e purificação das proteínas recombinantes. Concomitantemente, também avaliamos o efeito da hipóxia na expressão e produção da proteína SAA nativa em linhagens de pré-adipócitos murinos 3T3-L1, não diferenciados e diferenciados e adipócitos humanos. Aparentemente quanto maior o grau de diferenciação celular, maior a expressão e produção da proteína. Para os adipócitos humanos, o perfil de expressão de mRNA da SAA mostra que SAA1>SAA2>SAA4 nas relações 500:150:1. Na hipóxia, há um aumento na expressão de SAA, entretanto não associamos esta expressão a um aumento da concentração da proteína. A importância do reconhecimento de que SAA pode ser umas das proteínas induzidas pela hipóxia em adipócitos é discutida em relação ao seu papel pró-inflamatório. / In order to provide more complex studies with the protein serum amyloid A (SAA), this study proposed the production of its human recombinant in bacteria (Escherichia coli), more specifically, the synthesis of the main isoform found in the acute phase (A-SAA1) and the constitutively expressed (C-SAA4). The expression, identification and purification of the recombinants proteins was performed. Concurrently, we also did a study evaluating the effect of hypoxia in the expression and protein production of native SAA in undifferentiated and differentiated murine preadipocytes 3T3-L1 and humans adipocytes. Apparently, the protein expression and production increases with the cell differentiation degree. For human adipocytes, we demonstrated the mRNA expression profile of SAA, in which SAA1 > SAA2 > SAA4 (500:150:1). In hypoxia, there is an increased expression of SAA, but we could not link it to an increase of protein concentration. The importance of recognizing that SAA may be one of the proteins induced by hypoxia in adipocytes is discussed in relation to the proinflammatory role of this protein.