Bordetella pertussis, o agente etiológico da coqueluche ou tosse comprida, que estabelece a infecção através da fixação bacteriana no epitélio do trato respiratório superior. Os principais mediadores de adesão da bactéria são a toxina pertússica (PT) e a hemaglutinina filamentosa (FHA). A FHA é a adesina majoritária e contém pelo menos 4 domínios: porção Nterminal, domínio de reconhecimento de carboidrato (CRD) (FHA1141-1279), trinca de aminoácidos Arginina-Glicina-Ácido aspártico (RGD) (FHA1097-1099) e o sítio de ligação a heparina (domínio Hep) (FHA442-863). Neste trabalho, foi realizado a amplificação de duas regiões do domínio de ligação à heparina, as regiões MAL80 (FHA299-873) e HEP (FHA430-873). As regiões foram amplificadas, clonadas no vetor de expressão pAE, expressas utilizando a cepa BL21 SI de E. coli e purificadas. A proteína HEP purificada de E. coli possui baixa afinidade por heparina e não é capaz de aglutinar hemácias. A proteína recombinante HEP purificada foi utilizada para a produção de anticorpos. Através do experimento de ELISA foi demonstrado que o anti-soro anti-HEP é capaz de reconhecer além da região HEP, a região MAL80 e a proteína FHA. Estes resultados foram confirmados por experimentos de Western. Neste período também foi realizada a amplificação do domínio HEP de FHA e da subunidade S1 da toxina pertússica (PT) de B. pertussis através do método de TAP Express. Este método envolve duas reações de PCR e no final do processo é obtido um fragmento que contém uma região promotora (CMV), uma seqüência codificadora e uma região terminadora (SV40), que está pronto para ser introduzido e expresso em animais. De posse deste material e da proteína recombinante HEP, foi realizado o desafio intracerebral com Bordetella pertussis e através do monitoramento dos camundongos foi observado que nenhum dos candidatos testados foi capaz de proteger os animais contra B. pertussis. Foi realizado também a expressão do domínio Hep em lactobacilos, visando um possível sistema de imunizações de mucosas. Os anticorpos produzidos nos camundongos imunizados com a proteína HEP expressa em E. coli, lactobacilos e por vacina de DNA foram capazes de inibir a hemaglutinação promovida pela proteína FHA. / Bordetelfa pertussis, the agent of whopping cough, establishes infection by attaching to the ciliated epithelial cells of the respiratory tract. The bacterial adherence is mediated by pertussis toxin and filamentous hemagglutinin (FHA). FHA is the major adhesin of B. pertussis and displays multipie adherence activities. FHA contains four distin\'ct domains that exhibit specific affinities for different ligands or receptor, the amino-terminal end, the RGD triplet (FHA1097-1099), the lectin domain (FHA1141-1279) and the heparin-binding domain (FHA442-863). In this study, two overlapping regions of the heparin-binding domain, Mal80 (FHA299-873) and Hep (FHA442-873), were amplified by peR and subcloned in pAE expression vectors for E. coli. The fusion proteins in pAE were transformed in E. coli BL21 SI, induced with NaCI 0,3 M and purified using a nickel-charged metal chelating resin. The purified protein has low heparin affinity and does not have hemagglutination activity. The purified protein HEP was used to produce polyclonal antibodies in mouse. The anti-HEP antibodies are able to recognize the HEP, MAL80 and FHA proteins in ELISA and western assays, but anti-FHA only recognized the FHA protein. The genetically detoxified S1 subunit of pertussis toxin and Hep domain were amplified by the TAP Express method. There are two PCR reactions involved in the TAP processo At the end of the process the fragment of interest will carry a CMV promoter and a SV40 terminator and is ready to be introduced into animals or cell by transfection. Groups were immunized with proteins and/or DNA, challenged i.c. with a lethal dose of live Bordetelfa pertussis and the survival was monitored. No groups were protected against the challenge. The recombinant protein HEP were also expressed in Lactobacilfus aiming the development of potential mucosal vaccines. The polyclonal antibodies produce in mouse immunized with DNA and protein Hep expressed in E. coli and Lactobacillus were able to inhibition the FHA hemagglutination activity.

Animais hematófagos possuem em sua saliva substâncias que permitem a fluidez do sangue, para o sucesso de sua alimentação. Com isso, têm sido descritos diversos componentes com atividades nos diferentes processos hemostáticos (coagulação, fibrinólise e agregação plaquetária). O complexo salivar da sanguessuga Haementeria depressa vem sendo estudado através de bioquímica clássica e análises transcriptômica e proteômica deste tecido determinaram o perfil dos transcritos e das proteínas produzidas. Dentre os transcritos mais abundantes foram encontrados três clones (H06A09, H06A02 e L02F02) que apresentaram 45%, 87% e 94% de similaridade ao LAPP, um inibidor de agregação plaquetária da sanguessuga Haementeria officinallis, a produção destes componentes pelo tecido foi confirmada pela análise proteômica. O LAPP é um inibidor que age pela via do colágeno e possui cerca de 14 kDa e pI de 4,0 e inibe a ligação da plaqueta ao colágeno tanto pelo epítopo do FvW quanto pelo domínio <font face=\"Symbol\">a2<font face=\"Symbol\">b1. Assim, o objetivo do presente trabalho foi clonar, expressar e caracterizar a proteína recombinante ativa, a partir do clone H06A09 para estudos de atividade desta molécula. Para obter a proteína recombinante de interesse inicialmente a clonagem do transcrito foi realizada com sucesso em vetor pAE, porém, a expressão em sistema procarioto apresentou alguns obstáculos já que a molécula não tinha atividade. Uma nova estratégia foi proposta, sendo realizada clonagem em vetor pPIC9K e expressão em sistema eucariótico (leveduras Pichia pastoris - GS115). Após a utilização de diferentes metodologias para estabelecimento das melhores condições para expressão neste sistema, foi eleito o protocolo onde a proteína recombinante era expressa a 28 °C, sob agitação de 260 rpm, e indução por 0,5% de Metanol a cada 24h, durante 72h de expressão. A molécula recombinante expressa e secretada foi submetida a diferentes metodologias para purificação, assim, determinou-se que a estratégia utilizada que melhor isolou a proteína foi a submissão do sobrenadante da expressão à diálise e concentração em sistema de ultrafiltração (Amicon 5 kDa Millipore) seguida de uma cromatografia de gel filtração em Superdex 75 (GE), sistema FPLC, com coleta fracionada. Ensaios de agregação plaquetária confirmaram a atividade inibitória da proteína recombinante tanto em sangue total como em PRP (plasma rico em plaqueta) e plaqueta lavada, especificamente quando o agonista era o colágeno, apresentando IC50 para PRP e plaqueta lavada de 20 e 712 ng, respectivamente. Ensaios por citometria de fluxo indicaram que a proteína recombinante, diferente do LAPP, age na inibição da agregação plaquetária induzida por colágeno, pela ligação à subunidade Ib<font face=\"Symbol\">a do complexo GPIb-IX-V, complexo este que usa o FvW como ponte entre a plaqueta e o colágeno, firmando assim a interação da plaqueta ao subendotélio e posterior agregação. Desta forma, o presente trabalho caracteriza o primeiro inibidor recombinante de agregação plaquetária pela via do colágeno proveniente de sanguessugas Haementeria depressa, e comprova que apesar de apresentar 45% de similaridade estrutural ao LAPP é um inibidor com características funcionais diferentes, e com grande potencial a ser estudado. / Hematophagous animals have in their saliva substances that maintain the blood fluidity to the success of their feeding. Therefore, components have been described by their activities in the hemostatic processes (coagulation, fibrinolysis and platelet aggregation).The salivary complex of Haementaria depressa leech has been studied by classical biochemical and transcriptomic and proteomic analysis of this tissue determined the profile of transcripts and proteins produced by it. Among the most abundant transcripts were found three clones (H06A09, H06A02 e L02F02) that showed 45%, 87% e 94% of similarity to LAPP, an inhibitor of platelet aggregation from Haementeria officinallis, the components production was confirmed by proteomic analysis. LAPP is a inhibitor that acts by collagen pathway and has around 14 kDa and pI of 4.0, and inhibits the binding of platelet to collagen by both the epitope domain of vWF as the <font face=\"Symbol\">a2<font face=\"Symbol\">b1. Thereby, the aim of this study was to clone, express and characterize the active recombinant protein from the clone H06A09 for studies of activity of this molecule. To obtain the recombinant protein initially cloning of transcript was successfully performed in pAE vector, however, the protein expressed in prokaryotic system presented some obstacles not presenting activity. A new strategy was proposed, being held in pPIC9K vector and expression in eukaryotic system - yeast Pichia pastoris (GS115). After using different methodologies to establish the best conditions for expression in this system, was elected the protocol where the recombinant protein was expressed in 28 °C, under agitation of 260 rpm, and 0.5% methanol induction every 24 hours during 72 hours of expression. The recombinant molecule was expressed in soluble portion and was subjected to differents methods for purification, so it was determined that the best strategy to isolation of the protein was the concentration and dialysis of the expression supernatant by ultrafiltration system (Amicon 5 kDa Millipore) followed by gel filtration chromatography on Superdex 75 (GE), FPLC system. Tests confirmed the platelet aggregation inhibitory activity of the recombinant protein in whole blood, PRP (platelet rich plasma) and in washed platelets, specifically when the agonist was collagen, with IC50 to PRP and washed platelet of 20 and 712 ng, respectively. Assays by flow cytometry indicated that the recombinant protein, different from LAPP, acts to inhibit platelet aggregation induced by collagen, by the binding to the Ib<font face=\"Symbol\">a subunit of the GPIb-IX-V complex, this complex uses the vWF as a bridge between the platelet and collagen, thus firming the interaction of the subendothelium and subsequent platelet aggregation. Thus, this study characterized the first recombinant inhibitor of platelet aggregation through collagen pathway from Haementeria depressa leeches, and proves that despite having 45% structural similarity to the LAPP is an inhibitor with different functional characteristics, and with great potential to be studied.

O HPV (Papilomavírus Humano) causa verrugas anogenitais e alguns tipos de câncer, como o câncer de colo do útero. Seu capsídeo é composto pelas proteínas L1 e L2. A L1 se autoestrutura em VLPs, utilizadas nas atuais vacinas comerciais. Para a geração de vacinas com maior espectro de proteção, a L2 é promissora, pois gera proteção cruzada. Para caracterizar VLPs de L1L2 do HPV16, células HEK293T cotransfectadas tiveram a expressão proteica analisada por citometria de fluxo, Western blotting, microscopia confocal a laser e eletrônica de transmissão. As proteínas L1 (60kDa) e L2 (100kDa) estavam presentes no núcleo e no citoplasma celular, formando VLPs de L1L2 de conformação heterogênea, cuja máxima expressão ocorre 12h após a transfecção. As VLPs extraídas estavam em diferentes estágios de estruturação. Foi possível estabelecer um sistema eficaz de produção heteróloga das proteínas de VLPs de L1L2, que poderão ser utilizadas em testes pré-clínicos, na pesquisa básica e contribuir no desenvolvimento de uma vacina profilática de amplo espectro de ação contra o HPV. / HPV (Human Papillomavirus) is the causative agent of anogenital warts and several types of cancer, as cervical cancer. The HPV capsid is composed of L1 and L2 proteins. L1 can self-assemble into VLPs (virus-like particles), the basis for HPV commercially available vaccines. To generate broad-spectrum vaccines L2 shows the greatest promise, due to cross-protection. To characterize VLPs composed of HPV16 L1 and L2 proteins, cotransfected HEK293T cells were analyzed by flow cytometry, confocal laser scanning microscopy, transmission electron microscopy and Western blotting. Proteins L1 (60kDa) and L2 (100kDa) were present in cell nucleus and cytoplasm, forming heterologous L1L2 VLPs with highest expression at 12h post-transfection. Extracted VLPs were at different maturation stages. It was possible to establish an efficient system of heterologous L1, L2 and L1L2 VLPs production. After some adjustments in protocols, these particles could be used in preclinical tests, HPV basic research and also in the development of an HPV broad-spectrum vaccine.

O presente trabalho propõe o desenvolvimento e a caracterização de uma estratégia vacinal de caráter profilático contra o vírus da dengue (VD), baseada nas proteínas NS1 e domínio III da proteína E (EIII), empregando proteínas recombinantes em ensaios de imunização por via sub-cutânea em modelo murino. Estes antígenos foram obtidos pela clonagem e expressão de suas sequências de DNA codificadoras em sistema procarioto (E. coli). Além disso, formas atóxicas da toxina termo-lábil (LTG33D e LTK63) de E. coli enterotoxigência (ETEC) foram obtidas e incorporadas como adjuvantes às formulações vacinais. As respostas celulares e humorais anti-NS1 e anti-EIII foram monitoradas por ELISA para anticorpos e citocinas, ICS (do inglês intracellular citokine staining) e atividade citotóxica in vivo. Observamos que animais imunizados com a NS1 recombinante adicionada da LTG33D foram capazes de gerar respostas imunológicas com produção de anticorpos específicos e alta afinidade pelo antígeno. Em ensaios de desafio realizados para avaliar a proteção vacinal conferida à infecção por uma linhagem referência do o VD tipo 2 (NGC) observamos que essa formulação conferiu uma proteção de 50% aos animais imunizados. Paralelamente a esses resultados, demonstramos que a EIII não é um bom antígeno vacinal e que pode induzir anticorpos capazes de acentuar a infecção do VD. Descrevemos ainda a obtenção e a caracterização genética e patológica de um isolado clínico de VD tipo 2 naturalmente letal para camundongos Balb/C. A nova cepa viral (JHA1) demonstrou ser capaz de induzir perda de peso corporal, dano tecidual geral, e distúrbios hematológicos similares aos observados em humanos infectados pelo VD, podendo ser aplicada como modelo de infecção na avaliação de candidatos vacinais. Os resultados obtidos neste trabalho representam uma importante contribuição na área de desenvolvimento de estratégias vacinais contra a dengue e representam uma base importante para futuros estudos sobre a patologia da dengue. / The present study proposes the development and characterization of a strategy for prophylactic vaccination against dengue virus (VD) based on the NS1 protein and the domain III of the envelope glycoprotein (EIII), using recombinant proteins in subcutaneous immunization in a murine model. These antigens were obtained by cloning and expression of their DNA coding sequences in prokaryotic system (E. coli). In addition, the s non-toxic forms of the heat-labile toxin from enterotoxigenic E. coli (ETEC) (LTK63 and LTG33D) were obtained and incorporated as adjuvants to vaccine formulations. Anti-NS1 and anti-EIII cellular and humoral immune responses were monitored by antibody and cytokine ELISA, , intracellular citokine staining (ICS) and in vivo cytotoxic activity. We observed that animals immunized with the recombinant NS1 and LTG33D were capable to induce immune responses including specific antibodies with high affinity for the antigen. In challenge assays performed to evaluate the immunization protective efficacy such vaccine conferred protection of 50% against infection with a reference type 2 VD (VD2) strain(NGC). Alongside to these results, we demonstrated that EIII is not a good vaccine antigen and can induce the generation of antibodies that enhance DENV infection. We also described the isolation and the genetic and pathological characterization of a VD2 clinical isolate naturally lethal to immunocompetent Balb/c mice. The new strain was shown to cause weight loss, general tissue damage, and hematological disturbances similar to those observed in VDinfected humans, and therefore, may be applied as infection model to evaluate vaccine candidates. The results obtained in this study represent an important contribution to DENV vaccine development and established an important background for future studies of the dengue pathology.

O Lopap é um ativador de protrombina da lagarta L. obliqua, pertence à família das lipocalinas e apresenta atividade antiapoptótica. O Lopap foi obtido na forma recombinante (rLopap), na levedura P. pastoris, por metodologia escalonável, e sua atividade foi avaliada in vitro e in vivo. O tratamento com rLopap reduziu o tempo de sangramento em animais anticoagulados com enoxaparina. Por outro lado, um peptídeo derivado do Lopap, designado antiapoptotic peptide (AP), foi capaz de induzir a síntese de colágeno em cultura de fibroblastos e na derme de animais. A região correspondente a AP apresentou propriedades físicas e estruturais semelhantes a seqüências relacionadas em outras lipocalinas com atividade antiapoptótica. Estes resultados abrem perspectivas para aplicações do Lopap, como uma molécula procoagulante, e de AP, através de sua ação na modulação celular, como um componente cosmético, no reparo e remodelamento tecidual e em disfunções que envolvem morte celular e perda de colágeno. / Lopap is a prothrombin activator from the L. obliqua caterpillar, belongs to the lipocalin family, and displays antiapoptotic activity. Lopap was obtained in the recombinant form (rLopap) in the P. pastoris yeast, by a scaled up methodology, and its activity was evaluated in vitro and in vivo. Treatment with rLopap reduced the bleeding time in animals anticoagulated with enoxaparin. On the other hand, a Lopap-derived peptide, designated antiapoptotic peptide (AP), was able to induce collagen synthesis in fibroblast culture and in the animal dermis. The region corresponding to AP had similar physical and structural properties when compared with other antiapoptotic lipocalins. These results open perspectives for the use of Lopap, as a procoagulante molecule, and the use of AP, based on its cell modulation effects, as a cosmetic component, aiding tissue repair and in dysfunctions involving cell death and loss of collagen.

A leptospirose é uma zoonose de importância mundial causada por bactérias do gênero Leptospira. No Brasil, a maioria dos casos é causada por L. interrogans sorovar Copenhageni. O objetivo destre trabalho foi identificar adesinas de leptospira pela técnica de Phage display. Bibliotecas com fragmentos genômicos resultaram na idendificação de ligantes de leptospira com afinidade por tecidos de hamster. Uma varredura dessas bibliotecas contra heparan sulfato proteoglicano (HSPG) identificou como ligantes as proteínas LigA e LigB. Proteínas recombinantes foram produzidas e submetidas à ligação às células de mamíferos e aos componentes de matriz extracelular. LigB recombinante foi capaz de se ligar ao HSPG, à heparina e às células de mamíferos. HSPG e heparina foram capazes de reduzir significativamente a interação dessa proteína com as células. Estes resultados evidenciam o papel de proteínas da leptospira na sua interação com o hospedeiro e ilustram a possibilidade do uso da técnica de phage display para identificar possíveis adesinas. / Leptospirosis is a worldwide important zoonosis caused by bacteria of the genus Leptospira. In Brazil, most cases is caused by L. interrogans serovar Copenhageni. Our goal was to identify leptospiras adhesins by phage display technique. Libraries of genomic fragments resulted in the identification of ligands with affinity for leptospiras hamster tissues. Screening these libraries against heparan sulfate proteoglycan (HSPG) identified the proteins LigA and LigB. Recombinant proteins were produced and subjected to binding to mammalian cells and extracellular matrix components. LigB recombinant was able to bind to HSPG, heparin and mammalian cells. HSPG and heparin were able to significantly reduce the interaction of this protein with cells. These results highlight the role of leptospiras proteins in its interaction with the host and illustrate the possibility of the use of phage display technique to identify potential adhesins.

El trabajo de tesis consta de tres bloques: 1) la caracterización de dos proteínas (BatA y BatB) codificadas en el genoma de Leptospira interrogans; 2) el estudio del rol de los neutrófilos durante la infección con Leptospira interrogans, utilizando un modelo de leptospirosis murina experimental; 3) el análisis de la relación entre el polimorfismo Arg753Gln del TLR2 humano y la leptospirosis.

La tos convulsa es una enfermedad aguda, respiratoria y altamente contagiosa que a pesar de ser inmunoprevenible, hoy en día es considerada una enfermedad resurgente. Surge entonces la necesidad de aplicar refuerzos de inmunización de forma de prolongar la duración de la inmunidad contra la enfermedad, así como también de mejorar las vacunas actuales de manera tal que no solo ofrezcan una protección duradera en el tiempo sino que también protejan contra cepas circulantes antigénicamente distintas. Es por esto que la inclusión de antígenos expresados por cepas circulantes en las formulaciones vacunales podría ofrecer una mejora en el control de esta enfermedad Por otra parte, ante las vacunas parenterales convencionales, una vacuna mucosal podría ser una alternativa válida para mejorar las vacunas existentes, ya que imita a la infección natural y puede prevenir la colonización de B. pertussis mediante la generación de anticuerpos en la mucosa. Sin embargo, la inducción de una respuesta inmune protectora es difícil de lograr mediante inmunización por vía mucosal con antígenos recombinantes solubles. Es por ésto que el uso correcto de adyuvantes es fundamental a la hora de diseñar vacunas recombinantes administradas por vía de mucosas. En este sentido, se ha demostrado que la subunidad B de la toxina colérica es un potente inmunoestimulador que puede actuar como adyuvante estimulando la respuesta inmune sistémica y de mucosas contra antígenos administrados por vía mucosal, además de ser seguro para su uso en humanos. Con el objetivo de contribuir al desarrollo de una vacuna recombinante acelular para la mejora de la prevención de la infección por B. pertussis, el objetivo general de este trabajo fue generar herramientas moleculares que resulten útiles en el control de la infección causada por B. pertussis. Nuestro trabajo contempló la identificación, caracterización, y la validación de proteínas de B. pertussis como candidatos vacunales así como el estudio de la respuesta del huésped a dichas proteínas. Nuestra hipótesis es que proteínas recombinantes de B. pertussis fusionadas con CTB son buenos candidatos vacunales para ser utilizados por vía mucosal.

Made available in DSpace on 2016-06-28T12:15:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 320.pdf: 1676340 bytes, checksum: 711128ac80440a81a6bb4dc9ff8ef57b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2012 / Made available in DSpace on 2016-07-05T22:00:06Z (GMT). No. of bitstreams: 3 320.pdf.txt: 125592 bytes, checksum: 94d4fa2436a2862cb43733491b5ab4ce (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 320.pdf: 1676340 bytes, checksum: 711128ac80440a81a6bb4dc9ff8ef57b (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A Filariose Linfática (FL) no Brasil é causada pela espécie Wuchereria bancrofti e consiste em um problema de saúde pública. O principal foco ativo de transmissão atualmente no país é a Região Metropolitana do Recife - PE, que desde 2003 iniciou o Programa de Controle/Eliminação da FL, tendo como estratégia principal o Tratamento Coletivo (TC) com Dietilcarbamanzina (DEC). Este trabalho, aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães, analisou o TC nessas áreas, acompanhando 30 moradores, no período de 2003 a 2009. Para essa análise além das ferramentas tradicionais da pesquisa filarial - Filtração (MF/mL de sangue) e Antígeno Circulante Filarial (Og4C3) - também foi utilizada a pesquisa de anticorpos através de um antígeno recombinante (Bm14). Essa nova metodologia desenvolvida é recomendada para ser empregada como uma forma de avaliar o progresso dos programas de controle e eliminação da FL nas áreas sob intervenção. Os resultados obtidos indicam redução na positividade para a FL pelas três metodologias: o Bm14 reduziu de 90 por cento para 80,00 por cento, o Og4C3 de 100 por cento para 60,00 por cento e a microfilaremia (MF) de 100 por cento para 0 por cento. A análise da densidade de MF/mL de sangue e a positividade para o Bm14 revelou que o grupo com maior densidade de MF/mL no sangue (= 57 MF/mL) apresentou maior percentual de redução na positividade para o anticorpo do que o grupo de menor densidade ( 57 MF/mL) em 2009. A taxa de anticorpos-positivos apresentou um percentual de redução de 11,11 por cento no último ano. A diminuição nas taxas de positividade apresentadas pelo Bm14 e o padrão de decaimento observado na análise das Densidades Óticas média e mediana do anticorpo durante os seis anos da pesquisa indicam que o monitoramento dos anticorpos com o antígeno recombinante Bm14 foi capaz de reconhecer indivíduos infectados e também de identificar redução dos níveis de anticorpos produzidos por eles após exposição aos parasitos filariais. Sugerindo que o TC com DEC teria surtido efeito na eliminação dos vermes adultos e conseqüente desaparecimento das microfilárias da circulação sanguínea

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissCLSP.pdf: 1835751 bytes, checksum: 94d92e1d4b14f4f8befcd6cb0b350de1 (MD5) Previous issue date: 2006-11-23 / Universidade Federal de Sao Carlos / Disintegrins are snake venom protein, of low molecular weight, rich in cysteines and RGDcontaining peptides that bind specifically to integrins &#945;IIb&#946;3, &#945;5&#946;1, and &#945;v&#946;3 expressed on platelets, endothelial and tumor cells. The biological effects of these peptides are related with biological process of cellular adhesion where receptors called integrins are presents. This dissertation describes the optimization of purification and additional characterization of a recombinant RGD-disintegrin of Bothrops alternatus, DisBa-01.. The DisBa-01 is a recombinant RGD-disintegrin, which interacts with &#945;IIb&#946;3 integrin, inhibiting platelet aggregation and proliferation of endothelial and some tumor cells. In this work, a new protocol of purification was proposed for most efficient purification of the DisBa-01. The recombinant disintegrin, DisBa-01, was expressed in an optimizedbacterial system (Escherichia coli BL21(DE3) pET28a+DisBa-01) and purified by affinity chromatography. In this new protocol, the product of the purification in nickel column is submitted ion exchange chromatography. The use of the ion exchange chromatography as second step for purification increased the purity degree and the protein yield. The purified protein had its N-Terminal portion sequenced in 20 amino acids residues and its molecular mass determined by mass spectrometry. The mass spectrometry assay confirmed the mass of the DisBa-01 as 11.658 Da. The RGD-disintegrin pure had the tag of polihistidinas removed with thrombin. The cleavage of the tag of histidinas with thrombin was efficient. Polyclonal antibodies against DisBa-01 have also been produced in mice. The reactivity of these antibodies was observed through imunoblotting. These results provided one better form of obtain the pure protein as well as significant additional information for a better characterization of recombinant RGDdisintegrin, DisBa-01, which could be useful for the study of RGD-disintegrin, recombinant or native, and integrin. / Desintegrinas são proteínas de veneno de serpentes, de baixo peso molecular, ricas em cisteína e em geral um peptídeo contendo o motivo RGD que liga especificamente a integrinas &#945;IIb&#946;3, &#945;5&#946;1, e &#945;v&#946;3 de plaquetas, células endoteliais e células tumorais. Os efeitos biológicos desses peptídeos estão relacionados com processos biológicos de adesão celular onde receptores denominados integrinas estão presentes. Esta dissertação descreve a otimização da purificação de uma desintegrina-RGD recombinante de Bothrops alternatus, DisBa-01, e a caracterização adicional desta proteína. A DisBa-01 é uma desintegrina-RGD recombinante que interage com a integrina &#945;IIb&#946;3 inibindo agregação plaquetária e proliferação de células endoteliais e algumas células tumorais. Neste trabalho, um novo protocolo de purificação foi proposto para a purificação mais eficiente da DisBa-01. A desintegrina, DisBa-01, foi expressa em um sistema bacteriano otimizado (Escherichia coli BL21(DE3)pET28a+DisBa-01) e purificada em coluna de afinidade. Neste novo protocolo, o produto da purificação na coluna de níquel é submetido à cromatografia de troca-iônica. O uso da cromatografia de troca-iônica aumentou o grau de pureza e o produto protéico final. A proteína purificada teve o N-terminal seqüenciado em 20 resíduos de aminoácidos. A massa molecular foi determinada por espectrometria de massa que confirmou como 11.658 Da a massa da proteína. A desintegrina-RGD pura teve a cauda de polihistidinas eficientemente removida com proteólise com trombina. Anticorpos policlonais contra DisBa-01 foram produzidos em camundongos. A reatividade desses anticorpos foi observada através de imunoblotting. Estes resultados estabelecem uma nova forma de obtenção da proteína pura, assim como informações adicionais significativas de uma melhor caracterização da desintegrina-RGD recombinante, DisBa-01, que pode ser útil para o estudo de desintegrinas- RGD, recombinantes ou nativas, e interações com integrinas.