Molecular interaction among proteins drives the cellular processes through the formation of complexes that perform the requisite biochemical function. While some of the complexes are obligate (i.e., they fold together while complexation) others are non-obligate, and are formed through macromolecular recognition. Macromolecular recognition in proteins is highly specific, yet it can be both permanent and non permanent in nature. Hallmarks of permanent recognition complexes include large surface of interaction, stabilization by hydrophobic interaction and other noncovalent forces. Several amino acids which contribute critically to the free energy of binding at these interfaces are called as “hot spot” residues. The non permanent recognition complexes, on the other hand, usually show small interface of interaction, with limited stabilization from non covalent forces. For both the permanent and non permanent complexes, the specificity of molecular interaction is governed by the geometric compatibility of the interaction surface, and the noncovalent forces that anchor them. A great deal of studies has already been performed in understanding the basis of protein macromolecular recognition.1; 2 Based on these studies efforts have been made to develop protein-protein docking algorithms that can predict the geometric orientation of the interacting molecules from their individual unbound states. Despite advances in docking methodologies, several significant difficulties remain.1 Therefore, in this thesis, we start with literature review to understand the individual merits and demerits of the existing approaches (Chapter 1),3 and then, we attempt to address some of the problems by developing methods to infer protein quaternary structure from the crystalline state, and improve structural and chemical understanding of protein-protein interactions through biological complex prediction. The understanding of the interaction geometry is the first step in a protein-protein interaction study. Yet, no consistent method exists to assess the geometric compatibility of the interacting interface because of its highly rugged nature. This suggested that new sensitive measures and methods are needed to tackle the problem. We, therefore, developed two new and conceptually different measures using the Delaunay tessellation and interface slice selection to compute the surface complementarity and atom packing at the protein-protein interface (Chapter 2).4 We called these Normalized Surface Complementarity (NSc) and Normalized Interface Packing (NIP). We rigorously benchmarked the measures on the non redundant protein complexes available in the Protein Data Bank (PDB) and found that they efficiently segregate the biological protein-protein contacts from the non biological ones, especially those derived from X-ray crystallography. Sensitive surface packing/complementarity recognition algorithms are usually computationally expensive and thus limited in application to high-throughput screening. Therefore, special emphasis was given to make our measure compute-efficient as well. Our final evaluation showed that NSc, and NIP have very strong correlation among themselves, and with the interface area normalized values available from the Surface Complementarity program (CCP4 Suite: <http://smb.slac.stanford.edu/facilities/software/ccp4/html/sc.html>); but at a fraction of the computing cost. After building the geometry based surface complementarity and packing assessment methods to assess the rugged protein surface, we advanced our goal to determine the stabilities of the geometrically compatible interfaces formed. For doing so, we needed to survey the quaternary structure of proteins with various affinities. The emphasis on affinity arose due to its strong relationship with the permanent and non permanent life-time of the complex. We, therefore, set up data mining studies on two databases named PQS (Protein Quaternary structure database: http://pqs.ebi.ac.uk) and PISA (Protein Interfaces, Surfaces and Assemblies: www.ebi.ac.uk/pdbe/prot_int/pistart.html) that offered downloads on quaternary structure data on protein complexes derived from X-ray crystallographic methods. To our surprise, we found that above mentioned databases provided the valid quaternary structure mostly for moderate to strong affinity complexes. The limitation could be ascertained by browsing annotations from another curated database of protein quaternary structure (PiQSi:5 supfam.mrc-lmb.cam.ac.uk/elevy/piqsi/piqsi_home.cgi) and literature surveys. This necessitated that we at first develop a more robust method to infer quaternary structures of all affinity available from the PDB. We, therefore, developed a new scheme focused on covering all affinity category complexes, especially the weak/very weak ones, and heteromeric quaternary structures (Chapter 3).6 Our scheme combined the naïve Bayes classifier and point-group symmetry under a Boolean framework to detect all categories of protein quaternary structures in crystal lattice. We tested it on a standard benchmark consisting of 112 recognition heteromeric complexes, and obtained a correct recall in 95% cases, which are significantly better than 53% achieved by the PISA,7 a state-of-art quaternary structure detection method hosted at the European Bioinformatics Institute, Hinxton, UK. A few cases that failed correct detection through our scheme, offered interesting insights into the intriguing nature of protein contacts in the lattice. The findings have implications for accurate inference of quaternary states of proteins, especially weak affinity complexes, where biological protein contacts tend to be sacrificed for the energetically optimal ones that favor the formation/stabilization of the crystal lattice. We expect our method to be used widely by all researchers interested in protein quaternary structure and interaction. Having developed a method that allows us to sample all categories of quaternary structures in PDB, we set our goal in addressing the next problem that of accurately determining stabilities of the geometrically compatible protein surfaces involved in interaction. Reformulating the question in terms of protein-protein docking, we sought to ask how we could reliably infer the stabilities of any arbitrary interface that is formed when two protein molecules are brought sterically closer. In a real protein docking exercise this question is asked innumerable times during energy-based screening of thousands of decoys geometrically sampled (through rotation+translation) from the unbound subunits. The current docking methods face problems in two counts: (i), the number of interfaces from decoys to evaluate energies is rather large (64320 for a 9º rotation and translation for a dimeric complex), and (ii) the energy based screening is not quite efficient such that the decoys with native-like quaternary structure are rarely selected at high ranks. We addressed both the problems with interesting results. Intricate decoy filtering approaches have been developed, which are either applied during the search stage or the sampling stage, or both. For filtering, usually statistical information, such as 3D conservation information of the interfacial residues, or similar facts is used; more expensive approaches screen for orientation, shape complementarity and electrostatics. We developed an interface area based decoy filter for the sampling stage, exploiting an assumption that native-like decoys must have the largest, or close to the largest, interface (Chapter 4).8 Implementation of this assumption and standard benchmarking showed that in 91% of the cases, we could recover native-like decoys of bound and unbound binary docking-targets of both strong and weak affinity. This allowed us to propose that “native-like decoys must have the largest, or close to the largest, interface” can be used as a rule to exclude non native decoys efficiently during docking sampling. This rule can dramatically clip the needle-in-a-haystack problem faced in a docking study by reducing >95% of the decoy set available from sampling search. We incorporated the rule as a central part of our protein docking strategy. While addressing the question of energy based screening to rank the native-like decoys at high rank during docking, we came across a large volume of work already published. The mainstay of most of the energy based screenings that avoid statistical potential, involve some form of the Coulomb’s potential, Lennard Jones potential and solvation energy. Different flavors of the energy functions are used with diverse preferences and weights for individual terms. Interestingly, in all cases the energy functions were of the unnormalized form. Individual energy terms were simply added to arrive at a final score that was to be used for ranking. Proteins being large molecules, offer limited scope of applying semi-empirical or quantum mechanical methods for large scale evaluation of energy. We, therefore, developed a de novo empirical scoring function in the normalized form. As already stated, we found NSc and NIP to be highly discriminatory for segregating biological and non biological interface. We, therefore, incorporated them as parameters for our scoring function. Our data mining study revealed that there is a reasonable correlation of -0.73 between normalized solvation energy and normalized nonbonding energy (Coulombs + van der Waals) at the interface. Using the information, we extended our scoring function by combining the geometric measures and the normalized interaction energies. Tests on 30 unbound binary protein-protein complexes showed that in 16 cases we could identify at least one decoy in top three ranks with ≤10 Å backbone root-mean-square-deviation (RMSD) from true binding geometry. The scoring results were compared with other state-of-art methods, which returned inferior results. The salient feature of our scoring function was exclusion of any experiment guided restraints, evolutionary information, statistical propensities or modified interaction energy equations, commonly used by others. Tests on 118 less difficult bound binary protein-protein complexes with ≤35% sequence redundancy at the interface gave first rank in 77% cases, where the native like decoy was chosen among 1 in 10,000 and had ≤5 Å backbone RMSD from true geometry. The details about the scoring function, results and comparison with the other methods are extensively discussed in Chapter 5.9 The method has been implemented and made available for public use as a web server - PROBE (http://pallab.serc.iisc.ernet.in/probe). The development and use of PROBE has been elaborated in Chapter 7.10 On course of this work, we generated huge amounts of data, which is useful information that could be used by others, especially “protein dockers”. We, therefore, developed dockYard (http://pallab.serc.iisc.ernet.in/dockYard) - a repository for protein-protein docking decoys (Chapter 6).11 dockYard offers four categories of docking decoys derived from: Bound (native dimer co-crystallized), Unbound (individual subunits as well as the target are crystallized), Variants (match the previous two categories in at least one subunit with 100% sequence identity), and Interlogs (match the previous categories in at least one subunit with ≥90% or ≥50% sequence identity). There is facility for full or selective download based on search parameters. The portal also serves as a repository to modelers who may want to share their decoy sets with the community. In conclusion, although we made several contributions in development of algorithms for improved protein-protein docking and quaternary structure inference, a lot of challenges remain (Chapter 8). The principal challenge arises by considering proteins as flexible bodies, whose conformational states may change on quaternary structure formation. In addition, solvent plays a major role in the free energy of binding, but its exact contribution is not straightforward to estimate. Undoubtedly, the cost of computation is one of the limiting factors apart from good energy functions to evaluate the docking decoys. Therefore, the next generation of algorithms must focus on improved docking studies that realistically incorporate flexibility and solvent environment in all their evaluations.

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Les changements évolutifs nous instruisent sur les nombreuses innovations permettant à chaque organisme de maximiser ses aptitudes en choisissant le partenaire approprié, telles que les caractéristiques sexuelles secondaires, les patrons comportementaux, les attractifs chimiques et les mécanismes sensoriels y répondant. L'haploïde de la levure Saccharomyces cerevisiae distingue son partenaire en interprétant le gradient de la concentration d'une phéromone sécrétée par les partenaires potentiels grâce à un réseau de protéines signalétiques de type kinase activées par la mitose (MAPK). La décision de la liaison sexuelle chez la levure est un événement en "tout–ourien", à la manière d'un interrupteur. Les cellules haploïdes choisissent leur partenaire sexuel en fonction de la concentration de phéromones qu’il produit. Seul le partenaire à proximité sécrétant des concentrations de phéromones égales ou supérieures à une concentration critique est retenu. Les faibles signaux de phéromones sont attribués à des partenaires pouvant mener à des accouplements infructueux. Notre compréhension du mécanisme moléculaire contrôlant cet interrupteur de la décision d'accouplement reste encore mince. Dans le cadre de la présente thèse, je démontre que le mécanisme de décision de la liaison sexuelle provient de la compétition pour le contrôle de l'état de phosphorylation de quatre sites sur la protéine d'échafaudage Ste5, entre la MAPK, Fus3, et la phosphatase,Ptc1. Cette compétition résulte en la dissociation de type « intérupteur » entre Fus3 et Ste5, nécessaire à la prise de décision d'accouplement en "tout-ou-rien". Ainsi, la décision de la liaison sexuelle s'effectue à une étape précoce de la voie de réponse aux phéromones et se produit rapidement, peut-être dans le but de prévenir la perte d’un partenaire potentiel. Nous argumentons que l'architecture du circuit Fus3-Ste5-Ptc1 génère un mécanisme inédit d'ultrasensibilité, ressemblant à "l'ultrasensibilité d'ordre zéro", qui résiste aux variations de concentration de ces protéines. Cette robustesse assure que l'accouplement puisse se produire en dépit de la stochasticité cellulaire ou de variations génétiques entre individus.Je démontre, par la suite, qu'un évènement précoce en réponse aux signaux extracellulaires recrutant Ste5 à la membrane plasmique est également ultrasensible à l'augmentation de la concentration de phéromones et que cette ultrasensibilité est engendrée par la déphosphorylation de huit phosphosites en N-terminal sur Ste5 par la phosphatase Ptc1 lorsqu'elle est associée à Ste5 via la protéine polarisante, Bem1. L'interférence dans ce mécanisme provoque une perte de l'ultrasensibilité et réduit, du même coup, l'amplitude et la fidélité de la voie de réponse aux phéromones à la stimulation. Ces changements se reflètent en une réduction de la fidélité et de la précision de la morphologie attribuable à la réponse d'accouplement. La polarisation dans l'assemblage du complexe protéique à la surface de la membrane plasmique est un thème général persistant dans tous les organismes, de la bactérie à l'humain. Un tel complexe est en mesure d'accroître l'efficacité, la fidélité et la spécificité de la transmission du signal. L'ensemble de nos découvertes démontre que l'ultrasensibilité, la précision et la robustesse de la réponse aux phéromones découlent de la régulation de la phosphorylation stoichiométrique de deux groupes de phosphosites sur Ste5, par la phosphatase Ptc1, un groupe effectuant le recrutement ultrasensible de Ste5 à la membrane et un autre incitant la dissociation et l'activation ultrasensible de la MAPK terminal Fus3. Le rôle modulateur de Ste5 dans la décision de la destinée cellulaire étend le répertoire fonctionnel des protéines d'échafaudage bien au-delà de l'accessoire dans la spécificité et l'efficacité des traitements de l'information. La régulation de la dynamique des caractères signal-réponse à travers une telle régulation modulaire des groupes de phosphosites sur des protéines d'échafaudage combinées à l'assemblage à la membrane peut être un moyen général par lequel la polarisation du destin cellulaire est obtenue. Des mécanismes similaires peuvent contrôler les décisions cellulaires dans les organismes complexes et peuvent être compromis dans des dérèglements cellulaires, tel que le cancer. Finalement, sur un thème relié, je présente la découverte d'un nouveau mécanisme où le seuil de la concentration de phéromones est contrôlé par une voie sensorielle de nutriments, ajustant, de cette manière, le point prédéterminé dans lequel la quantité et la qualité des nutriments accessibles dans l'environnement déterminent le seuil à partir duquel la levure s'accouple. La sous-unité régulatrice de la kinase à protéine A (PKA),Bcy1, une composante clé du réseau signalétique du senseur aux nutriments, interagit directement avec la sous-unité α des petites protéines G, Gpa1, le premier effecteur dans le réseau de réponse aux phéromones. L'interaction Bcy1-Gpa1 est accrue lorsque la cellule croit en présence d'un sucre idéal, le glucose, diminuant la concentration seuil auquel la décision d'accouplement est activée. Compromettre l'interaction Bcy1-Gpa1 ou inactiver Bcy1 accroît la concentration seuil nécessaire à une réponse aux phéromones. Nous argumentons qu'en ajustant leur sensibilité, les levures peuvent intégrer le stimulus provenant des phéromones au niveau du glucose extracellulaire, priorisant la décision de survie dans un milieu pauvre ou continuer leur cycle sexuel en choisissant un accouplement. / Evolution has resulted in numerous innovations that allow organisms to maximize their fitness by choosing particular mating partners, including secondary sexual characteristics, behavioural patterns, chemical attractants and corresponding sensory mechanisms. The haploid yeast Saccharomyces cerevisiae selects mating partners by interpreting the concentration gradient of pheromone secreted by potential mates through a network of mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling proteins. The mating decision in yeast is an all-or-none, or switch-like, response that allows cells to make accurate decisions about which among potential partners to mate with and to filter weak pheromone signals, thus avoiding inappropriate commitment to mating by responding only at or above critical concentrations when a mate is sufficiently close. The molecular mechanisms that govern the switch-like mating decision are poorly understood. In this thesis I demonstrate that the switching mechanism arises from competition between the MAPK Fus3 and a phosphatase Ptc1 for control of the phosphorylation state of four sites on the scaffold protein Ste5. This competition results in a switch-like dissociation of Fus3 from Ste5 that is necessary to generate the switch-like mating response. Thus, the decision to mate is made at an early stage in the pheromone pathway and occurs rapidly, perhaps to prevent the loss of the potential mate to competitors. We argue that the architecture of the Fus3–Ste5–Ptc1 circuit generates a novel ultrasensitivity mechanism that resembles “zero-order ultrasensitivity”, which is robust to variations in the concentrations of these proteins. This robustness helps assure that mating can occur despite stochastic or genetic variation between individuals. I then demonstrate that during the mating response, an early event of Ste5 recruitment to plasma membrane is ultrasensitive and that it is generated by dephosphorylation of eight N-terminal phosphosites on Ste5 by the phosphatase Ptc1 when associated with Ste5 via the polarization protein Bem1. Interference with this mechanism results in loss of ultrasensitivity and reduced amplitude and therefore fidelity of the pheromone signaling response. These changes are reflected in reduced fidelity and accuracy of the morphogenic mating response. Polarized assembly of signaling protein complexes at the plasma membrane surface is a general theme recapitulated in all organisms from bacteria to humans. Such complexes can increase the efficiency, fidelity and specificity of signal transduction. Together with our previous findings, our results demonstrate that ultrasensitivity, accuracy and robustness of the pheromone response occurs through regulation of the stoichiometry of phosphorylation of two clusters of phosphosites on Ste5, by Ptc1, one cluster mediating ultrasensitive recruitment of Ste5 to the membrane and the other, ultrasensitive dissociation and activation of the terminal MAP kinase Fus3. The role of Ste5 as a direct modulator of a cell-fate decision expands the functional repertoire of scaffold proteins beyond providing specificity and efficiency of information processing. Regulation of dynamic signal-response characteristics through such modular regulation of clusters of phosphosites may be a general means by which cell fate decisions are achieved. Similar mechanisms may govern cellular decisions in higher organisms and be disrupted in cancer. Finally, in a related theme, I present the discovery of a novel mechanisms by which the threshold of pheromone response is controlled by a nutrient-sensing pathway, thus adjusting the set-point at which the quantity and quality of nutrients available in the environment set the threshold of pheromone at which yeast will mate. The regulatory subunit of protein kinase A (PKA), Bcy1, a key component of a nutrient sensing signaling network, directly interacts with the α subunit of G-protein, Gpa1, the primary effector of the pheromone signaling network. The Bcy1-Gpa1 interaction is enhanced when cells are grown in their ideal carbon source glucose, lowering the threshold concentration at which the mating response is activated. Disruption of Bcy1-Gpa1 interaction or Bcy1 deletion increased the threshold concentration for the mating response. We argue that by adjusting their sensitivity, yeast can integrate pheromone stimulus with glucose levels and prioritize decisions to survive in a nutrient-starved environment or to continue their sexual cycle by mating.

La réparation de l’ADN par excision des nucléotides (NER) est un mécanisme capable de retirer une large variété de lésions causant une distorsion de la double hélice, comme celles causées par les rayons ultraviolets (UV). Comme toutes les voies de réparation de l’ADN, la NER contribue à la prévention de la carcinogénèse en prévenant la mutation de l’ADN. Lors de ce processus, il y a d’abord reconnaissance de la lésion par la protéine XPC/Rad4 (humain/levure) qui recrute ensuite TFIIH. Ce complexe déroule l’ADN par son activité hélicase et recrute l’endonucléase XPG/Rad2 ainsi que d’autres protéines nécessaires à l’excision de l’ADN. Lors de son arrivée au site de lésion, XPG/Rad2 déplace XPC/Rad4. TFIIH agit également lors de la transcription de l’ADN, entre autres par son activité hélicase. Outre cette similarité de la présence de TFIIH lors de la transcription et la réparation, il est possible de se demander en quoi les deux voies sont similaires. Nous nous sommes donc intéressés aux interactions impliquant TFIIH et la machinerie de réparation de l’ADN. Nous avons donc entrepris une caractérisation structurale et fonctionnelle de ces interactions. Nous avons découvert que Rad2 et Rad4 possèdent un motif d’interaction en nous basant sur d’autres interactions de la sous-unité Tfb1 de TFIIH. Par calorimétrie à titrage isotherme, nous avons observé que les segments de ces deux protéines contenant ce motif interagissent avec une grande affinité au domaine PH de Tfb1. Le site de liaison de ces segments sur Tfb1PH est très semblable au site de liaison du domaine de transactivation de p53 et au domaine carboxy-terminal de TFIIEα avec Tfb1PH, tel que démontré par résonance magnétique nucléaire (RMN). De plus, tous ces segments peuvent faire compétition les uns aux autres pour la liaison à Tfb1PH. Nous avons aussi démontré in vivo chez la levure qu’une délétion de Tfb1PH crée une sensibilité aux radiations UV. De plus, la délétion de multiples segments de Rad2 et Rad4, dont les segments d’interaction à Tfb1PH, est nécessaire pour voir une sensibilité aux rayons UV. Ainsi, de multiples interactions sont impliquées dans la liaison de Rad2 et Rad4 à TFIIH. Finalement, les structures des complexes Rad2-Tfb1PH et Rad4-Tfb1PH ont été résolues par RMN. Ces structures sont identiques entre elles et impliquent des résidus hydrophobes interagissant avec des cavités peu profondes de Tfb1PH. Ces structures sont très semblables à la structure de TFIIEα-p62PH. Ces découvertes fournissent ainsi un lien important entre la transcription et la réparation de l’ADN. De plus, elles permettent d’émettre un modèle du mécanisme de déplacement de XPC/Rad4 par XPG/Rad2 au site de dommage à l’ADN. Ces connaissances aident à mieux comprendre les mécanismes de maintient de la stabilité génomique et peuvent ainsi mener à développer de nouvelles thérapies contre le cancer. / The nucleotide excision repair pathway (NER) is a mechanism capable of removing a wide variety of helix-distorting lesions, such as those caused by ultraviolet irradiation (UV). As all DNA repair pathways, NER contributes to the prevention of carcinogenesis by preventing DNA mutation. During this process, the lesion is first recognized by the protein XPC/Rad4 (human/yeast), which then recruits TFIIH. This complex unwinds the DNA with its helicase activity and then recruits the endonuclease XPG/Rad2 and other proteins necessary for DNA excision. Upon arrival at the lesion site, XPG/Rad2 displaces XPC/Rad4. TFIIH also acts in DNA transcription, using its helicase activity. In addition to the similarity of the presence of TFIIH in transcription and DNA repair, it is possible to ask ourselves how the two pathways are similar. We were interested in the interactions involving TFIIH and the DNA repair machinery. We have therefore undertaken a structural and functional characterization of these interactions. We have found that Rad2 and Rad4 have a motif of interaction based on other interactions of the Tfb1 subunit of TFIIH. Using isothermal titration calorimetry, we found that segments of these two proteins containing this motif interact with high affinity to the PH domain of Tfb1. The binding site of these segments is very similar to Tfb1PH binding site of transactivation domain of p53 and the carboxyl-terminal domain of TFIIEα with Tfb1PH, as demonstrated by nuclear magnetic resonance (NMR). In addition, these segments can compete with each other for binding to Tfb1PH. We also demonstrated in vivo that deletion of Tfb1PH in yeast creates a sensitivity to UV irradiation. In addition, the deletion of multiple segments of Rad2 and Rad4, including segments of interaction Tfb1PH, is required to observe a sensitivity to UV. Thus, multiple interactions are involved in the binding of TFIIH to Rad2 and Rad4. Finally, the structures of the Rad2-Tfb1PH and Rad4-Tfb1PH complexes were solved by NMR. These structures are identical to each other and involve hydrophobic residues interacting with shallow grooves on Tfb1PH. These structures are very similar to the structure of TFIIEα-p62PH. These findings provide an important mechanistic link between transcription and DNA repair. In addition, they provide a model of the mechanism of the displacement of XPC/Rad4 by XPG/Rad2 at the damaged site. This knowledge helps to better understand the mechanisms of genomic stability and can lead to novel cancer therapies.

Les mécanismes cellulaires anti-prolifératifs, lesquels comprennent l’apoptose, aussi appelée la mort cellulaire programmée, l’arrêt transitoire du cycle cellulaire et la sénescence, permettent à la cellule de prévenir, en réponse à différents stress, l’accumulation de mutations pouvant conduire à une prolifération incontrôlée et, éventuellement, au développement d’une tumeur. La régulation de ces différents mécanismes requiert l’activation de protéines appelées des suppresseurs de tumeur, dont le principal est p53. p53 est un facteur de transcription dont la stabilisation et l’activation conduit à une hausse de l’expression de gènes directement impliqués dans l’arrêt de la prolifération. Au cours des dernières années, l’ensemble des travaux sur p53 ont permis de mettre en évidence la complexité de sa fonction, de même que la multitude de voies de signalisation et de protéines avec lesquelles il coopère pour maintenir l’intégrité du génome. De ce fait, l’étude des mécanismes d’activation de p53 est de mise pour la compréhension de sa régulation et, éventuellement, pour la prévention et l’élaboration de nouvelles stratégies de traitement contre le cancer. L’objet de cette thèse est la mise en évidence d’un mécanisme d’activation de p53 et de la sénescence par la protéine SOCS1, un suppresseur de la signalisation par les cytokines. Ce mécanisme implique une interaction directe entre les deux protéines, plus précisément entre le domaine SH2 de SOCS1 et le domaine de transactivation de p53. SOCS1 interagit également, au niveau de son SOCS Box, avec les kinases ATM et ATR de la voie du dommage à l’ADN de façon à faciliter la phosphorylation de p53 en sérine 15. Ainsi, en interagissant à la fois avec p53 et ATM/ATR, SOCS1 contribue à la stabilisation et à l’activation de p53. En accord avec ce modèle, l’inhibition de SOCS1 dans des fibroblastes humains normaux tend à diminuer le nombre de cellules sénescentes suite à l’expression de l’oncogène ca-STAT5A et à réduire l’accumulation nucléaire de p53 dans ces cellules. De la même façon, les lymphocytes T provenant de souris Socs1-/-Ifnγ-/- sont moins susceptibles d’entrer en apoptose que les lymphocytes provenant de souris Socs1+/+Ifnγ+/+, suite à une exposition à des radiations. Dans les deux contextes, on observe une baisse de l’expression des gènes cibles de p53, ce qui démontre que SOCS1 est impliquée dans l’activation de p53 in vivo. Cette thèse a également pour but de mettre en évidence l’implication de SOCS1 dans l’activation d’autres facteurs de transcription et, par le fait même, de démontrer qu’elle peut agir comme un régulateur plus général de la transcription. Une étude approfondie de l’interaction entre SOCS1 et p53 a permis de démontrer que le domaine de transactivation II de p53 (acides aminés 36-67) est suffisant pour l’interaction. Plus précisément, il semble que le tryptophane 53 (W53) et la phénylalanine 54 (F54) sont les principaux résidus impliqués. Une analyse structurale de ce domaine de p53 a conduit à l’identification d’un motif conservé dans plusieurs autres facteurs de transcription pourvus d’un domaine de transactivation acide, dont p63, p73 et E2F1. En accord avec ces résultats, SOCS1 est en mesure d’interagir avec chacune des deux protéines. Ainsi, la capacité de SOCS1 d’interagir et de réguler l’activité de p53 peut s’étendre à d’autres facteurs de transcription. En terminant, le mécanisme présenté dans cette thèse contribue à la compréhension de la régulation de p53, le principal suppresseur de tumeur de la cellule. De plus, il met en évidence une nouvelle fonction de SOCS1, laquelle était jusqu’alors essentiellement connue pour inhiber la voie de signalisation JAK/STAT. Ce nouveau rôle pour SOCS1 permet d’expliquer de quelle manière une activation aberrante de la signalisation par les cytokines peut déclencher la sénescence ou l’apoptose. Enfin, le fait que SOCS1 puisse réguler différents facteurs de transcription permet de la qualifier de régulateur général des facteurs de transcription composés d’un domaine de transactivation acide. / In response to different stress, three anti-proliferative mechanisms, namely apoptosis, also called programmed cell death, transient growth arrest and senescence, prevent the cells from cumulating mutations that can lead to uncontrolled proliferation and, eventually, to tumor development. Regulation of these mechanisms requires the activation of proteins called tumor suppressors. One of them, p53, is a transcription factor whose stabilization and activation lead to an increase in expression of genes directly implicated in cell cycle arrest. In the past years, studies about p53 showed how much its function is complex and with how many signaling pathways and proteins it cooperates to maintain genome integrity. Thus, studying the activation mechanisms of p53 is essential to understand its regulation and, thereby, to prevent tumor development and to elaborate new strategies for cancer treatment. The first aim of this thesis is to show a new activation mechanism of p53 and of senescence by the protein SOCS1, a suppressor of cytokine signaling. This mechanism implies a direct interaction between the two proteins, specifically between the SH2 domain of SOCS1 and the N-terminal transactivation domain of p53. SOCS1 also interacts with the DNA damage-regulated kinases ATM and ATR via its C-terminal domain, which contains a SOCS Box, to facilitate the phosphorylation of p53 on its serine 15. Thus, by interacting at the same time with p53 and ATM, SOCS1 contributes to stabilization and activation of p53. In accordance with this model, SOCS1 inhibition in human normal fibroblasts decreases the number of senescent cells in which the activated oncogene STAT5A is expressed and reduces p53 nuclear accumulation in these cells. In the same way, T cells from Socs1-/-Ifnγ-/- mice are less likely to undergo apoptosis than T cells from Socs1+/+Ifnγ+/+ mice, after exposure to γ radiation. In both contexts, the expression of p53 target genes is decreased, which indicates that SOCS1 is implicated in p53 activation in vivo. This thesis also aims to show the role of SOCS1 in the activation of other transcription factors and, thereby, to show that it can act as a more general regulator of transcription. A detailed study of the interaction between SOCS1 and p53 showed that the transactivation domain II of p53 (amino acids 36-67) is sufficient for the interaction. Specifically, it seems that tryptophan 53 (W53) and phenylalanine 54 (F54) are essential for the interaction. A structural analysis of this p53 region highlights an acid transactivation domain actually conserved in many others transcription factors, such as p63, p73 and E2F1. In accordance with this observation, SOCS1 is able to interact with both proteins. Thus, the capacity of SOCS1 to interact with p53 and to regulate its activity may extend to other transcription factors. The mechanism showed in this thesis contributes to the understanding of p53 regulation and highlights a new function for the SOCS1 protein. Indeed, until now, SOCS1 was mostly known to be a negative regulator of the JAK/STAT pathway. Moreover, this new role for SOCS1 explains how an aberrant cytokine signaling can trigger senescence or apoptosis. Finally, the fact that SOCS1 can regulate different transcription factors allows us to consider it as a general regulator of transcription factors containing an acid transactivation domain.

Les papillomavirus sont de petits virus à ADN double brin qui infectent les cellules de l’épithélium de la peau et des muqueuses d’une variété de vertébrés causant des lésions bénignes telles des verrues. Certains de ces virus sont également associés au développement de lésions malignes, notamment le cancer du col utérin. La protéine régulatrice E2 des papillomavirus est impliquée dans diverses fonctions contribuant à l’établissement de l’infection par ces virus. Entre autre, E2 régule la transcription des gènes viraux, participe à l’initiation de la réplication de l’ADN viral en s’associant à l’hélicase virale E1 et est responsable du maintien et de la ségrégation de l’épisome viral au cours de la division cellulaire. Toutes ces activités sont attribuables à la capacité de E2 à s’associer au génome viral et à interagir avec des protéines virales et cellulaires. De plus, ces fonctions sont elles-mêmes régulées par des modifications post-traductionnelles de la protéine E2. Plusieurs études ont été réalisées afin de découvrir les mécanismes de régulation des fonctions de E2 mais le rôle exact des différents domaines de E2 dans ces contrôles reste à être défini. En premier lieu, nous nous sommes intéressés à l’interaction entre E2 et Brd4(L) qui avait été définie comme étant essentielle à la ségrégation de l’épisome. Plusieurs caractéristiques associées à la protéine Brd4(L) telles que sa capacité à lier les lysines acétylées des histones, son interaction avec le complexe Mediator et sa participation à l’activation de la transcription en formant un complexe avec pTEFb, nous ont permis d’émettre l’hypothèse que l’interaction E2-Brd4(L) est nécessaire à l’activité transcriptionnelle de E2. Nous avons démontré que la protéine Brd4(L) interagit avec le domaine de transactivation de E2 de divers types de papillomavirus. De plus, cette interaction implique les résidus de E2 essentiels à son activité transcriptionnelle. Ainsi, ces résultats proposent que l’association E2-Brd4(L) serve à la régulation de la transcription des gènes viraux. Dans un second temps, nos recherches se sont concentrées sur l’existence d’une interface de dimérisation au sein du domaine de transactivation de E2 et de son implication dans les activités transcriptionnelles et réplicatives de la protéine. Nos études ont aussi mis en évidence que l’intégrité de la structure de ce domaine contribue au bon fonctionnement de la réplication du génome viral. Cette découverte suggère que la dimérisation de E2 peut réguler l’initiation de la réplication et propose l’existence d’un niveau de régulation additionnel impliquant l’état de la structure quaternaire de la protéine E2 et une modulation de l’interaction entre E1 et E2 à cette étape du cycle viral. Finalement, l’étude de l’instabilité de la protéine E2 nous a permis de définir une région importante dans le domaine flexible de la protéine, nécessaire à sa dégradation par le protéasome. De plus, la présence de résidus conservés localisés dans ce domaine, sont associés à la dégradation et portent la signature d’un signal de localisation nucléaire de type PY-NLS, suggérant que la stabilité de la protéine E2 est régulée par sa localisation au sein de la cellule. Ces études démontrent l’existence de nouvelles stratégies de régulation des activités transcriptionnelle et réplicative de la protéine E2 des papillomavirus. La compréhension de ces mécanismes nous permet de mieux cerner les étapes favorisant l’établissement et la progression du cycle viral et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques contre les infections aux papillomavirus. / Papillomaviridae is a family of small double-stranded DNA viruses known as papillomaviruses (PV) which infect skin and mucosal epithelial cells where they cause benign lesions such as warts. A subset of these viruses is associated with the development of malignant lesions and is the causal agent of cervical cancer. Papillomavirus E2 regulatory protein is involved in several functions leading to the establishment of the viral infection. These activities include the regulation of viral genes transcription, it participation to the initiation of viral DNA replication by recruiting the viral helicase E1, and to the maintenance and segregation of the viral episome during cellular division. All these functions are associated to the ability of E2 to bind specifically the viral genome, to interact with viral and cellular proteins and to acquire post-translational modifications. The first article of this thesis led to the identification of Brd4(L) as the major protein associated to E2 protein of different papillomavirus types. This interaction involves the amino acids associate to the transcription function of E2. The protein Brd4(L) was identified originally as a factor that maintains epigenetic memory by it interaction with acetylated histones during mitosis. This association with the chromatin, it interaction with Mediator complex and it participation to the cellular transcription by recruiting pTEFb complex allowed us to propose that the interaction between Brd4 and E2 is essential to the regulation of viral gene transcription. The second part of this work based on previous characterization of the transactivation domain dimerization interface; investigate the role of this surface in the transcriptional and replicative activities of E2. Our studies demonstrated that the integrity of the TAD dimerization interface may contribute to the DNA replication activity of E2. This discovery suggests that the dimerization interface may regulate the viral DNA replication by the redox state of the E2 protein. A fine characterization of this interface may provide new aspect of the interaction between E1 and E2 in the context of viral cycle. Finally, the third section of this thesis define a region of E2 protein associated to it degradation by the proteasome. This study also demonstrates that the stability of E2 is related to its cellular localization and suggests that the highly conserved residues found in this region may represent a PY-NLS nuclear localization signal signature. This thesis shows the existence of different approaches to regulate the transcriptional and the replicative activities as well as the stability of the papillomavirus E2 protein to favor the establishment and the progression of viral cycle.

Les petites protéines G Arf ont besoin d'un facteur d'échange nucléotidique (GEF) afin de passer de leur forme inactive liée au GDP à leur forme active liée au GTP. GBF1 est la GEF pour Arf1 qui assure, notamment, le recrutement du complexe manteau COPI impliqué dans le transport entre le Golgi précoce et le réticulum endoplasmique. Il a été récemment montré que GBF1 est impliqué dans la livraison de l'Adipose TriGlycéride Lipase (ATGL) sur les corps lipidiques (LDs). ATGL est une enzyme qui catalyse l'hydrolyse des triglycérides en diglycérides. Les travaux présentés dans cette thèse ont eu pour objectif d'étudier et de caractériser l'interaction entre GBF1 et la lipase ATGL. Par des expériences de co-immunoprécipitation dans les cellules de mammifère, les domaines des deux protéines impliquées dans l'interaction ont été identifiés. Par des expériences de pulldown utilisant les protéines exprimées chez E. coli, j'ai montré que ces interactions sont directes. Afin d'approfondir l'étude de l'interaction entre GBF1 et ATGL, j'ai construit des outils permettant l'étude biochimique de GBF1 en purifiant plusieurs de ses domaines. J'ai tout d'abord cherché à mettre au point un test d'activité pour GBF1 afin de tester l'influence de protéines partenaires, dont ATGL, sur son activité. Malgré la purification de différents fragments de GBF1 contenant le domaine Sec7, aucun n'a présenté une activité avec Arf1Δ17 en solution. Le domaine N-terminal de la protéine, avec et sans une mutation empêchant une interaction intramoléculaire, ainsi que les domaines HDS1 et HDS2 de GBF1 ont également été purifiés / Small G proteins Arf require assistance from a Guanine nucleotide exchange factor (GEF) in order to switch between GDP- and GTP-bound forms. GBF1 is the Arf1 GEF that mediates COPI coat complex recruitment to early secretory pathway membranes. COPI is a protein that coats vesicles transporting proteins from the cis side of the Golgi complex back to the rough endoplasmic reticulum. GBF1 was recently shown to mediate delivery of Adipose TriGlyceride Lipase (ATGL) to the surface of lipid droplets (LDs). ATGL is an enzyme catalyzing the initial step in triglyceride hydrolysis in LDs. Thus, the aim of this work was to study interactions between GBF1 and ATGL. By co-immunoprecipitation experiments in mammalian cells, the domains of two proteins involved in the interaction have been identified. By pulldown assays using proteins expressed in bacteria, I showed that these interactions are direct. To further study of the GBF1-ATGL interaction, I developed tools for the biochemical study of GBF1, by purifying several of its domains. I first tried to develop a kinetic essay for GBF1 to test the influence of interacting partners, including ATGL, on its activity. Despite the purification of various GBF1 fragments containing the Sec7 domain, none have activity with Arf1Δ17 in solution. The N-terminal domain of the protein, with and without a mutation disrupting an intramolecular interaction, and the HDS1 and HDS2 domains of GBF1 were also purified.