Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais. / Made available in DSpace on 2012-10-22T21:37:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / No Brasil, a produção de maçãs está concentrada na região sul do país, e o Estado de Santa Catarina é responsável por cerca de 50% da oferta nacional. A cultura da macieira apresenta um panorama de crescimento com resultados altamente positivos nos últimos 30 anos. Porém, para a manutenção destes índices, os porta-enxertos devem ser adaptados às regiões de cultivo e ser resistentes aos principais problemas fitossanitários da cultura. Entretanto, os programas de melhoramento genético via hibridação sexual encontram limitações devido às características reprodutivas da macieira. A tecnologia de protoplastos para a hibridação somática constitui-se numa alternativa para contornar estas barreiras. Este trabalho teve como objetivo estabelecer um protocolo eficiente de isolamento e cultivo de protoplastos de porta-enxertos de macieira M9 e Marubakaido, visando à hibridação somática. Uma série de experimentos foi realizada avaliando-se diferentes meios de cultura para a calogênese, metodologias de isolamento e formas de cultivo de protoplastos. Para a calogênese de folhas do cultivo in vitro dos dois porta-enxertos o meio MS com 30g.L-1 de sacarose, 17,76µM de BAP e 1,00µM de 2,4-D promoveu o maior índice de formação de calos compactos. Quando este meio suplementado com 30g.L-1 de maltose, ao invés de sacarose ocorreu a regeneração por organogênese direta dos explantes do porta-enxerto M9. Para a calogênese de nucelos dos dois porta-enxertos obteve-se uma alta percentagem de oxidação e não houve a formação de calos friáveis. Para a calogênese de anteras do porta-enxerto M9 o meio NN suplementado com 30g.L-1 de sacarose, 4,52 M de 2,4-D, 2,85 M de AIA e 4,56 M de KIN promoveu o maior índice de formação de calos friáveis, possibilitando o estabelecimento de suspensões celulares. Para o isolamento de protoplastos de mesofilo foliar de ambos os porta-enxertos e de calos e suspensões de anteras do porta-enxerto M9, o uso do meio KM para diluição da solução enzimática aliado ao tempo máximo de digestão de 8 horas, proporcionaram os maiores rendimentos e viabilidade dos protoplastos para todas as fontes de protoplastos avaliadas neste trabalho. O cultivo dos protoplastos em meio líquido resultou nos maiores valores de viabilidade promoveu os resultados mais consistentes, sendo esta considerada a fonte de explante mais promissora para futuros trabalhos. Os progressos alcançados neste estudo são pioneiros no Brasil para estes genótipos e os resultados obtidos contribuíram com informações técnicas relevantes que servem como base para os futuros estudos nesta área

Estabeleceu-se um sistema rápido para regeneração de plantas a partir de protoplastos derivados de calos primários de dois cultivares de arroz brasileiros, IAC-165 e IAC-201. Após uma série de experimentos em indução de calos, foi possível produzir uma quantidade suficiente de calos embriogênicos derivados de semente nos meios B5 (GAMBORG et al, 1968) e N6 (CHU, 1978) suplementados com 2 e 4 mg/l de 2,4-D, acrescidos de 576 e 288 mg/l de L-prolina para os cultivares IAC-165 e IAC-201, respectivamente. Os calos embriogênicos primários derivados de sementes foram utilizados para isolamento direto de protoplastos ou para o início de suspensões celulares. Linhagens de células em suspensão foram estabelecidas para ambos cultivares sendo capazes de produzir uma grande quantidade de protoplastos em 4 a 6 meses. Os protoplastos derivados de calos induzidos a partir de sementes foram plaqueados em blocos de agarose e formaram colônias embriogênicas, visíveis ao olho nu, em 15 a 16 dias após o plaqueamento. Este tipo de colônia formou pequenos calos que foram plaqueados em meio de regeneração. Mais de 100 plantas foram regeneradas, sendo 22,2%. O presente sistema possibilitará fazer-se transformação genética em não mais do que 120 dias. Isto torna o sistema mais rápido do que o sistema tradicional de obtenção de protoplastos derivados de suspensões celulares e, devido a isto, torna-o competitivo com a biolística. Existem somente dois trabalhos que relatam a regeneração de plantas a partir de protoplastos derivados de calos primários, ambos usaram calos embriogênicos induzidos a partir de embriões imaturos. O presente trabalho relata, pela primeira vez, a regeneração de plantas de cultivares de arroz brasileiros utilizando sementes para a indução de calos. / not available

A instabilidade genética observada no fungo filamentoso Aspergillus nidulans, é semelhante em muitos aspectos aos estudos em milho de McCLINTOCK (1951), com os elementos genéticos móveis. Muitos trabalhos vêm sendo realizados desde 1960 no sentido de caracterizar através da genética clássica, e mais recentemente com as técnicas modernas, o fenômeno de transposição. A instabilidade deste fungo é observada na forma de setores produzidos por uma linhagem que apresenta uma duplicação de um segmento do grupo de ligação I translocado para o grupo de ligação II. Tais setores originados por deleções, novas duplicações, outros rearranjos e por transposição podem ser classificados em melhorados, deteriorados e heterocarióticos. Este trabalho pretendeu ser mais uma contribuição aos estudos básicos dessa instabilidade. Inicialmente através do isolamento de setores deteriorados e sua análise genética via metodologia clássica, já que tais setores podem ser originados por transposição. Foram analisados 7 variantes deteriorados através do ciclo sexual e parassexual, sendo que os determinantes de deterioração foram localizados nos grupos de ligação III • IV. Utilizando-se de técnicas modernas através da obtenção, fusão e regeneração de protoplastos, a análise genética dos variantes foi feita em diplóides obtidos por fusão. Nenhuma alteração foi detectada quanto a loca1ização dos determinantes genéticos de deterioração na análise mitótica dos 7 variantes. E finalmente foi verificado se ocorre transposição pela fusão citoplasmática, através da fusão dos protoplastos. Foi encontrado 1 variante hap1óide com fenótipo deteriorado e marcadores genéticos da linhagem MSE, pela fusão de protoplastos desta linhagem com o variante V94, em menos que 600 colônias analisadas. Para se alcançar esses três objetivos, outros pequenos ensaios complementares foram feitos, como a segregação meiótica dos cruzamentos entre variantes deteriorados e a linhagem MSE, em meio com estabilizador osmótico, para diminuir a desvantagem seletiva dos deteriorados em relação as colônias normais; porcentagem de regeneração e fusão de protoplastos, um estudo comparativo das linhagens A, MSE e variantes deteriorados; verificação da toxicidade do PEG aos variantes deteriorados; efeito do fungicida banlate sobre a instabilidade dos diplóides obtidos pela metodologia clássica e fusão de protoplastos; e padrão eletroforético das enzimas do sistema esterase das linhagens A, MSE e variantes deteriorados. / The genetic instability found in the filamentous fungus Aspergillus nidulans is, in many aspects, similar to the studies of moving genetic elements in maize, done by McCLINTOCK (1951). Since 1960, many studies have been carried out with the aim of understanding the phenomena of transposition, initially by using classical genetic techniques and more recently by using modern techniques. The instabili1y of this fungus is observable by the production of sectors by strains which possess a duplicated segment of linkage group I translocated to linkage group II. Such sectors, originated either by deletions, new duplications, transposition or by other rearrangements, may be classified as improved, deteriorated or heterokaryotic. This work is a contribution to the basic studies of this instability, and is divided into three main parts. Initially, deteriorated sectors were isolated and genetica11y analyzed by classica1 methods, since such sectors may be originated by transposition. Seven deteriorated variants were analyzed by their sexual and parasexual cycles. The determinants of deterioration were found to be localized in linkage group III and IV. Modern techniques, namely the obtainment, fusion and regeneration of protoplasts, were used and genetical analysis of variants were carried out on diploides obtained by fusion. No alteration of the 1ocalization of the genetic determinants of deterioration was detected by mitotic analysis of the seven variants. Finally, protoplast fusion was used to verify if transposition occurs from citoplasmic fusion. A haploid variant, with a deteriorated phenotype and genetic markers of the MSE strain, was found from the protoplastic fusion of this strain with the variant V94, within less than 600 analyzed colonies. To achieve the above objectives, other small complementary assays were done, such as the meiotic segregation of the crosses between deteriorated variants and the MSE strain, in a medium containing osmotic stabilizer, with the aim of decreasing the selective desadvantage of the deteriorates; a comparative study of strains A and MSE and deteriorated variants as to percentage of regeneration and fusion of protoplasts; examination of PEG toxicity to deteriorated variants; effect of benlate fungicide upon the instability of the diploids obtained by classical methodology and by protoplast fusion; and the eletrophoretic pattern of the enzymes of the esterase system of strains A and MSE and deteriorated variants.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-14T18:25:04Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 15350 bytes, checksum: dfb862c1ae844570018456c3a9ff28f4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-14T18:25:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 15350 bytes, checksum: dfb862c1ae844570018456c3a9ff28f4 (MD5) Previous issue date: 2005-02-14 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O objetivo deste trabalho foi padronizar as condições de obtenção e regeneração de protoplastos de Epulorhiza repens e Ceratorhiza sp. e determinar o cariótipo eletroforético de Ceratorhiza sp. Para o fungo Epulorhiza repens, a maior produção de protoplastos, 8,0 x 10 6 protoplastos/mL, foi obtida em KCl 0,6 M, na presença de 15 mg/mL de “Lysing Enzymes” e 0,5 g de micélio fúngico com 2 dias idade, após fragmentação em liquidificador. A maior freqüência de regeneração obtida foi de 8,5 % quando sacarose 0,5 M foi utilizada como estabilizador osmótico. Do total de protoplastos obtidos, 58,6 % eram uninucleados, 21,4 % binucleados e 20 % anucleados. Para o fungo Ceratorhiza sp., a maior produção de protoplastos, 4,0 x 10 7 protoplastos/mL, foi obtida em NaCl 0,6 M, na presença de 15 mg/mL de “Lysing Enzymes” e 15mg/mL de Glucanex, 0,5 g de micélio fúngico com 2 dias de idade, após fragmentação em liquidificador. A maior freqüência de regeneração obtida foi de 6,7 % utilizando sacarose 0,5 M como estabilizador osmótico. Do total de protoplastos obtidos, 61 % eram uninucleados, 24,6 % binucleados, 3,2 % trinucleados e 11,2 % anucleados. O cariótipo eletroforético do fungo Ceratorhiza sp. apresentou no mínimo, 3 cromossomos cujos tamanhos foram estimados em 4,6; 3,5 e 2,2 Mb. A maior intensidade da banda de 4,6 Mb sugere que esta possa estar representando dois cromossomos, sendo o tamanho do genoma estimado em pelo menos 14,9 Mb. O estabelecimento de protocolos otimizados para obtenção e regeneração de protoplastos dos fungos Epulorhiza repens e Ceratorhiza sp. é importante, permitindo o estabelecimento de técnicas de transformação genética, o isolamento de mutantes, a determinação de cariótipo eletroforético e o cruzamento de linhagens. O cariótipo de Ceratorhiza sp. é importante para a determinação do número e do tamanho dos cromossomos, para se estimar o tamanho do genoma e a localização de genes relacionados à formação de micorrizas. / This study was conducted in order to standardize the formation conditions and regeneration of Epulorhiza repens and Ceratorhiza sp. protoplasts and also to determine the electrophoretic karyotype of Ceratorhiza sp. For Epulorhiza repens, the highest production of protoplasts, 8,0 x 10 6 protoplasts/mL, was obtained in KCl 0,6 M, with 15 mg/mL of “Lysing Enzymes” and 0,5 g of mycelium at 2 days, after fragmentation in the liquefier. The best regeneration frequency, 8,5 %, was achieved when sucrose 0,5 M was used as an osmotic stabilizer. From total protoplasts obtained, 58,6 % were uninucleate, 21,4 % binucleate and 20 % anucleate. For Ceratorhiza sp. the highest production of protoplasts, 4,0 x 10 7 protoplasts/mL, was obtained in NaCl 0,6 M, with 15 mg/mL of “Lysing Enzymes” and 15 mg/mL of Glucanex, and 0,5 g of mycelium at 2 days, after fragmentation in the liquefier. The best regeneration frequency, 6,7 %, was achieved when sucrose 0,5 M was used as an osmotic stabilizer, and from total protoplasts obtained, 61 % were uninucleate, 24,6 % binucleate, 3,2 % trinucleate and 11,2 % anucleated. The electrophoretic karyotype of Ceratorhiza sp. showed at least 3 chromosomes around 4,6; 3,5 and 2,2 ixMb. The highest intensity of the band 4,6 Mb suggests that it represents two chromosomes, and the genome height was estimated in, at least, 14,9 Mb. It is important to establish optimized protocols for obtaining and regenerating protoplasts of Epulorhiza repens and Ceratorhiza sp. to allow the establishment of techniques of genetic transformation, mutant isolation, electrophoretic karyotype determination and crossings between strains. Ceratorhiza sp. karyotype is important to determine chromosomes number and height, to estimate genome height and gene localization related to mycorrhizas formation.

O estudo de fungos celulolíticos tem-se mostrado relevante, tendo em vista o interesse econômico do complexo celulases, especialmente na indústria têxtil e, mais recentemente, para propósitos energéticos. No presente trabalho, a fusão de protoplastos foi utilizada para combinar genótipos de mutantes parcialmente desreprimidos para produção de celulases de Penicillium echinulatum (9A02S1B9) e richoderma harzianum (AS5CH3), utilizando a técnica do doador morto, buscando-se obter recombinantes com maior produção de celulases. Nesta estratégia, ambas as linhagens tiveram seu micélio tratado com Glucanex 0,01 g/mL, para quebra da parede celular. Os protoplastos resultantes da linhagem portadora de marca de resistência ao benomil (9A02S1B9) foram inativados por calor (técnica do doador morto) de 60oC antes da etapa de fusão, a qual após foi induzida por PEG4000 e Ca2+, com protoplastos da linhagem sensível ao benomil (AS5CH3). A partir de um produto de fusão, foram selecionados 24 sub-clones, após estratégias de estabilização e seleção para precocidade e eficiência na formação de halo de hidrólise de celulose em placas de Petri. Os produtos de fusão apresentaram morfologia e esporulação semelhantes a um dos parentais, sendo treze semelhantes à Penicillium, nove semelhantes à Trichoderma e dois mostrando formas alteradas. Os produtos de fusão que segregaram para morfologia de T. harzianum apresentaram a característica de resistência ao benomil, sendo capazes de crescer e esporular em meios contendo até 100 μg/mL deste inibidor. A morfologia, o perfil de bandas, obtidos por RAPD, e o padrão de secreção de celulases dos produtos de fusão foram sempre mais semelhantes a um dos parentais. Os clones apresentaram variação quanto ao halo de hidrólise de celulose em placas de Petri e na atividade sobre papel filtro FPAases, -glicosidase ou endoglicanase, quando crescidas em cultivo submerso ou em estado sólido. Desta variabilidade, verificaram-se aumentos significativos para algumas das linhagens em relação aos parentais. A aplicação da metodologia de fusão de protoplastos para obter recombinantes entre P. echinulatum e T. harzianum, empregando a técnica do doador morto, mostrou-se adequada na geração de variabilidade para produção de celulases. / Submitted by Ana Guimarães Pereira (agpereir@ucs.br) on 2015-02-12T12:22:13Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Barbara Lizandra Perini de Souza.pdf: 2248330 bytes, checksum: 2a20339f50d031a74d2a889ddbe2435e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-12T12:22:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Barbara Lizandra Perini de Souza.pdf: 2248330 bytes, checksum: 2a20339f50d031a74d2a889ddbe2435e (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The study of cellulolytic fungi has proved to be important, considering economic interest of the cellulase complex, especially in the textile industry and, more recently, for energy purposes. In this work, the protoplast fusion was used to combine genotypes of mutants partially non repressed for cellulases production of Penicillium echinulatum (9A02S1B9) and Trichoderma harzianum (AS5CH3) using the technique dead donor, intending to obtain recombinants with higher cellulases production. In this strategy, both strains had their mycelium treated with Glucanex  0,01 g/mL, to lyse the cell wall. The protoplast obtained from the benomyl-resistant (9A02S1B9) were heat-inactivated (technique of dead donor) at 60ºC, before the step of fusion, induced by PEG4000 and Ca2+, with protoplast of the sensitive-benomyl strain (AS5CH3). Twenty four sub-clones were selected from one fusion product, after stabilization and selection strategies for precocity and efficiency in the formation clearing zones of by cellulose hydrolysis in Petri plates. The fusion products showed similar morphology and sporulation to one of parents, thirteen similar to Penicillium, nine similar to Trichoderma and two showed altered forms. The fusion products which segregate to the morphology of T. harzianum resistance to benomyl, being able to grow and sporulate in media containing up to 100 μg/mL of this inhibitor. The morphology, the profile of bands, obtained by RAPD, and the pattern of cellulase secretion by fusion products were ever more similar to one of parents. The fusants presented variation in the halo of cellulose hydrolysis in Petri plates, and in the activity on filter paper (FPAases), - glicosidase or endoglicanase, when grown submerged cultivation or solid state. From this variability, significant improvement was verified for some of the parental strains. The application of the protoplast fusion methodology to obtain recombinant between P. echinulatum and T. harzianum, using the technique of dead donor, has proved to be adequate to generate variability in the production of cellulases.

O estudo de fungos celulolíticos tem-se mostrado relevante, tendo em vista o interesse econômico do complexo celulases, especialmente na indústria têxtil e, mais recentemente, para propósitos energéticos. No presente trabalho, a fusão de protoplastos foi utilizada para combinar genótipos de mutantes parcialmente desreprimidos para produção de celulases de Penicillium echinulatum (9A02S1B9) e richoderma harzianum (AS5CH3), utilizando a técnica do doador morto, buscando-se obter recombinantes com maior produção de celulases. Nesta estratégia, ambas as linhagens tiveram seu micélio tratado com Glucanex 0,01 g/mL, para quebra da parede celular. Os protoplastos resultantes da linhagem portadora de marca de resistência ao benomil (9A02S1B9) foram inativados por calor (técnica do doador morto) de 60oC antes da etapa de fusão, a qual após foi induzida por PEG4000 e Ca2+, com protoplastos da linhagem sensível ao benomil (AS5CH3). A partir de um produto de fusão, foram selecionados 24 sub-clones, após estratégias de estabilização e seleção para precocidade e eficiência na formação de halo de hidrólise de celulose em placas de Petri. Os produtos de fusão apresentaram morfologia e esporulação semelhantes a um dos parentais, sendo treze semelhantes à Penicillium, nove semelhantes à Trichoderma e dois mostrando formas alteradas. Os produtos de fusão que segregaram para morfologia de T. harzianum apresentaram a característica de resistência ao benomil, sendo capazes de crescer e esporular em meios contendo até 100 μg/mL deste inibidor. A morfologia, o perfil de bandas, obtidos por RAPD, e o padrão de secreção de celulases dos produtos de fusão foram sempre mais semelhantes a um dos parentais. Os clones apresentaram variação quanto ao halo de hidrólise de celulose em placas de Petri e na atividade sobre papel filtro FPAases, -glicosidase ou endoglicanase, quando crescidas em cultivo submerso ou em estado sólido. Desta variabilidade, verificaram-se aumentos significativos para algumas das linhagens em relação aos parentais. A aplicação da metodologia de fusão de protoplastos para obter recombinantes entre P. echinulatum e T. harzianum, empregando a técnica do doador morto, mostrou-se adequada na geração de variabilidade para produção de celulases. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The study of cellulolytic fungi has proved to be important, considering economic interest of the cellulase complex, especially in the textile industry and, more recently, for energy purposes. In this work, the protoplast fusion was used to combine genotypes of mutants partially non repressed for cellulases production of Penicillium echinulatum (9A02S1B9) and Trichoderma harzianum (AS5CH3) using the technique dead donor, intending to obtain recombinants with higher cellulases production. In this strategy, both strains had their mycelium treated with Glucanex  0,01 g/mL, to lyse the cell wall. The protoplast obtained from the benomyl-resistant (9A02S1B9) were heat-inactivated (technique of dead donor) at 60ºC, before the step of fusion, induced by PEG4000 and Ca2+, with protoplast of the sensitive-benomyl strain (AS5CH3). Twenty four sub-clones were selected from one fusion product, after stabilization and selection strategies for precocity and efficiency in the formation clearing zones of by cellulose hydrolysis in Petri plates. The fusion products showed similar morphology and sporulation to one of parents, thirteen similar to Penicillium, nine similar to Trichoderma and two showed altered forms. The fusion products which segregate to the morphology of T. harzianum resistance to benomyl, being able to grow and sporulate in media containing up to 100 μg/mL of this inhibitor. The morphology, the profile of bands, obtained by RAPD, and the pattern of cellulase secretion by fusion products were ever more similar to one of parents. The fusants presented variation in the halo of cellulose hydrolysis in Petri plates, and in the activity on filter paper (FPAases), - glicosidase or endoglicanase, when grown submerged cultivation or solid state. From this variability, significant improvement was verified for some of the parental strains. The application of the protoplast fusion methodology to obtain recombinant between P. echinulatum and T. harzianum, using the technique of dead donor, has proved to be adequate to generate variability in the production of cellulases.

Memoria para optar al título profesional de: Ingeniero Agrónomo Mención: Sanidad Vegetal / El presente trabajo tuvo como objetivo determinar la capacidad biocontroladora de cepas mejoradas de Trichoderma spp. obtenidas a través de fusión de protoplastos y aplicación de N-metil-N-nitro-N-Nitrosoguanidinio (NG) en cepas silvestres previamente caracterizadas y seleccionadas por su buena capacidad biocontroladora en Rhizoctonia solani. Se evaluó su efecto in vitro a través de antagonismo directo en cultivos duales, metabolitos volátiles y metabolitos difusibles en dos cepas de Rhizoctonia solani (509 (GA 2-1) y 618 (GA 4)). Las pruebas de antagonismo se realizaron a la temperatura y pH óptimo de crecimiento del patógeno. Las cepas ThF 2-1, ThF 2-18, ThF 3-3, ThF 4-15 y la cepa ThF 5-8, presentaron los mejores porcentajes de inhibición. También se evaluó la capacidad biocontroladora de las cepas antes indicadas, bajo condiciones de invernadero en plántulas de tomate de los cultivares 92.95 y Góndola susceptibles. En la prueba de inocuidad se evaluó altura, peso fresco y seco de las plántulas. Todas las cepas resultaron inocuas. Para evaluar la capacidad biocontroladora, las cepas se aplicaron en forma de pellets de alginato de sodio (1,7 g pellet/ L suelo) al suelo en macetas, previamente inoculado con el fitopatógeno en suelo estéril y se compararon con un tratamiento testigo (sólo Rhizoctonia solani) y con un tratamiento a base del fungicida pencycuron. Se evaluó peso fresco y seco de las plantas, cancrosis, desarrollo radical y mortalidad. La cepa mejorada ThF 4-15 fue el mejor agente de biocontrol en el cultivar de tomate Góndola, cuando se evaluó el nivel de cancrosis comparado con sus genotipos silvestres. En cuanto al desarrollo radical de las plantas los tratamientos que incluyeron a las cepas mejoradas, no tuvieron diferencias. También se estudió la viabilidad y sobrevivencia de las cepas bioantagonistas formulados como pellets en dos suelos (Antumapu y La Palma) a tres temperaturas de almacenaje (22ºC, 5ºC y temperatura ambiental de laboratorio (18,6-25°C)) determinándose su capacidad antagónica sobre el fitopatógeno a los 30, 60 y 90 días, observándose que las cepas biocontroladoras se mantuvieron viables en los suelos Antumapu y La Palma, al menos hasta los 90 días a las temperaturas estudiadas. Se determinó también que ellos conservan su capacidad antagónica

O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma metodologia para identificação de regiões promotoras funcionais a partir de segmentos de um genoma qualquer. O genoma da cana-de-açúcar foi escolhido para o desenvolvimento desta estratégia na qual envolve a obtenção de fragmentos de DNA os quais foram clonados em vetores de expressão. A triagem destes fragmentos foi realizada através de biobalística e resultou no isolamento de quatro clones. Um ensaio de transformação permanente em arroz com três clones gerou 12 plantas. Foi detectada expressão do marcador GUS em calos, folhas e raízes, comprovando sua funcionalidade. Desta maneira, o presente trabalho permitiu estabelecer uma metodologia de recuperação de sequências regulatórias funcionais com ampla possibilidade de serem explorados biotecnologicamente. / The aim of this work is develop a strategy to identify functional promoter regions from any genome. The modern sugarcane genome was chosen as a model for the development of this strategy that involves the generation of fragments of DNA and cloning them into expression vectors. These fragments were then screened by a transient expression assay using biolistic particle delivery resulting in the isolation of four clones. Three clones were permanently transformed in rice, and 12 plants were obtained. GUS expression was detected in the callus, leaves and roots of the rice plants thus confirming the functionality of sequences in these clones. The present work has established a strategy to identify and extract functional regulatory sequences containing functional regulatory regions which show great potential of being useful in both the biotechnology field and in the field of basic science.

A regeneração de plantas, por organogênese ou embriogênese somática, a partir do cultivo de células e tecidos vegetais in vitro é a base para a utilização da biotecnologia no melhoramento. Realizaram-se estudos com cinco cultivares de laranja doce (Citrus sinensis L. Osbeck), Pêra, Natal, Lima Verde, Hamlin e Westin. Este trabalho objetivou a avaliação da eficiência de isolamento de protoplastos das cultivares de laranja doce; o estudo da eficiência de plaqueamento em função de cinco densidades de protoplastos e diferentes meios de cultura e avaliação da embriogênese somática em função da composição dos meios de cultura e concentração da fonte de carboidrato. As soluções enzimáticas testadas para o isolamento de protoplastos foram: 1. Grosser e Chandler (1987), composta de 1% de celulase Onozuka RS (Yakult), 1% macerase R- 10 (Yakult Honsha) e 0,2% de pectoliase Y-23 (Seishin); 2. Grosser e Chandler (1987) modificado, composta de 1% de celulase Onozuka RS (Yakult), 1% macerase R-10 (Yakult Honsha); 3. Solução enzimática composta de 4% de celulase Onozuka R-10 (Yakult), 1% macerase R-10. O plaqueamento dos protoplastos foi realizado em cinco densidades, 2 x 104, 5 x 104; 105; 2x 105 e 3 x 105 protoplastos . mL-1,nos meios de cultura EME 0,7M, BH3 0,7M e BH3 + EME 0,7M em ausência de luz, a 25 ± 1 ºC. A solução enzimática 2 proporcionou um maior rendimento no isolamento de protoplastos das cultivares Hamlin, Natal e Pera e solução enzimática 1 foi melhor para a cultivar Westin. A eficiência final de plaqueamento avaliada aos 90 dias foi superior nas densidades de de 3 x 105 e 2 x 105 protoplastos. mL-1 para as cultivares Hamlin, Natal e Lima Verde, e na densidade de 2 x 105 e 105 protoplastos. mL-1 para a cultivar Westin. A indução da embriogênese somática ocorreu em meio de cultura MT modificado com 500 mg.L-1 de extrato de malte, acrescido de sacarose, galactose, glicose, sorbitol, lactose e maltose, nas concentrações de 18, 37, 75, 110 e 150 mM à temperatura de 27 °C. A formação de embriões somáticos variou com o genótipo, sendo a cultivar Lima Verde e Westin apresentaram menor número de embriões somáticos. As melhores fontes de carboidratos foram a maltose, seguida pela lactose nas concentrações de 37 e 75 mM para a cultivar Pêra, 37 mM para a cultivar Natal e 37, 75 e 110 mM para a cultivar Hamlin. / Plant regeneration, by organogenesis or somatic embryogenesis from cell cultures and in vitro plant tissue culture is the basis for the use of biotechnology in plant breeding. Studies were conducted with five cultivars of sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck), Pêra, Natal, Lima Verde, Hamlin and Westin. This work aimed to evaluate the isolation efficiency of protoplasts, to evaluate platting efficiency of protoplasts based on five densities of cells and different culture media and to evaluate somatic embryogenesis based on culture medium composition and concentration. The enzymatic solutions tested were: 1. Grosser and Chandler (1987): 1% de cellulase Onozuka RS (Yakult), 1% macerase R-10 (Yakult Honsha) and 0,2% de pectoliase Y-23 (Seishin); 2. Grosser and Chandler (1987) modified: 1% de cellulase Onozuka RS (Yakult) and 1% macerase R-10 (Yakult Honsha); 3. Enzimatic solution containing 4% cellulase Onozuka R-10 (Yakult) and 1% macerase R-10. Protoplasts were cultured at densities of 2 x 104; 5 x 104; 105; 2 x 105 e 3 x 105 protoplasts.mL-1 in EME 0,7M, BH3 0,7M and BH3 + EME 0,7M, in the dark, at 25 ± 1 ºC. The enzymatic solution 2 provided higher yield for the cultivars Hamlin, Natal and Pêra, and enzymatic solution 1 resulted in better protoplast isolation for cultivar Westin. Final platting efficiency, evaluated 90 days after culture, was higher at the densities of 3 x 105 e 2 x 105 protoplasts.mL-1 for Hamlin, Natal and Lima Verde, and at the density of 2 x 105 e 105 protoplasts.mL-1 for Westin. Somatic embryogenesis stimulation occurred in cultured medium MT (MURASHIGE AND TUCKER, 1969) modified with 500 mg. L-1 of malt extract, supplemented with sucrose, galactose, glucose, maltose, lactose and sorbitol at concentrations of 18, 37, 75, 110 and 150 mM, at 27 ± 1 ºC. Somatic embryos produced varied with the genotype, the smaller number of somatic embryos was observed in cultivars Lima Verde and Westin. The best source of carbohydrate were maltose, followed by lactose at concentrations of 37 and 75 mM for cultivar Pêra, 37 mM for cultivar Natal, and 37, 75 and 110 mM for cultivar Hamlin.

A regeneração de plantas, por organogênese ou embriogênese somática, a partir do cultivo de células e tecidos vegetais in vitro é a base para a utilização da biotecnologia no melhoramento. Realizaram-se estudos com cinco cultivares de laranja doce (Citrus sinensis L. Osbeck), Pêra, Natal, Lima Verde, Hamlin e Westin. Este trabalho objetivou a avaliação da eficiência de isolamento de protoplastos das cultivares de laranja doce; o estudo da eficiência de plaqueamento em função de cinco densidades de protoplastos e diferentes meios de cultura e avaliação da embriogênese somática em função da composição dos meios de cultura e concentração da fonte de carboidrato. As soluções enzimáticas testadas para o isolamento de protoplastos foram: 1. Grosser e Chandler (1987), composta de 1% de celulase Onozuka RS (Yakult), 1% macerase R- 10 (Yakult Honsha) e 0,2% de pectoliase Y-23 (Seishin); 2. Grosser e Chandler (1987) modificado, composta de 1% de celulase Onozuka RS (Yakult), 1% macerase R-10 (Yakult Honsha); 3. Solução enzimática composta de 4% de celulase Onozuka R-10 (Yakult), 1% macerase R-10. O plaqueamento dos protoplastos foi realizado em cinco densidades, 2 x 104, 5 x 104; 105; 2x 105 e 3 x 105 protoplastos . mL-1,nos meios de cultura EME 0,7M, BH3 0,7M e BH3 + EME 0,7M em ausência de luz, a 25 ± 1 ºC. A solução enzimática 2 proporcionou um maior rendimento no isolamento de protoplastos das cultivares Hamlin, Natal e Pera e solução enzimática 1 foi melhor para a cultivar Westin. A eficiência final de plaqueamento avaliada aos 90 dias foi superior nas densidades de de 3 x 105 e 2 x 105 protoplastos. mL-1 para as cultivares Hamlin, Natal e Lima Verde, e na densidade de 2 x 105 e 105 protoplastos. mL-1 para a cultivar Westin. A indução da embriogênese somática ocorreu em meio de cultura MT modificado com 500 mg.L-1 de extrato de malte, acrescido de sacarose, galactose, glicose, sorbitol, lactose e maltose, nas concentrações de 18, 37, 75, 110 e 150 mM à temperatura de 27 °C. A formação de embriões somáticos variou com o genótipo, sendo a cultivar Lima Verde e Westin apresentaram menor número de embriões somáticos. As melhores fontes de carboidratos foram a maltose, seguida pela lactose nas concentrações de 37 e 75 mM para a cultivar Pêra, 37 mM para a cultivar Natal e 37, 75 e 110 mM para a cultivar Hamlin. / Plant regeneration, by organogenesis or somatic embryogenesis from cell cultures and in vitro plant tissue culture is the basis for the use of biotechnology in plant breeding. Studies were conducted with five cultivars of sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck), Pêra, Natal, Lima Verde, Hamlin and Westin. This work aimed to evaluate the isolation efficiency of protoplasts, to evaluate platting efficiency of protoplasts based on five densities of cells and different culture media and to evaluate somatic embryogenesis based on culture medium composition and concentration. The enzymatic solutions tested were: 1. Grosser and Chandler (1987): 1% de cellulase Onozuka RS (Yakult), 1% macerase R-10 (Yakult Honsha) and 0,2% de pectoliase Y-23 (Seishin); 2. Grosser and Chandler (1987) modified: 1% de cellulase Onozuka RS (Yakult) and 1% macerase R-10 (Yakult Honsha); 3. Enzimatic solution containing 4% cellulase Onozuka R-10 (Yakult) and 1% macerase R-10. Protoplasts were cultured at densities of 2 x 104; 5 x 104; 105; 2 x 105 e 3 x 105 protoplasts.mL-1 in EME 0,7M, BH3 0,7M and BH3 + EME 0,7M, in the dark, at 25 ± 1 ºC. The enzymatic solution 2 provided higher yield for the cultivars Hamlin, Natal and Pêra, and enzymatic solution 1 resulted in better protoplast isolation for cultivar Westin. Final platting efficiency, evaluated 90 days after culture, was higher at the densities of 3 x 105 e 2 x 105 protoplasts.mL-1 for Hamlin, Natal and Lima Verde, and at the density of 2 x 105 e 105 protoplasts.mL-1 for Westin. Somatic embryogenesis stimulation occurred in cultured medium MT (MURASHIGE AND TUCKER, 1969) modified with 500 mg. L-1 of malt extract, supplemented with sucrose, galactose, glucose, maltose, lactose and sorbitol at concentrations of 18, 37, 75, 110 and 150 mM, at 27 ± 1 ºC. Somatic embryos produced varied with the genotype, the smaller number of somatic embryos was observed in cultivars Lima Verde and Westin. The best source of carbohydrate were maltose, followed by lactose at concentrations of 37 and 75 mM for cultivar Pêra, 37 mM for cultivar Natal, and 37, 75 and 110 mM for cultivar Hamlin.