Os microrganismos podem apresentar-se tanto em forma de vida livre como aderidos a uma superfície ou interface ar-líquido, formando comunidades complexas e dinâmicas conhecidas como biofilmes. Nos últimos anos, com o avanço das pesquisas em nível molecular, foi identificado que a maioria das bactérias utilizam guanosina monofosfato (3´-5´)-cíclica dimérica (c-di-GMP) como um segundo mensageiro. De forma geral, essa molécula controla a sinalização celular, virulência, comunicação entre células e a expressão de proteínas relacionadas com o fenótipo de biofilmes, em resposta à sua concentração intracelular. Sua síntese e degradação são controladas respectivamente por diguanilto ciclases (DGCs) contendo domínio GGDEF e fosfodiesterases (PDEs) que possuem os domínios EAL ou HD-GYP. Em Pseudomonas aeruginosa (PA14) foi identificada uma nova classe de receptor específico para c-di-GMP, a proteína transmembranar PelD, cuja porção citoplasmática contém os domínios GAF e GGDEF degenerado. Sua modulação através desse dinucleotídeo controla a produção de exopolissacarídeos pelos componentes do conservado operon pel e influencia diretamente na capacidade de formação de biofilmes. Devido à escassez de dados a respeito dos eventos moleculares do mecanismo de sinalização mediado por c-di-GMP, este trabalho teve como objetivo principal a caracterização biofísica/estrutural da proteína PelD, bem como o reconhecimento de interação entre este ligante e a porção citoplasmática da proteína. Diversas construções solúveis de PelD foram clonadas e expressas, sendo que a construção compreendendo os resíduos 176-455 (PelD176-455) foi cristalizada com sucesso e teve sua estrutura determinada por iodo-SAD. O modelo final apresentou os dois domínios com enovelamentos característicos das famílias GAF e GGDEF, sendo a interface inter-domínios composta majoritariamente por resíduos hidrofóbicos. Visando uma compreensão das bases moleculares de reconhecimento e ativação de PelD por c-di-GMP, uma estrutura em complexo com o ligante foi resolvida. Como esperado, o dinucleotídeo foi encontrado no sítio inibitório do domínio GGDEF, onde o motivo R367xxD370 e o resíduo R402 são responsáveis pela maior parte das interações com c-di-GMP. No entanto, nenhuma grande mudança estrutural foi observada entre as formas apo e holo de PelD, ao contrário de outros sistemas efetores tal como LapD e domínios PilZ. Curiosamente, apenas uma molécula de c-di-GMP foi encontrada no sítio, contrastando com a forma dimérica intercalada normalmente ligada aos sítios inibitórios de domínios GGDEF, tais como em PleD e WspR. Estudos de ITC confirmaram a estequiometria 1:1 em solução. Isso mostra a versatilidade dos diversos receptores já identificados até o momento, frente à ligação desse dinucleotídeo. Estudos de bioinformática identificaram uma potencial região de coiled-coil na hélice juxtamembrana de PelD, resíduos 115-160, provavelmente responsável pela homodimerização. Visando uma comprovação experimental dessa hipótese, uma construção contendo toda a porção citoplasmática, PelD111-455, foi expressa e purificada. Estudos comparativos de dicroísmo circular e ultracentrifugação analítica entre as construções PelD176-455 e PelD111-455 realmente demonstraram que os resíduos extras presentes em PelD111-455 formam uma hélice-α e são responsáveis pela dimerização da porção citoplasmática da proteína. De modo geral, os resultados aqui apresentados não só contribuirão para o entendimento dos mecanismos de regulação das vias de sinalização mediadas por c-di-GMP como, em longo prazo, poderão levar ao desenvolvimento de agentes contra infecções bacterianas. / Microorganisms may be presented either in planktonic free-swimming life-style or adhered to surfaces, forming a complex and dynamic community known as biofilm. In recent years, with the progress of research at the molecular level, it was identified that the majority of bacteria use guanosine monophosphate (3\'-5 \')-cyclic dimeric (c-di-GMP) as a second messenger. Generally, this molecule controls the cell signaling, virulence, communication between cells and expression of proteins related to the phenotype of biofilms in response to its intracellular concentration. Its synthesis and degradation are controlled respectively by diguanylate cyclases (DGC) containing the GGDEF domain and phosphodiesterases (PDE) with the domains EAL or HD-GYP. In Pseudomonas aeruginosa (PA14) a novel class of receptor specific for c-di-GMP has been identified, the transmembrane protein PelD, which contains a GAF and degenerate GGDEF domains in the cytoplasmic portion. Its modulation through this dinucleotide controls the production of exopolysaccharides by the components of the conserved operon pel and directly influences the ability of biofilm formation. Due to the paucity of data about the molecular events of the signaling mechanism mediated by c-di-GMP, this study aimed to characterize biophysically and structurally the protein PelD. Various soluble constructions of PelD were cloned and expressed, and the construction comprising the residues 176-455 (PelD176-455) was successfully crystallized and its structure was determined by iodine-SAD. The final model showed the two characteristic domains of families GAF and GGDEF, and the inter-domain interface composed primarily of hydrophobic residues. Seeking an understanding of the molecular basis of recognition and activation of PelD by c-di-GMP, a structure in complex with the ligand was solved. As expected, the dinucleotide was found at the inhibitory site of the GGDEF domain, where the motif R367xxD370 and the residue R402 are responsible for most of the interactions with c-di-GMP. However, no major structural change was observed between the apo and holo forms of PelD, unlike other effector systems such as LapD and domains PilZ. Interestingly, only one molecule of c-di-GMP was present on the site, in contrast to the dimeric intercalated form normally found at I-sites GGDEF domains, such as PleD and in WspR. ITC studies confirmed the 1:1 stoichiometry in solution. This shows the versatility of the various receptors identified so far, compared to the binding of dinucleotide. Bioinformatics studies have identified a potential coiled-coil region in the juxtamembrane helix of PelD, residues 115-160, probably responsible for homodimerization. Aiming at an experimental confirmation of this hypothesis, a construct containing the full cytoplasmic portion, PelD111-455 was expressed and purified. Comparative studies of circular dichroism and analytical ultracentrifugation between constructs PelD176-455 and PelD111-455 indeed demonstrated that the extra residues present in PelD111-455 form an α-helix and are responsible for dimerization of the cytoplasmic portion of the protein. Overall, the results presented here not only contribute to the understanding of the mechanisms of regulation of signaling pathways mediated by c-di-GMP as in the long run, may lead to the development of agents against bacterial infections.

Introdução e objetivos: A produção de beta-lactamases de espectro ampliado (ESBLs) tem sido restrita a espécies do gênero Klebsiella spp. e E. coli, sendo associada a altos índices de resistência, morbidade e mortalidade. Uma vez que os determinantes genéticos para ESBLs (genes blaESBL) são mediados por plasmídios, a sua disseminação para outras espécies de importância médica é considerada uma urgência epidemiológica. Os genes que codificam para ESBLs são mais comumente encontrados em membros da família Enterobacteriaceae, porém, plasmídeos, integrons, e sequências de inserção têm contribuído para o aumento da incidência de genes blaESBL entre outras bactérias Gramnegativas, incluindo Pseudomonas aeruginosa. Infelizmente, uma das maiores dificuldades associada à identificação precoce da produção de ESBL em agentes de infecção hospitalar como Pseudomonas aeruginosa tem sido a padronização de métodos fenotípicos, os quais são afetados por resultados falso-negativos, decorrentes de mecanismos intrínsecos que mascaram a presença destas enzimas (i.e., produção de beta-lactamase AmpC de origem cromossômica). O presente estudo teve como objetivo caracterizar feno e genotipicamente a produção de ESBLs em isolados clínicos de P. aeruginosa recuperados de diferentes hospitais do Estado de São Paulo durante o período de 2004-2008. Materiais e métodos: 35 amostras de P. aeruginosa provenientes de 4 diferentes centros médicos de São Paulo, com perfil de resitência às cefalosporinas de terceira geração, foram submetidas à triagem fenotípica para a produção de ESBL na presença e ausência de inibidores específicos (ácido clavulânico e cloxacilina). A confirmação genotípica foi realizada por PCR e sequenciamento, usando iniciadores para pesquisa dos genes blaCTX-M, blaTEM, blaSHV, blaOXA, blaPER e blaGES, e para o mapeamento de integron Classe 1. A diversidade genética das amostras foi realizada com auxílio do método de ERIC PCR e o índice de similaridade calculado empregando-se o coeficiente de Dice. Resultados e conclusão: Os métodos fenotípicos identificaram 3 cepas produtoras de ESBL, porém, a presença dos genes blaCTX-M e blaOXA-10 foi confirmada em 9 (33%) e 2 (7%) cepas de P. aeruginosa, respectivamente, recuperadas em 3 centros. O mapeamento e seqüenciamento do integron classe 1 encontrado revelou que duas cepas carregam 2 diferentes integrons classe 1 com genes blaCTX-M-2, aac6, e aadA6 de resistência para as cefalosporinas de terceira geração e para aminoglicosídeos. A transferência horizontal dos genes blaESBL não foi confirmada por transformação. Este estudo descreve que o aparecimento e disseminação de genes blaCTX-M em isolados clínicos de P. aeruginosa no Brasil teve sua origem a partir de 2005. Uma vez que ESBLs do tipo CTX-M têm sido amplamente descritas em Enterobactérias, a identificação destes genes em isolados de P. aeruginosa é alarmante e mostra que a mobilização horizontal do gene blaCTX-M entre diferentes gêneros e espécies é uma realidade no Brasil. Os genes que conferem resistência às metilases 16s RNAr não estavam relacionados a cepa de Pseudomonas aeruginosa produtores da enzima ESBL isoladas nas amostras de São Paulo. As cepas de Pseudomonas aeruginosa do presente estudo mostraram vários elementos de mobilização genéticos, como integrons e sequências de inserção, que podem estar participando na disseminação de resistência aos antibióticos beta- lactâmicos de amplo espectro. / Introduction and aim: The production of extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs) has been restricted to Klebsiella spp. and Escherichia coli, being associated with high rates of resistance, morbidity and mortality. Since genetic determinants for ESBLs (blaESBL genes) are mediated by plasmids, the spread to other medical important species is considered an epidemiological urgency. These genes encoding ESBLs are commonly found in members of the Enterobacteriaceae however, plasmids, integrons, and insertion sequences have contributed to the increase in the incidence of blaESBL genes among other gram-negative bacteria, including Pseudomonas aeruginosa. Unfortunately, one of the biggest difficulties associated with the early identification of the production of ESBL in nosocomial agents as Pseudomonas aeruginosa has been the standardization of phenotypic methods, which are affected by false-negative results stemming from intrinsic mechanisms which can mask the presence of these enzymes (i.e., production of chromosomal beta-lactamase AmpC). The aim of this study is to characterize phenotypical and genotypical ESBL production in clinical isolates of P. aeruginosa recovered in different hospitals in São Paulo during the period of 2004 to 2008. Materials and methods: 35 P .aeruginosa isolates intermediately resistant or resistant to third generation cephalosporin were phenotypically analyzed for the presence of ESBL with and without inhibitors (clavulanic acid and cloxacilin).Genotipic confirmation with specific primers for blaCTX-M, blaTEM, blaSHV, blaOXA, blaPER and blaGES and the characterization of the genetic environment of blaCTX-M was performed by PCR and DNA sequencing.The random amplified polymorphism DNA technique with primer ERIC-2 was carried out for the isolates genotyping and the similarity index calculated with coefficient of Dice. Results and conclusion: the phenotypic methods identified 3 ESBL producing strains, however, the presence of genes blaCTX-M and blaOXA-10 has been confirmed in 9 (33%) and 2 (7%) strains of P. aeruginosa, respectively, from 3 medical centers. The mapping and sequencing of integron class 1 revealed that two strains harbored two different class 1 integrons with aadA6-like , aac6 gene and blaCTX-M-2-like genes conferring resistance to aminoglicosydes and third generation cephalosporins. The blaESBL horizontal transferation has not been confirmed by transformation. This study describes that the emergence and spread of genes blaCTX-M in clinical isolates of P. aeruginosa in Brazil had its origin from 2005. Since CTX-M type ESBLs have been widely described in Enterobacteriaceae, the identification of these genes in P. aeruginosa is alarming and shows that the blaCTX-M horizontal mobilization among different genus and species is a reality in Brazil. The genes that confer resistance to 16s RNAr methylases are not related to ESBL positive Pseudomonas aeruginosa strains in samples of São Paulo. The Pseudomonas aeruginosa strains of this study showed several genetic mobilization elements, such as integrons and insertion sequences, which may be participating in the spread of resistance to broad spectrum betalactams.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A maioria dos micro-organismos encontra-se integrados em comunidades denominadas âbiofilmeâ. Dentre estes se destaca a Pseudomonas aeruginosa, um patÃgeno oportunista de vegetais, animais e humanos, frequentemente associado à infecÃÃes nosocomiais difÃceis de serem erradicadas devido à presenÃa de biofilme. Os antibiÃticos fluoroquinolonas, tais como a ciprofloxacina (CIP), sÃo utilizados contra esta bactÃria, entretanto, mecanismos de resistÃncia vem sendo desenvolvidos por este micro-organismo. Assim, novas formas de controle microbiano tÃm sido alvo de inÃmeras pesquisas a fim de substituir ou potencializar os mÃtodos convencionais. Para esse fim, peptÃdeos antimicrobianos (AMPs) obtidos de diversos seres vivos representam uma alternativa para o desenvolvimento de novas drogas. Formas sintÃticas anÃlogas ao AMP Hilina a1 (Hy-a1), isolado da espÃcie Hypsiboas albopunctatus, tem demonstrado excelente eficÃcia antimicrobiana, dentre os quais se destacam o peptÃdeo Lys-[Trp6]hy-a1 (Lys-a1). Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi verificar a influÃncia do peptÃdeo Lys-a1 na atividade antimicrobiana de CIP contra o micro-organismo patogÃnico Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027. A concentraÃÃo inibitÃria mÃnima (CIM), a concentraÃÃo bactericida mÃnima (CBM) e a curva de morte foram determinadas para a CIP e a Lys-a1, separadamente. A influÃncia da Lys-a1 na atividade antimicrobiana da CIP foi verificada pela metodologia checkerboard com quantificaÃÃo da biomassa e do nÃmero de cÃlulas viÃveis do biofilme atravÃs da coloraÃÃo pelo cristal violeta e contagem de unidades formadoras de colÃnia (UFC), respectivamente. Os valores de CIM e CBM da Lys-a1 foi de 125 μg.mL-1, e para a CIP foi de 0,24 e 0,48 μg.mL-1, respectivamente. Os dados mostraram que tanto a CIP quanto a Lys-a1 sÃo potentes antimicrobianos contra P. aeruginosa, sendo capazes de inibir tanto o crescimento planctÃnico como o desenvolvimento do biofilme. A interaÃÃo das substÃncias foi interpretada pelo Ãndice de concentraÃÃo inibitÃria fracional (ICIF) e mostrou um efeito aditivo, estabelecendo uma diminuiÃÃo de 16 vezes da CIM e da CBM da CIP, quando combinada com a Lys-a1. Esta influÃncia foi observada tambÃm na cinÃtica de morte e na atividade antibiofilme. Em conclusÃo, o efeito aditivo entre a Lys-a1 e a CIP na atividade antimicrobiana sugere que o peptÃdeo tem potencial como um agente terapÃutico e adjuvante para o tratamento de doenÃas infecciosas causadas por P. aeruginosa, podendo habilitar o uso de concentraÃÃes menores do antibiÃtico. / Most microorganism lies embedded in communities called "biofilms". Among these stand out Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen of plants, animals and humans, frequently associated with nosocomial infections difficult to be eradicated due to the presence of biofilm. The fluoroquinolone antibiotics such as ciprofloxacin (CIP) against this bacterium are used, however, the mechanism of resistance has been developed for this microorganism. Thus, new forms of microbial control have been the subject of numerous studies in order to replace or enhance conventional methods. For this purpose, antimicrobial peptides (AMPs) obtained from various living beings represent an alternative to the development of new drugs. Synthetic forms analogous to Hylin a1 AMP (Hy-a1), isolated from species Hypsiboas albopunctatus, has shown excellent antimicrobial efficacy, among which stand out the peptide Lys-[Trp6]hy-a1 (Lys-a1). Thus, the aim of this work was to verify the influence of the peptide Lys-a1 in antimicrobial activity of CIP against pathogenic microorganism Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027. Minimum inhibitory concentration (MIC), minimum bactericidal concentration (MBC) and the curve death were determined to CIP and Lys-a1 separately. The influence of Lys-a1 in the antimicrobial activity of the CIP has been verified by the checkerboard method to quantify the biomass and the number of viable cells in biofilms by crystal violet staining and counting of colony forming units (CFU), respectively. The MIC and MBC values of Lys-a1 was 125 μg.mL-1 and the CIP was 0.24 and 0.48 μg.mL-1, respectively. The data showed that both the CIP as Lys-a1 are potent antibiotics against P. aeruginosa is able to inhibit both the planktonic growth and biofilm development. The interaction of substances interpreted by the fractional inhibitory concentration index (FICI) and showed an additive effect, establishing a decrease of 16 times the MIC and MBC of the CIP, when combined with the Lys-a1. This effect was also observed in the kinetics of death and antibiofilm activity. In conclusion, the additive effect of the Lys-a1 and CIP in antimicrobial activity suggests that the peptide has potential as a therapeutic agent and an adjuvant for the treatment of infectious diseases caused by P. aeruginosa can enable the use of lower concentrations of the antibiotic.

As bactérias são reconhecidas pelos macrófagos através dos receptores do tipo Toll (TLR), que ativam as vias do NF-κB e das MAPKs, resultando em respostas como a fagocitose e a produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (ROS/RNS), que causam a morte do microrganismo. P. aeruginosa, uma causa comum de pneumonia associada à ventilação mecânica, é uma bactéria que utiliza diversas estratégias de virulência e defesa, incluindo mecanismos antioxidantes. O objetivo deste trabalho foi verificar a relação entre o papel da 1-Cys peroxirredoxina LsfA está envolvida na virulência de P. aeruginosa. Linhagens mutantes com deleção em lsfA ou com uma mutação pontual neste gene (troca da Cys45 por Ala, RB302) foram construídas, sendo mais sensíveis a peróxido de hidrogênio que a linhagem selvagem PA14, como verificado pelo halo de inibição de crescimento. A atividade peroxidásica de LsfA foi medida in vitro pelo ensaio de tiocianato férrico e apenas a proteína com a sequência selvagem foi ativa, enquanto uma mutação na Cys45 aboliu completamente a sua atividade. Infecção de macrófagos J774 com as linhagens ΔlsfA ou C45A resultaram em uma diminuição da morte dos macrófagos, aumento do clearance bacteriano e aumento da secreção de TNF-α em comparação aos macrófagos infectados com a linhagem PA14, sugerindo uma maior ativação das vias do NF-κB e das MAPKs nos macrófagos infectados com as linhagens mutantes. Para verificar se LsfA poderia alterar o estado oxidativo dos macrófagos, eles foram infectados com as linhagens PA14 ou RB302 (C45A) e incubadas com carbóxi-H2DCFDA, um indicador que se torna fluorescente quando oxidado. Macrófagos infectados com a linhagem mutante demonstraram um maior estado oxidativo em comparação aos macrófagos infectados com a linhagem selvagem, confirmando que LsfA limita a ativação dos macrófagos, resultando numa menor produção de TNF-α e diminuição da citotoxicidade. A via das MAPKs e do NF-κB são requeridos para a produção máxima de TNF-α nos macrófagos infectados com a linhagem RB302, o que foi demonstrado utilizando-se de inibidores farmacológicos para essas vias. Como esperado, quando os macrófagos foram infectados com a linhagem RB302 na presença do antioxidante N-acetil-cisteína, houve uma redução da produção de TNF-α a níveis semelhantes dos macrófagos infectados com a linhagem selvagem. Em modelo de pneumonia aguda, todos os camundongos infectados com a linhagem PA14 morreram 48h pós-infecção, enquanto os camundongos infectados com a linhagem RB302 sobreviveram por mais de 60 dias após a infecção. Houve uma redução do número de bactérias nos pulmões, baço e fígado nos camundongos infectados com a linhagem RB302 em comparação aos camundongos infectados com a linhagem PA14. Também foi observado um aumento na produção de citocinas pró-inflamatórias nos camundongos infectados com a linhagem RB302 em comparação aos camundongos infectados com PA14. Com isso, foi demonstrado pela primeira vez o envolvimento de uma 1-Cys peroxirredoxina de bactérias na virulência, com a modulação da resposta imune do hospedeiro in vitro e in vivo. / Bacteria are recognized by macrophages via Toll-Like Receptors (TLR), leading to a signaling pathway that activates NF-κB and MAPKs. Killing in phagossomes is achieved by reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) generation. P. aeruginosa is a common cause of ventilator associated pneumonia and it uses several strategies for virulence and defense, including antioxidant mechanisms. In this work, we show for the first time that the 1-Cys peroxiredoxin LsfA is implicated in P. aeruginosa virulence. Mutant strains with a deletion in lsfA or with a mutation (Cys45 to Ala, RB302) were constructed and they were more sensitive to H2O2 than the wild type strain PA14, as verified by a growth inhibition assay. In vitro peroxidasic activity of LsfA was measured by ferric-thiocyanate assay, and while the wild-type protein was active, the mutation in Cys45 abolished its activity. Infection of J774 macrophages with ΔlsfA or C45A strains resulted in lower cell death, increased bacterial clearance and higher TNF-α production in comparison to PA14-infected macrophages, suggesting a higher level of MAPKs and NF-κB activation due to the mutant strains. To verify whether LsfA could modify the oxidative state of infected macrophages, they were infected with PA14 or RB302 strains and incubated with carboxy-H2DCFDA, an indicator that emits fluorescence when oxidized. Macrophages infected with mutant strains showed a higher oxidative state in comparison to PA14-infected cells, thus confirming that LsfA limits macrophages activation that leads to TNF-α production and cytotoxic activity. MAPKs and NF-κB pathways are required to full production of TNF-α in macrophages infected with RB302, as shown using pharmacological inhibitors for those pathways. When macrophages were infected with RB302 in the presence of the antioxidant N-acetyl-cysteine, there was a reduction in TNF-α production as compared to PA14, as expected. In an acute pneumonia model, all PA14-infected mice died at 48h post-infection, while C45A-infected mice survived as long as 60 days. There was also reduction in bacterial counts in the lungs, spleen and liver of mice infected with RB302, in comparison to PA14-infected mice. A greater pro-inflammatory cytokine production was observed in mice infected with mutant strain in comparison to mice infected with PA14. Altogether, this work shows for the first time the role of a bacterial 1-Cys Prx that modulates host immune response in vitro and in vivo.

Foram avaliados 528 isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa de 131 pacientes fibrocísticos atendidos em um centro de referência em fibrose cística (FC) durante o período de 2005 a 2008. 135 isolados clínicos (25,6%) apresentaram subpopulação hipermutante (isolados com altas taxas de mutações) utilizando teste modificado de suscetibilidade aos antimicrobianos. Destes, 9 isolados (6,7%) de 7 pacientes foram classificados como hipermutantes (HPM) segundo estimativa da freqüência de mutação. Após seqüenciamento do gene mutS e análise de mutações relacionadas à inativação do sistema de reparo de erros no pareamento do DNA (Mismatch Repair System - MRS), foi possível observar este tipo de mutação em 5 isolados HPM de 4 pacientes. Avaliamos a formação de biofilme em 45 isolados NHPM, 9 HPM e suas respectivas subpopulações por duas metodologias. Segundo o primeiro método, 24 (53,3%) e 3 (21,4%) isolados NHPM e HPM, respectivamente, foram classificados como não-formadores de biofilme. Pelo segundo método, apenas 4 (8,9%) isolados NHPM e nenhum isolado HPM foram classificados nessa categoria. Os percentuais de resistência aos antibióticos ceftazidima, ciprofloxacino e tobramicina em condições de biofilme foram mais elevados que aqueles obtidos em crescimento plantônico e, em ambas as condições, foi possível evidenciar forte associação entre hipermutabilidade e aumento de resistência antibiótica. A associação dos macrolídeos azitromicina e claritromicina, em concentrações sub-inibidoras, com os antibióticos anti-pseudomonas, demonstrou ação inibitória sobre isolados clínicos de P. aeruginosa em condições de biofilme, o que sugere sua indicação no tratamento de infecções por P. aeruginosa pela sua ação anti-biofilme. / We evaluated 528 clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in 131 CF patients attended at a referral center for cystic fibrosis (CF) during the period of 2005 to 2008. 135 clinical isolates (25.6%) presented hypermutable subpopulation (isolates with high mutation rates) using a modified antimicrobial susceptibility method. Of these, 9 isolates (6.7%) of 7 patients were classified as hypermutable (HPM) according to the estimate of mutation frequency. After gene sequencing and analysis of mutS mutations related to inactivation of the repair system errors in DNA pairing (Mismatch Repair System - MRS), we observed this type of mutation in 5 HPM isolates of 4 patients. We evaluated the biofilm formation in 45 isolates NHPM, 9 HPM and their subpopulations by two methods. According the first method, 24 (53.3%) and 3 (21.4%) isolates NHPM and HPM, respectively, were classified as non-biofilm formers. According the second method, only 4 (8.9%) isolates NHPM and none HPM were classified in this category. The percentages of resistance to antibiotics ceftazidime, ciprofloxacin and tobramycin in conditions of biofilm were higher than those obtained in planktonic growth, and in both conditions, it was observed a strong association between hypermutability and increased antibiotic resistance. The association of macrolides azithromycin and clarithromycin, in sub-inhibitory concentrations, with anti-pseudomonas antibiotics, has shown inhibitory activity on clinical isolates of P. aeruginosa in biofilm conditions, which should be recommended for treatment of CF P. aeruginosa infections due to its anti-biofilm action.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-08-18T14:20:32Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 00 TESE PAULA Doc Final VD-30-03-2016 Com Ficha cat.pdf: 3292123 bytes, checksum: 3a9cccec1214620cbdc7f55f0d159fe1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-18T14:20:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 00 TESE PAULA Doc Final VD-30-03-2016 Com Ficha cat.pdf: 3292123 bytes, checksum: 3a9cccec1214620cbdc7f55f0d159fe1 (MD5) Previous issue date: 2015-12-16 / CAPEs / Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp. e Acinetobacter spp. estão entre as cinco principais causas de infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS), e estão associadas a um elevado índice de mortalidade em pacientes oncológicos. Diante da vulnerabilidade destes pacientes e da crescente incidência de patógenos multidroga resistentes (MDR), o presente trabalho teve por objetivo realiza um estudo epidemiológico e molecular de infecções ocasionadas por P. aeruginosa, Klebsiella spp. e Acinetobacter spp. em pacientes com neoplasias sólidas, internados em um hospital de Recife-PE. Para tal, foi realizado um estudo descritivo de corte transversal dos dados clínicos, microbiológicos e hospitalares e os genes de resistência blaSPM-1, blaIMP, blaVIM, blaKPC, blaTEM e blaCTX-M, foram investigados por meio da reação em cadeia da polimerase. Também foi realizada tipagem molecular dos isolados MDR utilizando a técnica Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-based PCR (ERIC-PCR). Entre 2012 e 2014, foram obtidos 169 isolados, sendo 58 P. aeruginosa, 36 Acinetobacter spp. e 75 Klebsiella spp.. A frequência de patógenos MDR (69,6%, IC95% 61,5% - 76,9%) foi significativamente maior que os isolados não MDR (30,4%, IC95% 23,1% - 38,5%). Dentre as bactérias resistentes aos carbapenêmicos, o gene blaSPM-1 foi detectado em P. aeruginosa (35,5%) e Acinetobacter spp. (3,8%), e o gene blaKPC detectado apenas em P. aeruginosa (25,8%). Já entre os isolados resistentes às cefalosporinas de terceira e quarta geração, o gene blaTEM estava presente em Acinetobacter spp. (25,9%) e Klebsiella spp. (30,6%) e o gene blaCTX-M em 58,3% das Klebsiella spp.. Também foi observado que o câncer de pulmão e os pacientes do sexo masculino foram predominantes na amostra e que o uso prévio de antimicrobianos durante o internamento e até três meses antes do isolamento do patógeno descrito neste estudo, apresentaram associação com o desenvolvimento de infecções por patógenos MDR. Assim, os resultados encontrados podem contribuir com epidemiologia molecular dos genes de resistência presentes no ambiente hospitalar, além de ressaltar a importância da monitorização contínua das IRAS em pacientes com câncer internados por longos períodos, a fim de melhorar os cuidados prestados a estes pacientes. / Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp. and Acinetobacter spp. are among the five leading causes of Healthcare-associated Infections (HAI) in cancer patients, and those associated with a high mortality rate. Because of the vulnerability of patients and the increasing incidence of multidrug-resistant pathogens (MDR), this study aimed to realize an epidemiological and molecular study of infections caused by P. aeruginosa, Klebsiella spp. and Acinetobacter spp. in patients with solid tumors, admitted to a Recife-PE hospital. Therefore, we conducted a descriptive cross-sectional study of clinical, microbiological and hospital, and the resistance genes blaSPM-1, blaIMP, blaVIM, blaKPC, blaTEM and blaCTX-M, were investigated by polymerase chain reaction. It was also performed molecular typing of MDR isolates using Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-based PCR (ERIC-PCR). Between 2012 and 2014, were obtained 169 isolates, 58 P. aeruginosa, 36 Acinetobacter spp. and 75 Klebsiella spp.. The frequency of MDR pathogens (69.6% 95% 61.5% - 76.9%) was significantly higher than non-MDR isolates (30.4% 95% 23.1% - 38.5%). Among the carbapenem-resistant bacteria, the blaSPM-1 gene was detected in P. aeruginosa (35.5%) and Acinetobacter spp. (3.8%), and blaKPC gene detected only in P. aeruginosa (25.8%). Among the resistant isolates to the third and fourth generation cephalosporins, the blaTEM gene was present in Acinetobacter spp. (25.9%) and Klebsiella spp. (30.6%) and blaCTX-M gene in 58.3% of the Klebsiella spp.. It was also noted that lung cancer and male patients were predominant in the sample and the previous use of antimicrobials during hospitalization and antibiotic use up to three months before the pathogen isolation described in this study were associated with the development of pathogen infections MDR. Thus, the results can contribute to molecular epidemiology of resistance genes present in the hospital, and underline the importance of continuous monitoring of HAI in cancer patients hospitalized for long periods aiming improve the care provided to these patients.

Submitted by Irene Nascimento (irene.kessia@ufpe.br) on 2017-04-10T17:01:48Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Iasmim Lucas da Silva.pdf: 2916095 bytes, checksum: c23cab722c74173251220dd40ba0f0cc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-10T17:01:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Iasmim Lucas da Silva.pdf: 2916095 bytes, checksum: c23cab722c74173251220dd40ba0f0cc (MD5) Previous issue date: 2016-07-28 / Facepe / A L-asparaginase (E.C. 3.5.1.1) é essencial para um curso normal do ciclo celular, estando presente em bactérias, fungos, animais e plantas e não é encontrada em seres humanos. Importante para o tratamento da leucemia linfoblástica aguda dentre outras doenças leucêmicas e a doença de Hodgkin. As Pseudomonas são ocorrentes no solo e água, apresentam a capacidade de produzir enzimas, como é o caso da L-asparaginase do Tipo I e II. Com isso, o objetivo deste trabalho foi obter melhores parâmetros para otimização, purificação parcialmente da L-asparaginase excretada por Pseudomonas sp. isolada da rizosfera da Caesalpinia. pyramidalis. No presente estudo visando otimizar a produção do complexo de L-asparaginase foi realizado um planejamento experimental central composto (23) com 4 pontos centrais, sendo as variáveis pH (4, 7 e 10), temperatura (30°C, 40°C e 50°C) e concentração da L-asparagina (0,2%, 0,5% e 0,8%) estudadas. Posteriormente realizou-se a análise estatística das variáveis e a análise da variância (ANOVA) dos resultados obtidos que foram avaliados através do programa Statistica, versão 7.0 (StatSoft Co., USA). Em seguida, realizou-se a purificação da enzima L-asparaginase excretada por Pseudomonas sp. através da técnica de cromatografia de troca iônica e uma eletroforese SDS-PAGE. Posteriormente, foi realizada a caracterização da enzima purificada, avaliando os efeito e estabilidades em diferentes valores de pH e temperaturas, por fim a enzima em diferentes substratos e íons. Finalizando foram efetuadas as identificações morfológica e molecular da bactéria, utilizando o Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) e a nível de espécie usou-se o primer 16 S respectivamente. Os resultados obtidos no procedimento de otimização da atividade de L-asparaginase foram obtidos nos ensaios com concentração de L-asparagina a 0,8%, pH 4 e temperatura de 30°C, com valores de atividades 0,5604 U/mL e 0,0632 mg de proteína/mL, respectivamente. Os melhores dados da cromatografia de troca iônica mostraram que das 57 frações coletadas, as de melhor atividade para L-asparaginase, foram as frações de valores 1,1412 U/mL e 1,1417 U/mL, com um rendimento de 0,64% e 18,6 U/mg de atividade específica. Realizou-se uma eletroforese PAGE-SDS para obter o peso molecular da proteína, apresentando como peso molecular de 32 kDa. Na caracterização enzimática, a enzima se mantem estável em pH 7, em relação a temperatura, tivemos a melhor estabilidade 30 °C, a L-asparaginase apresentou melhor efeito nos substratos L-asparagina seguido da L-glutamina e por fim o nitrato de sódio (NaNO3), cloreto de Mercúrio (HgCl2), cloreto de magnésio (MgCl2) e ureia apresentaram os melhores efeitos de íons. Em relação à identificação bacteriana encontrou-se colônias em forma de bastonetes curtos, com longos flagelos e a nível de espécie foi denominada com sendo Pseudomonas aeruginosa. Portanto, os resultados obtidos da L-asparaginase caracterizada, isolada da P. aeruginosa, mostraram resultados significativos e extremamente importantes para a indústria biotecnológica, apresentando assim a viabilidade e confiabilidade do estudo realizado. / L-asparaginase (E.C. 3.5.1.1) is essential for the normal course of cell cycle being present in bacteria, fungi, animals and plants and is not found in humans. Important for the treatment of acute lymphoblastic leukemia among other leukemic disease and Hodgkin's disease. The Pseudomonas are occurring in soil and water, have the capacity to produce enzymes, such as L-asparaginase Type I and II. Thus, the aim of this study was to obtain the best parameters for optimization, purification part of L-asparaginase secreted by Pseudomonas sp. isolated from the rhizosphere of Caesalpinia pyramidalis. In the present study to optimize the production of L-asparaginase complex was performed a central experimental design compound (23) with four central points and the variables pH (4, 7 and 10), temperature (30°C, 40°C and 50°C) and concentration of L-asparagine (0,2%, 0,5% and 0,8%) studied. Later there was the statistical analysis of the variables and analysis of variance (ANOVA) of the results that were evaluated through Statistica, version 7.0 (StatSoft Co., USA). Then there was the purification of L-asparaginase enzyme secreted by Pseudomonas sp. by ion exchange chromatography technique and SDS-PAGE electrophoresis. Afterwards, the characterization of the purified enzyme was carried out to evaluate the effect and stability at different pH values and temperatures, and finally the enzyme on different substrates and ions. Finalizing were made the morphological and molecular identification of bacteria using the Scanning Electron Microscope (SEM) and the kind of level we used the primer 16S respectively. The results of the optimization procedure for L-asparaginase activity in the assays were obtained with a concentration of L-asparagine to 0,8%, pH 4 and 30°C, with activity values 0,5604 U/mL and 0,0632 mg of protein/mL, respectively. The best data ionic exchange chromatography showed that the 57 collected fractions, the best activity to L-asparaginase were fractions values 1,1412 U/mL and 1,1417 U/mL, with a yield of 0,64 % and 18,6 U/mg specific activity. We performed a SDS-PAGE electrophoresis for the molecular weight of the protein, presenting as molecular weight of 32 kDa. In the enzyme characterization, the enzyme is stable at pH 7 with respect to temperature had better 30 °C stability, L-asparaginase had a better effect on the L-asparagine substrate followed by L-glutamine and finally sodium nitrate (NaNO3), mercury chloride (HgCl2), magnesium chloride (MgCl2) and urea showed the best effects ions. Regarding the bacterial identification met colonies in the form of short rods with flagella long and species level was named as being Pseudomonas aeruginosa. Therefore, the results of characterized L-asparaginase, isolated from P. aeruginosa, showed significant results and extremely important for the biotechnology industry, thus presenting the viability and reliability of the study performed.

Uma característica associada à capacidade de Pseudomonas aeruginosa sobreviver e disseminar-se frente a situações adversas encontradas no ambiente e no organismo de hospedeiros é a regulação de genes de resposta a condições de estresse celular, que incluem o evento de choque térmico. A exposição do microrganismo a um ambiente de alta temperatura resulta na indução da síntese de proteínas específicas, representadas por chaperonas e proteases, que conferem um aumento da viabilidade celular microbiana em condições consideradas letais. Presume- se que o gene PA 0657 de P. aeruginosa O1 possa estar associado à indução ou supressão do processo transcricional de genes envolvidos na resposta ao choque térmico. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi caracterizar a função do gene PA0657 de P. aeruginosa O1. Para isso, análises bioinformáticas foram realizadas e o gene foi clonado e expresso em sistema bacteriano, produzindo uma proteína recombinante que foi purificada e caracterizada enzimaticamente. Além disso, uma linhagem de P. aeruginosa O1 com o gene PA0657 rompido por recombinação homóloga foi construída, sendo submetida, juntamente com a linhagem selvagem, a uma condição de estresse térmico, permitindo que a expressão de diversos genes associados ao evento de choque térmico pudessem ser avaliadas por qRT-PCR. Os resultados mostraram que a proteína recombinante PA0657 foi capaz de degradar adenosina trifosfato (ATP), dependente do íon Zn2+. Foi possível verificar também que a linhagem rompida perdeu a capacidade de produzir o pigmento piocianina quando crescida em meio cetrimida e não apresentou seu fenótipo mucóide. Em análise in silico observou-se que a região promotora do gene PA0657 é dependente de σ32 e a análise de expressão gênica evidenciou uma diminuição de expressão do gene rpoH na linhagem selvagem de PAO1 após choque térmico, sendo este gene significativamente expresso na linhagem rompida. Observou-se também um acentuado aumento na expressão do gene algU, nestas mesmas condições, na linhagem selvagem PAO1, com ausência de expressão na linhagem rompida. É possível concluir, dessa forma, que o gene PA0657 exerce participação importante no processo de regulação de resposta ao choque térmico e está relacionado com a conversão do fenótipo mucóide. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES / A feature associated with the ability of Pseudomonas aeruginosa survive and dissemination in adverse conditions found in the environment and in hosts‘ organisms is a specific genes regulation of stress response, including heat shock event. The exposure of microorganisms to a high temperature environment results in the induction of synthesis os specific proteins, represent by chaperones and proteases, conferring an increase og the microbial cell viability under conditions considered lethal. . It is presumed that the PA0657 gene of P. aeruginosa O1 can be related to the induction or suppression of transcriptional process of genes that are involved in a response to heat shock. In this context, the aim of this work was to characterize the function of the PA0657 gene of P. aeruginosa O1. In this way, bioinformatic analyzes were performed and the gene was cloned and expressed in bacterial system, producing recombinant protein which was purified and enzymatically characterized. Moreover, the PA0657 gene of P. aeruginosa O1 strain was disrupted by homologous recombination. The wild type strain and the disrupted strain were submitted to a thermal stress and the expression of various genes associated with heat shock event could be evaluated by qRT -PCR. The results showed that the PA0657 recombinant protein was capable of degrading adenosine triphosphate (ATP) of Zn2+ dependent manner. It was also verified that the ruptured strain lost its ability to produce pyocyanin pigment when grown on cetrimide means and its mucoid phenotype. It was possible to find in computational analysis that the promoter region of the PA0657 gene is dependent on σ32. The gene expression analysis showed a decrease in expression of the rpoH gene in the wild type strain after heat shock, this gene is significantly expressed in the disrupted strain. A significant increase in expression of the algU gene was observed, on the wild type strain with absence of expression in the disrupted strain. Therefore, it was possible to conclude that the PA0657 gene cts in the regulatory process of thermal shock response and is related to the conversion of the mucoid phenotype.

Orientador: Antonio Fernando Ribeiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-09T13:21:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mathiazzi_IsabellaChiarini_M.pdf: 1597687 bytes, checksum: 20d1c4dff9a3dbb344a4d175911ae3cb (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A fibrose cística (FC) é uma doença multissistêmica, hereditária, limitante da vida. As infecções respiratórias, principalmente por Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) são responsáveis por repetidas exacerbações pulmonares, que evoluem para deterioração da função pulmonar, principal causa de morbi-mortalidade da FC. Este estudo teve como objetivo avaliar a variabilidade genotípica e fenotípica da P. aeruginosa isolada em dois momentos na evolução da doença pulmonar em pacientes com FC atendidos em um centro de referência. Foi realizado um estudo descritivo longitudinal. A secreção respiratória foi coletada sob a forma de escarro ou swab de orofaringe, efetuada sua identificação microbiológica e análise por Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD). Os dados foram apresentados de forma descritiva e em tabelas, o programa utilizado foi o SAS versão 8.02. Foram incluídos 81 pacientes, 52 apresentaram P. aeruginosa e 29 não apresentaram, foram identificadas 71 cepas não - mucóide e 67 mucóide. RAPD identificou 14 padrões com o primer 208 e 10 padrões com o primer 272. Exceto no caso dos irmãos gêmeos, não foram observadas cepas com mesmo padrão. Em nosso estudo, verificamos heterogeneidade da P. aeruginosa, independente do fenótipo da colônia. Observamos que 35,29% dos pacientes mantiveram um único genótipo. Os resultados mostraram: uma distribuição homogênea das cepas mucóide e não-mucóide; ausência de relação entre o genótipo e o fenótipo da P. aeruginosa; heterogeneidade fenotípica e genotípica da P. aeruginosa entre os pacientes fibrocísticos e na evolução de um mesmo paciente; evidências de não aquisição da P. aeruginosa pelos pacientes no ambiente de nosso centro de atendimento; um único caso de infecção cruzada (gemelares) / Abstract: Cystic fibrosis (CF) is a multiorgan inherited disease, and it restricts life. The respiratory infections, mainly by Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), are responsible for repeated lung exacerbations, which progress to the deterioration of lung functioning, the main cause of morbi-mortality of CF. The purpose of this work was to analyze the variability of P. aeruginosa regarding its genetic and phenotypic characteristics isolated in two moments during the evolution of the lung disease in patients with CF. A longitudinal descriptive study was performed. Respiratory secretion was collected as sputum or oropharynx swab, its microbiological identification and analysis by Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD). The data were presented in a descriptive way and in tables; SAS 8.02 the program used. 81 of the patients were included, 52 presented P. aeruginosa, 29 didn¿t present it; non-mucoid strains were identified in 71 of the samples and mucoid strains in 67. RAPD identified 14 patterns with primer 208 and 10 patterns with primer 272. With exception of the twin siblings¿ case, strains with the same pattern were not observed. In our study, we verified high P. aeruginosa heterogeneity, independent of the colony phenotype. We observed that 35,29% of the patients conserved only one P. aeruginosa genotype. The results showed: a balanced distribution of mucoid and non-mucoid strains; that there isn¿t a relationship between the P. aeruginosa genotype and phenotype; there was a phenotypical and genotypical P. aeruginosa heterogeneity among patients with cystic fibrosis and in the evolution of the same patient; there was no evidence of acquisition of P. aeruginosa by the patients environment in our care centre; only one case of cross-infection (twins) / Mestrado / Saude da Criança e do Adolescente / Mestre em Saude da Criança e do Adolescente

Biocélulas a combustível são dispositivos eletroquímicos que convertem energia química em energia elétrica por meio da combustão bioeletroquímica de matéria orgânica. Células a combustível microbianas são biocélulas que utilizam microrganismos para metabolizar substratos no compartimento anódico. Entre os diversos microrganismos utilizados, algumas bactérias têm se destacado por apresentarem características de transferência de elétrons altamente eficientes, seja diretamente ou indiretamente (mediada), para os eletrodos. Entre as bactérias mais estudadas a espécie Pseudomonas aeruginosa possui grande importância devido à sua capacidade de produzir piocianina, um pigmento azul-esverdeado, que possui as características necessárias para a transferência de elétrons. A Pseudomonas aeruginosa apresenta melhor desempenho na produção da piocianina em meios de cultura enriquecidos com glicerol. O glicerol, por sua vez, é o principal subproduto na produção de biodiesel, e amplamente utilizado em indústrias como a de cosméticos. No entanto, o aumento exponencial na produção de biodiesel resultou no acúmulo do glicerol residual, o que fez seu preço cair substancialmente nos últimos anos e ocasionado o acúmulo como um subproduto indesejável. Com base nesses dados, o objetivo deste trabalho foi estudar linhagens de P. aeruginosa quanto à produção de pigmentos em caldo nutriente enriquecido com glicerol e caldo King (meio de cultura próprio para a produção de piocianina, que contém em sua formulação 10 g.L-1 de glicerol) e células a combustível microbianas com a linhagem que apresentar os melhores resultados em relação à produção de pigmentos. Os resultados mostraram que das seis linhagens apenas três se mostraram capazes de produzir piocianina em meio King, sendo que a cepa ATCC 27853 apresentou o melhor desempenho. As células a combustível microbianas construídas com meio de cultura caldo nutriente enriquecido com glicerol e meio King mostraram que é possível produzir pequenas quantidades de corrente com esta bactéria. Os estudos de cronoamperometrias e reação de redução de oxigênio apontam que a utilização de Nafion® como membrana trocadora de prótons é ineficiente devido à alta concentração de íons Na+ e K+ e, portanto, mais estudos devem ser realizados na ausência deste tipo de membrana para a otimização da produção de corrente. / Biofuel cells are electrochemical devices that convert chemical energy into electrical energy by the bioelectrochemical combustion of organic matter. Microbial fuel cells are biofuel cells that use microorganisms to metabolize substrates in the anodic chamber. Among several microorganisms used, some bacteria species have gained special attention because they show high efficiency in the electronic transfer, directly or indirectly (mediated transfer), toward the electrodes. Among the most studied bacteria species Pseudomonas aeruginosa showed a great importance due to their capacity to produce pyocyanin, a blue-green pigment, that possess the necessary features to mediate electron transfer. The P. aeruginosa show the best performance for pyocyanin production in culture media enriched with glycerol. Glycerol is the main byproduct of biodiesel production and largely used in the cosmetics industries. Nevertheless, the exponential increase in the biodiesel production resulted in a glycerol byproduct accumulation that made its price decreased substantially in the last years and became an undesirable product. With this information, the aim of this study was to investigate the pigment production by P. aeruginosa strains in nutrient broth enriched with glycerol and King broth (a culture medium specific for pyocyanin production which uses 10 g.L-1 of glycerol) and microbial fuel cells with P. aeruginosa strains which showed the best results in the pigment production experiments. The results showed that among the six studied strains only three were able to produce pyocyanin in King culture medium, and the ATCC 27853 strain showed the best performance. Microbial fuel cells constructed with nutrient broth enriched with glycerol and King broth media resulted in a small current output. The experiments with chronoamperometry and oxygen reduction reaction suggest that the utilization of Nafion® as a proton exchange membrane is inefficient due the high Na+ and K+ ion concentration. So, new experiments with membraneless microbial fuel cells are needed to improve the current output.