Quorum sensing (QS) is a type of microbial communication used by bacteria to coordinate their behavior based on population density, regulating complex processes like biofilm formation and virulence, among other behaviors. Quorum quenching (QQ), on the other hand, disrupts this communication, usually by degradation of the QS signaling molecule. QQ offers a potential strategy for controlling bacterial behaviors linked to pathogenicity and biofouling. Despite significant advances in understanding and modeling the spatial-temporal behavior of QS, predictive modeling of QQ remains nascent, with a notable gap in the quantitative assessment of QQ's impact on QS. Here we show quantitative evaluation and characterization of the effect of QQ on QS in agar-based experiments, combined with an experimentally validated computational model. This research utilizes green fluorescence in E. coli MG 1655 as an indicator of QS activation, focusing on the degradation of Acyl-Homoserine Lactone (AHL), a key QS molecule in Gram-negative bacteria linked to pathogenicity, by the AiiA enzyme in engineered AiiA-producing Salmonella Typhimurium 14028. Our findings suggest that QQ more effectively influences QS in spatial configurations of the populations with larger interaction surfaces and shorter diffusion distances. Contrary to our initially held hypothesis, the primary effect of QQ is not a delay in QS onset but rather an attenuation of QS activity, with the area-under-the-curve of fluorescence serving as a quantitative metric. This study also introduces, to the best of our knowledge, one of the first instances of experimentally validated predictive modeling for QQ, applied to agar-based experimental setups. We posit that the quantitative experimental characterization and modeling framework presented in this research will enhance the understanding of bacterial community interactions. Enhanced comprehension of QQ and QS behaviors holds significant promise for advancing practical applications, particularly in mitigating or diminishing undesirable QS-associated activities. This is especially relevant in areas like biofouling, waste treatment, and the reduction of infections and progression of diseases in plants and animals, areas increasingly important as concerns about drug resistance in microbes and food security escalates. / Master of Science / One of the ways bacteria communicate with each other is called quorum sensing (QS), where they use chemical signals to organize and time group behavior, including forming communities encapsulated in protective layers, called biofilms, and engaging in virulent attacks against hosts. Quorum quenching (QQ) in bacteria, however, disrupts this communication system, usually by breaking down the chemical signals that bacteria use to send messages to each other. Even though QS has been studied extensively, determining how to predict and control QQ is still a nascent area of research. Here, we studied and characterized how QQ affects QS by doing experiments with bacteria populations in agar (a jelly-like substance) and applied a computational model to explain and ultimately predict the experimental observations. Engineered QS population (E. coli MG 1655) produced Acyl-Homoserine Lactone (AHL) signaling molecules, and engineered QQ bacteria (S. Tm 14028) used the Autoinducer Inactivation A (AiiA) enzyme to break down the AHL. According to our results, QQ doesn't delay the QS bacteria's group behaviors (in our case, green fluorescent signal production); it weakens the signal instead. Understanding QQ and QS better, especially through measurements and modeling, could lead to expanded methods of deterring harmful bacterial behavior, managing waste better, and stopping diseases in plants, animals, and humans, especially with the concerning rise of drug-resistant microbes and food security. One exciting possibility is using QQ to protect plants from bacterial infections. This could be a way to shield our crops without always relying on antibiotics.

La découverte d'un contexte génétique chez les streptocoques – codant un petit peptide hydrophobe (SHP) et un régulateur transcriptionnel appartenant à la famille Rgg –, suivi de l'étude d'un de ces loci chez S. thermophilus LMD-9, a conduit à l'hypothèse que les protéines régulatrices Rgg en association avec une phéromone putative SHP pourraient intervenir dans un mécanisme de type quorum-sensing (QS) chez les bactéries à Gram positif. La première partie de ma thèse a consisté à confirmer cette hypothèse sur le locus shp/rgg1358 de S. thermophilus LMD-9, espèce contenant le plus grand nombre de systèmes SHP/Rgg dans son génome. Pour ceci, les étapes impliquées dans un mécanisme de QS ont été étudiées : la sécrétion, la maturation et la détection à une concentration seuil de la phéromone, sa réimportation à l'intérieur de la cellule, son interaction avec un régulateur transcriptionnel et enfin l'interaction de la protéine régulatrice à l'ADN. Par l'utilisation d'approches génétiques et biochimiques, nous avons démontré l'existence d'un nouveau mécanisme de QS impliquant pour la première fois un régulateur transcriptionnel Rgg et une phéromone SHP, importée à l'intérieur de la cellule par le transporteur d'oligopeptides AmiCDEF. Le rôle de la protéase membranaire, Eep, a également été démontré dans la maturation de la phéromone, dont la forme mature a été déterminée par spectrométrie de masse et validée in vivo. Dans un second temps, nous avons exploré la fonctionnalité de ce nouveau mécanisme sur d'autres loci shp/rgg, dans le but d’étudier l'existence d’éventuels phénomènes de cross-talk entre les bactéries. L'étude de nouveaux loci, en système hétérologue chez S. thermophilus LMD-9, a permis d'étendre la fonctionnalité du mécanisme à deux systèmes SHP/Rgg de streptocoques pathogènes, à savoir S. agalactiae et S. mutans. En parallèle à ce travail de caractérisation, l'identification des régulons des systèmes SHP/Rgg a été entreprise. La construction d'un arbre phylogénétique des protéines Rgg-like a permis d'identifier 68 systèmes SHP/Rgg, que nous avons classés en trois groupes. L'analyse des régions promotrices des gènes shp a conduit à l'identification d'un site putatif de liaison des protéines Rgg à l'ADN spécifiques de chaque groupe SHP/Rgg. Une approche in silico a ensuite été menée afin de rechercher, dans les génomes séquencés de streptocoques, les gènes cibles putatifs. Alors que des cibles proximales ont été détectées pour les groupes II et III, des cibles distales ont été identifiées dans les groupes I et II. Actuellement, la validation de certaines cibles est en cours au laboratoire. A l'avenir, ce travail pourrait permettre le développement de petits peptides permettant d'optimiser l'utilisation de S. thermophilus en industries laitières et de réduire la virulence des streptocoques pathogènes. / The discovery of a genetic context – encoding a small hydrophobic peptide (SHP) and a transcriptional regulator belonging to the Rgg family (in nearly all streptococcal genomes) –, following by the study of one of this loci in S. thermophilus LMD-9, led to the hypothesis that the regulatory proteins Rgg in association with a putative pheromone SHP could define a novel quorum-sensing (QS) regulatory mechanism in Gram-positive bacteria. The first part of my PhD consisted to validate this hypothesis. For this purpose, we analyzed the SHP/Rgg system in all the steps that are commonly involved in QS mechanisms: (i) secretion of the putative pheromone, (ii) maturation of the pheromone, (iii) capture of the pheromone from the external environment at a threshold concentration, (iv) importation of the pheromone inside the cell and (v) interaction of the transcriptional regulator to the promoter regions of targeted genes. Experimentally, we focused on the so-called shp/rgg1358 locus of S. thermophilus LMD-9, which is the streptococcal species containing the largest number of shp/rgg pairs in its genome. By using genetic and biochemistry approaches, we uncovered a new QS mechanism that involves the pheromone SHP, the oligopeptide transporter AmiCDEF for the uptake of the pheromone and the transcriptional regulator Rgg for the control of target gene expression. Furthermore, we showed that the membrane protease Eep participates in the production of the mature pheromone, which has been identified by mass spectrometry. Once characterized, the second part of my PhD was to explore the functionality of this new QS system in other streptococcal strain or species, in order to determine if cross-reactivity phenomenon between streptococci can occur. By using heterologous expression in S. thermophilus LMD-9, we extended the functionality of the SHP/Rgg system to two pathogenic streptococcal species, i.e. S. agalactiae and S. mutans. The last part of my PhD consisted in identifying the regulon of all SHP/Rgg systems. Following the construction of a phylogenetic tree of the Rgg-like proteins in low GC Gram-positive bacteria, we identified 68 SHP/Rgg systems that we classified in three groups. Analyzing the promoter regions of all shp genes led to the identification of a putative Rgg DNA binding site specific to each SHP/Rgg group. An in silico approach was used to scan all sequenced streptococcal genomes for the three identified patterns. Whereas proximal target genes were detected for groups II and III, distal target genes were found in groups I and II. In addition, we uncovered that putative Rgg DNA binding sites can be localized in coding or non-coding region. Currently, validations are in progress. To sum-up, my PhD studies provided evidences that the Rgg proteins in association with small peptide pheromones define a new QS mechanism that seems to regulate the expression of distal and proximal genes in a species-dependent manner. Important insights should be obtained concerning a putative crosstalk among streptococci that involves the SHP/Rgg QS system. My studies may constitute a basis for the development of small peptides to optimize the use of S. thermophilus in dairy factories and reduce the virulence of pathogenic streptococci.

Chez les bactéries sporulantes du genre Bacillus, des mécanismes importants tels que la sporulation et la virulence sont régulés par des systèmes de communication cellulaire qui impliquent des peptides de signalisation et des régulateurs de la famille RNPP (Rap, NprR, PlcR, PrgX). L'objectif de mon travail de thèse a été de déterminer le rôle du régulateur NprR chez les bactéries du groupe B. cereus. Ce travail se divise en trois parties complémentaires. La première partie a consisté à montrer que NprR est impliqué dans un système de communication cellulaire. Nous avons montré que NprR est un régulateur transcriptionnel de début de phase stationnaire qui est dépendant du peptide de signalisation NprX. Associé à NprX, NprR active la transcription du gène nprA qui code pour une protéase extracellulaire. Nous avons démontré que le peptide NprX est sécrété, maturé puis réimporté dans la cellule bactérienne par deux systèmes d'oligopeptide perméase (Opp et Npp). Une fois dans la cellule, la forme mature de NprX (vraisemblablement l'heptapeptide SKPDIVG) se lie à NprR et permet la transcription du gène nprA. Nous avons ensuite cherché à déterminer la fonction de ce régulateur au cours du cycle infectieux de B. thuringiensis (Bt) chez l'insecte. Nous avons montré que NprR est actif après la mort de l'insecte et permet aux bactéries de survivre, sous forme de cellules végétatives, dans les cadavres. Une analyse transcriptomique indique que NprR régule l'expression d'au moins 41 gènes qui codent notamment pour des enzymes dégradatives et un locus de gènes impliqués dans la production d'un peptide synthétisé de façon non ribosomique (la kurstakine). Nous avons démontré que les gènes codant pour les enzymes dégradatives s'expriment spécifiquement après la mort de l'hôte et que les produits de ces gènes sont essentiels pour hydrolyser différents substrats (protéines, lipides, chitine), ce qui suggère que Bt a un mode de vie nécrotrophe dans le cadavre. La kurstakine est essentielle pour la survie de Bt pendant son développement nécrotrophe et nous avons montré que cette molécule est nécessaire pour le swarming et la formation de biofilm. Par ailleurs, un mutant du gène nprR ne se développe pas et ne sporule pas efficacement dans le cadavre. L'ensemble de nos résultats indiquent que le necrotrophisme est un mode de vie hautement régulé, qui est essentiel dans le cycle infectieux de Bt car il contribue à la transmission horizontale de ce micro-organisme. Enfin, nous avons étudié la régulation de l'expression des gènes nprR et nprX. Nous avons montré que les gènes nprR-nprX sont co-transcrits à partir d'un promoteur dépendant de sigma-A (PA) situé en amont du gène nprR. La transcription à partir de ce promoteur débute lors de l'entrée en phase stationnaire et est contrôlée par deux régulateurs transcriptionnels: CodY et PlcR. Le répresseur CodY pourrait se lier à l'ADN en amont du promoteur PA et réprimer la transcription des gènes nprR-nprX pendant la phase exponentielle de croissance. Au début de la phase stationnaire, le contrôle négatif de CodY est levé et PlcR active la transcription de nprR-nprX en se liant à une boîte PlcR située en amont de PA. Nos résultats indiquent que nprX est également transcrit indépendamment de nprR à partir de deux promoteurs, PH et PE, respectivement dépendant de sigma-H et sigma-E. Les deux promoteurs permettent d'assurer la transcription de nprX en phase stationnaire tardive alors que la transcription à partir du promoteur PA est achevée. Cette étude met en évidence le role clé des régulateurs CodY, PlcR and Spo0A dans la régulation de l'expression des gènes nprR-nprX. / In sporulating Bacillus, major processes like virulence gene expression and sporulation are regulated by communication systems involving signaling peptides and regulators of the RNPP family. In this work, we investigated the role of one such regulator, NprR, in bacteria of the Bacillus cereus group. This work can be divided into three complementary parts.The first part consisted to demonstrate that NprR is involved in a quorum-sensing system. We showed that NprR is a transcriptional regulator whose activity depends on the NprX signalling peptide. In association with NprX, NprR activates the transcription of an extracellular protease gene (nprA) during the first stage of the sporulation process. We demonstrated that the NprX peptide is secreted, processed and then reimported within the bacterial cell by two oligopeptide permease systems (Opp and Npp). Once inside the cell, the mature form of NprX, presumably the SKPDIVG heptapeptide, directly binds to NprR allowing nprA transcription. The second part was to explore the function of NprR during the infectious cycle of B. thuringiensis (Bt). We showed that NprR is active after death of the insect and allows Bt to survive in the cadavers as vegetative cells. Transcriptomic analysis revealed that NprR regulates at least 41 genes encoding degradative enzymes or involved in the synthesis of a non-ribosomal peptide named kurstakin. The degradative enzymes include chitinases, proteases and lipases. The corresponding genes are specifically expressed after host death suggesting that Bt has an active necrotrophic lifestyle in the cadaver. We showed that kurstakin is essential for Bt survival during necrotrophic development. It is required for swarming mobility and biofilm formation, presumably through a pore forming activity. A nprR deficient mutant does not develop necrotrophically and does not sporulate efficiently in the cadaver. Altogether, our results show that necrotrophism is a highly regulated mechanism essential for the Bt infectious cycle, contributing to horizontal transmission. Finally, the last part of my PhD consisted to study the regulation of nprR and nprX expression. We showed that the nprR-nprX genes are cotranscribed from a sigma A-dependent promoter (PA) located upstream from nprR. The transcription from PA starts at the onset of the stationary phase and is controlled by two transcriptional regulators: CodY and PlcR. The nutritional repressor CodY binds a DNA target site upstream from PA and represses nprR-nprX transcription during the exponential growth phase. At the onset of the stationary phase, the negative control of CodY is relieved and PlcR activates nprR-nprX transcription by binding a PlcR box located upstream from PA. We showed that nprX is also transcribed independently of the nprR transcription from two promoters, PH and PE, dependent on sigma-H and sigma-E, respectively. Both promoters ensure nprX transcription during late stationary phase and sporulation while transcription from PA is complete. This study highlights the key role played by CodY, PlcR and Spo0A in nprR-nprX transcription.

Les salmonelles sont l’une des premières causes d’infections bactériennes d’origine alimentaire. Depuis le début des années 1990, l’isolement de salmonelles multirésistantes aux antibiotiques a considérablement accru avec l’émergence des souches épidémiques Salmonella Typhimurium DT104 qui sont, pour la majorité, résistantes à l’ampicilline, le chloramphénicol, la streptomycine, les sulfamides et les tétracyclines. Les gènes codant ces résistances sont regroupés sur un intégron complexe de classe 1 nommé In104, localisé lui-même sur un îlot génomique de 43 kb désigné Salmonella Genomic Island 1 (SGI1). Depuis sa première identification chez S. Typhimurium DT104, SGI1 a été identifié à travers le monde chez plusieurs sérovars de Salmonella, et plus récemment chez Proteus mirabilis. Chez ces souches, la multirésistance aux antibiotiques est liée, soit à l’îlot SGI1 dans sa forme initialement décrite, soit à des variants de SGI1 correspondant à la structure initiale de SGI1 comportant des modifications au niveau de l’intégron complexe In104. L’îlot génomique Salmonella Genomic Island 1 (SGI1) représente une préoccupation importante car le phénotype de multirésistance qu’il confère aux souches bactériennes est souvent responsable d’échecs thérapeutiques pouvant entrainer des complications importantes, voire la mort. Dans ce contexte, le travail de thèse a été centré sur l’enjeu sanitaire majeur représenté par cette diffusion épidémique du clone S. Typhimurium au cours des années 1990 chez l’homme et les bovins. Les travaux entrepris dans le cadre de la thèse ont eu, en premier lieu, l’objectif d’apprécier l’évolution moléculaire de SGI1 dix années après l’émergence de ces souches en élevage bovin, puis d’évaluer la diffusion de SGI1 chez des souches naturelles appartenant à d’autres genres bactériens que Salmonella. Il a ainsi été dressé un bilan de la multirésistance aux antibiotiques chez les souches de S. Typhimurium isolées de bovins malades en France de 2002 à 2007 et une recherche de la présence de SGI1, chez d’autres espèces bactériennes que Salmonella, et par sondage à partir de leurs phénotypes de résistance, a été mise en œuvre. Les résultats obtenus ont indiqué un faible pouvoir évolutif de SGI1 qui semble en contradiction avec les capacités moléculaires majeures de recombinaison et de transfert démontrées tant in vitro qu’in vivo. Les études menées ont toutefois permis la première description d’un nouveau variant, nommé SGI1-T, qui résulte d’une recombinaison intramoléculaire. Le deuxième grand objectif de la thèse a été de contribuer à une meilleure connaissance du rôle que pourrait avoir SGI1 dans la virulence bactérienne. Une première stratégie de modélisation expérimentale (salmonellose systémique murine) a ainsi été conduite, qui visait à comparer le pouvoir virulent in vivo de souches isogéniques ne se distinguant que par la présence ou l’absence de SGI1. Une seconde approche a été également menée, qui a consisté en une évaluation du rôle de SGI1 dans la formation de biofilms, l’organisation en biofilms favorisant une meilleure colonisation bactérienne, qui peut constituer à son tour un élément d’efficacité du pouvoir virulent final. Les résultats obtenus ont confirmé le rôle positif de SGI1 dans la formation de biofilms, et plus généralement son implication dans la signalisation cellulaire du Quorum Sensing. / Salmonella is a major cause of food-borne outbreaks. Since the early 1990s, isolation of multidrug-resistant Salmonella has increased with the emergence of epidemic Salmonella Typhimurium DT104 strains which are mostly resistant to ampicilin, chloramphenicol, streptomycin, sulfonamides and tetracyclines. The genes coding these resistances are clustered on a complex class 1 integron (MDR region) located on a genomic island of 43 kb designated SGI1. Since its first identification in S. Typhimurium DT104, SGI1 has been identified worldwide in other Salmonella serotypes, and more recently in Proteus mirabilis. For these strains, multidrug resistance is conferred, either to the classical structure of SGI1, or to related variants of SGI1 corresponding to the initial structure of SGI1 with modification of the complexe integron In104. The Salmonella Genomic Island 1 (SGI1) constitutes a great concern since it confers a multidrug resistance phenotype often responsible of therapeutic failures which may cause important complications, or even death. In this context, the work has been focused on the major health issue represented by the epidemic diffusion of the Salmonella Typhimurium clone in the course of 1990s in human and cattle. As a first objective, the work allowed to appreciate the molecular evolution of SGI1 in the course of time and to assess the diffusion of SGI1 to other bacterial strains than Salmonella in natural conditions. Therefore, an overview of the multidrug resistance in Salmonella Typhimurium strains isolated from diseased cattle in France from 2002 to 2007 was carried out and a screening of natural strains from other bacterial species than Salmonella that may harbor SGI1 was undertaken. The results indicated weak molecular evolutions of SGI1, which seems in contradiction with the great capability of SGI1 to recombine and transfer, as attested in vitro as in vivo. Nevertheless, this study allowed the first description of a new SGI1 variant, named SGI1-T, which is the result of intra-molecular recombination events. Another second objective of the thesis was to contribute to a better knowledge of the role of SGI1 in bacterial virulence. A strategy of experimental modeling (murine systemic salmonellosis) was first set up to compare the levels of virulence conferred by isogenic strains differing only by the presence or the absence of SGI1. A second approach was also carried out to evaluate the role of SGI1 in biofilm formation. Indeed, the organization in biofilm facilitates bacterial colonization, which constitutes in turn an element of effectiveness of the final virulence. A positive role of SGI1 in biofilm formation was demonstrated in the framework of this study, and more generally, questions the role of SGI1 in the Quorum Sensing regulation system.

Issue de l'Archaea extrêmophile Sulfolobus solfataricus, SsoPox est une enzyme à fort potentiel biotechnologique du fait de son extrême stabilité. Nous avons caractérisé son activité lactonase naturelle ainsi que son activité de promiscuité phosphotriestérase. Elle est capable d'hydrolyser les organophosphorés (OPs), des agents neurotoxiques utilisés en tant qu'insecticide et arme chimique de guerre dont les méthodes actuelles de décontamination restent insatisfaisantes. Non optimale, l'activité phosphotriestérase de SsoPox a été améliorée en redessiné in silico son site actif de afin qu'il ressemble à celui des PTEs, hydrolysant très efficacement les OPs. L'enzyme ainsi développée offre des perspectives d'utilisation pour la décontamination des pollutions aux OPs. L'activité lactonase de l'enzyme a également été améliorée envers certaines N-Acyl Homosérine Lactones (AHLs), des molécules impliquées dans la communication inter-bactérienne (quorum sensing). Or, le quorum sensing régule notamment la virulence bactérienne (e.g. Pseudomonas aeruginosa). Ainsi, l'utilisation de lactonases telles que SsoPox constituerait une alternative aux antibiotiques par interférence au quorum sensing (i.e. quorum quenching). L'ensemble de ces travaux a conduit au dépôt d'un brevet protégeant les séquences des variants améliorés ainsi que leurs domaines d'applications. Ils permirent également d'étudier des phénomènes clés dans l'évolution des enzymes tels que l'épistasie, la promiscuité et la flexibilisation. Ce projet, mêlant Sciences fondamentales et appliquées, pourrait, in fine, mener à la valorisation d'un projet de recherche académique. / Issued from the extremophilic Archaea Sulfolobus solfataricus, SsoPox exhibits an important biotechnological potential because of its extreme stability. Belonging to the phosphotriesterase-like lactonase family, its natural lactonase and promiscuous phosphotriesterase activities were characterized. The enzyme is able to hydrolyze organophosphates (OPs), i.e. nerve agents used as insecticides and chemical warfare agents for which current methods of decontamination are unsatisfactory. The phosphotriesterase activity of SsoPox is suboptimal unlike some mesophilic enzymes (PTEs). To develop a robust bio-decontaminant of OPs, we redesigned, in silico, SsoPox active site in the aim to mimic that of PTEs. Using a mutation database in an in vitro evolution protocol, we screened, selected and characterized efficient enzymes for OPs insecticides hydrolysis, offering prospects in OPs decontamination. SsoPox lactonase activity was also improved for some N-Acyl Homoserine Lactones (AHLs), molecules involved in the inter-bacterial communication (quorum sensing). Quorum sensing regulates several functions such as virulence of some pathogens (e.g. Pseudomonas aeruginosa). The use of lactonases such as SsoPox could constitute an alternative to antibiotics by quorum sensing (and thus virulence) inhibition (i.e. quorum quenching). These works were patented, protecting the sequences of improved variants and their fields of application. They also allowed to study key phenomena in enzyme evolution such as epistasis, promiscuity and flexibility. This project, combining basic and applied Sciences, could lead, in fine, to the promotion of an academic research project.

Les bactéries utilisent un mode de communication appelé quorum sensing pour régulerl’expression des gènes en fonction de la densité de population et contrôler ainsi de façonmulticellulaire des processus tels que la sporulation, la compétence ou la virulence. Chez les bactériesà Gram-positif, le quorum sensing repose principalement sur la production, la sécrétion et la détectionde petits peptides de signalisation.Le projet porte sur l’étude du système quorum sensing: NprR/NprX chez Bacillus cereus, oùNprR est l’effecteur qui reconnait spécifiquement le peptide de signalisation NprX. NprR est uneprotéine bi-fonctionnelle. Seule, elle agit en tant qu’inhibiteur de la sporulation, en complexe avecNprX, elle perd sa fonction initiale au profit d’une activité facteur de transcription impliquée dans lavirulence. NprR appartient à une famille d’effecteurs de quorum sensing appelée RNPP (Rap, NprR,PlcR et PrgX) encore mal caractérisée au niveau structural. Mon projet de thèse a consisté en l’analysestructure-fonction du système NprR/NprX.Pour comprendre la régulation fonctionnelle de NprR par NprX, des études en solution (SECMALSet DLS) ont permis de mettre en évidence un switch moléculaire qui repose sur un changementd’oligomérisation. Ainsi NprX fait basculer NprR d’une conformation Apo dimérique à uneconformation compléxée tétramérique.L’étude structurale par cristallographie a aboutit à la résolution de la structure du complexeNprR/NprX. L’analyse de ce tétramère suggère la reconnaissance de 2 sites distincts sur l’ADN.L’étude structurale par SAXS, a quant à elle, permis de proposer une conformation dimérique de laforme Apo NprR, modèle conforté grâce à une étude par mutagénèse dirigée des résidus d’interface. Ils’agit d’un mode de dimérisation semblable à celui des protéines Rap (membres de la famille RNPP).La caractérisation par ITC de l’interaction NprR/NprX avec différentes formes du peptide,ainsi que l’analyse de la poche de fixation du complexe, ont permis de mieux comprendre la spécificitéd’interaction et de mettre en évidence deux résidus clés de l’effecteur : l’Asn275 essentielle à lafixation du peptide et l’Arg 126 essentielle à l’activation de la fonction facteur de transcription.Ces travaux ont contribué à une meilleure compréhension du système quorum sensingNprR/NprX grâce à l’élucidation du switch moléculaire contrôlé par NprX mais aussi à une meilleureconnaissance de la famille d’effecteurs RNPP. / Bacteria use a communication mode named quorum sensing to regulate gene expression depending on the population density and thus to control processes such as sporulation, competence or virulence in a multicellular manner. In Gram-positive bacteria, the quorum sensing relies mostly on the production, the secretion and the detection of small signaling peptides. The project focuses on the study of the quorum sensing system NprR/NprX in Bacillus cereus, where NprR is the effector, which recognizes specifically the signaling peptide NprX. NprR is a bi-functional protein. In the absence of peptide, it acts as a sporulation inhibitor while in complex with NprX, it acts as transcription factor implicated in virulence. NprR belongs to a family of quorum sensing effectors named RNPP (for the first identified members: Rap, NprR, PlcR and PrgX) still not well characterized at a structural level. My PhD project consisted to perform the structure/function analysis of the NprR/NprX system. To understand the functional regulation of NprR by NprX, I carried out different studies in solution (SEC-MALS and DLS). These results allowed me to highlight a molecular switch based on a changing of the oligomerisation state of the protein. NprX binding switches NprR from an Apo dimeric conformation to a tetrameric complex. The structural study by crystallography led to the resolution of the tetrameric NprR/NprX complex structure. The analysis of this tetramer suggests the recognition of 2 DNA binding sites. The structural study of the dimeric conformation of Apo NprR by SAXS, allowed me to propose a model similar to that of the Rap dimers (members of RNPP family). This model is supported by a directed mutagenesis study of interface residues. The characterization by ITC of the NprR/NprX interaction with different forms of the peptide, as well as the analysis of the binding pocket in the complex, led to a better understanding of the specificity of the interaction. Two key residues of the effector were highlighted: Asn275, essential to peptide binding and Arg126, essential to the activation of the transcription factor function. These results have contributed to a better understanding of the NprR/NprX quorum sensing system thanks to the elucidation of the molecular switch controlled by NprX but also in a better knowledge of the RNPP effectors family.

A inibição do quorum sensing (QS) altera a comunicação bacteriana, reduzindo a expressão de fatores de virulência e a formação de biofilmes, o que pode conferir menor pressão seletiva em comparação aos antibióticos tradicionais. As frutas e hortaliças constituem uma fonte rica em compostos com propriedades potenciais de inibição do QS. Entretanto, há pouca referência sobre o potencial de pimentas do gênero Capsicum e de seus compostos isolados como inibidores do QS. Esse trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de extratos orgânicos obtidos das variedades de pimenta-malagueta e pimentão vermelho sobre o sistema QS dependente do sinalizador AI-1 (acil homoserina lactona - AHL) em bactérias Gram-negativas. Os extratos foram obtidos por extração em fase sólida e separados em uma fração metanólica e outra amônica; sendo os compostos característicos identificados e quantificados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A atividade antimicrobiana dos extratos foi avaliada pela determinação da concentração inibitória mínima (MIC) e pela curva de crescimento de Chromobacterium violaceum ATCC 12472, Serratia liquefaciens MG1 e Pseudomonas aeruginosa PAO1. O efeito anti-QS dos extratos foi avaliado pelos testes de difusão em ágar e quantificação da produção de violaceína em meio líquido por C. violaceum e sobre a formação de biofilme, avaliado pelo ensaio de cristal violeta e microscopia confocal, em S. liquefaciens e P. aeruginosa nas temperaturas 30 ºC e 37 ºC. Os resultados obtidos pela CLAE indicaram que o extrato metanólico de pimenta-malagueta (EMPM) continha capsaicinoides como a capsaicina e dihidrocapsaicina, luteolina e outros compostos não identificados; já o extrato amônico desta não continha os compostos capsaicinoides. Ambos os extratos de pimentão vermelho continham luteolina e compostos não identificados, mas não apresentaram capsaicinoides. Como o EMPM era representativo dos demais extratos, por conter tanto capsaicinóides quanto luteolina, o foco deste trabalho foi avaliar os efeitos do EMPM sobre fenótipos microbianos nas concentrações 5; 2,5; 1,25 e 0,625 mg/ml, além de utilizar a capsaicina como controle comparativo em concentrações equivalentes às do extrato (25, 50 e 100 µg/ml). Os resultados da atividade antimicrobiana mostraram inibição parcial do crescimento das bactérias nas concentrações sub-MIC (MIC >5 mg/ml) de 5 e 2,5 mg/ml de EMPM. A capsaicina também inibiu parcialmente o crescimento das bactérias a 100 µg/ml, com exceção de S. liquefaciens a 37 ºC, cujo crescimento foi induzido em 50 e 25 µg/ml. A produção de violaceína foi reduzida pelo EMPM a 1,25 e 0,625 mg/ml, sem afetar o crescimento de C. violaceum. Ensaios com C. violaceum CV026, estirpe biosensora capaz de produzir o pigmento na presença de AI-1 exógeno, sugerem que o possível mecanismo de atuação do extrato sobre o sistema QS em C. violaceum 12472 é sobre a síntese do sinalizador, já que não foi observada inibição da produção de violaceína em CV026 pelo extrato. Contrariamente, a capsaicina incrementou a produção do pigmento na estirpe 12472, mas ensaios com a estirpe CV026 indicaram que a capsaicina não atua como sinalizador do QS, uma vez que esta não induziu a produção de violaceína nesta estirpe. Já a formação de biofilme foi incrementada na presença do EMPM, sendo consideravelmente maior em P. aeruginosa a 30 ºC. Igualmente, observou-se indução da formação de biofilme por capsaicina em S. liquefaciens (37 ºC) e P. aeruginosa (30 ºC). Porém, a capsaicina não teve efeito sobre a formação de biofilme de S. liquefaciens quando cultivada a 30 ºC, nem P. aeruginosa a 37 ºC. Os resultados revelam que a produção de violaceína em C. violaceum ATCC 12472 é inibida pelo EMPM, mas não pela capsaicina. Já, o EMPM e a capsaicina, de forma geral, não inibem a formação de biofilme de S. liquefaciens MG1 nem P. aeruginosa PAO1. Outros estudos são necessários para elucidar os mecanismos pelos quais o EMPM e a capsaicina agem sobre os fenótipos avaliados neste trabalho. / Quorum sensing inhibition alters bacterial communication by reducing virulence factors expression and biofilm formation, exerting less selective pressure compared to antibiotics. Fruits and vegetables are rich sources of compounds with potential QS-inhibition properties. However, there are few references about the potential of peppers belonging to the genus Capsicum and its isolated compounds as QS inhibitors. This study aimed to assess the effect of organic extracts obtained from Capsicum varieties, pimenta-malagueta (red chili) and pimentão vermelho (red bell pepper), on the AI-1 dependent QS system. The extracts were obtained by solid phase extraction and split into a methanolic and an ammonic fraction. Characteristic compounds were identified and quantified by high performance liquid chromatography (HPLC). The antimicrobial activity of the extracts was assessed by determining the minimal inhibitory concentration (MIC) and the growth curve of Chromobacterium violaceum ATCC 12472, Serratia liquefaciens MG1 and Pseudomonas aeruginosa PAO1. The anti-QS effect of the extracts was evaluated by the agar diffusion assay and the quantification of violacein production was assessed in liquid medium by C. violaceum, as well as in the biofilm formation test determined by the crystal violet assay and confocal microscopy with S. liquefaciens and P. aeruginosa at 30 ºC and 37 ºC. HPLC results showed that the methanolic extract of pimenta-malagueta (EMPM) contained capsaicinoids such as capsaicin and dihidrocapsaicin, luteolin and other unidentified compounds in lower concentrations; while its ammonic extract did not have capsaicinoids. Both pimentão vermelho extracts contained luteolin and other unidentified compounds in low concentrations, but they did not contain capsaicinoids. As EMPM was representative among the extracts because it contained capsaicinoids and luteolin, the focus of this work was to assess the effect of EMPM over microbial phenotypes at concentrations of 5, 2.5, 1.25 and 0.625 mg/ml, using capsaicin as a comparative control at equivalent concentrations to those in EMPM (25, 50 and 100 µg/ml). Antimicrobial activity assays showed a partial inhibition growth of bacteria at sub-MIC concentrations (MIC >5 mg/ml) of EMPM at 5 and 2.5 mg/ml. Similarly, capsaicin partially inhibited bacterial growth at 100 µg/ml, except for S. liquefaciens at 37 ºC in which growth was induced at 50 and 25 µg/ml. Violacein production was reduced by EMPM at 1,25 and 0,625 mg/ml without affecting C. violaceum growth. Assays with C. violaceum CV026, a biosensor strain that produces violacein in the presence of exogenous AI-1, suggest that EMPM reduced violacein production in C. violaceum 12472 by interfering with the AI-1 synthesis. In contrast, capsaicin incremented violacein synthesis in strain 12472, but experiments with strain CV026 revealed that capsaicin does not function as an analog of AI-1. Biofilm formation was increased in EMPM presence, being remarkably superior in P. aeruginosa cultivated at 30 ºC, as opposed to cultivation at 37 ºC. Similarly, capsaicin induced biofilm formation in S. liquefaciens (37 ºC) and P. aeruginosa (30 ºC). However, capsaicin did not affect biofilm formation on S. liquefaciens cultured at 30 ºC, neither on P. aeruginosa at 37 ºC. These results show that violacein production in C. violaceum ATCC 12472 is inhibited by EMPM, but not by capsaicin. In general, EMPM and capsaicin did not inhibit biofilm formation in S. liquefaciens MG1 neither in P. aeruginosa PAO1. More studies are necessary to elucidate the mechanisms by which EMPM and capsaicin affect the studied phenotypes in this work.

Agrobacterium tumefaciens est une bactérie du sol responsable de la galle du collet chez les plantes lorsqu'elle possède le plasmide Ti (Tumor inducing) dit de virulence (pTi). La bactérie transfère un morceau d’ADN du pTi dans le génome de la plante qui code d'une part la production d’hormones de plantes, à l’origine de la formation de tumeurs colonisées par les bactéries et d'autre part la production de petites molécules (opines) qui servent de nutriment à A. tumefaciens. L'opine, agrocinopine A induit la production de signaux quorum sensing à l’origine de la dissémination du plasmide de virulence vers des bactéries non pathogènes. Agrobacterium radiobacter K84, une bactérie non pathogène, produit de l’agrocine 84, un antibiotique qui tue A. tumefaciens.L’import et le catabolisme de l’agrocinopine A sont réalisés par l’opéron acc présent sur le pTi. La protéine périplasmique (PBP) AccA associée à un transporteur ABC importe l’opine dans le cytoplasme qui est ensuite dégradée par AccF et AccG. AccR régule l’expression de l’opéron acc et celle du facteur de transcription TraR, central dans la signalisation quorum sensing. AccA importe l’agrocine 84 qui est activée par AccF. Mon travail de doctorat a permis par des études structure-fonction de caractériser la spécificité d'AccA et d’AccF et d’initier l’étude du facteur de transcription AccR. L’étude structurale de la PBP en complexe avec l’agrocinopine A, l’agrocine 84 et des dérivés de ces molécules a révélé que seul le motif pyranose-2-phosphate commun aux 2 molécules était reconnu par AccA. Cela a été confirmé par microcalorimétrie et autofluorescence. Le motif pyranose-2-phosphate permettrait donc l’entrée de toute molécule qui le possède à une extrémité. La structure de l’enzyme AccF a montré que là encore seul le groupement pyranose-2-phosphate est reconnu. A partir de la structure obtenue et de modélisation du substrat dans le site actif, un mécanisme enzymatique original pour l’hydrolyse de la liaison phosphodiester est proposé. Les mesures d’affinité par microcalorimétrie montrent que seuls l’arabinose-2-phosphate et le glucose-2-phosphate sont capables de fixer AccR. Des expériences in cellulo ont confirmé qu'ils régulent bien l'expression du QS.Mes travaux apportent un éclairage nouveau sur l’import et l'utilisation de l’agrocinopine chez A. tumefaciens. La spécificité de reconnaissance de la PBP pour une partie de la molécule importée est observée chez d’autres PBP, et ouvre la voie à la conception de molécules antibiotiques qui, à l’image de l’agrocine 84, utilisent une stratégie de type « cheval de Troie ». / Agrobacterium tumefaciens is a soil bacterium responsible of the crown gall in plants when it possesses the Tumor inducing plasmid (pTi) which is also the virulence plasmid. The bacterium transfers a piece of DNA from the pTi into the plant genome. The transferred DNA codes for plant hormone synthesis, leading to the formation of tumors which are colonized by bacteria, on one hand, and on the other hand, for the synthesis of small molecules (opines) that are used as nutrients by A. tumefaciens. The opine agrocinopine A induces the production of quorum sensing signals responsible for the spread of the virulence plasmid from pathogenic to nonpathogenic bacterium. Agrobacterium radiobacter K84, a nonpathogenic bacterium, produces the agrocin 84, an antibiotic that kills A. tumefaciens.Import and catabolism of agrocinopine A are operated by acc operon, present on the pTi. The periplasmic binding protein AccA (PBP AccA) associated with the ABC transporter imports the opine into the periplasm where it is degraded by AccF and AccG. AccR regulates the expression of the acc operon and that of the transcription factor TraR, central in quorum sensing signaling. AccA also imports agrocin 84, which is activated by AccF. My PhD work focused on AccA and AccF specificity through structure-function studies and I initiated the study of the transcription factor AccR. The structural study of AccA in complex with agrocinopine A, agrocin 84 and derivatives from these molecules revealed that only the pyranose-2-phosphate motif, common in these two molecules, was recognized. Microcalorimetry and autofluorescence measurements confirmed this conclusion. The pyranose-2-phosphate motif would allow any compound possessing this motif at one end to be transported. The structure of the enzyme AccF showed that again only the pyranose-2-phosphate group is recognized. From the structure and molecular modelling of the substrate in the active site, an original mechanism of the phosphodiester bond cleavage is proposed. Microcalorimetry affinity measures showed that only the arabinose-2-phosphate and glucose-2-phosphate are capable of interacting with AccR. In cellulo experiments confirm that both compounds regulate the expression of quorum sensing.My work sheds light on import and use of agrocinopine in A. tumefaciens. Recognition specificity of the PBP AccA for a part of the imported molecule is observed in other PBPs and opens new ways for rational design of antibiotic compounds that, similarly to agrocin 84, would use the “Trojan horse” strategy.

Les macroalgues hébergent de nombreux micro-organismes, collectivement désignés sous le terme de microbiote algal, qui ont un rôle essentiel dans le développement et l’état de santé de leur hôte. Dans ce travail, nous avons exploré le microbiote fongique et bactérien d’algues brunes, ainsi que l’impact des interactions bactérie-champignon sur la médiation chimique et, en particulier, sur le quorum sensing bactérien. Par des approches de metabarcoding ciblant l’ADNr 16S et l’ITS2, nous avons montré que les communautés fongiques et bactériennes associées à la macroalgue brune Saccharina latissima étaient très riches, principalement composées de quelques OTUs dominants, et d’une grande abondance d’OTUs « rares ». De manière intéressante, les communautés fongiques comme bactériennes différaient de celles de l’eau de mer environnante et paraissaient spécifiques des tissus algaux. Cependant, de grandes variations intra et interindividuelles de composition ont été observées au sein des échantillons de tissus d’algue. Ainsi, ce qui définit la spécificité des communautés microbiennes reste à préciser. En parallèle, nous avons exploré la médiation chimique au sein de l’endomicrobiote de quatre algues brunes : Saccharina latissima, Laminaria digitata, Pelvetia canaliculata et Ascophylum nodosum, et révélé que de nombreux endophytes fongiques et bactériens isolés synthétisaient des métabolites interférant avec les systèmes de quorum sensing bactériens, en les induisant ou les inhibant. De plus, les bioessais basés sur les biosenseurs, couplés à une approche métabolomique, effectués sur les co-cultures, ont mis en évidence en quoi les interactions bactéries-champignons au sein de l’endomicrobiote d’algues brunes pouvaient affecter la production de médiateurs chimiques, et notamment de molécules interférant avec le quorum sensing bactérien. Ensemble, ces résultats suggèrent que le quorum sensing pourrait jouer un rôle clé dans le réseau complexe d’interactions au sein du microbiote algal, et ainsi dans l’équilibre hôte-microbiote. / Macroalgae host various microorganisms, collectively referred as the algal microbiota, which play an essential role in the development and health status of their host. In this work, we explored the bacterial and fungal microbiota of brown algae, as well as the impact of bacterial fungal interactions on the chemical mediation and, in particular, on the bacterial quorum sensing. Using 16S rDNA-based and ITS2-based metabarcoding approaches we showed that the fungal and bacterial communities associated with the brown macroalgae Saccharina latissima were very rich, mainly composed of few dominant OTUs, and a large abundance of “rare” OTUs. Interestingly, both fungal and bacterial communities differed from the ones of the surrounding seawater and appeared specific to the algal tissues. However, high intra and interindividual variations of composition were observed among the algal tissue samples. Thus what define the specificity of the microbial communities remains to be clarified. In parallel, we explored the chemical mediation within the cultivable endomicrobiota of four brown algae: Saccharina latissima, Laminaria digitata, Pelvetia canaliculata and Ascophylum nodosum, and pointed out that many of the isolated bacterial and fungal endophytes could synthetize metabolites interfering with bacterial quorum sensing systems, either inducing or inhibiting them. Additionally, biosensor-based bioassays coupled with metabolomics approaches performed on co-culture experiments, highlighted how bacterial-fungal interactions within the endomicrobiota of brown algae could affect the production of chemical mediators, including those interfering with bacterial quorum sensing. Altogether, the results suggest that the quorum sensing could play a key role in the complex network of interactions within the algal microbiota, and thus in the host-microbiota equilibrium.

Les sources hydrothermales océaniques profondes renferment des écosystèmes extrêmes, situés dans la zone abyssale des Océans. Dans ces environnements dépourvus de lumière, la production primaire est réalisée par la chimiosynthèse microbienne. Ces milieux sont colonisés par des espèces animales, dont la plupart vivent en associations plus ou moins fortes avec des micro-organismes. La crevette Rimicaris exoculata est une espèce hydrothermale endémique des sites de la Ride-Médio-Atlantique (MAR), qui domine la plupart des sites qu’elle colonise. Ce crustacé a pour particularité de posséder deux communautés symbiotiques : une située dans son céphalothorax hypertrophié et une inféodée à son tractus digestif. Tout d’abord, ce travail de thèse s’est concentré sur l’étude de la communication bactérienne (Quorum Sensing ou QS) au sein des communautés ectosymbiotiques de R. exoculata au cours de son cycle de mue et de vie. Ensuite, ce travail s’est focalisé sur l’identification d’un peptide antimicrobien (PAM), puis à rechercher sa fonction dans l'immunité et le contrôle des symbiotes chez Rimicaris exoculata. Ce travail a permis, d’une part, de confirmer la présence de deux gènes du QS (luxS et luxR) dans les communautés ectosymbiotiques de R. exoculata sur quatre sites hydrothermaux : Rainbow, TAG, Snake Pit et Logatchev. Ces gènes étant plus divergents que ceux de l'ARNr 16S, leur utilisation comme marqueurs génétiques biogéographiques pour retracer l'origine des individus est discuté. Ce travail a permis, d’autre part, d’identifier pour la première fois un PAM (sus nommé Re-crustin), chez un arthropode hydrothermal. Les données suggèrent une participation de ce PAM dans le contrôle de l’ectosymbiose. L’ensemble de ces travaux apporte de nouvelles hypothèses sur l’interaction entre les épibiontes du céphalothorax et la crevette Rimicaris exoculata. / Deprived of light, the deep-sea hydrothermal vents are extremes ecosystems sustained by micobial chemosynthesis. These environments are colonized by animal species living in close relationships with these chemoautotrophic micro-organisms, eating them or establishing long term interactions with them, may they be trophic or not only. The shrimp Rimicaris exoculata is an endemic hydrothermal species of the Mid-Atlantic Ridge (MAR) sites. This crustacean represents the predominant macrofauna of some sites of the MAR. It lives in symbiotic association with two distinct microbial communities qualified as ectosymbiosis. One is located in its gill chamber and one in its gut. First, this work focused on the study of bacterial communication (Quorum Sensing or QS) within the ectosymbiontic communities during the molting and life cycles of R. exoculata. Then, we focused on an antimicrobial peptide (AMP) identification and search for its function in R. exoculata immunity and in controlling symbionts. Two QS genes (luxS and luxR) were identified in the R. exoculata ectosymbiontic community at different shrimp molt stages and life stages at the Rainbow, TAG, Snake Pit and Logatchev vent sites.As these genes are more divergent than that of 16S rRNA, they could be then used as biogeographical genetic markers tools to trace back the origin of individuals to a location or between locations along its life cycle. This work reports also the first description of an AMP in an extremophile arthropod (namely Recrustin). Data suggest a participation of this AMP in the control of the ectosymbiosis in Rimicarisexoculata. All this work provides new hypotheses wich are discussed in the manuscript, dealing with the interaction between symbionts and Rimicaris exoculata.