Orientador: Hyun Mo Yang / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Matematica, Estatistica e Computação Cientifica / Made available in DSpace on 2018-08-12T23:10:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Delboni_RobertaRegina_M.pdf: 1935834 bytes, checksum: c76bab850d32e85026fe1a7e37e3e14d (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Um grande desafio para a indústria de alimentos é, por um lado, atender a demanda dos consumidores por alimentos minimamente processados, livres de aditivos químicos e submetidos a tramentos térmicos mais brandos, devido ao forte apelo como "alimentos naturais", mas, ao mesmo tempo, garantir a segurança microbiológica destes produtos. Para abordar quantitativamente o controle biológico como técnica de conservação, apresenta-se um modelo matemático da interação entre bactérias lácticas e o patógeno Listeria monocytogenes. A partir deste modelo, estuda-se a possível ação do ácido láctico e da bacteriocina, produzidos pela bactéria láctica, na redução do crescimento da Listeria no alimento. Através do conhecimento bioquímico de regulação da biossíntese de bacteriocina, desenvolve-se outro modelo, com enfoque na bacteriocina nisina. Mostra-se o efeito da nisina na resposta do sistema que regula a expressão de genes necessários para a biossíntese. Expandindo esse modelo, são incluídas equações para descrever também o processo de biossíntese, e avalia-se a resposta do sistema regulatório quando se aumenta a densidade de células da bactéria produtora. Observa-se comportamento típico de histerese. Mostra-se, assim, o funcionamento do mecanismo de "quorum sensing", ou seja, a produção da nisina regulada de maneira dependente da densidade celular, devido a uma transição entre o estado ativado e desativado do sistema regulatório, que correspondem às duas soluções estacionárias assintoticamente estáveis / Abstract: A major challenge for the food industry is the attending of demands of consumers for minimally processed foods, which do not contain chemical preservatives neither were submitted to intensive heat treatments, but at the same time ensuring microbiological safety of these products. To study quantitatively the biological control as a technique of conservation, we developed a mathematical model to describe the interaction between lactic acid bacteria and the pathogen Listeria monocytogenes in the food. The steady states and dynamical trajectories analyses of the model allowed us to study the possible action of the lactic acid and the bacteriocin, produced by lactic acid bacteria, in the reduction of activity of Listeria in the food. Through the knowledge of the bacteriocin biosynthesis biochemical regulation, we developed other model focusing on the production of bacteriocin nisin. We then have shown the effect of nisin on the response of the system which regulates the expression of genes required for biosynthesis. This model was extended to include synthesis of nisin in order to study the dynamic of the regulatory system in a growing bacterial population. Both models demonstrate a typical behavior of hysteresis. Using the last model, we have shown the cell-density-dependent regulation of bacteriocin production, called mechanism of quorum sensing, which is the switch between two stable steady solutions corresponding to non-activated and activated states of the regulatory system / Mestrado / Biomatematica / Mestre em Matemática Aplicada

O gene MAS1/GAS2, conhecido como \"Magnaporthe Apressoria Specific\", foi identificado como altamente expresso durante a formação do apressório do fungo filamentoso fito patogênico Magnaporthe grisea. Em Aspergillus fumigatus, fungo patogênico oportunista, o gene masA, ortólogo a MAS1/GAS2 foi identificado como upregulated em uma análise transcriptômica exposto a voriconazole e anidulafungina, antifúngicos que afetam a síntese do ergosterol e a parede celular, respectivamente. Em ambos os ortólogos apresentam uma estrutura na região N-terminal da proteína denominada peptídeo sinal o qual neste trabalho foi determinado em uma análise in silico a presença de peptídeo sinal na região N-terminal da proteína. Na caracterização fenotípica de uma linhagem masA - deletada de A. fumigatus não foi identificado alteração estrutural do conidióforo e no seu aspecto macromorfológico. A linhagem masA-deletada é resistente a voriconazol e farnesol, drogas que inibem a síntese de ergosterol e a uma molécula quorum sensing, respectivamente. Ao avaliar o nível de expressão gênica do masA frente a diferentes classes de drogas, foi observado que o gene esta super expresso quando ocorre dano na parede celular, membrana citoplasmática, DNA, inibições na síntese de lipídeos e ácidos graxos e no estresse oxidativo. Na presença de dano na parede celular fúngica causados por anidulafungina, a proteína MasA está localizado na parede celular próximo a ponta da hifa. Adicionalmente, foi capaz de transferir para o meio extra-celular a proteína fusionada a ele, a GFP. Assim, possivelmente MasA participa da via secretória do fungo principalmente em momentos de estresse como o desarranjo da parede celular. A capacidade de secreção natural dos fungos filamentosos tem sido explorada no contexto industrial há décadas. Indicando para este fim, uma possível aplicabilidade para este peptídeo sinal. / The MAS1/GAS2 gene, known as \"Magnaporthe Apressoria Specific\", was identified as highly expressed during the formation of the appressorium phyto pathogenic filamentous fungus Magnaporthe grisea. In Aspergillus fumigatus, opportunistic saprophytic fungus, masA gene orthologous to MAS1/GAS2 was identified as upregulated in a transcriptomic analysis exposed to voriconazole and anidulafungin, antifungals that affect the synthesis of ergosterol and the cell wall, respectively. In both orthologs have a structure at the N-terminus of the protein called signal peptide. During the phenotypic and functional characterization of masA gene in A. fumigatus, was determined on an in silico analysis the presence of signal peptide at the N-terminal region of the protein. In the phenotypic characterization of a strain masA - deleted, no structural change of conidiophores and its macromorfologic aspect was not identified. The characterization masA-deleted strain is resistant to voriconazol and farnesol drugs which inhibit ergosterol synthesis and a quorum sensing molecule, respectively. When evaluating the level of gene expression masA against different class of drugs was observed the super gene is expressed when damage occurs in the cell wall and membrane DNA, the synthesis of lipids and fatty acids, and oxidative stress. In the presence of damage in the fungal cell wall caused by anidulafungin, MasA protein is located near the cell wall and the tip of the hypha and additionally, was able to transfer the protein to the extracellular the protein fused to GFP. Thus, possibly MasA participates in the secretory pathway of the fungus especially in stress of the cell wall. The natural secretion capability of filamentous fungi has been exploited in the industrial context for decades. Indicating for this purpose, a possible applicability for this signal peptide.

Orientador: Alessandra Alves de Souza / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T17:43:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Caserta_Raquel_D.pdf: 28122729 bytes, checksum: f611b63be786134a0c9fbad9785006b0 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A produção do suco de laranja concentrado é uma das commodities mais importantes para o agronegócio brasileiro, entretanto, os constantes problemas fitossanitários que afetam a citricultura vem aumentando os custos de produção e consequentemente a rentabilidade econômica deste setor. É urgente a busca por alternativas para solucionar os problemas fitossanitários da citricultura, nesse sentido, a utilização de transgenia mostra-se uma ferramenta promissora, pois possibilita a obtenção de plantas com genes exógenos que conferem resistência a doenças. Uma das doenças que afetam a citricultura brasileira é a clorose variegada dos citros (CVC), causada pela bactéria Xylella fastidiosa, onde todas as variedades de Citrus sinensis mostram-se suscetíveis a doença. Uma estratégia que vem sendo utilizada para resistência a X. fastidiosa que afeta a cultura de uva na Califórnia-EUA envolve a chamada "confusão do patógeno" onde utiliza-se genes do próprio patógeno visando a alteração da sinalização molecular entre as células bacterianas, interferindo em sua patogenicidade. Neste trabalho foram abordadas as transformações de Nicotiana tabacum e Citrus sinensis com o gene rpfF de X. fastidiosa causadora da CVC, envolvido na síntese de uma molécula sinalizadora que regula a expressão de genes associados a patogenicidade dessa bactéria. Eventos dos cultivares de laranja doce Hamlin e Pineapple transformados com rpfF foram desafiados com X. fastidiosa e, após avaliações nas fases inicial e avançada de sintomas, foi observada uma redução na incidência e na severidade de sintomas de CVC. A movimentação bacteriana ao longo de tais plantas também foi comprometida, sendo que a população bacteriana em pontos distantes do ponto de inoculação foi maior em plantas do tipo selvagem quando comparadas as transgênicas. Esses resultados sugerem que as moléculas produzidas pelas plantas transgênicas foram capazes de alterar o comportamento da bactéria, reduzindo sua patogenicidade. Outro fitopatógeno que ataca pomares brasileiros é Xanthomonas citri subsp. citri, que também apresenta o gene rpfF, e assim como em X. fastidiosa, é responsável pela sinalização molecular. Eventos transgênicos de Carrizo e Pineapple também foram desafiados com X. citri. Nesse patógeno, a interrupção da sinalização mediada por DSF, Diffusible Signal Factor - uma molécula de ácido graxo, reduz sua virulência, e interessantemente, sintomas de cancro cítrico foram reduzidos nas plantas transgênicas. Em folhas transgênicas não foi observado o aparecimento de pústulas, e biofilmes formados na área da inoculação foram alterados. Genes modulados por DSF em bactérias isoladas de plantas transgênicas foram reprimidos, sugerindo que a sinalização foi comprometida. Por fim, seiva das plantas transgênicas não ativou a expressão do promotor engA::GFP em Xanthomonas campestris biosensoras, indicando que a molécula produzida por essas plantas foi capaz de alterar a sinalização. Por outro lado, a seiva das plantas transgênicas ativou a expressão do hxfA::PhoA em X. fastidiosa biosensoras, indicando a funcionalidade dessa molécula para esse fitopatógeno. Portanto, em ensaios com X. citri, o DSF das plantas transgênicas atuou como antagonista, diminuindo a virulência da bactéria através da alteração da sinalização molecular. Esses resultados mostram que as moléculas sinalizadoras produzidas por plantas transformadas com rpfF de X. fastidiosa são promissoras na tentativa de controle de CVC e cancro cítrico / Abstract: The production of concentrate orange juice is one of the most important commodities for Brazilian agribusiness, however, the constant phytosanitary problems affecting the citrus industry is increasing production costs and consequently the economic profitability of this sector. It is urgent to search for alternatives to solve citrus phytosanitary problems, in this sense, the use of transgenesis shows a promising tool because it enables the production of plants with exogenous genes that confer resistance to diseases. One of the diseases that affect Brazilian citrus industry is the citrus variegated chlorosis (CVC), caused by the bacterium Xylella fastidiosa, where all varieties of Citrus sinensis are susceptible to this disease. One strategy that has been used for X. fastidiosa resistance that affects grape cultures in California-USA involves the so-called "pathogen confusion" that is related to the usage of genes of the pathogen itself aiming to change the molecular signaling between bacterial cells by interfering in its pathogenicity. In this work we will discuss the transformation of Nicotiana tabacum and Citrus sinensis with the rpfF gene isolated from X. fastidiosa causing the CVC, involved in the synthesis of a signaling molecule that regulates the expression of genes associated with pathogenicity of these bacteria. Transgenic events of Hamlin and Pineapple transformed with rpfF were inoculated with X. fastidiosa and after evaluations in early and advanced stages of symptoms, a reduction was observed in the incidence and severity of symptoms of CVC. Bacterial movement along these plants was also impaired, and the bacterial population analyzed far from the point of inoculation was higher in wild type plants compared to transgenic ones. These results suggest that the molecules produced by the transgenic plants were able to change the behavior of the bacteria, reducing its pathogenicity. Another pathogen that attacks Brazilian orchards is Xanthomonas citri subsp. citri, which also features rpfF gene, and as in X. fastidiosa is responsible for molecular signaling. Transformed plants of Carrizo and Pineapple were also challenged with X. citri. In this pathogen, the interruption of DSF-mediated signaling reduces its virulence, and interestingly, citrus canker symptoms were reduced in transgenic plants. In transgenic leaves there was no pustules development and alterations in biofilms formed in the area of inoculation were observed. Genes modulated by DSF in bacteria isolated from transgenic plants were repressed, suggesting that signaling was compromised. Finally, sap of transgenic plants did not activate the expression of the promoter engA::GFP in Xanthomonas campestris biosensors, indicating that the molecule produced by these plants was able to change the signaling. On the other hand, the sap of transgenic plants activated the expression of hxfA::PhoA in X. fastidiosa biosensors, indicating the functionality of this molecule for this pathogen. Therefore, in assays with X. citri, the DSF of transgenic plants acted as antagonist, decreasing the virulence of the bacteria by changing the molecular signaling. These results show that the signaling molecules produced by plants transformed with rpfF of X. fastidiosa are promising in the attempt to control CVC and citrus canker / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Nos últimos 30 anos, Acinetobacter tornou-se um dos patógenos de maior preocupação clínica pela falta de terapias eficazes em virtude do fenótipo de multirresistência frequentemente apresentado. Dentre as espécies do gênero Acinetobacter, A. baumannii, A. genoespécie 3 e A. genoespécie 13TU são as mais comumente encontradas a partir de amostras biológicas. Estas espécies ao lado de A. calcoaceticus constituem o complexo A. calcoaceticus-A. baumannii (ACB). Este estudo propõe um esquema composto de duas PCRs para a identificação das espécies de interesse médico que fazem parte do complexo ACB. O método é simples, rápido e, além de identificar as espécies, permite pesquisar a presença de genes de resistência. Foram identificadas 515 amostras do complexo ACB, isoladas de pacientes no período de janeiro de 2005 a dezembro de 2010. A identificação das espécies do complexo ACB foi realizada por esquema composto de duas reações de PCR. Foram avaliados os perfis de sensibilidade por disco difusão e a pesquisa da presença dos genes blaOXA-23-like, blaOXA-24-like, blaOXA-51-like, blaOXA-58-like, blaIMP, blaVIM, blaSIM, blaSPM e blaGIM foi realizada por PCR utilizando-se iniciadores específicos. No grupo de amostras estudas, 82,5% são A. baumannii (425), 11,5% A. genoespécie 13TU (59) e 6,0% A. genoespécie 3 (30), sendo A. baumannii mais isolado em pacientes internados em UTIs (p=0,0407) e A. genoespécie 13TU mais isolado em pacientes de outros ambientes hospitalares (p=0,0204). A. baumannii apresentou menor sensibilidade a todos os antimicrobianos quando comparado com A. genoespécie 13TU e A. genoespécie. 3 (p<0,05). Foi possível observar ao longo do período estudado o aumento significativo da resistência aos carbapenêmicos e da sensibilidade a gentamicina por A. baumannii entre os isolados de pacientes de UTIs (p<0.05). Nenhum dos genes codificadores para metalo-lactamases foi detectado nas amostras estudadas Dentre os cepas resistentes aos carbapenêmicos (176) o gene blaOXA-23 foi detectado em 81,25% e uma amostra de A. baumannii apresentou o gene codificador para OXA-72. A tipagem molecular foi realizada por RAPD e para os isolados resistentes aos carbapenêmicos também por PFGE. Resultados obtidos por RAPD revelaram menor diversidade entre os isolados de pacientes internados em UTIs. O dendrograma obtido utilizando-se PFGE separou dois clones cujos componentes eram resistentes aos carbapenêmicos, no entanto não apresentavam o gene blaOXA-23-like. A produção de acil-homoserina lactona, autoindutor-2 e autoindutor-3 de três amostras de cada espécie clínica do complexo ACB foi pesquisada utilizando-se bioensaios. Apenas Autoindutor 3 foi detectado por bioensaio e em menor quantidade no meio précondicionados obtido a partir de A. genoespécie 3 quando comparado com A. genoespécie 13TU e A. baumannii (p<0.05). Três cepas de cada espécie clínica do complexo ACB foi avaliada quanto a capacidade de adesão em monocamada de células Hep-2, MRC-5 e NCI-H292, sendo essa última a que revelou diferenças entre as espécies clínicas do complexo ACB. A. baumannii apresentou adesão difusa, A. genoespécie 13 TU adesão com formação de agrupamentos e A. genoespécie 3 não aderiu. Esse mesmo ensaio foi realizado na presença de propanolol e notou-se a diminuição de células aderidas por campo observado. Dez cepas de cada espécie clínica do complexo ACB foram pesquisadas quanto a produção de biofilme por ensaio colorimétrico utilizando cristal violeta e foi possível notar a produção significativa de biofilme por A. baumannii, quando comparado com A. genoespécie 3 (p<0.05). Esse mesmo ensaio na presença de de fentolamina, mostrou a diminuição significativa na produção do biofilme por A. baumannii. A interferência no ensaio de adesão bacteriana e biofilme, na presença de fentolamina ou propanolol, sugerem o envolvimento do autoindutor-3 na regulação desses mecanismos de virulência. / The genus Acinetobacter has emerged as one of the most troublesome pathogens for health care institutions globally. Its clinical significance, especially over the last 15 years, has been driven by its remarkable ability to up regulate or acquire resistance determinants, making it one of the organisms threatening the current antibiotic era. A. baumannii, A. 3 and A. 13TU are the most commonly species found from biological samples. These species beside A. calcoaceticus are very closely related and difficult to distinguish from each other by phenotypic properties. Therefore, it has been proposed to refer to these species as the A.calcoaceticus-A. baumannii complex(ACB). In the period from 2005 to 2009, the most frequent bacterial isolates among the nosocomial infection at the HU-USP was ACB (18%). Due to the frequency with which species are involved in ACB outbreaks of infection in the HU-USP and the emergency clinic because of expression of the phenotype of resistance to several classes of antibiotics, this study aimed to identify and characterize the species of complex ACB by molecular methods, to study their mechanisms of resistance and to characterize the different clones from patients admitted to different hospital areas. Furthermore, the ability to characterize biofilm formation, adhesion to different cell lines as well as the mechanisms of cell-cell communication were analyzed. From the ACB complex, 515 samples were identified, isolated from patients from January 2005 to December 2010. The identification of clinical species of the ACB was performed by molecular methods that were developed and validated for identification of Acinetobacter sp. include two reactions of PCR. The profiles of sensibility were evaluated by disc diffusion and the detection of the presence of genes blaOXA-23-like, blaOXA-24-like, blaOXA-51-like, blaOXA-58-like, blaIMP, blaVIM, blaSIM, blaGIM, and blaSPM were performed using specific primers. Molecular typing was performed by RAPD and isolates resistant to carbapenems also by PFGE. The production of autoinducers of three clinical species complex was sought using bioassays with sensor strains. The ability adhesion was evaluated in monolayer of Hep-2 cells, MRC-5 and NCI-H292E. Ten clinical strains of each species of ACB complex were screened for the production of biofilms by colorimetric assay using crystal violet. Among all the strains studied, 82.5% were A. baumannii (425), 11.5% A.13TU (59) and 6.0% A. 3 (30). A. baumannii strains were more isolated from intensive care unit (ICU) patients (p = 0.0407) and A. 13TU from other patients in different hospital settings (p = 0.0204). A. baumannii showed less sensitivity to all drugs when compared with A. 13TU and A.3 (p <0.05). It was possible to observe during the study period a significant increase in carbapenem resistance and sensitivity to gentamicin by A. baumannii isolates from patients in ICUs (p <0.05). No genes coding for metallo-lactamase was detected in the samples studied. blaOXA-23 gene was detected in 81.25% among the 176 strains resistant to carbapenems. Results obtained by RAPD revealed less diversity among isolates from ICU patients compared to isolates from patients from other hospitals. The dendrogram obtained by PFGE showed less diversity than RAPD It was unable to detect homoserine lactone and autoinducer-2 by bioassay. The survey was positive of autoinducer-3 observed differences in yield among clinical species, smaller amount produced by strains of A. 3 when compared with A. 13TU and A. baumannii (p <0.05). Among the cells studied in adhesion testing, line NCI-H292 showed the greatest power discrimination between adhesion pattern observed and species of the ACB. A. baumannii showed diffuse adherence, A. 13 TU strains showed adhesion clustering and A. 3 did not adhere. This experiment was repeated in the presence of 100 &#181;M of propranolol and it was noted a decrease in cell A. 13TU and A. baumannii adhered per field observed. The biofilm assay showed significantly higher production of biofilms by A.baumannii compared with A. 3 (p <0.05). When the test was conducted in the presence of phentolamine at 100&#181;M, it was observed a significant decrease in the biofilm productions by A. baumannii, which revealing the involvement of the autoinducer-3 in biofilm production. The data obtained suggest that the proposed method of identification is a method for identification of species of medical interest belonging to the ACB complex which could be used in a routine laboratory. The method is simple, fast and beside the identification species, provides data about the resistance genes. Moreover, it revealed that the isolates of A. baumannii are more resistant and OXAbla genes, that was restricted to the ACB complex studied in this work. A. baumannii has also increased capacity for adhesion and biofilm formation, which regulates the expression of the phenotype may be linked to the production of autoinducers-3.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_regis_sturbelle.pdf: 477794 bytes, checksum: d7692995394f46dd2524f4a667bb1ce6 (MD5) Previous issue date: 2009-10-29 / One of the most important sanitary problems that cause economic losses in swine industry is the diarrhea caused by Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC). It is the main infectious cause of mortality for animals in suckling and post-weaning periods. Their primary factors of pathogenicity are the fimbriae, which bond the bacteria to specific receptors of the enterocytes. This causes a succession of events, brought about by the enterotoxins, the stable toxins (ST) and heat-labile toxins (LT), leading to diarrhea. Another important structure is the flagellum, which has an important role in cell stimulation to produce pro-inflammatory cytokines through the interaction with Toll-like receptors (TLR5), signaling cell recruitment and activation, thus increasing local inflammation as well as antigen presentation to lymphocytes. Quorum Sensing is a signaling system among bacteria that uses substances denominated autoinducers (AI). When the auto-inducers reach a certain concentration, due to an increase of cell density, there is an activation of transcriptional factors, which regulate the gene expression. The catecholamines (adrenaline and noradrenalin), produced by nervous cells, use the auto-inducer type 3 (AI-3) pathway. These have a significant role in gene expression as they stimulate the growth and the expression of virulence factors of the Escherichia coli. The goal of the present study was to produce experimental vaccines containing total cultures of ETEC cultivated in different induction conditions, mediated by the conditioned media (mc) so as to study the expression of vaccine antigens. Different concentrations of mc were used, with the 50% of conditioned media added with 500 μM of adrenaline having the major initial growth and antigen expression. In the motility assay, a sixteen-fold increase was observed in comparison to the control. By the ELISA, hemoagglutination, hemoagglutination inhibition and Dot Blot techniques, a higher expression of fimbriae (F4) was observed, whereas by Dot Blot, ELISA and RT-PCR techniques an increase of LT expression was observed. Based on this data a bacterin was prepared using 50% of mc and 500 μM of adrenaline, with Al(OH)3 as an adjuvant. Five weeks old Swiss female mice were vaccinated twice with 250 μL subcutaneously on days 0 and 8 14. The vaccine immune response was evaluated by ELISA and hemoagglutination inhibition. The mc bacterin vaccinated group respond with a seroconversion significantly higher that the control group. These results suggest that the presence of mc with adrenaline is capable of activating the expression of important vaccine antigens, therefore making bacterin more efficient. / Um dos maiores problemas sanitários que causam prejuízo à suinocultura é a diarréia causada por Escherichia coli Enterotoxigênica (ETEC). Esta é a causa infecciosa mais comum de mortalidade em animais em aleitamento e no período pós-desmame. Os fatores primários de patogenicidade desta bactéria são as fímbrias, que as ancoram a receptores específicos dos enterócitos permitindo que as enterotoxinas, toxinas termo estáveis (ST) e toxinas termo lábeis (LT) desencadeiem uma sucessão de eventos levando à diarréia. Outra estrutura é o flagelo que possui um papel na estimulação de células na produção de citocinas pró-inflamatórias através da interação com receptores Toll-like 5 (TLR5), sinalizando o recrutamento e ativação de células, desta forma ampliando a inflamação local bem como a apresentação de antígeno aos linfócitos. Quorum Sensing é um sistema de sinalização entre as bactérias, os quais produzem substâncias denominadas de auto-indutores (AI). Quando os auto-indutores alcançam uma determinada concentração, decorrente do aumento da densidade celular ocorre uma ativação de fatores transcricionais que acabam regulando a expressão gênica. As catecolaminas (adrenalina e noradrenalina), produzidas pelas células nervosas, utilizam a via de sinalização do auto-indutor tipo 3 (AI-3) que têm um papel significante na expressão gênica, estimulando o crescimento e a expressão de fatores de virulência de Escherichia coli. O objetivo deste estudo foi utilizar o sistema de sinalização Quorum Sensing para induzir a expressão in vitro de antígenos vacinais de Escherichia coli Enterotoxigênica cultivadas em diferentes condições de indução mediada pelos meios condicionados (mc). Diferentes concentrações de mc foram utilizadas, sendo que o maior crescimento inicial e a maior expressão de antígenos de interesse foram obtidos com 50% de meio condicionado adicionado de 500 μM de adrenalina. No ensaio de motilidade foi observado um aumento de 16 vezes em relação ao controle. Pelas técnicas de ELISA, hemaglutinação, inibição da hemaglutinaçõa e Dot blot foi observado uma maior expressão de fimbria (F4) e pelas técnicas de Dot blot, ELISA e RT-PCR foi observado aumento da expressão de LT. Baseado nesses dados 6 testou-se uma bacterina utilizando 50% de mc e 500 μM de adrenalina com Al(OH)3 como adjuvante. Foram utilizados camundongos Swiss fêmeas com 5 semanas de idade que foram vacinados por via subcutânea com 250 μL nos dias 0 e 14. A avaliação da resposta imune foi realizada através de soroconversão frente aos antígenos estudados por meio de ELISA e inibição da hemaglutinação. O grupo vacinado com a bacterina com mc obteve uma soroconversão significativamente superior ao grupo controle. Estes resultados sugerem que a presença de mc com adrenalina são capazes de ativar a expressão de importantes antígenos vacinais, tornando desta forma a bacterina mais eficiente.

Orientador: Marcelo Palma Sircili / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T04:50:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franzin_FernandaMaria_D.pdf: 6490379 bytes, checksum: facd90d2115a20d8eccb498865503103 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Escherichia coli enteropatogênica atípica (aEPEC) faz parte de um grupo de patógenos capazes de formar um tipo de lesão em células epiteliais denominada Attaching and Effacing (A/E). Os genes requeridos para a formação da lesão A/E estão localizados em uma ilha de patogenicidade denominada Locus of Enterocyte Effacement (LEE). A regulação da expressão dos genes de LEE é um processo complexo e envolve inúmeros fatores e vias regulatórias, incluindo o sistema de quorum sensing AI- 3/Epinefrina/Norepinefrina. O sensor histidina-quinase QseC é responsável por detectar AI-3 produzido por outras bactérias e epinefrina/norepinefrina produzidas pelo hospedeiro e iniciar uma cascata regulatória que induz a expressão de genes de virulência. Para avaliar o papel desse sistema na regulação de fatores de virulência de aEPEC, um mutante para o gene qseC foi gerado e analisado a nível transcricional e fenotípico quanto a sua motilidade, capacidade de secretar proteínas e induzir lesão A/E, na presença e/ou ausência do sinal epinefrina. Ensaios de qRT-PCR demonstraram níveis transcricionais diminuídos para LEE e para os genes flhD, fliC e nleA no mutante, sugerindo que QseC regula a expressão desses fatores de virulência. Ensaios de motilidade, proteínas secretadas e FAS evidenciaram que a motilidade, a secreção de proteínas e a formação da lesão A/E estavam diminuídas no mutante, comprovando a participação de QseC na regulação desses fenótipos em aEPEC. Os mesmos ensaios realizados na presença de epinefrina demonstraram que esse sinal tem papel importante na regulação dos genes de LEE de aEPEC e que essa regulação não ocorre exclusivamente via QseC, mas envolve outro receptor para esse hormônio. Epinefrina regula a expressão dos genes de LEE, porém, parece não ser um sinal importante na regulação da expressão de NleA e flagelo/motilidade. A análise do transcriptoma da linhagem mutante demonstrou que, além de ter uma importância central na regulação da virulência de aEPEC, QseC age também como um importante regulador global da expressão gênica nessa linhagem, regulando, direta ou indiretamente, a expressão de, aproximadamente, 1505 genes, entre eles genes relacionados ao metabolismo, transporte, quimiotaxia, captação de íons, resistência à stress, formação de biofilme, regulação transcricional, etc. Um modelo geral simplificado da regulação gênica da virulência de aEPEC através do sistema AI-3/Epi/NE e seu sensor QseC foi proposto. Esse trabalho descreve pela primeira vez a regulação do tipo quorum sensing na modulação da expressão da virulência em uma EPEC atípica / Abstract: Atypical enteropathogenic Escherichia coli (aEPEC) is part of a group of pathogens capable of forming a characteristic lesion in epithelial cells called Attaching and Effacing (A/E). Genes required for A/E lesion formation are located on a pathogenicity island called Locus of Enterocyte Effacement (LEE). The regulation of LEE gene expression is a complex process and involves several factors and regulatory pathways, including the quorum sensing system AI-3/Epinephrine/Norepinephrine. The histidine kinase sensor QseC is responsible for detecting AI-3 produced by other bacteria and epinephrine/norepinephrine produced by the host, starting a regulatory cascade that induces the expression of virulence genes. In order to evaluate the influence of this system in the regulation of virulence factors of aEPEC, a qseC mutant has been generated, and transcriptional and phenotypical analyses were performed. Motility, ability to secrete proteins and induce A/E lesion, in the presence and/or absence of the epinephrine signal were analysed. qRT-PCR assays demonstrated reduced transcriptional levels of the LEE operons, and flhD, fliC and nleA genes in the mutant strain, suggesting that QseC regulates the expression of these virulence factors. Motility assays, secreted proteins and FAS have shown that motility, protein secretion and A/E lesion formation were decreased in the mutant, confirming the participation of QseC regulating these phenotypes in aEPEC. The same tests were performed in the presence of epinephrine, and demonstrated that this signal plays an important role in LEE gene regulation of aEPEC and this regulation does not occur exclusively via QseC, but involves other receptor for this hormone. Epinephrine regulates the expression of LEE genes, however, does not seem to be an important signal in the regulation of NleA and flagella/motility gene expression. Transcriptome analysis of the mutant strain has shown that, besides having a central role in the regulation of aEPEC virulence, QseC also acts as an important global regulator of gene expression in this strain, regulating, directly or indirectly, the expression of approximately 1505 genes, including genes related to metabolism, transport, chemotaxis, ion uptake, resistance to stress, biofilm formation, transcriptional regulation, and other. We proposed a simplified general model of virulence gene regulation of aEPEC through the AI-3/Epi/NE system and its sensor QseC. This is the first work describing the quorum sensing gene regulation modulating the virulence expression in atypical EPEC / Doutorado / Microbiologia / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Muitos genes bacterianos são regulados pelo mecanismo de comunicação denominado quorum sensing (QS). Neste sistema, moléculas sinalizadoras ativam um comportamento de grupo, conforme a densidade celular, permitindo o controle da expressão gênica. Estudos sugerem o potencial de compostos extraídos de plantas sobre o QS, a exemplo da quercetina, um flavonol presente em concentrações elevadas em algumas frutas e hortaliças. Este composto é o flavonoide majoritário presente em cebola (Allium cepa), mas não existem estudos que mostrem a atividade anti-QS de extratos orgânicos deste vegetal. Este trabalho avaliou o potencial antimicrobiano e anti-QS de extratos orgânicos de cebola branca e cebola roxa, assim como de alguns de seus componentes majoritários identificados, em fenótipos regulados pelo QS como a produção de violaceína em Chrormobacterium violaceum ATCC 12472, a motilidade tipo swarming e a formação de biofilmes em Pseudomonas aeruginosa PAO1 e Serratia marcescens MG1. Extratos de cebola branca e roxa foram obtidos por extração em fase sólida utilizando coluna de poliamida e seus compostos identificados e quantificados pelas técnicas de Cromatografia líquida- ionização por elétron spray-espectrometria de massas e cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector de arranjo de diodo. A atividade antimicrobiana foi avaliada pelas curvas de multiplicação de cada micro-organismo. O efeito dos compostos quercetina aglicona (inibidor do QS já relatado na literatura e encontrado no extrato de cebola roxa) e quercetina-3-&#946;-D-glicosideo (um dos compostos majoritários encontrados em ambos extratos) sobre os micro-organismos utilizados neste estudo foi também avaliado. Foram obtidos três extratos: cebola branca em metanol (CB-MeOH), cebola branca em metanol amônia (CBMeOH/ NH4) e cebola roxa em metanol (CR-MeOH). Os compostos quercetina 3,4\'- diglicosídeio, quercetina-4-glicosídeo, quercetina-3-&#946;-D-glicosideo e quercetina aglicona foram os predominantes nos extratos das duas variedades de cebola. Cianidina-3-O-glicosideo também foi identificada no extrato de cebola roxa. A concentração inibitória mínima (MIC) dos extratos foi igual ou superior a 125 &#181;g/ml (p/v) de extrato seco. Não foi observada inibição significativa da produção de violaceína em C. violaceum pelos extratos orgânicos de cebola e nem pela quercetina-3-&#946;-D-glicosideo, nas concentrações sub-inibitórias avaliadas. No entanto, a quercetina aglicona inibiu significativamente a produção de violaceína em todas as concentrações. A glicosilação da quercetina pode ter afetado sua atividade sobre a inibição da produção de violaceina, já que estudos mostram menor atividade biológica deste composto quando glicosilado. Para a motilidade tipo swarming em P. aeruginosa PAO1 houve inibição significativa pelo extrato de cebola roxa, em todas as concentrações estudadas. Os demais extratos não apresentaram inibição contra este micro-organismo. Para S. marcescens MG1, foi observada inibição da motilidade swarming somente na concentração de 125 &#181;g/ml de CBMeOH/ NH4. As análises de comparação entre os dois tipos de quercetina revelaram que, embora para as duas bactérias testadas os dois compostos apresentaram atividade inibitória sobre a motilidade tipo swarming, a quercetina-3-&#946;-D-glicosideo foi menos eficiente que a quercetina aglicona na concentração de 125 &#181;g/ml. A formação de biofilmes não foi influenciada pelos extratos e, inesperadamente, não se detectou inibição da formação de biofilmes por ambos tipos de quercetina avaliados. De forma geral, os extratos orgânicos de cebola mostraram pouco efeito sobre os fenótipos controlados pelo quorum sensing e a glicosilação da quercetina provavelmente explica a baixa atividade antimicrobiana e anti-QS dos extratos. / Many bacterial genes are regulated by a communication mechanism called quorum sensing (QS). In this system, signaling molecules activate a group behavior according to cell density, allowing the control of gene expression. Studies suggest the inhibitory potential of compounds extracted from plants on the QS system, like quercetin, a flavonol present in high concentrations in some fruits and vegetables. This compound is the main flavonoid found in onion (Allium cepa); however, there are no studies showing the anti-QS activity of organic extracts of this plant. The objective of this work was to evaluate the antimicrobial and anti-QS potential of organic extracts of white and red onions, and their major components studied in QS-regulated phenotypes such as violacein production in Chromobacterium violaceum, swarming motility and biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa PAO1 and Serratia marcescens MG1.White and red onion extracts were obtained by solid phase extraction using a polyamide column and its compounds were identified and quantified by Liquid Chromatography - Electron Spray-Mass Spectrometry and high performance liquid chromatography coupled to diode array detector. O The antimicrobial activity was evaluated by growth curves of each microorganism. The effect of non-glycosylated quercetin (a QS inhibitor already reported in the literature and found in red onion extract) and quercetin-3-&#946;-D-glycoside (one of the major compounds found in both extracts) on the microorganisms used in this study was also evaluated. Three extracts were obtained: white onion in methanol (CB-MeOH), white onion in methanol ammonia (CB-MeOH / NH4) and red onion in methanol (CR-MeOH). Our results showed that quercetin 3,4\'- diglycoside, quercetin-4-glycoside, quercetin-3-&#946;-D-glycoside and non-glycosylated quercetin were predominant in the extracts of the two onion varieties. Cyanidin-3-O-glycoside has also been identified in the purple onion extract. The minimum inhibitory concentration (MIC) of extracts was equal or greater than 125 &#181;g / ml (w / v) of dry extract. There was no significant inhibition of violacein production in C. violaceum by organic onion extracts or by quercetin-3-&#946;- D-glycoside at the sub-inhibitory concentrations evaluated. However, non-glycosylated quercetin showed a significant inhibition of violacein production in all tested concentrations. The glycosylation of Quercetin could have altered its inhibition activity towards violacein production, and in fact, some studies have shown less biological activity of some phenolic compounds when they have been glycosylated. For swarming motility in P. aeruginosa PAO1 there was significant inhibition by red onion extract, in all studied concentrations. The other extracts did not present inhibition against this microorganism. For S. marcescens MG1, inhibition of swarming motility was observed only at the concentration of 125 &#181;g / ml of CB-MeOH / NH4. Comparative analyses between the two types of quercetin showed that, although for the two bacteria tested the two compounds showed inhibitory activity on swarming motility, quercetin-3-&#946;-D-glycoside was less efficient than non-glycosylated quercetin in the concentration of 125 &#181;g / ml. Biofilm formation was not influenced by the extracts and unexpectedly, both types of quercetin evaluated did not show inhibition towards biofilm formation. In general, organic onion extracts showed little effect on quorum sensing controlled phenotypes and glycosylation of quercetin probably explains the low antimicrobial and anti-QS activity of the extracts.

Le groupe Bacillus cereus est composé de huit espèces de bactéries à Gram positif sporulantes qui peuvent coloniser plusieurs niches écologiques. Les espèces les plus importantes sont B. cereus, une bactérie ubiquitaire du sol et un pathogène opportuniste; B. thuringiensis, un entomopathogène très utilisé comme biopesticide; et B. anthracis l’agent de la maladie du charbon. Bien que ces espèces présentent différents phénotypes, elles sont étroitement liées génétiquement et leurs facteurs de virulences principaux sont portés par des plasmides. Le cycle infectieux de B. thuringiensis dans la larve d’insecte est régulé par l’activation séquentielle de systèmes de quorum sensing de la famille RNPP. Parmi eux, les systèmes Rap-Phr, caractérisés chez B. subtilis, ont très peu été étudiés dans le groupe B. cereus. Ces systèmes régulent divers processus bactériens importants dont la sporulation. L’objectif de cette étude est d’analyser les systèmes Rap-Phr dans le groupe B. cereus, pour connaitre leur distribution, leur localisation et leur diversité afin d’obtenir une vue globale de ces systèmes chez ces bactéries. De plus, leur possible implication dans la régulation du processus de sporulation a été prédite sur la base de données structurales décrites chez RapH de B. subtilis. Les gènes rap, toujours associés à un gène phr, sont présents dans toutes les souches étudiées avec une moyenne de six gènes rap-phr par souche et avec 30% de ces systèmes qui sont portés par des plasmides. Les souches de B. thuringiensis portent six fois plus de systèmes Rap-Phr plasmidiques que les souches de B. cereus. Par ailleurs, les souches phylogénétiquement proches possèdent un profil de gènes rap-phr similaire. Un tiers des protéines Rap sont prédites pour inhiber la sporulation et ces protéines sont préférentiellement localisées sur les plasmides et donc plus fréquemment présentes chez B. thuringiensis que chez B. cereus. Cette prédiction a été partiellement validée par des tests de sporulation suggérant que les résidus impliqués dans cette activité chez B. subtilis sont conservés mais insuffisants pour prédire cette fonction. Le système Rap63-Phr63 porté par le plasmide pAW63 de la souche B. thuringiensis HD73 a ensuite été caractérisé. La protéine Rap63 a un effet modéré sur la sporulation et retarde l’expression des gènes régulés par Spo0A. La Rap63 est inhibée par son peptide Phr63, dont la forme mature correspond à l’extrémité C-terminale du pro-peptide. Les résultats de sporulation dans l’insecte suggèrent une activité synergique des systèmes Rap63-Phr63 et Rap8-Phr8 (porté par le pHT8_1) dans la régulation de la sporulation. Malgré la similarité entre les Phr63 et Phr8 aucun cross-talk n’a pu être mis en évidence, ce qui confirme la spécificité de ces systèmes de communication cellulaire. L’ensemble de ces résultats démontre la grande diversité des systèmes Rap-Phr dans le groupe B. cereus et souligne l’impact des systèmes plasmidiques dans le développement de ces bactéries. Par conséquent, les plasmides sont des éléments importants pour l’adaptation et la survie de ces bactéries et particulièrement pour B. thuringiensis. / The Bacillus cereus group of Gram positive spore forming bacteria is comprised by eight species that are able to colonize several ecological niches. The most important species are B. cereus, a ubiquitous soil bacterium and an opportunistic pathogen; B. thuringiensis, an entomopathogen widely used as biopesticide; and B. anthracis, the causative agent of anthrax. Even if they present different phenotypes, they are genetic closely related and their main virulence factors are encoded on plasmids. The infectious cycle of B. thuringiensis in the insect larvae is regulated by the sequential activation of quorum sensing systems from the RNPP family. Among them, the Rap-Phr was extensively studied in B. subtilis but just punctually in B. cereus group species. The Rap-Phr systems were shown to regulate various bacterial processes, including the sporulation. The objective of this study was to analyze the Rap-Phr systems in the B. cereus group, regarding their distribution, location and diversity to achieve an overview of these systems in these bacteria. Moreover, their possible involvement in the control of the sporulation process was predicted based on structural data described for RapH in B. subtilis. The rap genes, always associated with a phr gene, were present in all 49 studied strains with an average of six rap-phr genes per strain and 30% were located on plasmids. Comparison among B. cereus and B. thuringiensis strains revealed that the last one harbors six-fold more plasmid rap-phr system then the former. Moreover, phylogenetic closer strains possess a similar profile of rap-phr genes. Interestingly, 32% of the Rap proteins were predicted to inhibit sporulation and these proteins were preferentially located on plasmids and therefore in B. thuringiensis strains. This prediction was partially validated by sporulation efficiency assays suggesting that residues identified in B. subtilis as involved in the phosphatase activity are conserved but not sufficient to predict the sporulation function. Then, the plasmid-borne Rap63-Phr63 system from pAW63 plasmid of B. thuringiensis HD73 strain was further studied. The Rap63 protein moderately inhibits the sporulation and delays the expression of Spo0A-regulated genes. Rap63 is counteracted by its cognate Phr63 peptide, which mature form corresponds to the C-terminal end of the pro-peptide. Sporulation assays in insect larvae suggest a synergistic activity of Rap63-Phr63 and Rap8-Phr8 (from pHT8_1 of B. thuringiensis HD73 strain) systems on sporulation efficiency. Despite the similarities of Phr63 and Phr8 no cross-talk was found between these two systems, confirming their specificity. Altogether, these results reveal the high diversity of the Rap-Phr systems in the B. cereus group and highlight the relevance of the plasmid-borne systems to cell development. Therefore, the results demonstrated the importance of the plasmids in the adaptation and the survival of these bacteria, especially for B. thuringiensis.

Einleitung: Biofilme gelten als die ursprüngliche Form des Lebens. Biofilme haben sich als Lebensform so gut bewährt, dass sie über die gesamte Zeit überlebt, sich weiterentwickelt und aufgrund dessen weit verbreitet haben. Ökologisch gesehen, besitzen sie eine große Bedeutung an den globalen Stoffwechselkreisläufen. Weiterhin spielen sie eine bedeutende Rolle bei der Pathogenese von chronischen Erkrankungen. So stellen im Organismus auftretende Biofilme die Ursache für zahlreiche, teils lebensbedrohliche Infektionen, wie die Endokarditis dar. In der Mundhöhle bilden die sich in der dentalen Plaque befindlichen Bakterien Säuren, welche Karies verursachen und im parodontalen Sulkus proliferierend zur Entstehung von Parodontopathien führen können. Neben ihren krankheitsauslösenden Effekten besitzen Biofilme auch lebensnotwendige Eigenschaften. Sie sind zum Beispiel Bestandteil der natürlichen Darmmikrobiota und tragen dort zur Verdauung, Immunmodulation sowie zur Versorgung des Organismus mit Vitaminen bei. Ziel dieser Übersichtsarbeit war es einen aktuellen Stand über die Ätiologie und Pathogenese von Biofilmen im Allgemeinen und die spezielle Bedeutung der dentalen Plaque bei der Pathogenese der Parodontitiden im Besonderen zu evaluieren. Material und Methoden: Die Bearbeitung der Thematik erfolgte anhand einer systematischen Literaturrecherche. Hierzu wurden internationale Quellen zusammengetragen und ausgewertet. Zum Auffinden von themenrelevanten Quellen dienten entsprechende Keywords. Diese Schlagwörter wurden einheitlich in den Datenbanken verwendet und sowohl in englischer als auch deutscher Sprache formuliert. Für die Auswahl der Datenbanken waren ausschlaggebend das Fachgebiet, der Evidenzgrad und die Zugänglichkeit. Primär erfolgte die Suche in der „Cochrane Library“, da dort Studien mit dem höchsten Evidenzgrad erfasst sind. Weiterhin wurden die Metadatenbanken „PubMed“ der American National Library of Medicine und „DIMDI“ verwendet. Zur Verwaltung der Literatur kam die Literaturverwaltungssoftware „Citavi“ zur Anwendung. Ergebnisse: Unabhängig von deren Lebensraum weisen alle Biofilme gemeinsame Merkmale auf. Am wichtigsten für die Biofilmentstehung ist die Produktion einer extrazellulären polymeren Matrix, in welche die Bakterien eingebettet und dadurch besser vor äußeren Einflüssen, wie Scherkräften und Austrocknung geschützt sind. Weitere wichtige Effekte des multibakteriellen Zusammenlebens innerhalb der Plaque sind Stoffwechseloptimierungen, die Virulenzsteigerung, eine erhöhte Resistenz gegenüber antimikrobiellen Substanzen, interzelluläre Kommunikation mittels Quorum sensing und die sich dadurch ergebende Möglichkeit der gezielten Expression von Genen. Auch die Etablierung von wachstumsfördernden Umgebungsbedingungen resultiert aus dem bakteriellen Zusammenschluss. Im Vergleich zu anderen Biofilmen zeichnet sich die orale Mikrobiota durch ihre besonders hohe Heterogenität und damit Komplexität aus. Unter normalen Bedingungen gehen die Plaquebakterien mit dem Wirtorganismus eine Symbiose ein. Dieser mutualistische Zustand wird als mikrobielle Homöostase bezeichnet. Während die residente orale Mikrobiota vom Nährstoffangebot und Lebensraum profitiert, trägt sie zur Abwehr pathogener Keime bei. Nur durch das Zusammenspiel verschiedener Einflussfaktoren, die Initiierung einer Entzündungsreaktion sowie die bakteriellen Interaktionsmöglichkeiten innerhalb des Biofilms, kommt es zur Krankheitsentstehung. Pathogene Plaquebakterien spielen eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der Parodontitis. Die Zusammensetzung von supragingivaler und subgingivaler Plaque differenziert deutlich voneinander. Bei chronisch und aggressiv verlaufender Parodontitis weist die subgingivale Plaquezusammensetzung keine signifikanten Unterschiede auf. Es gibt jedoch Hinweise auf spezielle Subspezies, die mit besonders schweren Verlaufsformen in Zusammenhang gebracht werden. Einzelne Bakterienspezies sind aber nicht in der Lage die Pathogenese einer Parodontitis zu initiieren. Schlussfolgerung: Neben der mechanischen Eradikation des supra- und subgingivalen Biofilms mittels verschiedener Behandlungsmöglichkeiten, stellt die Prävention, in Form einer Entzündungsprophylaxe, eine effektive Therapieoption dar. Nur wenn das natürliche Gleichgewicht zwischen oraler Mikrobiota und Wirtsorganismus aufrechterhalten wird, kann die Entwicklung einer Parodontitis vermieden werden. Neue, sich aus der Wissenschaft ableitende Therapieansätze, wie der Einsatz von Quorum sensing - Inhibitoren und probiotischen Stoffen, erfordern weitere Erforschung, um sie für den praktischen Einsatz nutzbar zu machen.:Abkürzungsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis II 1. Einleitung 1 1.1. Allgemeines zu Biofilmen 2 1.2. Natürliches Vorkommen von Biofilmen 4 1.3. Bildung von Biofilmen 5 1.3.1. Initiale Adhäsion 6 1.3.2. Proliferation und Reifung 7 1.3.3. Dispersion 8 1.4. Biofilmstrukturen 10 1.4.1. Aufbau von Biofilmen allgemein 10 1.4.2. Aufbau der dentalen Plaque 12 1.5. Quorum sensing 17 1.6. Immunreaktionen auf Biofilme 19 1.7. Bedeutung von Biofilmen in der Medizin 23 2. Fragestellung 29 3. Material und Methode 30 4. Ergebnisse 34 4.1. Eigenschaften der dentalen Plaque 34 4.2. Bedeutung der oralen Plaque in der Zahnmedizin 40 4.2.1. Karies 41 4.2.2. Parodontopathien 41 4.2.3. Endodontale Infektionen 49 4.2.4. Periimplantitis 50 4.3. Therapieansätze für bakterielle Erkrankungen 51 4.3.1. Therapieoptionen biofilmbasierter Krankheiten 52 4.3.2. Therapie spezieller biofilmbasierter oraler Erkrankungen 53 5. Diskussion 57 6. Zusammenfassung 60 7. Literatur - und Quellenverzeichnis Iv 8. Anhang XXIV 8.1. Abbildungsverzeichnis XXIV 8.2. Tabellenverzeichnis XXIV

Als Quorum sensing (QS) wird die Kommunikation zwischen Bakterien bezeichnet. Diese basiert auf kleinen Signalmolekülen, die Autoinducer (AI) genannt werden. Durch QS werden von Bakterien Verhaltensweisen wie Fähigkeit zur Symbiose, Virulenz, Produktion von Antibiotika und Bildung von Biofilmen reguliert. Die Kommunikation kann innerhalb einer Spezies (Intraspezies-Kommunikation) oder mehreren Spezies (Interspezies-Kommunikation) erfolgen. Gram-negative Bakterien kommunizieren über acetylierte Homoserinlaktone (AHL), Gram-positive Bakterien dagegen benutzen modifizierte Oligopeptide als Autoinducer. Für die Interspezies-Kommunikation dient der Autoinducer-2 (AI-2). AI-2 entsteht auf dem Weg der spontanen Zyklisierung von 4,5-Dihydroxy-2,3-Pentadion (DPD), der von LuxS synthetisiert wird. Die Universalität des AI-2 als Signalmoleküls basiert auf dessen chemischen Eigenschaften. Als biologisch aktive Formen von DPD gelten S-THMF-Borat (bei marinen Bakterien wie Vibrio harveyi) und R-THMF (z.B. bei Enterobakterien wie Escherichia coli oder Salmonella enterica Serovar Typhimurium). AI-2 wird bei allen Bakterien von einem periplasmatischen Rezeptor gebunden. S-THMF-Borat bindet spezifisch an den Rezeptor LuxP, R-THMF dagegen an den Rezeptor LsrR. Durch die Anbindung des AI-2 verändert sich die Konformation des Rezeptors, was als Signal über weitere Proteine in die Zelle weitergeleitet wird. In E. coli ist die Expression des Operons lsrACDBFGE von AI-2 abhängig. Der lsr-Promotor wird von dem Repressor LuxR, Phospo-AI-2 sowie dem cAMP-CRP-Komplex reguliert. In dieser Arbeit wurden die molekularbiologische Grundlagen zur Entwicklung eines AI-2-Biosensors gelegt. Es wurden mehrere Fusionskonstrukte des V. harveyi AI-2 Rezeptors LuxP sowie dessen Derivate mit veränderter Affinität zur AI-2 kreiert, in E. coli exprimiert und aufgereinigt. Auch Rezeptorproteine von Vibrio fischeri sowie E. coli konnten erfolgreich exprimiert werden. Die Expression der Proteine erfolgte in E. coli luxS- Deletionsstämmen, die hierfür konstruiert worden sind. Die AI-2-Rezeptorproteine werden in E. coli vorwiegend in Form von inclusion bodys exprimiert. Nur ein Teil des Proteins ist löslich und kann für die Aufreinigung unter nativen Bedingungen verwendet werden. Auf der Basis von E. coli luxS- Deletionsstämmen wurde ein Bioassay entwickelt, der für die Detektion von AI-2 verwendet werden kann. Hierfür wurden mehrere Reporterplasmide konstruiert, in denen das rot fluoreszierende Protein DsRed unter die Kontrolle des lsr-Promotors von E. coli kloniert wurden. Dabei konnte unter Verwendung einer dieser Reporterplasmide (pBRDsRed) sowie des luxS-Deletionsstammes KIB1 Bioassay-Bedingungen etabliert werden, die einen Nachweis von AI-2 ermöglichen. Die für den Assay benötigten AI-2-Moleküle wurden in vitro mithilfe der Enzyme Pfs und LuxS und S-Adenosyl-Homocystein (SAH) als Substrat hergestellt. Der entwickelte AI-2-Bioassay wurde für die Bestimmung der Bindeaktivität der V. harveyi LuxP-Derivate verwendet. Die resultierenden Ergebnisse wiesen eine hohe Reproduzierbarkeit (1,2 bis 11,3 % Standartabweichung) auf.