A maciez da carne bovina é o resultado do processo de proteólise miofibrilar influenciado pelas calpaínas (CAPN), enzimas ativadas pelo cálcio. A calpastatina (CAST) constitui um regulador das calpaínas, atuando como substrato e degradando-se pela ação da própria calpaína. A suplementação com vitamina D3 na dieta dos animais tem alterado positivamente a maciez da carne, por obter maior absorção e deposição de cálcio nos músculos. Tendo em vista a importância desses genes para a maciez da carne em bovinos e o metabolismo de vitamina D3, o objetivo deste estudo foi verificar a expressão gênica de 1-HYD, 24-HYD, CAPN1 e CAST (Isoformas). Foram utilizados 42 machos castrados da raça Nelore que foram divididos em 6 tratamentos (7 animais por tratamento). Os animais foram alojados em baias individuais e os tratamentos foram: T1) sem suplementação de Vitamina D3 + sem sombrite; T2) sem suplementação de Vitamina D3 + com sombrite filtração de 50% de UV; T3) com 2x106UI de vitamina D3 por dois dias consecutivos pré-abate + sem sombrite; T4) com 2x106UI de vitamina D3 por dois dias consecutivos pré-abate + com sombrite filtração de 50% de UV; T5) com 2x106UI de vitamina D3 por oito dias consecutivos pré-abate + sem sombrite; 6) com 2x106UI de vitamina D3 por oito dias consecutivos pré-abate + com sombrite filtração de 50% de UV. A expressão gênica foi analisada por PCR quantitativa em tempo real. O gene 1-HYD foi mais expresso nos tratamentos com 2 e 8 dias de suplementação com vitamina D3, independente da exposição diferenciada aos raios ultravioleta. O gene 24-HYD foi mais expresso no tratamento com 8 dias de suplementação pré-abate quando comparado ao tratamento controle, não diferindo do tratamento com suplementação por 2 dias consecutivos pré-abate. Portanto os resultados não corroboram com o mecanismo de regulação das atividades das enzimas modulada de forma oposta para regular os níveis circulantes de 1,25-di-hidroxi-vitamina D3 (1,25 D). Quando a concentração de 1,25 D atinge níveis elevados um mecanismo de regulação inativa a 1,25 D e promove a diminuição da expressão de 1-HYD. Assim pode-se inferir que neste estudo esses fatores não exerceram influência sobre o gene 1-HYD que teve um aumento da expressão. A única possibilidade de verificar o aumento da expressão do gene da enzima 1-HYD parece envolver um hiperparatireoidismo secundário decorrente de hipocalcemia em algum momento do experimento. A suplementação com vitamina D3 não exerceu influência na expressão de RNAm da CAPN1, isoforma I e isoforma total da CAST. A isoforma II do gene da calpastatina foi mais expressa no tratamento com 8 dias de suplementação pré-abate, onde parece que o aumento da expressão é devido a uma sinalização intracelular indicando que a calpastatina está sendo degradada pela ativação prolongada das calpaínas, em decorrência do aumento do influxo de cálcio. As análises de associação apontam para um possível descompasso entre abundância de RNAm e atividade da protease do sistema das calpaínas no processo de amaciamento da carne. / The tenderness of beef is the result of the process of myofibrillar proteolysis influenced by calpains (CAPN), enzymes activated by calcium. The calpastatin (CAST) is a regulator of calpains, acting as a substrate and degraded by the action of calpain itself. Supplementation with vitamin D3 in the diet has changed positively on meat tenderness, to obtain greater absorption and calcium deposition in muscle. Given the importance of these genes for meat tenderness in cattle and metabolism of vitamin D3, the objective of this study was to investigate the gene expression of 1-HYD, HYD-24, CAPN1, CAST (isoforms). We used 42 Nellore steers were divided into 6 treatments (seven animals per treatment). The animals were housed in individual pens and treatments were: T1) without vitamin D3 feeding + without shadow; T2) without vitamin D3 feeding + with black - 50% filtration of UV; T3) with 2x106UI of vitamin D3 for two days consecutive slaughter + without shadow; T4) with 2x106UI vitamin D3 for two days consecutive slaughter + with black - 50% filtration of UV; T5) with 2x106UI vitamin D3 for eight days consecutive slaughter + without shading; T6) 2x106UI with vitamin D3 for eight days consecutive slaughter + with black - 50% filtration of UV. Gene expression was analyzed by quantitative real-time. The 1-HYD gene was more expressed in the treatments with 2 and 8 days of supplementation with vitamin D3, independent of differential exposure to ultraviolet rays. The 24-HYD gene was more expressed in the treatment with 8 days of pre-slaughter supplementation compared to control treatment, the treatment did not differ with supplementation for 2 consecutive days pre-slaughter. These findings do not corroborate the mechanism for regulating the activities of enzymes modulated so diametrically opposite to regulate the circulating levels of 1,25- dihydroxy vitamin D3 (1,25 D). When there is an overproduction of 1,25 D regulation mechanism inactivates 1.25 D and promotes the reduction of the expression of 1-HYD. Thus we can infer that in this study, these factors did not influence the 1-HYD gene that had increased expression. The only way to verify the increase of gene expression of the enzyme 1-HYD seems to involve a secondary hyperparathyroidism due to hypocalcemia sometime in the experiment. Supplementation with vitamin D3 did not influence the mRNA expression of CAPN1, isoform I and isoform total of CAST. The isoform II of the calpastatin gene expression was higher in treatment with 8-day preslaughter supplementation, where it appears that increased expression is due to an intracellular signaling indicating that calpastatin is degraded by prolonged activation of calpain as a result of increased influx of calcium. The association analysis point to a possible mismatch between mRNA abundance and activity of the calpain system components in these physiological conditions.

As técnicas sorológicas são os testes de referência para o diagnóstico da doença de Chagas, porém, são pouco efetivas para avaliar a resposta ao tratamento, uma vez que a soronegativação pode levar muitos anos. As sorologias também são usadas para identificar episódios de reativação em pacientes com algum grau de imunodeficiência, por exemplo, os co-infectados pelo HIV. Já a hemocultura e o xenodiagnóstico possuem elevada especificidade e baixa sensibilidade, requerendo de 30 a 120 dias para a liberação do resultado final, podendo gerar resultados falso-negativos especialmente na fase crônica da infecção. Diante disso, a PCR em tempo real (qPCR), técnica com elevada sensibilidade e especificidade, poderia ser utilizada para detectar e quantificar a carga parasitária, permitindo o diagnóstico de episódios de reativação e o monitoramento de pacientes em tratamento. A escolha dos alvos de amplificação e dos iniciadores da qPCR é desafiadora, já que ainda não existe consenso na literatura sobre a melhor sequência alvo de amplificação e os melhores iniciadores. No presente estudo, foram selecionados iniciadores do DNA nuclear (F2/B3) e do mitocondrial (32F/148R) de T. cruzi. Posteriormente, para validação dos ensaios, foram obtidas amostras de sangue, cérebro, coração, pulmão, fígado, baço, rim, intestino, glândulas adrenais, tecido adiposo e tecido muscular esquelético de 24 camundongos Swiss adultos, infectados intraperitonealmente com 103 formas tripomastigotas da cepa Y de Trypanosoma cruzi. Amostras foram colhidas no 13º, 26º e 61º dias pós-infecção, correspondendo a diferentes intensidades de carga parasitária (alta, média e baixa). As amostras foram analisadas por qPCR com SYBR Green. Os resultados mostraram que os iniciadores do DNA nuclear e mitocondrial detectaram T. cruzi de forma específica, sendo que as maiores cargas parasitárias foram detectadas pelos iniciadores do DNA nuclear, embora os iniciadores do DNA mitocondrial tenham apresentado maior sensibilidade analítica (0,002 e 0,0002 de um único parasito, respectivamente). As duas qPCR obtiveram índices adequados de reprodutibilidade e repetibilidade inferiores a 25%. Os parâmetros de eficiência, (90%- 110%) e linearidade (R2 >= 0.98) das duas qPCR apresentaram valores adequados de acordo com o estabelecido pela literatura especializada. A comparação do threshold cycle (CT) das duas qPCR não apresentou diferença estatística. Em relação à carga parasitária foi possível detectar o DNA do parasito em todas as amostras de sangue e tecidos, com distribuição universal, porém heterogênea, e em todas as fases da infecção. O modelo animal utilizado neste estudo foi adequado para validar as duas qPCR voltadas à detecção e quantificação da carga parasitária. De acordo com os parâmetros estabelecidos, as duas qPCR, com iniciadores do DNA nuclear e do mitocondrial, foram padronizadas e validadas com sucesso, sendo capazes de quantificar todos os tipos de amostras (sangue e órgãos), nas fases aguda, subaguda e crônica da doença, sinalizando positivamente para a utilização dos dois ensaios moleculares no diagnóstico da infecção por T. cruzi. / Serological techniques are the gold standards for the diagnosis of Chagas\' disease, but are not very effective in evaluating the response to treatment, since seronegativation may take many years. Serology is also used to identify reactivation episodes in patients with some degree of immunodeficiency, for example those co-infected with HIV. Hemoculture and xenodiagnosis have high specificity and low sensitivity, requiring 30 to 120 days for releasing a final result, and they can generate false-negative results especially in the chronic phase of infection. Therefore, real-time PCR (qPCR), a technique with high sensitivity and specificity, could be used to detect and quantify the parasite load, allowing the diagnosis of reactivation episodes and the monitoring of patients undergoing treatment. The choice of amplification targets and qPCR primers is challenging since there is as yet no consensus in the literature about the best amplification target sequence and the best primers. In the present study, primers from the nuclear (F2/B3) and mitochondrial, kDNA (32F/148R) T. cruzi sequences were designed. Samples were obtained from the blood, brain, heart, lung, liver, spleen, kidney, intestine, adrenal glands, adipose tissue and skeletal muscle tissue of 24 adult Swiss mice, infected intraperitoneally with 103 trypomastigote forms of the Y strain of Trypanosoma cruzi. The samples were collected at the 13th, 26th and 61st post-infection days, corresponding to different parasite load levels (low, medium and high), and were analyzed by qPCR with SYBR Green. The results showed that the nuclear and mitochondrial DNA primers detected T. cruzi DNA in a specific way. The nuclear primers detected higher parasite load levels than the kDNA ones, although the kDNA primers presented higher analytical sensitivity (0.002 and 0.0002 of a single parasite, respectively). The two qPCRs showed adequate reproducibility and repeatability indexes, i.e., below 25%. The efficiency parameters, (90% - 110%) and linearity (R2 >=0.98) of the two qPCRs showed adequate values according to the established literature. The comparison of the threshold cycle (CT) of the two qPCRs found no statistical difference. Regarding the parasite load, it was possible to detect the parasite DNA in all blood and tissue samples, with universal distribution, however heterogeneous, and at all stages of infection. The animal model used in this study was adequate to validate the two qPCRs for the detection and quantification of the parasite load. According to established parameters, the two qPCRs, with nuclear and mitochondrial primers, were successfully standardized and validated, being able to quantify all types of samples (blood and organs), in the acute, subacute and chronic phases of the disease, signaling positively to the use of both molecular assays in the diagnosis of T. cruzi infections.

Para obter resultados rápidos e confiáveis que permitam o monitoramento da segurança microbiológica de alimentos, seja pela indústria ou pelos órgãos de fiscalização, diversos métodos alternativos têm sido desenvolvidos para a detecção e quantificação de Salmonella. Os propósitos do estudo foram avaliar a viabilidade de emprego do QIAamp® DNA Stool Mini Kit para extração e purificação de DNA de Salmonella; validar ensaios baseados em PCR-tempo real (PCR-RT) para quantificar o DNA de Salmonella empregando ttr ou tuf e desenvolver um ensaio para quantificar Salmonella baseado na transcriptase reversa-PCR-tempo real (RT-PCR-RT). Para avaliação do QIAamp® DNA Stool Mini Kit empregaram-se fezes coletadas diretamente do reto de animais infectados ou não, sendo estas últimas artificialmente contaminadas e submetidas à extração segundo protocolo do fabricante. As amostras de DNA isoladas foram quantificadas empregando um ensaio Salmonella-específico PCR-RT utilizando como alvo o lócus ttr. O mesmo ensaio foi utilizado para células de Salmonella provenientes de meio de cultura. O ensaio PCR-RT baseado no alvo tuf foi validado empregando-se primeiramente cepas de diferentes sorotipos de Salmonella e de outras Enterobacteriaceae. A seguir sua eficiência foi avaliada para alimentos-modelo (ave e suíno) artificialmente contaminadas com elevada (≈ 6 log UFC/mL) e baixa (≈ 2 log UFC/mL) população de Salmonella Typhimurium DT 104. A validação do método quantitativo de Salmonella por RT-PCR-RT foi realizada primeiramente com células em meio de cultura e posteriormente nos mesmos alimentos-modelo utilizados para PCR-RT. Em ambos os métodos, alíquotas dos alimentos-modelo foram mantidas a 20 ºC e a 8 ºC, sendo examinadas em diferentes tempos pós-inoculação. Como controle empregou-se a enumeração de microrganismos mesófilos totais e de Salmonella por técnicas convencionais. A taxa de recuperação de Salmonella em fezes suínas artificialmente inoculadas, após tratamento com QIAamp® DNA Stool Kit, variou entre 25% a 50%, dependendo da quantidade inicial de células. Empregando o DNA extraído e submetendo-o à PCR-RT para o ttr obteve-se limite de detecção de 2,8 log UFC eq/g de fezes; método que foi menos sensível que o convencional. A quantificação de Salmonella por PCR-RT empregando tuf apresentou limite de detecção menor que 1 log UFC eq. Os resultados obtidos com este método, empregando-se células em meio de cultura ou alimentos-modelo, foram, de maneira geral, ligeiramente inferiores aos do método convencional. A eficiência de amplificação para PCR-RT e tuf foi de 94%. O método RT-PCR-RT apresentou limite de detecção semelhante ao obtido com o ttr (2 log UFC eq) e sua eficiência de amplificação foi de 100%. Observou-se que tuf é expresso na fase logarítmica de multiplicação bacteriana, o que o torna um bom indicador da viabilidade de Salmonella. / In order to get fast and trustworthy results that allow monitoring the microbiological food safety either by industries or governmental agencies, diverse alternative methods have been developed for Salmonella detection and quantification. The purposes of this study were to evaluate the viability of the use of QIAamp® DNA Stool Mini Kit for Salmonella DNA extraction and purification; to validate assays based on real time-PCR (PCR-RT) to quantify Salmonella DNA by using ttr or tuf, and to develop an assay to quantify Salmonella based on reverse transcriptase- PCR-real time (RT-PCR-RT). For QIAamp® DNA Stool Mini Kit evaluation feces taken directly from the rectum of infected or health animals were used, with the former being artificially contaminated. Samples were submitted to DNA extraction, according to manufacturers protocol. The isolated DNA were quantified using a Salmonella-specific PCR-RT targeting the ttr locus. The same assay was used for Salmonella cells originated from culture medium. The PCR-RT assay with tuf as target was first validated employing different Salmonella serovars and other Enterobacteriaceae strains. After, its efficiency was evaluated on food-models (chicken and swine) spiked with high (≈ 6 log CFU/mL) and low (≈ 2 log CFU/mL) Salmonella Typhimurium DT 104 populations. The validation of the quantitative RT-PCR-RT method was first conducted with cells grown in culture medium, and then in the same food-model used for PCR-RT. For both methods aliquots of foodmodels were maintained at 20 ºC and 8 ºC being evaluated at different incubation times. Enumeration of total mesophilic microorganisms and Salmonella based on conventional methods were used as controls. The DNA recovery rate in swine feces artificially inoculated, after QIAamp® DNA Stool Mini Kit treatment, was between 25% to 50% depending the initial amount of cells. Using the extracted DNA and submitting it to PCR-RT for ttr a detection level of 2,8 CFU eq/g of feces was obtained. This method showed lower sensitivity than the conventional. Salmonella quantification by PCR-RT employing tuf showed a detection level lower than 1 log CFU eq. The results obtained with this method and cells suspended in culture medium or in food-model systems were, in general slightly lower that those obtained with the conventional method. The efficiency of amplification for PCR-RT tuf was 94%. Detection limit of RT-PCR-RT was similar to that of ttr (2 log CFU eq) and efficiency of amplification was 100%. tuf was expressed in logarithmic phase of bacteria growth curve showing that it is a good viability indicator for Salmonella.

A identificação de espécie de Leishmania é crucial no diagnóstico de leishmaniose cutânea (LC), para terapia e prognóstico, em áreas com diferentes espécies endêmicas. A reação em cadeia de polimerase (PCR) foi usada em amostras de biópsias estocadas em parafina e formol de pacientes com LC, do Espírito Santo, Brasil. Usando sequências de mini-exon do gênero Leishmania, 63,2% (36/57) das amostras em parafina e 46,1% (6/13) das amostras em formol foram positivas. Numa abordagem usando sequências de kDNA e RFLP, 100% (58/58) das amostras de parafina testadas foram identificadas como Leishmania (V.) braziliensis. Estas reações podem ser usadas tanto para diagnóstico como para definição da espécie infectante / The identification of Leishmania species, a crucial step in cutaneous leishmaniasis, had therapeutics and prognostics implications, specially at when several agent species are endemic. Polymerase chain reaction (PCR) was used for analysis of paraffin-embedded and formalin stored skin biopsies from patients with parasitologic confirmed cutaneous formalin stored skin biopsies from patients with parasitologic confirmed cutaneous leishmaniasis, from the Espirito Santo State, Brazil. Tested by PCR targeted to mini-exon genus specific primer, 63,2% (36/57) of parafin and 46,1% (6/13) of formalin stored samples were positive, but using a PCR for kDNA primer followed by RFLP analysis, only Leishamnia (V.) braziliensis was identified in 100% (58/58) of parafin biopsies studied. Those reactions allow either diagnosis or species identification in cutaneous leismaniasis

A partir de 280 isolados fúngicos de cana-de-açúcar, 18 cepas foram avaliadas quanto á presença de genes da policetídeo sintase por meio da técnica do PCR. Estes fungos foram identificados taxonomicamente por uma abordagem polifásica, classificando-os dentro de quatro ordens e nove gêneros. A avaliação da atividade biológica demonstrou a presença de metabolitos com propriedades antibióticas quando enfrentados a micro-organismos patogênicos. Segundo a análise de correspondência múltipla, esta atividade poderia estar associada com a local de isolamento dos fungos. Foram detectadas 36 seqüências similares a genes PKS a partir de 17 destes fungos. A análise filogenética do domínio KS, conduzida pelo método de neighbor-joining, indicou que 16 seqüências se acomodaram dentro do grupo monofilético dos PKS envolvidos na produção de policetídeos não reduzidos e as outras 10 seqüências se acomodaram dentro do grupo monofilético dos PKS envolvidos na produção de policetídeos reduzidos. A análise do domínio CMT também apontou que as seqüências podiam se acomodaram em grupos de PKS dependendo do grau de redução do policetídeo, todas as seqüências CMT se relacionaram com PKS envolvidos na produção de policetídeos reduzidos. As análises dos modelos estruturais também demonstraram que as seqüências estavam altamente relacionadas com estruturas protéicas da família das enzimas de condensação, destacando a presença de uma hélice característica que carrega o resíduo de cisteína, responsável pela atividade de condensação. Extratos orgânicos obtidos de cultivos dos fungos foram avaliados parar detectar a presença de compostos tipo lovastatina. Por meio de cromatografia CCDS, detectaram-se bandas de 10 extratos com o mesmo deslocamento que a lovastatina padrão, mas apenas 6 destas foram confirmados por CLAE. O isolado A. flavus CBMAI 1023, foi selecionado para a realização de experimentos de produção a maior escala onde foi possível isolar e caracterizar um novo policetídeo. / From a group of 280 sugarcane-derived fungi 18 strains were assessed for the presence of polyketide synthase genes by PCR approaches. These fungi were identified taxonomically by a polyphasic approach classifying into four orders and nine genres. Biological activity tests showed the presence of antibiotic metabolites against pathogenic microorganisms and the relationship of this activity might be linked with the fungal isolate location by multiple correspondence analyses. 36 sequences similar to PKS genes fragments were detected from 17 of these fungi. A neighbor-joining phylogenetic analysis of the KS domain showed that 16 sequences fit on the monophyletic group of PKS evolved with production of non reduced polyketides, and the other 10 sequences fit on the monophyletic group of PKS evolved with the production of reduced polyketides. CMT domain analysis also pointed that the sequences fit with groups of PKS depending on polyketide reduction grade, all ten related to PKS evolved with the synthesis of reduced polyketides. Protein structural analysis also pointed out that these sequences are closely related with proteins from condensing enzyme family, highlighting the presence of a characteristic helix elbow that bears the cysteine residue responsible for the condensation activity. The fungi were also tested for their capacity of producing lovastatin compounds where chromatographic TLC detected bands from 10 extracts with the same dislocation compared to a lovastatin, but only 6 were confirmed by HPLC. The A. flavus CBMAI (1023) were selected for upscale production experiments, from where it was possible isolate and characterize a new polyketide compound.

O vírus linfotrópico das células T humanas tipo 1 (HTLV-1), é responsável por patologias como a mielopatia associada ao HTLV-1 ou paraparesia espástica tropical (HAM/TSP) e a leucemia/linfoma das células T do adulto (ATL) dentre outras. As vias de replicação até hoje demonstradas, não suportam a hipótese de um estado virêmico. Neste estudo, a detecção de partículas virais plasmáticas foi executada, por PCR em Tempo Real e Nested PCR em 190 amostras de pacientes infectados pelo HTLV-1(assintomáticos ou com HAM/TSP), em acompanhamento, no Instituto de Infectologia Emílio Ribas. 12 indivíduos (8%) testados por PCR em tempo real (n=150) e 6 indivíduos (18%) testados por Nested PCR (n=33, dado que sete amostras foram excluídas da análise) apresentaram RNA do HTLV-1 detectável no plasma. Em conclusão, foi possível identificar RNA plasmático do HTLV-1, tanto em pessoas assintomáticas quanto com HAM/TSP. Esta detecção abre novas possibilidades de discussão sobre a replicação do HTLV-1 e das vias de transmissão, sugerindo maiores investigações para elucidar o assunto. / The human T-cell lymphotropic virus type1 (HTLV-1) is responsible for some pathologies such as HTLV-1-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP) and Adult T-cell Leukemia/ Lymphoma (ATL) among others. Its ways of replication so far presented do not support the hypothesis of a viremic stage. In this study, the detection of the plasmatic viral load was performed by real time PCR and Nested PCR in 190 samples from HTLV-1 infected individuals (Either Asymptomatic or HAM/TSP cases) following up at Instituto de Infectologia Emílio Ribas. 12 individuals (8%) tested by Real time PCR (n= 150) and 6 individuals (18%) tested by Nested PCR (n= 33, given that 7 samples were excluded from the analysis) presented detectable HTLV-1 RNA in the plasma. In conclusion, it was possible to indentify HTLV-1 plasmatic RNA in asymptomatic carriers as well as in HAM/TSP cases. This detection opens new possibilities of discussion about HTLV-1 replication and transmission pathways, suggesting further investigation for clarifying this matter.

Dados epidemiológicos documentaram a associação entre elevação moderada dos níveis da proteína C-reativa (PCR) pela técnica hipersensível (PCRhs), dentro da variação normal, e risco cardiovascular em indivíduos sem doença clínica vascular. A potencial aplicação da PCRhs, como uma ferramenta auxiliar na avaliação global, de risco requer conhecimento de sua distribuição na população e das características clínicas envolvidas. Há carência de dados sobre a influência sobre a genética na concentração da PCR. Formulamos a hipótese de que variações alélicas (polimorfismo) no gene que codifica a PCR poderiam interferir na sua concentração sérica. Avaliamos a distribuição da concentração sérica da proteína C-reativa determinada pela técnica hipersensível em indivíduos de uma população brasileira sem evidências clínica e laboratorial de cardiopatia, e as variações desta concentração e, relação às características clínicas, variáveis laboratoriais e ao polimorfismo G1059C do gene da PCR. Realizamos um estudo de coorte, de indivíduos assintomáticos com exames clínico e cardiológico normais, atendidos na Unidade Clínica de Ambulatório Geral do Instituto do Coração (InCor) do Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo, no período de julho de 1998 a julho de 2001. Critérios de inclusão: indivíduos assintomáticos com exame físico normal, eletrocardiograma de repouso e esforço normais e radiografia do tórax normal. Foram excluídos aqueles com glicemia superior a 125 md/dl, alterações na concentração sérica do hormônio tíreo-estimulante (TSH) e sorologia positiva para doença de Chagas. Foram elegíveis 684 indivíduos: 295 (43,1%) do sexo masculino e 389 (56,9%) do feminino. Suas idades variaram entre 14 e 74 anos (média 40,6; desvio-padrão 11,5); 513 (75,0%) eram brancos, 117 (17,1%) mulatos, 32 (4,7%) amarelos e 22 (3,2%) negros. O tabagismo foi relatado por 160 (23,4%) indivíduos e 524 (76,6%) não eram tabagistas. A avaliação laboratorial incluiu a dosagem de glicemia, colesterol total e frações, triglicérides e ácido úrico. Foram colhidas amostras de sangue para dosagem sérica da PCRhs e genotipagem de PCR. A ecocardiografia bidimencional com Doppler foi realizada em 634 indivíduos, com resultado normal. A concentração sérica da PCRhs foi distribuída por quartis da população em estudo, os valores mínimo e máximo por quartil foram: 1º quartil 0,014-0,037 mg/dl; 2º quartil 0,0384,07 mg/dl; 3º quartil 0,080-0,187 mg/dl e 4º quartil 0,188-1,31 mg/dl. Num modelo de regressão múltipla as variáveis independentes correlacionadas ao log da PCRhs foram: idade (p=0,03), índice de massa corpórea (IMC) (p<0,01), razão colesterol total/HDL colesterol (ColT/HDL-C) (P<0,01) e frequência cardíaca (p<0,01). Para avaliar o comportamento das variáveis significativas deste modelo de regressão, a amostra foi estratificada em quatro grupos, segundo sexo e tabagismo, e foram estimados quatro modelos múltiplos. Nos homens tabagistas foram variáveis significativas a idade (p=0,04) e a razão ColT/HDL-C (p<0,01); nos homens não tabagistas foram o IMC (p<0,01) e a razão ColT/HDL-C (p<0,01); nas mulheres tabagistas o IMC (p<0,01) e nas mulheres não tabagistas foram o IMC (p<0,01), a razão ColT/HDL-C (p=0,01) e a frequência cardíaca (p=0,02). Não houve diferença estatisticamente significativa (p<0,05) na concentração da PCRhs entre os diferentes genótipos do gene da PCR. Portanto as variáveis idade, IMC, razão ColT/HD1-C e frequência cardíaca, não se relacionam com a concentração sérica da PCRhs de maneira homogênea, mas sim de acordo com o subgrupo analisado, referente ao sexo e tabagismo; e as concentrações da PCRhs não diferiram quanto a presença ou ausência do polimorfismo G1059C do gene da PCR. / Epidemiologic data have documented the association between moderate elevation, within the normal range, of the C-reactive protein (CPR) serum levels measured by high-sensitivity assays (hs-CRP), and cardiovascular risk among individuals without clinical evidence of vascular disease. The potential use of hs-CRP as a new auxiliary tool in the assessment of overall risk requires that its distribution in the population and the related clinical characteristics are known. There is few data about the influence of genetics upon CRP concentration. The hypothesis that allele variations in the gene responsible for coding CRP (polymorphism) could interfere with CRP serum concentration has been posed. The aim of this study was to assess the distribution of C-reactive protein (CRP) serum concentration measured by high-sensitivity assay (hs-CRP), in a Brazilian population of individuals without heart disease, as well as the association of variations of that concentration with clinical characteristics and laboratory variables, and with the CRP gene G1059C polymorphism. A cohort of asymptomatic patients visiting the Outpatient Clinic of the Heart Institute (InCor) of the University of São Paulo Medical School between July 1998 and July 2001, all with normal results in the clinical and cardiological evaluations, was studied. The inclusion criteria were: asymptomatic individuals with normal results in the physical evaluation, normal electrocardiography and stress test, and normal chest X-ray examination. Individuals with glucose level above 125mg/dl, changes in the thyroid-stimulating hormone (TSH) serum concentration, and positive serology for Chagas\' disease, were excluded. Thus, 684 individuals, 295 men (43.1 %) and 389 women (56.9%), ages 14 to 74 (mean 40.6, SD 11.5) years, were eligible. White people in the cohort were 513 (75.0%), mulatto 117 (17.1%), eastern people 32 (4.7%) and 22 of black color (3.2%) 160 individuals (23.4%) reported as currently smoking, while 524 (76.6%) were non-smokers Laboratory screening consisted of dosing of glucose, total and partial: cholesterol, triglycerides and uric acid plasma levels. Doppler two-dimensional echocardiography was performed in 636 individuals, all with normal results. Serum hs-CRP concentration of the study population was distributed in quartiles, with minimum and maximum values per quartile as follows: 1st quartil, 0.014-0.037mg/dl; 2nd quartile: 0.038-0.078mg/dl; 3rd quartile 0.080-0.\'187mg/dl; and 4th quartile: 0.188-1,31mg/dl. Multiple regression analysis has shown that the independent variables correlating with hs-CRP-log were age (p=0.03), body mass index (p<0.01), total/HOL cholesterol ratio (p<0.01) and heart rate (p<0.01). The study population was stratified in 4 groups according to gender and smoking status, to verify the behavior of the significant variables in this regression model, with estimation of 4 multiple models. Significant variables were: among currently smoking men, age (p=0.04) and Total/HDL cholesterol ratio (p<0.01); among non-smoking men, BMI (p<0.01) and Total/HDL cholesterol ratio (p<0.01). Among currently smoking women, only BMI (p<0.01) was significant, and among non-smoking women, BMI (p<0.01), Total/HDL cholesterol ratio (p=001) and heart rate (p=0.02) were significant. There was no statistically significant difference (p<005) of the hs-CRP serum concentration in the groups with GG genotypes or the CRP gene G1059C polymorphism. Our findings led to the conclusion that the variables age, BMI, Total/HDL cholesterol: ratio and heart rate do not correlate homogeneously with the hs-CRP serum concentration in this study population, but according to the specific gender or smoking status subgroup being studied this is verified. Additionally, hs-CRP concentrations did not differ according to the presence or the absence of the CRP gene G1059C polymorphism.

A identificação de espécie de Leishmania é crucial no diagnóstico de leishmaniose cutânea (LC), para terapia e prognóstico, em áreas com diferentes espécies endêmicas. A reação em cadeia de polimerase (PCR) foi usada em amostras de biópsias estocadas em parafina e formol de pacientes com LC, do Espírito Santo, Brasil. Usando sequências de mini-exon do gênero Leishmania, 63,2% (36/57) das amostras em parafina e 46,1% (6/13) das amostras em formol foram positivas. Numa abordagem usando sequências de kDNA e RFLP, 100% (58/58) das amostras de parafina testadas foram identificadas como Leishmania (V.) braziliensis. Estas reações podem ser usadas tanto para diagnóstico como para definição da espécie infectante / The identification of Leishmania species, a crucial step in cutaneous leishmaniasis, had therapeutics and prognostics implications, specially at when several agent species are endemic. Polymerase chain reaction (PCR) was used for analysis of paraffin-embedded and formalin stored skin biopsies from patients with parasitologic confirmed cutaneous formalin stored skin biopsies from patients with parasitologic confirmed cutaneous leishmaniasis, from the Espirito Santo State, Brazil. Tested by PCR targeted to mini-exon genus specific primer, 63,2% (36/57) of parafin and 46,1% (6/13) of formalin stored samples were positive, but using a PCR for kDNA primer followed by RFLP analysis, only Leishamnia (V.) braziliensis was identified in 100% (58/58) of parafin biopsies studied. Those reactions allow either diagnosis or species identification in cutaneous leismaniasis

O vírus linfotrópico das células T humanas tipo 1 (HTLV-1), é responsável por patologias como a mielopatia associada ao HTLV-1 ou paraparesia espástica tropical (HAM/TSP) e a leucemia/linfoma das células T do adulto (ATL) dentre outras. As vias de replicação até hoje demonstradas, não suportam a hipótese de um estado virêmico. Neste estudo, a detecção de partículas virais plasmáticas foi executada, por PCR em Tempo Real e Nested PCR em 190 amostras de pacientes infectados pelo HTLV-1(assintomáticos ou com HAM/TSP), em acompanhamento, no Instituto de Infectologia Emílio Ribas. 12 indivíduos (8%) testados por PCR em tempo real (n=150) e 6 indivíduos (18%) testados por Nested PCR (n=33, dado que sete amostras foram excluídas da análise) apresentaram RNA do HTLV-1 detectável no plasma. Em conclusão, foi possível identificar RNA plasmático do HTLV-1, tanto em pessoas assintomáticas quanto com HAM/TSP. Esta detecção abre novas possibilidades de discussão sobre a replicação do HTLV-1 e das vias de transmissão, sugerindo maiores investigações para elucidar o assunto. / The human T-cell lymphotropic virus type1 (HTLV-1) is responsible for some pathologies such as HTLV-1-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP) and Adult T-cell Leukemia/ Lymphoma (ATL) among others. Its ways of replication so far presented do not support the hypothesis of a viremic stage. In this study, the detection of the plasmatic viral load was performed by real time PCR and Nested PCR in 190 samples from HTLV-1 infected individuals (Either Asymptomatic or HAM/TSP cases) following up at Instituto de Infectologia Emílio Ribas. 12 individuals (8%) tested by Real time PCR (n= 150) and 6 individuals (18%) tested by Nested PCR (n= 33, given that 7 samples were excluded from the analysis) presented detectable HTLV-1 RNA in the plasma. In conclusion, it was possible to indentify HTLV-1 plasmatic RNA in asymptomatic carriers as well as in HAM/TSP cases. This detection opens new possibilities of discussion about HTLV-1 replication and transmission pathways, suggesting further investigation for clarifying this matter.

A partir de 280 isolados fúngicos de cana-de-açúcar, 18 cepas foram avaliadas quanto á presença de genes da policetídeo sintase por meio da técnica do PCR. Estes fungos foram identificados taxonomicamente por uma abordagem polifásica, classificando-os dentro de quatro ordens e nove gêneros. A avaliação da atividade biológica demonstrou a presença de metabolitos com propriedades antibióticas quando enfrentados a micro-organismos patogênicos. Segundo a análise de correspondência múltipla, esta atividade poderia estar associada com a local de isolamento dos fungos. Foram detectadas 36 seqüências similares a genes PKS a partir de 17 destes fungos. A análise filogenética do domínio KS, conduzida pelo método de neighbor-joining, indicou que 16 seqüências se acomodaram dentro do grupo monofilético dos PKS envolvidos na produção de policetídeos não reduzidos e as outras 10 seqüências se acomodaram dentro do grupo monofilético dos PKS envolvidos na produção de policetídeos reduzidos. A análise do domínio CMT também apontou que as seqüências podiam se acomodaram em grupos de PKS dependendo do grau de redução do policetídeo, todas as seqüências CMT se relacionaram com PKS envolvidos na produção de policetídeos reduzidos. As análises dos modelos estruturais também demonstraram que as seqüências estavam altamente relacionadas com estruturas protéicas da família das enzimas de condensação, destacando a presença de uma hélice característica que carrega o resíduo de cisteína, responsável pela atividade de condensação. Extratos orgânicos obtidos de cultivos dos fungos foram avaliados parar detectar a presença de compostos tipo lovastatina. Por meio de cromatografia CCDS, detectaram-se bandas de 10 extratos com o mesmo deslocamento que a lovastatina padrão, mas apenas 6 destas foram confirmados por CLAE. O isolado A. flavus CBMAI 1023, foi selecionado para a realização de experimentos de produção a maior escala onde foi possível isolar e caracterizar um novo policetídeo. / From a group of 280 sugarcane-derived fungi 18 strains were assessed for the presence of polyketide synthase genes by PCR approaches. These fungi were identified taxonomically by a polyphasic approach classifying into four orders and nine genres. Biological activity tests showed the presence of antibiotic metabolites against pathogenic microorganisms and the relationship of this activity might be linked with the fungal isolate location by multiple correspondence analyses. 36 sequences similar to PKS genes fragments were detected from 17 of these fungi. A neighbor-joining phylogenetic analysis of the KS domain showed that 16 sequences fit on the monophyletic group of PKS evolved with production of non reduced polyketides, and the other 10 sequences fit on the monophyletic group of PKS evolved with the production of reduced polyketides. CMT domain analysis also pointed that the sequences fit with groups of PKS depending on polyketide reduction grade, all ten related to PKS evolved with the synthesis of reduced polyketides. Protein structural analysis also pointed out that these sequences are closely related with proteins from condensing enzyme family, highlighting the presence of a characteristic helix elbow that bears the cysteine residue responsible for the condensation activity. The fungi were also tested for their capacity of producing lovastatin compounds where chromatographic TLC detected bands from 10 extracts with the same dislocation compared to a lovastatin, but only 6 were confirmed by HPLC. The A. flavus CBMAI (1023) were selected for upscale production experiments, from where it was possible isolate and characterize a new polyketide compound.