A Síndrome de Martin-Bell é uma forma hereditária de retardo mental determinada pela perda da expressão do gene FMR1 que está associado com a expansão da repetição dos tri-nucleotídeos citosina-guanina¬-guanina (CGG). Os indivíduos com um alto grau dessa expansão apresentam o silenciamento da expressão desse gene, com conseqüente alteração no desenvolvimento do sistema nervoso do embrião, causando danos neurológicos irreparáveis. A citogenética é uma metodologia clássica que contribui para o diagnóstico da síndrome em casos sem esclarecimentos, porém sua sensibilidade isoladamente em muitos casos é insuficiente para um diagnóstico positivo mesmo diante de características clínicas evidentes. Na busca de uma alternativa para suprir esta necessidade de definir exatamente as alterações encontradas em cada caso propôs-se a otimização de uma PCR de alta fidelidade no diagnóstico diferencial da Síndrome e simultaneamente comparar com os dados da citogenética clássica. Para tanto, foram coletadas amostras de sangue periférico de 102 pacientes e avaliou-se 100 a 150 metáfases para cada indivíduo pela citogenética clássica e para a PCR duplex. Os resultados demonstram pelo teste de Kruskal-Wallis que a PCR com a citogenética não apresentou diferenças significativas (p>0,05). Porém quando avaliadados pelo índice de Kappa sugere-se que os dois critéiros de diagnósticos devem ser utilizados simultaneamente com caracteristicas clínicas do paciente. A PCR mostrou-se rápida e com custo relativamente menor, sendo portanto, aplicável no auxílio ao aconselhamento genético dos indivíduos e suas famílias, bem como para um acompanhamento psico-pedagógico adequado. / The Martin-Bell Syndrome is a heredity mental retard form determined by the loss of FMR1 gene expression which is associated with the tri-nucleotides cytosine-guanine-guanine (CGG) repetition expansion. The individuals showing a high degree of this expansion present the silencing of this gene expression, with a consequent alteration of the embryo nervous system evolution, causing irreparable neurological damage The cytogenetics is a classical methodology that contributes for diagnosing the syndrome in cases without clarification, thus its sensitivity isolated in many cases is insufficient for a positive diagnosis even in front of evident clinical characteristics. On searching for an alternative to fulfill this need to define the found alterations in each case, an optimization of a high fidelity PCR to Syndrome diagnosis and simultaneously to compare with classical cytogenetics. Peripheral blood samples were collected from 102 patients for evaluating 100 to 150 metaphases evaluation by classical cytogenetics for each sample and to duplex PCR. The results showed by the Kruskal-Wallis test that the PCR with the cytogenetics have not presented significant differences (p>0,05). However, when evaluated by the Kappa index it was suggested that the two diagnosis criteria should be used simultaneously with patient s clinical characteristics. The PCR showed itself quick and with a relatively lower cost , and in this way, applicable in helping genetically counseling individuals and their families, as well as sending them to a more adequate psycho-pedagogical treatment.

O desenvolvimento do músculo esquelético em vertebrados é um processo bem organizado que envolve diversos eventos, inicia-se na fase embrionária e continua durante toda a vida. Esse processo biológico requer uma adequada sinalização celular e é regulado por inúmeros genes. Em busca do entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na determinação do desenvolvimento e crescimento do tecido muscular foi acompanhada a expressão gênica dos fatores miogênicos (MyoD, Myf5, Miogenina e MRF4); Pax7; Miostatina; e da via de ação Shh (Shh, Ptch1, Smo, Pka, Sufu, Gli2 e Gli3) na musculatura peitoral de duas linhagens de galinhas de composições genéticas distintas. Uma linhagem de corte, selecionada para maior deposição de massa muscular, e outra de postura, caracterizada pela baixa taxa de crescimento e pouca massa muscular. Foram utilizados 90 animais distribuídos nas duas linhagens e cinco estádios de desenvolvimento: 9 e 17 dias da fase embrionária e 1, 21 e 42 dias da fase pós-eclosão. A expressão gênica foi analisada por PCR quantitativa em tempo real. Os genes Myf5, Miogenina, MRF4, Pax7, Shh e Ptch1 foram diferencialmente expressos na ontogenia e entre as linhagens. Já os genes MyoD, Miostatina, Smo, Pka, Sufu, Gli2 e Gli3 foram diferencialmente expressos somente na ontogenia. Foi possível traçar o perfil de expressão dos genes ao longo das fases de desenvolvimento. Os genes MyoD, Myf5 e Pax7 foram mais expressos na fase embrionária, onde há maior proliferação celular. Durante as fases estudadas, os genes da Miogenina e MRF4 apresentaram uma auto-regulação entre eles, indicando a ocorrência do processo de diferenciação celular. O gene da Miostatina demonstrou estar inibindo o crescimento muscular nos dias que antecedem a eclosão. Os genes da via de ação Shh foram mais expressos nas idades embrionárias, onde esta via age como um fator de sobrevivência e proliferação celular e menos expressos nas idades posteriores a eclosão, provavelmente, para que haja o processo de diferenciação dos mioblastos. Verificou-se que esses genes foram diferencialmente expressos sendo coordenados espaço-temporalmente, permitindo assim um ajuste sutil entre proliferação e diferenciação das células musculares, colaborando para as diferenças fenotípicas observadas entre as linhagens. / The development of skeletal muscle in vertebrates is a well-organized process that involves several events, initiating in the embryonic phase and continuing throughout life. This biological process requires a proper cell signaling and is regulated by numerous genes. Aiming to understand the molecular mechanisms involved in determining the development and growth of muscle tissue, we monitored gene expression of myogenic factors (MyoD, Myf5, Myogenin and MRF4); Pax7; Myostatin; and Shh pathway (Shh, Ptch1, Smo, Pka, Sufu, Gli2 and Gli3) in the pectoralis muscle of two strains of poultry from different genetic compositions. A broiler, selected for increased deposition of muscle mass, and a layer, characterized by slow growth and low muscle mass. We used 90 animals divided into two lines and five stages of development: 9 and 17 days of embryo and 1, 21 and 42 days post-hatching. Gene expression was analyzed by quantitative real-time PCR. The genes Myf5, Myogenin, MRF4, Pax7, Shh and Ptch1 are differentially expressed in ontogeny and among strains. The genes MyoD, myostatin, Smo, Pka, Sufu, Gli2 and Gli3 were differentially expressed only in ontogeny. It was possible to design the gene expression profile throughout the different developmental stages. The genes MyoD, Myf5 and Pax7 were more expressed in the embryo, where there is greater cell proliferation. During the four phases, the genes MRF4 and Myogenin showed self-regulation among them, indicating the occurrence of the cell differentiation process. The myostatin gene proved to be inhibiting muscle growth in the days before hatching. The genes of the Shh action were more highly expressed in embryonic ages, where this pathway acts as a survival factor and cellular proliferation, and less expressed in later times after hatching, probably to allow for the differentiation of myoblasts. We found that these genes were differentially expressed being coordinated in space and time, allowing, thus, a subtle tuning between proliferation and differentiation of muscle cells, contributing to the phenotypic differences observed between strains.

Para a execução da etapa inicial da identificação médico-legal de restos humanos (antropometria e exame dos arcos dentários), faz-se necessária uma limpeza prévia da ossada, para a remoção de tecidos moles putrefeitos. Os casos não identificados por esses métodos tradicionais, poderão ser submetidos ao exame de DNA. No entanto, apesar do grande avanço da biologia molecular, utilizando a amplificação de DNA pela PCR, algumas limitações que afetam a habilidade de se obter DNA em restos humanos, permanecem. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi fornecer subsídios morfológicos para os analistas forenses, com ênfase na prática médico-legal, visando uma utilização mais eficiente do DNA obtido de osso compacto de restos humanos em decomposição ou já esqueletizados, sem tecidos moles aderidos. Foi realizado o estudo da microestrutura do tecido ósseo compacto femoral, de restos humanos em decomposição, ainda com tecidos moles, que foram limpos pela fervura em água (n = 7) e ossadas já esqueletizadas pela decomposição natural, que não foram fervidas (n = 8). Destes, seis ossadas foram provenientes de cemitério público regular, após 3 anos de inumação, 1 ossada proveniente da região amazônica, e 1 ossada de origem desconhecida. Estas duas ultimas, apresentado-se porosas ou quebradiças. As análises morfológicas de cortes histológicos foram coradas com hematoxilina e eosina e o DNA amplificado pela PCR para os loci CSF1PO, TPOX, TH01, F13A0, FESFPS, vWA, D16S539, D7S820, D13S317 e amelogenina. Os resultados da análise desses dois grupos foram comparados com os de cadáveres frescos (n = 5) do Serviço de Verificação de Óbitos da Capital. A fervura dos ossos, do modo como é realizada no Instituto Médico Legal de São Paulo, pode aumentar a eosinofilia da matriz óssea e, em alguns casos, pode promover a desagregação dos ósteons. Tal procedimento pode remover células, mas pode também remover possíveis inibidores da PCR, favorecendo a análise do DNA obtido destas amostras. O fator limitante para a obtenção e análise de DNA, em amostras de ossos limpos por fervura, é a quantidade exígua de células. Ossos não submetidos à fervura, após inumação por três anos ou há mais tempo em contato com a terra, podem apresentar alterações da microestrutura. No entanto, a presença de hemácias preservadas e núcleos de osteócitos nestas amostras, indica melhor preservação de células em relação às amostras de ossos fervidos. O fator limitante para a análise de DNA nestas amostras é a presença sugestiva de inibidores da reação de amplificação pela PCR. Restos humanos, sem tecidos moles, macroscópicamente não preservados (porosos e quebradiços), e não submetidos à fervura, apresentam alterações de perda de matriz mineralizada; no entanto, nestas amostras ainda é possível encontrar células preservadas. Os resultados obtidos no neste trabalho permitem traçar algumas estratégias para uma melhor utilização nos protocolos de extração e análise do DNA em osso compacto de restos humanos. / To the first essential step to forensic identification of human remains (anthropological study of race, sex, age, etc) it is necessary a previous cleaning of the bones, to remove decomposing soft tissues. Medico-legal inconclusive or non identified cases, by using these traditional methods, could be subjected to DNA analysis. However, in spite of advances in human identification techniques, specially by PCR amplified DNA, some limitations that affect the ability to obtain DNA in human remains still persist. Therefore, the aim of this study was to provide additional support from morphological analysis, to help forensic analysts personnel to utilise more efficiently the DNA, extracted from compact bones of human remains in decomposition or already skeletonized corpse, it means without soft tissues, with special emphasis in the legal-medicine practice. Femoral compact bones were obtained from: 7 human remains found on the ground, in different degree of decomposition which were cleaned by boiling to remove soft tissues; also studied were collections of bones from 8 corpses having undergone natural decomposition: 6 human remains exhumed after 3 years from a common public cemetery in São Paulo City; 1 case from amazon region and 1 case with no information, both cases remained from long time (more than 3 years) in contact with soil. All eight cases, were not boiled as no soft tissue were adhered. As a control, five cadavers 12 to 16 hours post mortem were also used. The compact bones histological sections were stained by haematoxilin and eosin and the loci CSF1PO, TPOX, TH01, F13A01,FESFPS, vWA, D16S539, D7S820, D13S317 and amelogenin were amplified by PCR.The procedure for boiling the human remains utilised in the Legal Medicine Institute of São Paulo would have increased the eosinophily of bone matrix and, in some cases, promoted the desaggregation of the osteons. In addition these procedures would have removed the cells, but in some cases would have removed possible inhibitors of the PCR, favouring in this way the analysis of DNA obtained from these samples. The limiting factor to obtain successful analysis in bones submitted to boiling seem to be the low quantity of nuclei present in these samples. For the other hand, in bones not cleaned by boiling, the presence of preserved red cells and oscteocyte nuclei inside the lacunae indicates better preservation of cells in relation to those bones cleaned by boiling. The limiting factor to obtain successful DNA analysis in bones exhumed or in contact of soil, is the suggestive presence of inhibitors of PCR. Porous and brittle bones from human remains, without soft tissues that are not processed by boiling, present alterations through loss of mineralised matrix, although it is still possible to found preserved cells in these samples. The results presented in this work clarify concerns about viability of DNA for identification analysis. They also help to establish better strategies for optimisation of DNA extraction and analysis in compact bones of human remains.

A Glutamina (Gln) melhora a regeneração hepática em ratos nutridos. Para avaliar o efeito molecular da Gln endovenosa no remanescente hepático, 52 ratos foram classificados em: 1. Nutridos com hepatectomia parcial (HP) e Gln (N-Gln=10) ou prolina (N-Pro=10); 2. Desnutridos com HP: (D-Gln=10) ou (D-Pro=10); 3. Nutridos e Desnutridos sem HP (N-Controle=6) e (D-Controle=6). Após 96 horas da HP os resultados foram: DNA = (D-Gln, D-Pro e D-Controle < N-Gln, N-Pro e N-controle), (N-Gln, N-Pro, D-Gln e D-Pro < N e D-Controle), (N-Gln > D-Gln); RNA= (N-Gln, N-Pro, D-Gln e D-Pro < N e D-Controle), (N-Gln > D-Gln e N-Pro). Não houve diferença nos genes transcritos (GT) para HGF, TGF-a e timidina kinase. Concluímos que: A desnutrição e HP reduzem DNA e RNA; A Gln não altera os GT estudados em ratos desnutridos 96 horas após HP / Glutamine dipeptide (Gln) improve hepatic regeneration of nourished rats. To evaluate molecular effect of Gln on liver remnant 52 rats was classified into: 1. Nourished with partial hepatectomy (PH) and Gln (N-Gln=10) or proline (N-Pro=10); 2. Malnourished (MN) with PH: (MN-Gln=10) or (MN-Pro=10); 3. Nourished and Malnourished rat without PH (N-Control=6) and (MN-Control=6). Results: DNA = (MN-Gln, MN-Pro and MN-Control < N-Gln, N-Pro and N-control), (N-Gln, N-Pro, MN-Gln and MN-Pro < N and MN-Control), (N-Gln > MN-Gln); RNA= (N-Gln, N-Pro, MN-Gln and MN-Pro < N and MN-Control), (N-Gln > MN-Gln and N-Pro). There was no difference on transcript genes (TG) for HGF, TGF-a and thymidine kinase. Conclusions: Malnutrition and PH decrease hepatic DNA and RNA; Gln does not modify TG studied 96 hours after PH in MN rats

A couve-flor está entre as folhosas mais produzidas na região do Cinturão Verde de São Paulo. A planta apresenta alto valor nutricional para os consumidores e relevante importância econômica e social para os agricultores. Em campos comerciais, têm sido observadas plantas exibindo sintomas de enfezamento e deformação da inflorescência, além da necrose dos vasos condutores. A doença foi denominada de enfezamento e a sua incidência e severidade têm se tornado mais intensas nos últimos anos, afetando a produção e levando ao abandono do cultivo. O quadro sintomatológico levantou a suspeita de que a doença pudesse estar sendo causada por fitoplasmas. Desta forma, este trabalho teve como objetivos detectar e identificar os fitoplasmas associados às plantas doentes de couve-flor, demonstrar a sua patogenicidade, buscar possíveis insetos vetores do agente patogênico e analisar a distribuição espacial da doença no campo. Amostras de plantas coletadas na região do Cinturão Verde ou enviadas de outras localidades tiveram o DNA total extraído e submetido a reações de PCR. A amplificação de fragmentos genômicos de 1,2 kb evidenciaram a presença de fitoplasmas nos tecidos de 66% das plantas sintomáticas. A detecção de fitoplasmas em plantas assintomáticas revelou a ocorrência de infecção latente e que plantas sem sintomas aparentes podem ser portadoras do patógeno. O emprego de PCR com primers específicos, análises convencionais e virtuais de RFLP e análise filogenética permitiram a identificação de fitoplasmas afiliados aos grupos 16SrIII-J, 16SrXIII e 16SrXV-A, com predominância para a ocorrência do grupo 16SrIII. Secções histológicas feitas à mão da região vascular de plantas de couve-flor doentes observadas em microscópio de luz revelaram que a região do floema apresentava-se escurecido e com início de degeneração celular. Fitoplasmas do grupo 16SrXIII foram encontrados em cigarrinhas da espécie Balclutha hebe coletadas em campo cultivado com couve-flor. Estes insetos foram utilizados em experimentos de transmissão e foram capazes de inocular fitoplasmas em plantas sadias de couve-flor e vinca. A transmissão também ocorreu a partir de plantas doentes de couve-flor para plantas sadias de vinca, através do emprego da planta parasita cuscuta. Análise epidemiológica da doença foi feita em dez campos de cultivo de couve-flor, localizados no município de Sorocaba-SP. Análises do índice de dispersão, lei de Taylor modificada e áreas isopatas evidenciaram que plantas de couveflor com sintomas de enfezamento encontraram-se agregadas no campo, e que os focos da doença tinham início nos bordos da cultura. O presente trabalho demonstrou que o enfezamento da couve-flor está associado aos fitoplasmas, os quais podem estar sendo transmitidos por cigarrinhas, sendo que, em termos epidemiológicos, a doença tem padrão agregado de distribuição no campo. / Cauliflower is among the most produced vegetable in the region of the Green Belt of Sao Paulo State. It has high nutritional value and relevant social and economic importance for farmers. In commercial fields, it has been observed plants exhibiting symptoms of stunting, deformation of the inflorescence and conductive vessel necrosis. The disease was named cauliflower stunt and its incidence and severity have become more intense in the past years, the production is being affected and the field is abandoned by the growers. The symptomatology raised the suspect that the disease could be caused by phytoplasmas. Thus, this study aimed to detect and identify phytoplasmas associated to diseased cauliflowers, demonstrate its pathogenicity, look for possible insect vectors of the pathogen and analyse the spatial distributions of disease in the field. Plant samples collected in the region of the green belt or sent from other locations had the total DNA extracted and subjected to PCR reactions. Amplification of genomic fragments of 1.2 kb revealed the presence of phytoplasmas in 66% of the symptomatic plants. The detection of phytoplasmas in asymptomatic plants revealed the occurrence of latent infection and that plants without visible symptoms may be infected. The use of specific primers, conventional and virtual RFLP analysis and phylogenetic analysis allowed the identification of phytoplasmas affiliated to 16SrIII-J, 16SrXIII and 16SrXV-A groups, and predominantly the occurrence of 16SrIII group. Histological sections made by hand of the vascular region of symptomatic cauliflower were observed under light microscope and revealed that the phloem was darkened and with beginning of cellular degeneration. The 16SrXIII phytoplasma was found in Balclutha hebe from cauliflower field. These insects were used in experiments and were able to transmit phytoplasmas to healthy cauliflower and periwinkle. The transmission also occurred from diseased cauliflower to healthy periwinkle through the parasitic plant dodder. Epidemiological analysis of the disease was made in ten plots of cauliflower, located in Sorocaba, SP. Dispersion index, modified Taylors law and isopath areas analysis showed that cauliflower plants with symptoms of stunting were aggregated in field and initial foci were at the edge of the plot. This study demonstrated that cauliflower stunt is associated with phytoplasmas, that may be being transmitted by insects (Homoptera) and, in epidemiological terms, the diseased plants show aggregated pattern of distribution in the field.

O raquitismo das soqueiras (RSD), causado pela bactéria Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) é uma das principais doenças na cana-de-açúcar, contudo, as informações sobre a biologia do patógeno, bem como sobre sua interação com cana são limitadas. Desta forma, três estudos foram conduzidos com o objetivo de verificar a interferência de fatores do hospedeiro e do ambiente na cinética populacional da Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) in planta e in vitro. Num primeiro, foi quantificada, através de PCR em tempo real (qPCR), a colonização da bactéria de plantas de duas variedades submetidas a estresse por restrição hídrica e por injúria mecânica infligida através de corte da planta. Num segundo, o desenvolvimento in vitro da bactéria foi avaliado, por 10 dias, em resposta à adição ao meio de cultivo de fluido vascular de plantas de cana. Já o terceiro estudo avaliou o efeito do hormônio ácido abscísico (ABA) na cinética populacional de Lxx em cana. No primeiro estudo, os resultados apontaram efeito positivo tanto do estresse hídrico como da injúria no título bacteriano em plantas da variedade CB 49-260. Já na variedade RB83 5486, não houve efeito significativo destes agentes de estresse no título bacteriano. No segundo estudo, o maior desenvolvimento da população de Lxx ocorreu em meio de cultivo sem adição de fluido vascular, ao passo que o desenvolvimento da população em presença de fluido da variedade resistente não inoculada com Lxx foi maior, quando em presença de fluido de plantas da mesma variedade inoculadas com a bactéria. A adição de fluido vascular da variedade suscetível, por outro lado, inibiu substancialmente o desenvolvimento das culturas bacterianas. A análise cromatográfica do fluido vascular indicou diferenças na concentração de compostos do fluido das duas variedades, bem como entre plantas da mesma variedade inoculadas ou não com a bactéria. No terceiro estudo, apesar das variações nos títulos da Lxx detectados ao longo do tempo, tanto nas plantas testemunhas como nas plantas tratadas com ABA, não houve diferenças significativas (p>0,05) entre os tratamentos dentro de um período de avaliação de 4 meses. Em seu conjunto, os resultados, além de fornecerem informações inéditas sobre a interação entre Lxx e cana, ainda permitiram direcionar futuros estudos a fim de aprimorar o conhecimento sobre os mecanismos de colonização do hospedeiro desta bactéria. / Ratoon Stunting Disease (RSD) caused by the bacterium Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) is a major disease in sugarcane; however, information on the biology of this pathogen and on its interaction with sugarcane is limited. Three studies were conducted to analyze effects of the host and environment on the population kinetics of Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) in plant and in vitro. In the first treatment, we used real time PCR (qPCR) to quantify bacterial colonization in two sugarcane varieties subjected to water stress and mechanical injury. In the second treatment, we evaluated the in vitro growth of the bacteria for 10 days after the addition of 15% of sugarcane vascular fluid to the culture medium. The third treatment evaluated the effect of the application of abscisic acid (ABA) on Lxx colonization in sugarcane. In the first treatment, the results showed an increase in Lxx colonization in the variety CB 49-260 exposed to water stress and mechanical injury. For the variety RB83 5486, there was no significant effect of these stresses on the bacterial colonization. In the second treatment, the greatest development of Lxx population occurred in the culture medium without the addition of vascular fluid (control), while bacterial population in the presence of fluid from resistant variety non-inoculated with Lxx was greater, compared to the growth in the presence of plant fluids of the same variety inoculated with the bacteria. The addition of vascular fluid of the susceptible variety, on the other hand, significantly inhibited bacterial growth. The chromatographic analysis of the vascular fluid indicated differences in the compounds concentration in the fluid of the two varieties, as well as in plants of the same variety inoculated or not with the bacteria. In the third study, despite variations in Lxx colonization detected over time, the control plants and plants treated with ABA showed no significant differences (p> 0.05) among treatments during the trial period of four months. The results, in addition to providing new information about the interaction between Lxx and sugarcane, allowed to direct further studies on mechanisms of host colonization of this bacterium.

A cana-de-açúcar, é atualmente a cultura mais plantada no estado de São Paulo, apresentando grande importância no setor agrícola. Assim como qualquer outra cultura, é hospedeira de uma série de patógenos que podem limitar sua produção. A bactéria fastidiosa Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) é o agente causal do raquistismo-das-soqueiras (RSD) em canade- açúcar cujo o principal sintoma é a redução acentuada do crescimento observada em plantas adultas. Essa doença é de difícil diagnose pois a evolução dos sintomas é lenta devido à natureza fastidiosa da bactéria. Lxx pode ser considerada como um endófíto obrigatório que cresce a níveis patogênicos nos tecidos da planta dependendo de estímulos bióticos e abióticos. Devido à importância da cultura e aos danosoCasionados pela Lxx, este trabalho apresentou dois enfoques principais: o primeiro foi o desenvolvimento de um protocolo para quantificação de Lxx em tecido de cana-de-açúcar por meio da técnica de PCR quantitativo em tempo real; o segundo foi o estudo da interação entre cana-de-açúcar e Lxx, em busca de uma melhor compreensão da evolução desse processo através da identificação de proteínas que apresentaram alteração em abundância ao longo do tempo em função da colonização pela bactéria em duas variedades de cana (RB835486 e SP80-3280) e em seguida enfatizando o sistema antioxidante nesta relação. Para isso, foram desenvolvidos primers específicos para detecção de Lxx que permitiram quantificar baixos níveis bacterianos em tecido foliar, revelando diferenças entre variedades segundo a cinética do crescimento bacteriano. Plantas com diferentes títulos bacterianos obtidas mediante inoculação artificial ou não foram submetidas à análise proteômica por meio da técnica de 2D-DIGE, uma vez que para o RSD, os danos estão relacionados à alta colonização de Lxx em seus tecidos. Os resultados alcançados com o sequenciamento de proteínas que apresentaram alteração em abundância revelaram que, em plantas da variedade RB835486 observou-se repressão de proteínas da via de estresse oxidativo e metabolismo primário, em contraste com a variedade SP80-3280, que apresentou aumento da abundância de proteínas relacionadas à via de estresse oxidativo, ambas para o mesmo tratamento, em plantas não inoculadas artificialmente. Já em plantas inoculadas com Lxx foram identificadas alteração na abundância de proteínas relacionadas ao crescimento da planta, ciclo celular, vias de sinalização celular e hormonal, esses resultados são consistentes com o principal sintoma da doença, o raquitismo, pois indica que as alterações temporais observadas na expressão de proteínas relacionadas com o aumento do título de Lxx in planta podem resultar em alterações do equilíbrio hormonal e menor crescimento da planta. Alguns resultados observados com a análise bioquímica corroboram com os dados acima descritos, pois a variedade RB835486 apresentou uma resposta precoce ao estresse oxidativo e mostrou maior controle do crescimento bacteriano, o que pode estar relacionado ao balanço de ERO\'s (espécies reativas de oxigênio) utilizadas pelo metabolismo como sinalizador celular na interação planta-patógeno. Em contraste, a variedade SP80-3280, em sua maioria, apresentou indução da atividade de enzimas antioxidantes mais tardiamente, momento em que a bactéria Lxx apresentou os maiores títulos de crescimento. / Sugarcane is currently the most grown crop in the state of São Paulo, with great importance in the agricultural sector. Like every crop, sugarcane is host to a number of pathogens that may limit its production. The fastidious bacterium Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) is the causal agent of ratoon stunting in sugarcane (RSD), which the main symptom is a sharp reduction in growth observed in adult plants, this disease is difficult to diagnose because the evolution is slow due to nature of fastidious bacteria. Lxx can be considered as an obligatory endophyte that grows at pathogen levels in plant tissues depending on biotic and abiotic stimuli. Due to the importance of culture and the damage caused by the Lxx, this work presents two main approaches: the first one was the development of a protocol for the quantification of Lxx in sugarcane tissue by quantitative real time PCR; the second one was to study the interaction between sugarcane and Leifsonia xyli subsp. xyli aiming to a better understanding of the evolution of this process, identifying alterations in abundance of proteins over time depending on the bacterial colonization in the two varieties of sugarcane (RB835486 and SP80-3280) and then, emphasizing the antioxidant system in this relationship. Thus, we developed specific primers that enabled Lxx quantification at low bacterial levels in leaf tissue. The assay showed differences among sugarcane varieties according to the kinetics of bacterial growth. Plants that presented different titers of bacteria were obtained by artificial inoculum or not were selected to proteomic analysis by 2D-DIGE technique, since for RSD, the damage is related to high colonization in plant tissues. The identification of sugarcane proteins revealed that for variety RB835486 were observed a repression of stress proteins and proteins related to primary metabolism, in contrast with SP80-3280 variety, which it was identified high abundance of proteins of oxidative stress pathway, in not inoculated plants, for both varieties. However in inoculated plants it was identified a change in the abundance of proteins related to plant growth, cell cycle, cell signaling and hormonal pathways. These results corroborate with the main symptom of the disease, ratton, and suggest that temporal changes in expression of sugarcane cited proteins by increasing title of Lxx can result in hormonal imbalance and the decrease of plant growth. The major part of biochemistry analyzes corroborate with previous data obtained in proteomic approach. The RB835486 variety showed an early response to oxidative stress and suggests a greater control of bacterial growth in its tissues, which may be related to the balance of ERO\'s in signaling metabolism in plant pathogen interaction. While the SP80-3280, showed a later induction of antioxidant enzymes, when the bacterium Lxx had the highest titer of bacteria.

As leishmanioses são protozooses de alta prevalência em regiões tropicais como o Brasil, transmitidas por vetores flebotomíneos, cujos reservatórios são compostos por diferentes espécies animais. No vetor, os parasitos assumem uma forma flagelada indistinguível entre as espécies e outros tripanossomatídeos. A doença apresenta amplo espectro pela existência de varias espécies de leishmânias e por diferenças na susceptibilidade individual dos hospedeiros. Tanto para o prognóstico individual como também nas investigações epidemiológicas, levando-se em conta futuras medidas de controle desta doença, a identificação espécie especifica é de crucial importância. Um fator importante na rede causal é a determinação da preferência alimentar dos vetores, permitindo assim a intervenção adequada no controle da doença e de seus reservatórios. Atualmente, técnicas moleculares como a PCR, permitem diagnosticar a infecção, identificar a espécie infectante no vetor e seus hospedeiros,assim como o hábito alimentar dos flebotomíneos. Observou-se um aumento significativo de notificações de leishmaniose tegumentar e visceral no Estado do Mato Grosso do Sul, sendo que até o presente momento, pouco se conhece a respeito de sua etiologia. Neste sentido, em colaboração com pesquisadores do Mato Grosso do Sul e por meio da técnica de PCR, temos como objetivo: determinar a infecção natural dos flebotomíneos capturados em campo; identificar as espécies de leishmânias provenientes de amostras humanas e caninas e isoladas em hamster; padronizar reação que determine a fonte alimentar de flebotomíneos; em Campo Grande e Bela Vista. Para a identificação de leishmânia, foi utilizada como alvo seqüências de mini exon e nos casos positivos para subgênero Viannia utilizou-se a técnica de RFLP. Para identificação de fonte alimentar foi utilizado como alvo regiões conservadas do gene citocromo b. Na capital Campo Grande, a captura foi realizada no período de 2003 a 2005. Entre os anos de 2003 - 2004 a taxa mínima de infecção (TM) foi de 1,6%, sendo identificado L.(V.) braziliensis, já para o período de 2004 - 2005 a TM foi de 0,38%, para L.(L.) amazonensis, cuja maioria das espécies pertencia à Lu. longipalpis. Cinco amostras humanas provenientes de Campo Grande e outros municípios e isolados em hamster foram identificadas como L.(V.) braziliensis. No município de Bela Vista, no período entre 2004-2006, a maioria das espécies capturadas pertencia à espécie Bi. flaviscutelata. Destes, foi possível identificar TM de 0,6% de L. (L.) amazonensis e taxa de 0,24% para outros tripanossomatídeos. De um total de 10 amostras de cães isoladas em hamsters, 2 foram identificadas como L.(L.) amazonensis. A PCR para identificação de fonte alimentar foi capaz de identificar sangue de humano, galinha, camundongo, cavalo, gambá, capivara, porco, cachorro doméstico e cachorro do mato. Para validação da técnica, foram utilizados flebotomíneos capturados em Campo Grande (MS). Verificou-se que 68% dos insetos capturados alimentaram-se em galinha. Acreditamos que os resultados advindos deste projeto possam contribuir no desenho de futuras medidas de controle desta doença no Estado do Mato Grosso do Sul. / Leishmaniases protozooses have a high incidence in tropical regions such as Brazil and they are transmitted by sand fly vectors, their reservoirs consisting of different animal species. Flagellate forms in the vector are indistinguishable among the leishmania species as well as among other trypanosomatides. The disease presents a large spectrum due to the several leishmania species and also to different individual susceptibilities of hosts. Both for the individual prognosis as well as for epidemiological investigations in the future control measures of the disease the specific species identification is of crucial importance. An important factor in the causal net of the disease is knowledge of the vectors food source preferences, thus allowing an adequate intervention to control the spreading of the disease as well as of the reservoirs. Nowadays molecular techniques such as PCR allow an infection diagnosis, identification of the parasite infection in the vectors and hosts as well as the sand flies feeding habits. A significant increase of tegument and visceral leishmaniasis notifications was detected in Mato Grosso do Sul State (MS) and so far little is known about their etiology. In collaboration with Mato Grosso do Sul researchers we aim at the following goals, applying PCR techniques: determine the natural infections of field captured sand flies; identify leishmania species originating from human and canine isolates in hamsters; standardize the reaction to determine feeding source from sand flies captured in Campo Grande and Bela Vista. For leishmania species identification mini-exon sequences were used as target and in cases positive for Viannia subgenus the RFLP was applied. For food source identification citochrome b gene conserved regions were used as targets. Captures in Campo Grande were performed between 2003 to 2005. Between the years 2003 -2004 the minimum infection rate (MR) of 1.6% was found for L.(V.) braziliensis, while for the period 2004-2005 MR for L.(L.) amazonensis was 0.38% and the majority of sandfly species were identified as Lu. longipalpis. Five human isolates from Campo Grande and other municipalities were identified as L.(V.) braziliensis. The majority of specimens captured in Bela Vista municipality between 2004-2006 were Bi. flaviscutelata. From these a MR of 0.6% were identified as L .(L.) amazonensis and 0.24% for other Kinetoplastidia species. From a total of 10 canine isolates 2 were identified as L.(L.) amazonensis. Standardization of PCR for food source identification was capable to distinguish the origin of several blood sources: human, chicken, mouse, horse, opossum, capybara, pig, domestic and bush dogs. Sandflies captured in Campo Grande (MS) were used to validate the technique. A percentage of 68% from these captures had fed on chicken. We believe that results shown in this project may contribute to the design of future control measures of this disease in the State of Mato Grosso do Sul.

O HBoV é um novo parvovírus que foi isolado pela primeira vez em 2005 nas secreções respiratórias de pacientes humanos que tiveram pneumonia. Desde então, é associado a doenças do trato respiratório superior e doença gastrointestinal em pacientes adultos e pediátricos, desde a sua descoberta na Suécia e posteriormente em diversos países no Mundo. Quase todos os estudos foram realizados em amostras de secreção do trato respiratório, normalmente, de crianças com menos de 2 anos de idade e a maioria com infecção respiratória. As taxas de prevalência variam de 1,5% a 19% nos diferentes países. A Análise filogenética deste novo vírus demonstrou que tratava-se de um parvovirus, mais estreitamente relacionado ao parvovírus bovino e ao minuto vírus canino e por isso foi denominado de Bocavírus Humano. A variabilidade genética do HBoV é baixa e estudos filogenéticos indicam que duas linhagens circulam paralelamente ao redor do mundo. Entretanto, como ainda é um vírus relativamente novo, devem se feitos estudos mais detalhados de suas variantes. Em nosso estudo, com a finalidade de determinar a prevalência e conhecer a variabilidade genética do HBoV circulante, foram analisados de janeiro de 2008 a fevereiro de 2010, 935 amostras de aspirado de nasofaringe de crianças com menos de 2 anos de idade, com doença respiratória aguda, internadas no Hospital da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo. Pela técnica de PCR, obtivemos 47 (4,7%) amostras positivas para HBoV e dessas 27 amostras apresentaram coinfecção com outros vírus respiratórios, 45 amostras foram seqüenciadas na região da VP1/VP2 de um fragmento de 658 nt. A análise filogenética, quando comparada com seqüência do genBank representativas de vários países, mostrou a circulação, em nossa amostragem, de grupos de HBoV semelhantes aos que circulam no Japão e Taiwan. A variabilidade genética entre as nossas amostras foram inferiores a 1%, tanto entre si como quando comparadas com as amostras do genBank. / HBoV is a new parvovirus which was first isolated in 2005 from respiratory secretions from human patients who had pneumonia. It has been associated with respiratory and gastrointestinal diseases in adult and pediatric patients since its discovery in Sweden and later in several countries worldwide. Almost all studies were performed on samples of secretions from the respiratory tract, usually in children under 2 years of age. Prevalence rates vary from 1.5% to 19% in different countries. The phylogenetic analysis of this new virus showed that it was a parvovirus, more closely related to bovine parvovirus and canine minute virus, and therefore called Human Bocavirus. The genetic variability of HBoV is low and phylogenetic studies indicate that there are two strains circulating alongside around the world. However, as it is still a relatively new virus, more detailed studies of its variants should be carried out. In our study, 935 samples of nasopharyngeal aspirate from children under 2 years old with acute respiratory disease, patients at Santa Casa de Misericordia Hospital, São Paulo, were analyzed from February 2008 to February 2010 in order to determine the prevalence and genetic variability of HBoV stock. Using the PCR method, we obtained 47 (4.7%) positive samples for HBoV from which 27 showed coinfection with other respiratory viruses; 45 samples from a fragment of 658 nt were sequenced in the VP1/VP2 region. The phylogenetic analysis, when compared with GenBank sequences representing several countries, showed the presence in our samples of groups of HBoV similar to those circulating in Japan and Taiwan. Genetic variation in our samples were below 1%, both among themselves and when compared with samples from GenBank.

O presente estudo teve por objetivos caracterizar os vírus Influenza circulantes na cidade de São Paulo e verificar a variabilidade genética do gene da neuraminidase (NA) dos Influenzavírus A. Um total de 3009 amostras de crianças internadas no Hospital Universitário da USP, no período de 1995 a 2006, foram submetidas à duplex RT-PCR para detecção dos Influenzavírus A e B (IA e IB). As amostras positivas para IA foram submetidas à subtipagem pela multiplex RT-PCR. Cento e trinta e três amostras (4,4%) foram positivas, sendo 88,0% (117/133) IA e 12,0% (16/133) IB. Entre as amostras IA, 94 eram H3N2, 7 H1N1 e 16 não foram subtipadas pela multiplex. Um total de 74 amostras (71 H3N2 e 3 H1N1) tiveram o gene da neuraminidase sequenciado (total ou parcialmente). As sequências obtidas foram submetidas à análise filogenética, sendo verificado o agrupamento das cepas circulantes em clusters por ano de isolamento, demonstrando sua evolução temporal. Quando comparadas com as cepas vacinais utilizadas no período, foi verificada uma boa similaridade. / The aim of this study was to characterize Influenza virus circulating in São Paulo city and the neuraminidase (NA) gene sequence of Influenzavirus A in 3009 samples from children hospitalized at USP University Hospital, from 1995 to 2006. Samples underwent duplex RT-PCR for detection and typing of Influenza virus A and B (IA and IB) and also were submitted to multiplex PCR for subtyping of IA. Among 3009 samples, 4.4% were Influenza virus, being 88.0% IA (117/133) and 12.0% IB (16/133). Among samples of IA, 94 were characterized as H3N2, 7 H1N1 and 16 were not subtyped. A total of 74 samples (71 H3N2 and 3 H1N1) had the NA gene sequenced (total or partially). Sequences obtained were compared to sequences of the world and sequences of vaccine strains. Brazilian samples were grouped in clusters with samples isolated in the same year. It was also found a good similarity between circulating strains and vaccine strains.