Xanthomonas citri subsp. malvacearum é o agente causal da mancha angular do algodoeiro, uma importante doença reportada em áreas de produção no Brasil e em todo o mundo. A partir da análise comparativa de sequências parciais do gene rpoB de linhagens de X. citri subsp. malvacearum, X. campestris pv. campestris, X. axonopodis pv. axonopodis e X. citri subsp. citri, desenhou-se o par de primers xam1R/2R. Foram testadas 19 espécies pertencentes ao gênero Xanthomonas, além de bactérias dos gêneros Acidovorax, Burkholderia, Erwinia, Pseudomonas e Ralstonia, e o produto de PCR específico de aproximadamente 560 pares de bases foi observado apenas para linhagens de X. citri subsp. malvacearum. Os primers desenhados mostraram-se altamente sensíveis, apresentando níveis de detecção de 8 ufc/ 5,0 L para suspensões da cultura pura da bactéria e 1,0 ng de DNA genômico de X. citri subsp. malvacearum. No isolamento, a partir de amostras de sementes sabidamente contaminadas, foram obtidas colônias bacterianas com características de morfologia e coloração semelhantes à X. citri subsp. malvacearum. Esses isolados foram submetidos a testes de coloração de Gram, hidrólise de amido, reação de hipersensibilidade (HR) em folhas de fumo e tomateiro, testes de patogenicidade em plantas de algodoeiro, amplificação com os primers específicos desenhados e sequenciamento do fragmento obtido e os resultados obtidos confirmaram a identificação dos mesmos como X. citri subsp. malvacearum. Experimentos combinados de BIO-PCR/nested-PCR foram realizados a partir do material obtido do processo de extração do patógeno das sementes contaminadas utilizando-se na primeira etapa de amplificação os primers correspondentes à parte do gene rpoB e na segunda etapa o produto da primeira amplificação e os primers específicos xam1F/2R. O resultado foi a observação de uma banda de aproximadamente 560 pb correspondente ao fragmento específico de X. citri subsp. malvacearum para todas as amostras testadas. Neste trabalho foi desenvolvido um teste de PCR específico para a detecção e identificação rápida e precisa dessa bactéria em amostras de sementes de algodoeiro. / Xanthomonas citri subsp. malvacearum is the causal agent of angular leaf spot of cotton an important disease reported in production areas in Brazil and worldwide. From the comparative analysis of partial rpoB gene sequences of X. citri subsp. malvacearum, X. campestris pv. campestris, X. axonopodis pv. axonopodis and X. citri subsp. citri strains, the pair of primers xam1F/2R was designed. Nineteen species of the genus Xanthomonas and isolates of the genera Acidovorax, Burkholderia, Erwinia, Pseudomonas and Ralstonia were tested and the specific PCR product of about 560 base pairs was observed only for strains of X. citri subsp. malvacearum. The primers were highly sensitive, with detection levels of 8 cfu/ 5.0 L for suspensions of pure culture of bacteria and 1.0 ng of genomic DNA of X. citri subsp. malvacearum. From contaminated seed samples, bacterial colonies were obtained with characteristic morphology and coloration similar to X. citri subsp. malvacearum. These isolates were tested for Gram stain, starch hydrolysis, hypersensitivity reaction (HR) on tobacco and tomato leaves, pathogenicity tests on cotton plants, amplification with the specific primers designed and sequencing of the fragment obtained. The results confirmed their identification as X. citri subsp. malvacearum. PCR experiments in combination of BIOPCR/ nested-PCR were performed with the material obtained from the extraction process of pathogen from seeds using in the first step of amplification primers corresponding to part of the rpoB gene and the second step the product of the first amplification and the specific primers xam1F/2R. The result was a band of approximately 560 bp corresponding to the specific fragment of X. citri subsp. malvacearum for all samples tested. In this work, a PCR test for the quick detection and accurate identification of this bacterium in seed samples of cotton were developed.

A cana-de-açúcar é atualmente a cultura de maior importância agrícola do Estado de São Paulo, a partir da qual são gerados açúcar e etanol, além de vários outros subprodutos. No entanto, com a expansão das fronteiras agrícolas e alterações nas práticas de manejo, ocorre atualmente um momento de adequação de tal cultivo, que visa uma maior produtividade e sustentabilidade de produção. Para isto, dentre outros fatores, o papel da comunidade microbiana presente nos solos pode ter fundamental importância, auxiliando no melhor desenvolvimento da planta. No entanto, pouco se sabe sobre a comunidade microbiana existente nos solos cultivados com cana-de-açúcar. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo avaliar a diversidade e a abundância de fungos em solos de cultivo de cana-deaçúcar no estado de São Paulo, em áreas sob diferentes atributos químicos, físicos e de manejo. Objetivou-se também, verificar a ocorrência de padrões biogeográficos na estruturação de tais comunidades. Para isso, foi realizada a análise da estrutura das comunidades fúngicas por polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição terminal (T-RFLP), juntamente com a quantificação destas comunidades por meio da PCR em tempo real (qPCR) em 476 amostras de solo, obtidas de 11 áreas de cultivo (usinas). Dentro deste conjunto de dados, temos que os atributos químicos, físicos e manejo explicam maiores valores de variância dentro de cada área amostra, mas pouco explicam da variância geral dos dados, sugerindo a ocorrência de padrões biogeográficos das comunidades de fungos neste ambiente. Tal ocorrência foi confirmada pela significância estatística da correlação entre distância e dissimilaridade das comunidades de fungos, dando suporte a geração dos primeiros mapas biogeográficos de fungos em tais solos. Adicionalmente, a abundância de fungos mostrou-se relacionada com a produtividade da cultura, indicando este ser um dos fatores que modulam a produtividade de cana-de-açúcar nas áreas avaliadas. / The sugarcane is nowadays, the most important crop in the State of São Paulo, serving as the raw material for the production of sugar and ethanol, besides many others by-products. Considering the expansion of agricultural barriers, and shifts in fields management, such cultivation is under a re-arrangement process, aiming to a higher productivity and sustainability. In order to achieve that, among other factors, the role of microbial communities present in soils can be essential to support plant development. However, a few is known about the microbial community under sugarcane crop production soils. Hence, this work intended to evaluate the fungi diversity and abundance in soils cultivated with sugarcane in the State of São Paulo, exploring areas under distinct chemical and physical attributes and also distinct management practices. It was also aimed to determine the occurrence of biogeographically patterns in the structure of such communities. Indeed, it was made the analysis of the fungal community structure by terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP), together with the quantification of these communities by real time PCR (qPCR) in 476 soils samples, collected in 11 areas cultivated with sugarcane (mills). Within this dataset, it was found that chemical, physical and management attributes explain higher values of variance within each sampled area, but explain little about the total variance of data, suggesting the occurrence of biogeographically patterns in fungal communities in this environment. It was confirmed by the statistical significance of the correlation between distance and dissimilarity of fungal communities, supporting the generation of very first biogeographically maps in such soils. Additionally, the abundance of fungi revealed to be related with sugarcane productivity, indicating this issue as one of the factors modulating the sugarcane productivity in the evaluated areas.

O presente estudo teve como objetivo a caracterização genômica das espécies: Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum e Ureaplasma parvum em amostras cervicais de gestantes. Cepas de Mycoplasma hominis e de Ureaplasma spp., foram identificadas através do cultivo e por PCR utilizando-se primers genéricos e específicos. Os achados na literatura são contraditórios quanto a participação dessas bactérias nas doenças humanas, especialmente quanto a participação destas em casos de infertilidade e alterações perigestacionais. Considerando a marcante heterogeneidade das cepas de Mycoplasma hominis, utilizamos a reação de RAPD com a finalidade de definir os perfis genômicos das cepas isoladas. A caracterização dos biótipos 1 e 2 do gênero Ureaplasma, respectivamente, Ureaplasma urealyticum e Ureaplasma parvum, através da análise da MBA (Múltipla Banda Antigênica) por PCR, teve como finalidade determinar a predominância de cada uma dessas espécies. Foram estudadas amostras de material cervical de 163 gestantes em várias idades gestacionais. Os resultados obtidos neste trabalho foram: M. hominis foi detectado em 14,7% (24/163) das amostras, sendo a RAPO realizada em 7 das amostras positivas e puras de M. hominis. A reação RAPD demonstrou similaridade do perfil gênico entre as amostras 3 e 4 e entre as amostras 6 e 8, enquanto que as amostras 2, 5 e 7 demonstraram uma grande heterogeneidade. O gênero Ureaplasma foi isolado em 54,6% (89/163) das amostras, sendo 31,5% (28/89) cepas de U. urealyticum e 68,5% (61/89) U. parvum. Foram detectados 10,4% (17/163) casos de co-infecções M. hominis e Ureaplasma spp. O estudo da suscetibilidade das cepas isoladas frente a tetraciclina foi realizado com o intuito de se determinar a freqüência de cepas resistentes a essa droga. Considerando ser este antibiótico o de eleição no tratamento das micoplasmoses humanas e devido aos altos índices de resistência apresentados, resistência esta conferida pela presença do plasmídeo tetM, submetemos nossas amostras à pesquisa deste plasmídeo através da PCR. A presença do plasmídeo tetM foi detectada em 29,5% (7/24) das amostras positivas para Mycoplasma hominis e em 60,7% (54/89) das amostras positivas para Ureaplasma spp., sendo que dentre estas, 57,4% (31/54) foram detectados na espécie U. parvum e 42,6% (23/54) na espécie Ureaplasma urealyticum. O estudo da heterogeneidade intra-espécie das cepas de Mycoplasma hominis pela técnica de RAPD é inédito no Brasil. Da mesma maneira a caracterização das espécies do gênero Ureaplasma em U. parvum e U. urealyticum, através da PCR pela análise da MBA, foi pioneiramente realizada pelo nosso grupo de pesquisa. Esperamos com esse trabalho poder contribuir para um conhecimento melhor da freqüência dessas espécies na nossa população e tentar explicar as divergências das avaliações nas interações entre os micoplasmas e o hospedeiro. / The objective of this study was to characterize the species Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum and Ureaplasma parvum in cervical samples from pregnant women. Strains of Mycoplasma hominis and Ureaplasma spp., were identified by means of culture and by PCR using generic and specific primers. The findings in the literature with regard to the involvement of these bacteria in human diseases are contradictory, especially regarding their involvement in cases of infertility and perigestational changes. In view of the strong heterogeneity among Mycoplasma hominis strains, we used RAPD to define the profiles of the strains isolated. Biotypes 1 and 2 of the genus Ureaplasma - Ureaplasma urealyticum and Ureaplasma parvum respectively - were characterized by means of MBA (Multiple Banded Antigenic) analysis using PCR to determine the predominance of each of these species. Samples of cervical material from 163 pregnant women at various stages of pregnancy were studied. The results obtained in this study were: M. hominis was detected in 14.7% (24/163) of the samples, and RAPD analyses carried out in 7 M. hominis strains. The RAPD similarly gene profile was showed: between strains 3 and 4, and between strains 6 and 8. The strains 2, 5 and 7 showed a pronounced heterogeneity in the gene profile. The genus Ureaplasma was isolated in 54.6% (89/163) of the samples, of which 31.5% (28/89) were U. urealyticum and 68.5% (61/89) U. parvum. Mycoplasma hominis and Ureaplasma spp., coinfection were detected in 10.4% (17/163) of the samples. The study of the susceptibility of the isolated strains to tetracycline was carried out with a view to determining the frequency of strains resistant to this drug. As this is the antibiotic of choice in the treatment of human mycoplasmoses, and in view of the high resistance indices observed, which are conferred by the presence of the \"tetM\" plasmid, we looked for this plasmid in our samples using PCR. The presence of the tetM plasmid, was detected 57,1% (4/7) of the Mycoplasma hominis - positive samples and in 40,2% (29/72) of the Ureaplasma spp - positive samples. Of the latter, 41,6% (25/72) were detected in the species U. parvum and 33,4% (4/12) were detected in the species Ureaplasma urealyticum. This is the first time that a study of the intraspecies heterogeneity of Mycoplasma hominis strains using RAPD has been carried out in Brazil. Characterization of the genus Ureaplasma species into U. parvum and U. urealyticum by means of PCR using MBA analysis was likewise pioneering effort by our research group. We hope that our work will contribute to a greater knowledge of the frequency of these species in our population and that it will help to explain differences in the assessment of the interaction between mycoplasma and the host.

Vírus causadores de gastroenterite, descritos como pequenos vírus de estrutura arredondada (Small Round Structured Viruses-SRSV), foram detectados em extratos de ostras Crassostrea spp., coletadas em regiões distintas do litoral do Estado de São Paulo, utilizando a Reação em Cadeia por Polimerase com transcrição reversa (RT-PCR).Treze lotes de amostras, contendo 10 g de estômagos e divertículos, foram processados para extração e concentração das partículas virais, mediante adsorção-eluição e precipitação por polietilenoglicol (PEG 6000), e purificação com fluorocarbono (Freon, Dupont Co.) para eliminação prévia dos inibidores da reação de RT-PCR. A extração do ácido nucleico viral, foi realizada com uma mistura de isotiocianato de guanidina e fenol (TRIzol ®, Gibco) e clorofórmio, sendo completada com uma purificação em coluna spin, com membrana de polissulfona (Millipore,Corp.). A reação de RT-PCR foi realizada em uma única etapa, utilizando o kit \'\'Super Script ONE-STEP RT-PCR System\'\'® (Gibco). A reação de amplificação enzimática revelou, por eletroforese em gel de agarose (2%), corada com brometo de etídio, produtos de 123 bp, em 3 (23%) dos 13 lotes de amostras coletadas durante o verão de 1998, sendo verificadas em uma delas por imunomicroscopia eletrônica (IME),partículas de SRSV. Os produtos encontrados pertencem ao grupo genômico G2(Snow Mountain e outros vírus). A aplicação deste método possibilitou pela 1ª vez a detecção molecular de SRSVs no Brasil em ostras naturalmente contaminadas. / The Small Round Structured Viruses (SRSVs) have been associated with gastroenteritis in humans, and were detected in extracts of oysters Crassostrea spp., by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT - PCR). Thirteen lots of samples, originated from different regions of the State of São Paulo, were processed for viral particles extraction. The samples, containing 10 g of stomach and diverticula, were extracted by adsorption - elution and polyethylene glycol (PEG 6000) precipitation, and fluorocarbon (Freon, Dupont Co.) was used for purification and previous elimination of RT - PCR inhibitors. For the viral nucleic acid extraction, guanidine isothiocyanate - phenol mixture (TrizolÒ, Gibco ) and chloroform were used, followed by a polysulfone spin column (Millipore, Corp.) purification. The RT-PCR was done in one step, using the \'\'Super Script ONE-STEP RT-PCR System\'\'® (Gibco). The enzimatic amplification reaction run in 2% agarose gel electrophoresis stained with ethidium bromide, revealed 123 bp products in 3 (23%) of the 13 lots of samples collected during the summer of 1998. One of these three samples was positive for SRSV particles by Immune Electron Microscopy (IEM). These 3 products were classified in the Genogroup G2 (Snow Mountain and others viruses). The application of this methodology made it possible to detected, in a molecular basis, the first cases of SRSVs in environmentally contaminated oysters in Brazil.

Os microorganismos estão entre os maiores responsáveis pela transformação dos compostos orgânicos em uma lagoa de estabilização e são a chave do sucesso deste tratamento. A utilização de técnicas de biologia molecular em conjunto é uma das melhores formas para obter resultados mais confiáveis. A estrutura da comunidade microbiana na lagoa de estabilização facultativa da estação de tratamento de esgoto doméstico do Município de Cajati foi descrita baseada nos padrões dos fragmentos do gene RNAr 16S por PCR-DGGE, CARD-FISH, biblioteca de clones de gene RNAr 16S e sequenciamento. Os padrões obtidos com o DGGE foram correlacionados com as variáveis ambientais coletadas por análise de redundância (RDA). As amostras foram coletadas em três períodos para o estudo da variação temporal, coletou-se em três profundidades (superfície, 0,7 m e 1,5 m) para o estudo espacial vertical e em nove pontos a 0,7 m de profundidade para o estudo espacial horizontal da comunidade. / Microorganisms are amongst the most responsible for the conversion of sewage organic compounds and they are the key of the treatment success. The combination of two or more molecular techniques in this kind of assessment allows getting more accurate results concerning a microbial community. The facultative stabilization pond microbial community structure of domestic sewage treatment from Cajati city was characterized based on 16S RNAr gene fragments patterns from PCR-DGGE, FISH, 16S RNAr gene clone library and sequencing. The patterns obtained by DGGE were co-related to environmental variables by redundancy analysis (RDA). The samples were collected in three intervals to study the seasonal variation, it was collected in three depth (surface, 0,7 m and 1,5 m) to the vertical assessment and in nine spots at 0,7 m depth for the horizontal assessment of the microbial community.

O diagnóstico da leishmaniose tegumentar (LT) baseia-se em critérios clínicos e epidemiológicos podendo ser confirmado por exames laboratoriais de rotina como a pesquisa direta do parasito por microscopia e a intradermorreação de Montenegro. Atualmente, os métodos moleculares, principalmente a reação da cadeia da polimerase (PCR), têm sido considerados para aplicação em amostras clínicas, devido a sua alta sensibilidade e especificidade. Este trabalho teve como objetivo a padronização e validação das técnicas de PCR-RFLP com diferentes iniciadores (kDNA, its1, hsp70 e prp1), visando o diagnóstico e a identificação das espécies de Leishmania presentes em amostras de DNA provenientes de lesões de pele ou mucosa de 140 pacientes com suspeita de leishmaniose tegumentar. Para tal, realizamos ensaios de: 1) sensibilidade das PCRs com os diferentes iniciadores, 2) especificidade dos ensaios utilizando DNAs de diferentes espécies de referência de Leishmania, de tripanossomatídeos inferiores e de fungos, 3) validação das técnicas de PCR-RFLP com os iniciadores estudados em amostras de DNA de lesões de pele ou mucosas de pacientes com LT. Os resultados dos ensaios de limiar de detecção das PCR (sensibilidade) mostraram que os quatro iniciadores do estudo foram capazes de detectar o DNA do parasito, porém em quantidades distintas: até 500 fg com os iniciadores para kDNA e its1, até 400 fg com hsp70 e até 5 ng com prp1. Quanto à especificidade dos iniciadores, não houve amplificação dos DNAs fúngicos. Por outro lado, nos ensaios com os iniciadores para kDNA e hsp70, verificamos amplificação do fragmento esperado em amostras de DNA de tripanossomatídeos. Nos ensaios com its1 e prp1, o padrão de amplificação com os DNAs de tripanossomatídeos foi diferente do apresentado pelas espécies de Leishmania. Verificou-se nos ensaios de validação que o PCR-kDNA detectou o parasito em todas as 140 amostras de DNA de pacientes e, assim, foi utilizado como critério de inclusão das amostras. A PCR-its1 apresentou menor sensibilidade, mesmo após a reamplificação com o mesmo iniciador (85,7% ou 120/140 amostras). Para os ensaios da PCR-hsp70, as amostras de DNA foram amplificadas com Repli G, para obter uma sensibilidade de 68,4% (89/140 amostras). A PCR-prp1 não detectou o parasito em amostras de DNA dos pacientes. Quanto aos ensaios para a identificação da espécie presente na lesão, a PCR-kDNA-RFLP-HaeIII e a PCR-its1- RFLP-HaeIII permitem a distinção de L. (L.) amazonensis das outras espécies pertencentes ao subgênero Viannia. A PCR-hsp70-RFLP-HaeIII-BstUI, apesar de potencialmente ser capaz de identificar as seis espécies de Leishmania analisadas, quando utilizada na avaliação das amostras humanas permitiu apenas a identificação de L. (V.) braziliensis. No entanto, é uma técnica com várias etapas e de difícil execução, o que pode inviabilizar o seu uso rotineiro em centros de referência em diagnósticos. Assim, recomendamos o uso dessa metodologia apenas em locais onde várias espécies de Leishmania sejam endêmicas. Finalmente, os resultados indicam que o kDNA-PCR devido à alta sensibilidade apresentada e facilidade de execução pode ser empregada como exame de rotina nos centros de referência, permitindo a confirmação ou exclusão da LT. / The diagnosis of cutaneous leishmaniasis is based on clinical and epidemiological criteria and can be confirmed by routine laboratory tests such as direct detection of parasites by microscopy and by Montenegro skin test. Currently, the molecular methods, especially the polymerase chain reaction (PCR) have been considered for use in clinical samples due to its high sensitivity and specificity. This study aimed to standardize and validate the PCR-RFLP techniques with different primers (kDNA, its1, hsp70 and prp1) for the diagnosis and identification of Leishmania species present in DNA samples from skin or mucosal lesions of 140 patients with suspected cutaneous leishmaniasis. The following assays were performed to evaluate the 1) sensitivity of the PCRs with different pairs of primers, 2) specificity of the markers using DNAs of various species of Leishmania, lower trypanosomatids and fungi, 3) validate the PCR-RFLP techniques with DNA samples from skin or mucosal lesions of patients with LT. The results of the PCR detection threshold tests (sensitivity) showed that the four study pairs of primers were able to detect the DNA of the parasite, but in different quantities: up to 500 fg with kDNA and its1, 400 fg with hsp70 and up to 5 ng with prp1. Regarding the specificity of the primers, no amplification was observed with fungal DNA. On the other hand, the expected fragments for kDNA and hsp70 PCR were amplified with DNA of trypanosomatids. In its1 and prp1- PCR the pattern of amplification with the DNA of trypanosomatids was different of the one observed for species of Leishmania. In validation assays of PCR-kDNA protocol the parasite was detected in all 140 DNA samples from patients and it was used as inclusion criteria of the samples. The its1-PCR showed lower sensitivity even after reamplification (85.7% or 120/140 samples). The hsp70-PCR validation test was done with DNA samples amplified with Repli G, we obtained a sensitivity of 68.4% (89/140 samples). The PCR-prp1 did not detect the parasite in DNA samples from patients. Concern the tests for the identification of species present in the lesion, PCR-RFLP kDNA-HaeIII and PCR-RFLP ITS1-HaeIII enable distinction L. (L.) amazonensis from the other species belonging to the subgenus Viannia. The PCR-RFLP hsp70-BstUI, HaeIII, although potentially able to identify the six species of Leishmania studied, when it was used in the evaluation of only human samples, it identified only L. (V.) braziliensis. However, PCR-RFLP hsp70-BstUI, HaeIII is a technique with several stages and difficult to implement, which can derail your routine use in referral centers for diagnosis. Thus, we recommend using this method only in places where various Leishmania species are endemic. Finally, our results indicate that kDNA-PCR due to the high sensitivity and ease of execution could be used as a routine examination in reference centers, allowing the confirmation or exclusion of LT.

A infecção por Toxoplasma gondii, em hospedeiros imunocompetentes, resulta no desenvolvimento de anticorpos específicos e resposta imune celular que, frequentemente, induzem imunidade protetora e duradoura, prevenindo reinfecção. Entretanto, casos de toxoplasmose congênita em mulheres imunocompetentes em fase crônica de infecção indicam a possibilidade de reinfecção em humanos. Em modelos experimentais, reinfecção por T.gondii já foi descrita em casos de infecção por cepa de genótipo distinto ao da infecção primária e por cepas recombinantes, porém os estudos envolvendo genótipos clonais, em modelo murino, restringem-se à utilização de cepas do genótipo II na infecção primária, com desafio subsequente por cepas do mesmo genótipo, ou dos genótipos I e III, com ausência de informações sobre as cepas do tipo III, que correspondem ao genótipo de maior frequência e distribuição mundial. Procuramos explorar vários modelos de infecção sequencial com cepas clonais dos tipos I, II e III, buscando dados mais consistentes para compreensão dos seguintes questionamentos: (i) A infecção primária por um genótipo de T.gondii é capaz de proteger o hospedeiro da reinfecção por genótipo distinto? (ii) A imunidade induzida pela infecção primária pode prevenir a progressão da infecção causada pela cepa secundária, impedindo doença aguda e mortalidade dos animais? (iii) A imunidade da infecção primária previne a colonização do cérebro por cistos teciduais da cepa secundária? Nossos dados mostram que a imunidade induzida pela infecção primária por cepas clonais de T.gondii não protege o hospedeiro da reinfecção por cepa de genótipo distinto, já que foram detectados anticorpos contra as cepas das infecções primária e secundária em todos os modelos propostos. Somente a imunidade induzida pela infecção primária por cepa do tipo III foi capaz de prevenir a progressão da infecção secundária causada pelas cepas do tipo I e do tipo II, impedindo a mortalidade e colonização do cérebro dos animais por cistos teciduais da cepa secundária. Esses achados são extremamente importantes para auxiliar estudos vacinais e terapêuticos da toxoplasmose. / Toxoplasma gondii infection in immunocompetent hosts results in the development of specific antibodies and cellular immune responses that often induce protective and lifelong immunity, preventing reinfection. However, cases of congenital toxoplasmosis in immunocompetent women at a chronic phase of infection indicate the possibility of reinfection in humans. In experimental models, reinfection by T.gondii has been described in cases of infection by genotype distinct from that of primary infection and by recombinant strains, but studies involving clonal genotypes in the murine model are restricted to the use of type II genotype in primary infection, with subsequent challenge by strains of the same genotype, or genotypes I and III, without information about type III strains, which correspond to the genotype with the highest frequency and worldwide distribution. We explore several models of sequential infection with clonal strains of types I, II and III, looking for more consistent data to understand the following questions: (i) Primary infection by a T.gondii genotype is able to protect the host from reinfection by different genotype? (ii) Does the immunity induced by the primary infection prevent the progression of infection caused by the secondary strain, preventing acute disease and animal mortality? (iii) Does the immunity of primary infection prevent colonization of the brain by tissue cysts of the secondary strain? Our data show that the immunity induced by primary infection by T.gondii clonal strains does not protect the host from reinfection by a distinct genotype strain, since antibodies against the strains of primary and secondary infections were detected in all proposed models. Only the immunity induced by the primary infection by type III strain was able to prevent the progression of the secondary infection caused by type I and type II strains, preventing the mortality and colonization of the brains of the animals by tissue cysts of the secondary strain. These findings are extremely important to support vaccine and therapeutic studies of toxoplasmosis.

Considerada uma das mais severas doenças em citros, o Huanglongbing (HLB) foi descoberto no Brasil em 2004, e desde então tem causado sérios danos à citricultura do país. Anteriormente conhecida apenas na Ásia e África, atualmente está também presente em vários países do continente Americano. O HLB, no Brasil, é causado pelas bactérias Candidatus Liberibacter asiaticus (LAS) e Ca. L. americanus (LAM), sendo a última encontrada apenas neste país. São bactérias gram-negativas, limitadas ao floema, pertencentes ao subgrupo alpha das -proteobacterias. A transmissão desta doença pode ocorrer por enxertia de materiais vegetais infectados, pela planta parasita Cuscuta spp. ou pelo psilídeo-asiático-dos-citros, Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae). Para que o patógeno seja transmitido, há uma interação única que ocorre entre a bactéria e seu inseto vetor, cujo conhecimento auxiliaria no controle e prevenção da doença. Entretanto, vários aspectos da biologia da transmissão de Ca. Liberibacter spp. ainda são desconhecidos. Este trabalho teve por objetivo elucidar alguns aspectos relacionados à aquisição e interação de LAS e LAM com o inseto vetor, D. citri. Um primeiro estudo foi montado para avaliação de qual(s) estágio(s) apresentaria(m) maior eficiência de aquisição. Em seguida, avaliou-se o crescimento e concentração de ambas as bactérias no organismo do inseto em períodos sucessivos após a aquisição. Por fim, investigou-se a possibilidade de aquisição de ambas as bactérias concomitantemente pelo vetor, em períodos de acesso à aquisição iguais e seqüenciais em plantas-fonte de cada umas delas. Observou-se uma maior taxa de aquisição do patógenos por ninfas de 4° e 5° instares, contrastando com uma menor eficiência de aquisição por adultos. Por meio de análises de regressão, verificou-se um crescimento da população bacteriana com o passar do tempo, em insetos que se alimentaram em plantas infectivas ainda nas formas jovens (ninfas), sendo que o mesmo não foi observado para adultos. As bactérias foram detectadas no inseto por sonda específicas de PCR quantitativo apenas 7 dias após o início do período de acesso à aquisição (PAA) e foram detectadas até 40 dias após o PAA. O fato de as bactérias serem detectadas até 6 semanas após sua aquisição e em concentrações crescentes no vetor, caracterizam o tipo de transmissão como persistente propagativa. Este conhecimento é importante para melhor compreensão da epidemiologia e aprimorar o manejo do HLB. / Known as one of the most severe citrus diseases, Huanglongbing (HLB) was first described in Brazil in 2004. Ever since, it has caused serious damages to Brazilian citriculture. Previously known only in Asia and Africa, HLB is now present in several countries in the Americas. In Brazil, HLB is associated with two bacterial species, Candidatus Liberibacter asiaticus (LAS) and Ca. L. americanus (LAM); the latter one was found only in this country. These are gram-negative, phloem-limited bacteria, belonging to the alpha subdivision of the Proteobacteria group. Transmission of these bacteria may occur by grafting with infected plant material, by parasitic plants (Cuscuta spp.), or by the Asian citrus psyllid, Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae). The vector transmission process probably involves complex psyllid-pathogen interactions, which should be understood in order to improve management strategies to control HLB. The goal of this research was to study some aspects related to acquisition of LAS and LAM by the insect vector, D. citri. A first study was carried out to determine bacterial acquisition efficiency in relation to vector developmental stages. A second study was set up to investigate if bacterial concentration increases over time in the vector after acquisition by D. citri nymphs and adults. Finally, the possibility of acquisition of both LAS and LAM by a single insect was investigated by submitting D. citri nymphs and adults to sequential and similar acquisition access periods on citrus plants singly-infected with each one of these bacterial species. D. citri nymphs acquired Ca. L. asiaticus and Ca. L. americanus more efficiently than adults. No single insect acquired both bacterial species. Concentration of Ca. L. asiaticus reached higher levels in D. citri when acquired by 4th and 5th instar nymphs. Regression analyses showed an increase in the concentration of Ca. L. asiaticus in D. citri over time after acquisition for insects that acquired the pathogen yet as nymphs, which was not observed when bacterial acquisition occurred only in the adult stage. Both bacterial species were detected in D. citri by quantitative PCR from 7 to 40 days after onset of the acquisition access period. The observation of increasing concentrations of Ca. L. asiaticus in D. citri for several weeks after acquisition indicates that the bacterium is persistent and propagative in the vector. This information allows a better understanding of the transmission process with implications on HLB epidemiology and management.

A tuberculose bovina, cujo agente etiológico é o Mycobacterium bovis, é uma zoonose de caráter crônico que representa uma das principais enfermidades em rebanhos bovinos. Devido às perdas consideráveis de bacilos viáveis nos processos de descontaminação, e também pelo consumo de várias semanas entre o isolamento primário e a identificação final da espécie, métodos moleculares funcionam como metodologia diagnóstica auxiliar à bacteriologia clássica. Estes métodos têm ampla aplicação no diagnóstico e tipificação da tuberculose bovina, no entanto, a baixa sensibilidade quando aplicados diretamente sobre homogeneizados de tecidos tem limitado sua difusão como método diagnóstico de rotina. A solução do problema, ao que tudo indica, passa por métodos de extração mais eficientes e menos vulneráveis aos fatores inibidores da amplificação. Assim, foram selecionadas 60 lesões granulomatosas de 60 bovinos condenados em abatedouro, 30 positivas ao isolamento de Mycobacterium bovis (padrão ouro positivo) e 30 negativas (padrão ouro negativo). Dessas lesões foram obtidos homogeneizados que foram submetidos a diferentes protocolos de extração de DNA, que por sua vez foram todos submetidos ao mesmo protocolo de amplificação. Os resultados mostraram que o protocolo de BOOM et al. (1990) modificado apresentou sensibilidade superior ao isolamento de M. bovis pelo método clássico. / The bovine tuberculosis, whose etiological agent is the Mycobacterium bovis, is a major zoonosis of cattle, of chronical course. Due to the expressive loss of viable bacilli during the decontamination processes and the long period between the primary isolation and the final identification of the specie, molecular methods are being used as auxiliary diagnostic methods to the classical bacteriology. These methods have a broad scope of application in the diagnosis and typification of bovine tuberculosis. However, the low sensibility when applied directly to tissue homogenates have limited its application as routine diagnostic method. The answer to this problem, as it seems, is the development of extraction methods that are more efficient and less vulnerable to inhibition factors of amplification. Therefore, 60 granulomatous lesions of 60 condemned bovines at abattoir were selected, 30 Mycobacterium bovis isolation positives (positive gold standard), and 30 negatives (negative gold standard). The homogenates were obtained from these lesions and were subjected to different DNA extraction protocols, all of which were submitted to the same amplification protocol. The results showed that BOOM et al. (1990) modified protocol showed superior sensibility than the M. bovis isolation through the classical method.

Dentre todas as doenças infecciosas, a malária é a que exerce maior impacto sobre a mortalidade, sobretudo a infantil, em áreas endêmicas. O fato de apenas uma pequena porcentagem de indivíduos que vivem em áreas endêmicas desenvolverem complicações sugere que fatores genéticos do hospedeiro possam exercer papel fundamental. A identificação de polimorfismos genéticos de nucleotídeo único (SNP), associados à suscetibilidade ou proteção contra as formas sintomáticas de malária poderia auxiliar na elaboração de estratégias vacinais. O presente estudo teve como objetivo determinar a frequência de polimorfismos de citocinas pró e anti-inflamatórias em indivíduos moradores de uma área endêmica da Amazônia Legal brasileira. Foram investigados cinco SNP em cinco citocinas: IL-6 (-174) e IL-12p40 (+1188), IL-4 (+33), IL-10 (-3575), TGF?1 (+869) por meio de PCR-RFLP. Foram realizadas comparações entre as frequências genotípicas e alélicas desses SNP em dois grupos de indivíduos, com malária sintomática e assintomática e verificada a existência de associação entre os SNP de citocinas e os níveis de parasitemia. Foram recrutados 104 indivíduos com malária sintomática, porém não complicada, e 37 indivíduos assintomáticos que permaneceram desta forma por um período mínimo de 60 dias. As amostras de sangue foram colhidas em 1995 e 1996, época em que a transmissão de malária na região era perene. O diagnóstico laboratorial de malária foi realizado pelo teste da gota espessa e/ou semi-nested PCR. O teste do x2 foi aplicado para a comparação entre os grupos. A frequência do genótipo TT (selvagem) na posição -3575 foi maior no grupo AS em relação ao grupo MS [?2=3,716; p=0,0269; OR=0,4249, pc=0,0424]. Também houve diferenças quando comparamos o genótipo TT em relação aos genótipos AA e AT agrupados [?2=3,747; p=0,0264; OR=0,4053; pc=0,0264]. Na análise por alelo, a frequência do alelo T também foi maior no grupo AS em relação ao MS [?2=4,506; p=0,0169; OR=0,4570; pc= 0,0250]. Na análise da parasitemia os indivíduos foram divididos em dois grupos: parasitemia não detectável (ND), n=80, ou detectável, n=61. Foram encontradas diferenças estatisticamente significantes apenas em relação ao polimorfismo IL-12p40 +1188 com 36 indivíduos no grupo ND (45%) e 18 no grupo com parasitemias detectáveis (29,50%) [?2=4,725; p=0,0149; OR=2,235; pc= 0,0232]. Ademais, quando os sujeitos de pesquisa com genótipo AA (selvagem) foram comparados aos indivíduos com genótipo AC e CC nos dois grupos, mais uma vez foram encontradas diferenças estatisticamente significantes [?2=3,515; p=0,0304; OR=1,955; pc= 0,0446]. Em relação aos cinco SNP investigados, todas as distribuições genotípicas estavam de acordo com o equilíbrio de Hardy-Weinberg. Concluindo, as cinco PCR-RFLP para a detecção de polimorfismos da IL6 (-174), IL12p40 (+1188), IL4 (+33), IL10 (-3575) e TGF?1 (+869) foram padronizadas com sucesso. Apenas para o polimorfismo da IL10 - 3575 T->A foram encontradas frequências mais elevadas do alelo selvagem T e dos genótipos TT e TA nos indivíduos assintomáticos em relação aos sintomáticos, sugerindo um possível papel protetor do alelo selvagem. Em relação ao polimorfismo da IL-12p40 +1188, foi observada frequência mais elevada do genótipo selvagem AA entre indivíduos com parasitemia indetectável pela gota espessa. / Among all infectious diseases, malaria is the one that exerts greater impact on mortality, especially among children in endemic areas. The fact that only a small percentage of individuals living in endemic areas develop complications suggests that host genetic factors may play a fundamental role. The identification of genetic polymorphisms associated with increased susceptibility or protection against symptomatic forms of malaria could help to develop vaccine strategies. This study aimed to determine the frequency of genetic polymorphisms of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in subjects living in an endemic area of the Brazilian Legal Amazon. Five polymorphisms of IL-6 (-174), IL-12p40 (+1188), IL-4 (+33), IL-10 (-3575) and TGF-?1 (+869) were investigated by PCR-RFLP. Genotypic and allelic frequencies of these polymorphisms were compared in two groups of individuals, with symptomatic and asymptomatic malaria. We also verified the existence of any association between cytokine polymorphisms and parasitemia levels. We recruited 104 subjects with uncomplicated symptomatic malaria (MS), and 37 asymptomatic ones (AS) who remained this way for a minimum of 60 days. Blood samples were collected in 1995 and 1996, a time when malaria transmission was perennial in this region. Laboratory diagnosis of malaria was assessed by the ck blood smear and/or by a semi-nested PCR. The x2 test was applied for comparison between groups. The frequency of the wild type genotype TT at the IL- 10 -3575 SNP was higher in the AS group compared to MS [?2= 3.716, p = 0.0269, OR = 0.4249, pc = 0.0424]. This difference was also significant when the TT genotype was compared to the AA and AT genotypes grouped [?2= 3.747, p = 0.0264, OR = 0.4053, pc = 0.0264]. Analyzing by allele, the frequency of the T allele was also higher in the AS group compared to MS [?2= 4.506, p = 0.0169, OR = 0.4570, pc = 0.0250]. Studied subjects were redistributed in two groups according to the parasitemia determined by the thick blood smear: non detectable (ND), n = 80, or detectable, n = 61. Concerning the IL-12p40 +1188 polymorphism, we found 36 individuals with genotype AA in the ND group (45%) and 18 in the detectable one (29.50%) [?2=4,725, p=0.0149, OR=2.235, pc=0.0232]. Furthermore, when the analysis compared the genotype AA with AC and CC together in both parasitemia groups, once again statistically significant differences were found [?2=3,515, p=0.0304; OR=1.955, pc =0.0446]. Regarding the five polymorphisms, all genotype distributions were in agreement with the Hardy-Weinberg equilibrium. In conclusion, the five PCR-RFLP for the detection of IL-6 (-174), IL-12p40 (+1188), IL-4 (+33), IL- 10 (-3575) and TGF-?1 (+869) were successfully standardized. Only for IL-10 -3575 T->A higher frequencies of the wild type T allele and also of the genotypes TT and TA were found in asymptomatic individuals with respect to the symptomatic ones, suggesting a possible protective role of the wild-type allele. Regarding the IL-12p40 +1188, a higher frequency of the wild type genotype AA was found among individuals with undetectable parasitemia by the thick blood smear.