Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais. / Made available in DSpace on 2012-10-23T11:12:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 252348.pdf: 3711855 bytes, checksum: 86deac7f81ee011560f37a619f1601de (MD5) / A fruticultura de clima temperado é uma atividade de grande importância sócio-econômica no Brasil, sendo que a maior área de produção está localizada na Região Sul do país, e o Estado de Santa Catarina é responsável por cerca de 50% da oferta nacional. O consumo da maçã vem aumentando e com o rápido aumento da área de cultivo da macieira, houve um acréscimo de problemas fitossanitários. Para manter a cultura da macieira em nível de produtividade desejada, a utilização de técnicas biotecnológicas para obtenção de mudas de qualidade genética-sanitária comprovada, das novas variedades, a produção de plantas matrizes básicas de melhor qualidade e produtividade, são algumas das condições importantes para a macieira. Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver protocolos de regeneração in vitro para macieira (Malus domestica Borkh) cv. Galaxy, via organogênese direta, para estudos de propagação in vitro e melhoramento genético. Para isto foram usados como explantes segmentos nodais contendo gemas, apicais e laterais, e folhas os quais foram introduzidos em meio de cultura MS suplementado com BAP, TDZ e ANA. No estabelecimento in vitro, os tratamentos de assepsia aplicados foram pouco eficientes, apresentando índices de contaminação que variaram entre 5 a 40%. No processo de multiplicação in vitro, a concentração de 4,44 µM de BAP foi a mais efetiva para multiplicação e produção de brotos com altura igual ou superior a 20 mm. A respeito da organogênese, a partir de explante foliar, pôde-se observar que o tipo de explante, isto é, o limbo seccionado foi favorável ao processo de regeneração de brotações. Entretanto, o explante folha inteira apresentou os melhores resultados, onde obteve-se um maior número de explantes regenerados. A concentração de 9,1 µM de TDZ adicionada ao meio de cultura, foi a concentração que apresentou os resultados favoráveis a regeneração de brotações. No entanto, para os discos foliares, a concentração que apresentou resultados superiores foi 13,62 µM de TDZ. Os resultados das análises histológicas permitem inferir que a organogênese das brotações teve origem direta de células do mesofilo, ou seja, células do parênquima. Porém não podemos afirmar que todas as brotações adventícias originaram-se deste tecido, pois observou-se a presença de calos nos explantes no decorrer dos experimentos. The fruticultura of tempering climate is an activity of great partner-economic importance in Brazil, being that the biggest area of production is located in the South Region of the country, and the State of Santa Catarina is responsible for about 50% of offers national. The consumption of the apple comes increasing and with the fast increase of the area of culture of the apple tree, it had an addition of resistant to biotic and abiotic stresses. To keep the culture of the apple tree in level of desired productivity, the use of biotechnological techniques for attainment of dumbs of proven genetics-sanitary quality, of the new varieties, the production of basic first plants of better quality and productivity, they are some of the important conditions for the apple tree. The objective of this work was to develop regeneration protocols in vitro for apple tree (Malus domestica Borkh) cv. Galaxy, of organogenesis direct, for propagation studies in vitro and genetic improvement. For used as internodal explants and leaves where they had been introduced in cultured MS medium, with BAP, TDZ and ANA. In the establishment in vitro the applied treatments of asepsis had been little efficient, presented contamination indices that had varied between 5-40%. In the multiplication process the concentration of 4,44 µM of BAP was most effective for multiplication and production of shoots. Regarding organogenesis from leave explant, it could be observed that the type of explant, that is, the cut of the limb was favorable to the process of regeneration of shoots. However, the explant entire leaf presented the best ones resulted, where a bigger number of regenerated explants was gotten. The concentration of 9,1 µM of TDZ added to the medium of culture, was the concentration that presented the favorable results the regeneration of shoots. However, for folial disks, the concentration that presented resulted superior was 13,62 µM of TDZ. The results of the histological analyses allow to infer that organogenesis of the shoots, had direct origin of cells of mesophyll, or either, cells of parenchyma, however we cannot affirm that all the adventitious buds had originated, therefore observed it presence of callus in the explants in elapsing of the experiments.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2014-08-06T17:43:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 325867.pdf: 3859462 bytes, checksum: 3585825c2cd70fd8e1331b2d03a3f2fa (MD5) Previous issue date: 2013 / Novas estratégias para a regeneração da pele são necessárias a fim de proporcionar um tratamento eficaz para feridas cutâneas e doenças. Dentre estas possíveis estratégias estão o desenvolvimento de novos biomateriais, a realização de terapia celular e a identificação e aplicação de fatores envolvidos no reparo de tecidos. Avanços na área de engenharia tecidual têm possibilitado o desenvolvimento de biomateriais que se assemelham a arquitetura tecidual da pele, como os substitutos dérmicos, que permitem o recobrimento da lesão e facilitam a recolonização celular, auxiliando assim a regeneração do tecido dérmico. Além disso, as células-tronco mesenquimais (CTMs) têm sido descritas como uma fonte atrativa de células para a engenharia de tecidos, em razão da sua multipotencialidade e capacidade de liberação de moléculas ativas importantes para o reparo tecidual. Tendo em vista estes aspectos, o presente trabalho busca estabelecer e avaliar um novo método de tratamento de lesões de pele, tendo como base a associação das CTMs derivadas da pele humana com substitutos dérmicos comerciais, utilizados atualmente em abordagens clínicas. Para isso, primeiramente, CTMs da derme humana (dCTMs) foram isoladas e sua potencialidade e características morfológicas, fenotípicas e migratórias analisadas. Os resultados obtidos mostram que as dCTMs possuem características semelhantes às CTMs derivadas da medula óssea, como: morfologia fibroblastóide, alta capacidade proliferativa, perfil de expressão de marcadores de superfície e potencial de diferenciação para fenótipos mesodermais. Além disso, as células expressam marcadores de pluripotencialidade e de linhagens neurais e mesenquimais, sem indução específica, e possuem potencial de diferenciação para a linhagem epidermal. Ademais, as dCTMs mostram alta capacidade migratória in vitro. Após esta caracterização das dCTMs, foi avaliado o crescimento e a manutenção destas células em um sistema de cultura tridimensional com os substitutos dérmicos Integra® e Pelnac®. Os resultados mostram que ambos os substitutos dérmicos suportam igualmente a adesão, proliferação e migração das dCTMs, mantendo suas características fenotípicas, tais como o perfil de expressão de marcadores de superfície, de pluripotencialidade e de linhagens neurais e mesenquimais. Tendo em vista que a associação das dCTMs com os substitutos dérmicos mostrou-se eficiente, foi avaliado a seguir o potencial terapêutico destas células associadas ao substituto dérmico (SD) Integra® no reparo de lesões de pele em camundongos. Para isso, foi avaliada a inflamação, vascularização, depósito de matriz extracelular e a re-epitelização em lesões tratadas com dCTMs associadas ao SD e em lesões mantidas apenas com o SD (controle). Os resultados demonstram que o tratamento com dCTMs + SDs aumenta o tecido de granulação, o recrutamento de células inflamatórias (neutrófilos e macrófagos), a vascularização, o depósito de colágeno e a re-epitelização, acelerando assim o reparo tecidual. Além disso, o tratamento com dCTMs + SDs modula a expressão de diferentes genes relacionados com o reparo tecidual na área da lesão. Em conclusão, o presente estudo isolou uma população de CTMs da pele humana, denominada de CTMs dermais (dCTM), e mostrou uma eficiente associação destas células com os SDs, representando assim uma nova ferramenta terapêutica para a engenharia tecidual. Esta associação, quando avaliada no tratamento de lesões cutâneas de camundongos, mostrou-se promissora, resultando em um reparo tecidual mais eficiente.<br> / Abstract : New strategies for skin regeneration are needed in order to provide effective treatment for cutaneous wounds and diseases. Among these possible strategies are the development of new biomaterials, cell therapy and the identification and application of factors involved in tissue repair. Advances in tissue engineering have provided the development of biomaterials similar to the skin such as dermal substitute (DS), for covering the lesion and to facilitate cell recolonization thereby supporting dermal regeneration. In addition, mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as an attractive source of cells for tissue engineering because of their multipotentiality and ability to release active molecules for tissue repair. Therefore, the present study established and evaluated a new method for treatment of skin lesions, based on the association of MSCs derived from human skin with commercial dermal substitutes currently used in clinical procedures. Thus, MSCs from human dermis (dCTMs) were isolated and their morphologic, phenotypic migratory characteristics and potentiality analyzed. The results showed that dCTMs have characteristics similar to MSCs derived from bone marrow, such as: fibroblast-like morphology, high proliferative capacity, profile of surface markers and differentiation potential for mesodermal phenotypes. In addition, these cells express pluripotent and mesenchymal and neural lineages markers, without specific induction. Moreover, the dMSCs display the potential for epidermal lineage and show high migratory capacity in vitro. It was also evaluated the growth and maintenance of these cells in three-dimensional (3D) culture system with the dermal substitutes Pelnac® and Integra® . The results showed that both dermal substitutes equally support the adhesion, spread and growth of human dMSCs in 3D-culture, maintaining MSC phenotype, expression of the pluripotent and neural and mesnchymal lineages markers. In view of these results, the therapeutic potential of these cells associated with the Integra DS in the repair of skin lesions in mice was evaluated in vivo. Inflammation, vascularization, deposition of matrix extracellular molecules and reepithelialization in skin lesions were analyzed. The results demonstrated that the treatment with dCTMs + DSs increases the granulation tissue, recruitment of inflammatory cells (neutrophils and macrophages), vascularization, collagen deposition and reepithelization, thus accelerating tissue repair. In addition, the treatment with dCTMs + DSs modulates the expression of different genes related to tissue repair. In conclusion, the present study isolated a population of MSCs from human skin, named dermal MSCs (dMSCs), and showed an efficient association of these cells with DSs, representing a new therapeutic tool for tissue engineering. This combination, when evaluated in the treatment of cutaneous lesions in mice, has shown to be promising, resulting in a more efficient tissue repair.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento / Made available in DSpace on 2013-03-04T20:32:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Indivíduos acometidos por queimaduras graves e/ou extensas ou por grandes feridas, ou seja, que apresentam perda significativa de tecido epitelial, são considerados pacientes gravemente enfermos uma vez que a falta massiva da pele resulta em perdas hídricas e deixa o organismo mais susceptível à infecções. Quando estes pacientes sobrevivem, após tratamento intensivo e prolongado, se deparam com cicatrizes desfigurantes, não funcionais e contraturas graves da pele. No presente trabalho foi realizada uma análise comparativa do processo de cicatrização entre as matrizes de regeneração dérmica Integra® e Pelnac® em pele de camundongo Mus musculus, através de ensaios in vivo. Os animais foram separados em três grupos e posteriormente levados à cirurgia para a retirada de 1cm2 da pele do dorso. No grupo1 (G1), no local da excisão não era colocado matriz de regeneração dérmica, ficando o ferimento exposto para cicatrização por segunda intenção; no grupo 2 (G2), no local da excisão colocava-se, matriz de regeneração dérmica Integra® e no grupo 3 (G3), colocava-se matriz de regeneração dérmica Pelnac®. Eram realizadas biópsias com 3, 6 e 9 dias de pós-operatório, onde o material retirado era processado para emblocamento em parafina e posteriormente cortado e corado com hematoxilina-eosina e tricrômico de Masson . O estudo dos cortes histológicos corados com hematoxilina-eosina tinham como objetivo a análise do processo inflamatório, análise da celularidade e neoformação vascular. Com a coloração tricrômico de Masson pretendia-se fazer uma análise da presença de colágeno e fibrose. O estudo do processo inflamatório revelou uma discreta diferença entre as matrizes de regeneração dérmica Integra® e Pelnac® no sexto dia de pós-operatório, onde, neste momento, a matriz Pelnac® mostrou-se mais efetiva em conter a inflamação. A celularidade mostrou-se praticamente igual em todos os grupos e em todos os dias estudados, com discreto aumento no terceiro dia na matriz Integra®. Ambas as matrizes apresentaram células gigantes de corpo estranho. Isso nos sugere que ambas os substitutos não tiveram comportamento imunológico totalmente inerte, como esperado. A presença de neovasos ocorreu de forma efetiva em todos os grupos, porém não de forma acelerada. Não houve necrose tecidual em nenhum dos grupos estudados. A análise pela coloração tricrômico de Masson foi realizada somente de forma qualitativa devido a presença muito discreta de fibrose em nosso grupo experimental. Não observamos alterações cicatriciais severas, sendo que a mesma ocorreu de maneira uniforme em todos os grupos analisados, sem a presença de cicatrizes hipertróficas ou retrações teciduais. O resultado estético e funcional final foi viável, inclusive com presença de pilificação. Conclusão: A formação de neovasos foi semelhante em todos os grupos estudados, sugerindo uma não interferência das matrizes na neoformação vascular neste modelo experimental. A densidade de células inflamatórias por área apresentou-se um pouco maior na matriz de regeneração dérmica Integra no terceiro dia de pós-operatório, sugerindo que esta matriz possa apresentar um comportamento mais pró-inflamatório. Ambas as matrizes apresentaram células gigantes de corpo-estranho. Este resultado nos mostra que os dois substitutos dérmicos estudados não apresentaram um comportamento totalmente inerte, como é o desejado. Há portanto, necessidade de melhorias em ambos os produtos, neste sentido. Com a matriz de regeneração dérmica Pelnac® houve menos processo inflamatório no sexto dia de pós-operatório. No entanto, a cicatrização da pele nos animais sem matriz de regeneração dérmica e com e com matriz de regeneração dérmica Integra® e Pelnac® se deu de forma semelhante, onde todas apresentaram uma cicatriz normal, com ausência de fibrose ou cicatrização hipertrófica. Deste modo, as matrizes de regeneração dérmica Integra® e Pelnac® não apresentaram interferência no resultado final da cicatrização em relação às feridas sem matriz neste modelo experimental. Para estudos de cicatrizes hipertróficas ou retração de feridas, portanto, há necessidade de um aperfeiçoamento do mesmo / Three animal groups were taken to surgery consisting of removal of 1cm2 skin in the back. Group 1 (G1) animals were not treated with skin substitutes, leaving the exposed wound to heal second intention; Group 2 (G2) animals were treated, at the site of excision, with skin substitute Integra® and Group 3 (G3) animals were treated with skin substitute Pelnac®. Biopses were performed at the 3rd, 6th and 9th days after surgery. The material was then processed for histological procedures and stained with hematoxilin-eosin (HE) and Masson trichrome. HE staning was used to evaluate the linear inflammatory process, cellularity and neovascularization. On the other hand, Masson trichrome was used to analyze the presence of collagen and fibrosis. The study of inflammatory process revealed a slight difference between at the 6th day after surgery, being Pelnac® more effective in containing inflammation. The cellularity was similar in all analyzed groups in all the period studied, with a slight increase on the third day in dermal template Integra®. Both skin substitutes contained giant cells of foreign body. This suggests that both skin substitutes were not totally immunologically inert, as expected. Neovascularization were observed in all groups. Necrosis was not observed in any group. Masson staining reveled very discreet fibrosis in our experimental group. We did not observe cicatricicial changes, that was uniform in all groups, without presence of hypertrophic scars or tissue retraction. The final functional and cosmetic result was acceptable, even the presence of hairiness. Conclusion: The formation of new vessels was similar in all groups studied, suggesting a non interference matrices of neovascularization in this experimental model. The density of on inflammatory cells per area showed a little increase in dermal template Integra 3rd day after surgery, suggesting that this skin substitute display a pro-inflammatory action. Both matrices showed giant cells of foreign body. This result shows that both skin substitutes studied did not have a totally inert behavior, as is desired. Improvements in both products are needed. With Pelnac® there was less inflammatory process in the 6th pós- operative day. However, skin healing was similar in all animal groups including those animals maintained without skin substitutes, with normal scarring, no fibrosis and nor hypertrophic scarring. Thus, the skin substitutes Integra® and Pelnac® did not significantly affected the healing wounds. Improvement in the animal model is need for studies of wound contraction or hypertrophic scars

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-10-19T13:18:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 337734.pdf: 3377384 bytes, checksum: 41c3085f595d79158f356834905b6bcd (MD5) Previous issue date: 2015 / Neste estudo, foi avaliado o potencial de um novo tratamento para lesões cutâneas baseado em dois componentes da engenharia de tecidos: células e arcabouço. Foi utilizado como arcabouço o hidrogel de carragenana, um polímero termo reversível de origem natural, associado a células estromais multipotentes (CEM) humanas no tratamento de lesões cutâneas em modelo murino. Inicialmente foi realizada a caracterização química da carragenana teste, obtida da alga Kappaphycus alvarezii cultivada em Florianópolis e da carragenana comercial (Sigma®). Os resultados mostraram que a carragenana teste é da classe kappa e apresenta porcentagem de sulfato semelhante à encontrada na carragenana comercial (Sigma®). Em seguida, foi avaliada a regeneração cutânea após 3, 7 e 14 dias de pós-operatório. Os resultados mostraram que o tratamento com CEM encapsuladas no hidrogel de carragenana teste (HCT) não altera a densidade do infiltrado leucocitário, a vascularização e a espessura da epiderme, além de aumentar o tecido de granulação e o depósito de colágeno quando comparado ao grupo sem tratamento (S/T). Além disso, o tratamento com CEM + HCT apresenta um menor infiltrado leucocitário, não altera a espessura do tecido de granulação e a vascularização, aumenta o depósito de colágeno quando comparado aos grupos HCT e CEM. Os resultados mostraram também que as células humanas permanecem no tecido cicatricial murino após 3 dias de pós-operatório. Em conclusão, este estudo mostrou que a carragenana obtida da alga K. alvarezii cultivada em Florianópolis representa um material de baixo custo com potencial para aplicações terapêuticas. Apesar da associação do hidrogel de carragenana teste com as CEM humanas não apresentar melhora quando comparado ao grupo sem tratamento, demostrou bons resultados quando comparado aos tratamentos isoladamente (grupos HCT e CEM) e representa uma abordagem nova, barata e potencialmente aplicável na engenharia de tecidos.<br> / Abstract : This study evaluated the potential of a new treatment for cutaneous wound based on two components of tissue engineering: cells and scaffold. Carrageenan hydrogel, a thermo reversible polymer of natural origin was used as a scaffold for the delivery of human multipotent stromal cells (MSC) for treatment of cutaneous wound in mice. At first the chemical characterization of native carrageenan obtained from seaweed Kappaphycus alvarezii grown in Florianopolis and commercial carrageenan (Sigma®) was carried out. The results showed that the native carrageenan belongs to the kappa class and shows a percentage of sulphate similar to that found in commercial sample. Evaluation of mouse skin wound healing was carried out by three steps: excisional wound in the dorsal region, treatment application and coating with Tegaderm® dressing. The results after 3, 7 and 14 days post-wounding showed that treatment with MSC encapsulated in native carrageenan hydrogel (NCH) does not change the density of the leukocyte infiltrate, vascularity and the thickness of the epidermis, and increase granulation tissue and collagen deposition when compared to the control untreated group. Furthermore, treatment with MSC encapsulated in NCH has a lower leukocyte infiltration, does not change the thickness of the granulation tissue, epidermis and vascularity, and increase collagen deposition when compared with MSC and NCH groups. In addition, human cells were detected in the scar tissue within 72 h post-wounding. In conclusion, this study showed that the carrageenan obtained of seaweed K. alvarezii cultivated in Florianopolis is a low cost material with potential therapeutic applications. The carrageenan hydrogel association with human MSC did not showed improvement compared to untreated group, but showed good results when compared to NCH and MSC groups. Thus, MSC encapsulated NCH represents a new approach applicable in tissue engineering.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-12-13T03:10:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 341436.pdf: 4046203 bytes, checksum: fd2def57c8033759769226c7235109fa (MD5) Previous issue date: 2016 / Lesões de espessura total na pele, como queimaduras extensas e úlceras crônicas, resultam em numerosos problemas fisiológicos, funcionais e psicológicos para os pacientes. Apesar de existirem diversos tratamentos para essas lesões, nenhum deles resulta em uma pele totalmente íntegra e funcional. Por isso, buscou-se com este trabalho um melhor método de reparo cutâneo, associando células-tronco mesenquimais dermais (dCTMs) com matrizes de celulose bacteriana (MCBs). Trabalhos têm mostrado que CTMs melhoram o reparo de tecidos lesados, por meio de sua diferenciação nos fenótipos afetados ou da liberação de fatores parácrinos. As MCBs, por sua vez, são polímeros naturais produzidos por bactérias. Essas membranas são atrativas para o reparo tecidual, por apresentarem características como biocompatibilidade, alta capacidade de retenção de água, e boa permeabilidade. Neste trabalho as MCBs produzidas foram caracterizadas fisicamente em seu estado úmido e liofilizado. As MCBs hidratadas apresentaram uma alta capacidade de retenção de água, fibras nanométricas e porosidade superficial de cerca de 30%. Quando submetidas ao processo de liofilização as MCBs não mantiveram sua conformação tridimensional, apresentando porosidade quase nula, fibras achatadas e baixa taxa de reabsorção de água, não sendo capazes de retornar ao seu estado original. Desse modo, a associação de dCTMs foi analisada apenas com as MCBs hidratadas. As dCTMs foram obtidas a partir de fragmentos de pele, de pacientes saudáveis, que se submeteram a cirurgias de lifting facial, e foram cultivadas sobre as MCBs em condições de cultivo padrão. Os experimentos demonstraram que as dCTMs permaneceram viáveis por 21 dias sobre as MCBs, análises com microscopia de varredura e confocal indicaram que as dCTMs se aderem progressivamente sobre as MCBs, são capazes de se proliferar, não migram para o interior das membranas e mantém sua morfologia típica. Nessas condições as dCTMs também mantiveram suas características imunofenotípicas de CTMs como visto por citometria de fluxo. Esses resultados mostram que as MCBs são biocompatíveis às dCTMs. Considerando estas análises, o potencial terapêutico dessa associação foi avaliado in vivo em lesões cutâneas de camundongos. Foram avaliados os seguintes parâmetros: taxa de fechamento das lesões, infiltrado inflamatório, angiogênese, espessura e homogeneidade da epiderme e comprimento das cicatrizes. Os resultados revelaram que, quando comparado com o grupo controle, o grupo tratado com dCTM+MCB apresentou um aumento significativo na angiogênese e no infiltrado de neutrófilos. Além disso, o tratamento influenciou a espessura do tecido de granulação, levou a formação de uma epiderme mais fina e homogênea, e aparentemente diminuiu as cicatrizes. Em conjunto, os resultados sugerem que a associação esteja acelerando a maturação das lesões cutâneas, e favorecendo o processo de reparo cutâneo.<br> / Abstract : Full-thickness skin injuries, such as extensive burns and chronic ulcers result in numerous physiological functional and psychological problems for the patients. Even though there are various current treatments for these lesions, none of them lead to a fully reconstituted and functional skin. For this reason, this work search for a better method to improve skin repair, associating dermal mesenchymal stem cells (dMSCs) with bacterial cellulose membranes (BCMs). Studies have shown that MSCs improve tissue repair through differentiation in affected phenotypes or by releasing paracrine factors. The BCMs, in turn, are natural polymers produced by bacteria. These membranes are attractive for tissue repair by presenting biocompatibility, high capacity of water retention, and good permeability. In the present work, the produced BCMs were physically characterized in their wet and freeze-dried states. The wet BCMs showed a high capacity for water retention, nanometric fibers and a surface porosity of about 30%. When subjected to the freeze drying process, BCMs did not keep their three-dimensional conformation, presented almost no porosity, flattened fibers and low water absorption rate, not being able to return to its original state. Thus, dMSCs association was analyzed only with wet BCMs. The dMSCs were obtained from fragments of skin of healthy patients who had undergone facelift surgery. The cells were then cultured on BCMs in standard culture conditions. The experiments showed that dMSCs remained viable for 21 days on BCMs. Scanning electron and confocal microscope analyses revealed that dMSCs progressively adhered on BCMs, were able to proliferate, do not migrate to the interior of the matrices and maintained their typical morphology. In this condition, cells maintained the MSCs immunophenotypic characteristics as assessed by flow cytometry. These results show that the MCBs are biocompatible with the dMSCs. Therefore, the therapeutic potential of the dMSCs associated with BCMs was evaluated in vivo, in mice cutaneous lesions. The following parameters were evaluated: closing rate of lesions, inflammatory infiltration, neovascularization, thickness and homogeneity of the epidermis and length of scars. The results revealed that, when compared to the control group, the treated group (MSC+BCM) showed a significant increase in neovascularization and neutrophil infiltration. Besides, the treatment also influenced the thickness of granulation tissue, and allowed the formation of a thin and uniform epidermis. The lenght of scras int he treated gruoup were relatively smaller. Together, the results suggest that the MSC+BCM treatment is accelerating the maturation of skin lesions, and promoting the skin repair process.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-graduação em Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2012-10-21T17:57:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 213355.pdf: 3559834 bytes, checksum: ff75c76e18a293040def1120e0f6697e (MD5) / Foi realizado um estudo experimental, randomizado e prospectivo, com a finalidade de analisar histologicamente a integração da matriz de regeneração dérmica. Foram utilizados 30 ratos albinos, da linhagem Wistar-EPM1, com idade em torno de 180 dias e peso variando de 250 a 300 gramas, divididos aleatoriamente em 3 grupos. Em todos os ratos foi realizada a retirada de um quadrado profundo de pele na região dorsal, com tamanho em torno de 4 cm2. No Grupo Implante de Matriz Dérmica, cobriu-se a ferida com um enxerto de matriz de regeneração dérmica. No Grupo Enxerto Autólogo, utilizou-se um enxerto autólogo de pele, e no Grupo Cicatrização por Contração, aguardou-se a cicatrização espontânea. Biópsias foram realizadas com 7, 14 e 21 dias, e estudadas histologicamente em relação à resposta inflamatória, à regeneração da derme e ao desenvolvimento de fibrose. Os testes estatísticos com 21 dias (p<0,05), mostraram significância para a presença de neutrófilos, neoformação dérmica, formação de canais vasculares, deposição de colágeno e formação de fibrose. O grupo da matriz de regeneração dérmica mostrou os melhores resultados, com menor processo inflamatório, menor formação de fibrose, maior deposição de colágeno, maior neoformação dérmica e maior formação de canais vasculares. No estudo realizado, foi possível conhecer com detalhes as diferentes fases da integração da matriz de regeneração dérmica ao organismo, sendo que os resultados se assemelham aos da integração do enxerto autólogo de pele.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Botânica, Programa de Pós-Graduação em Botânica, 2017. / Texto parcialmente liberado pelo autor.Conteúdo liberado: Introdução geral,resumos e referências. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-05-22T20:41:00Z No. of bitstreams: 1 2017_RaphaelFerreiraAlmeida.pdf: 4925764 bytes, checksum: 3191eb7b6050ba8790cc9ecea687f852 (MD5) / Rejected by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br), reason: Boa tarde, Trata-se de uma publicação parcial. Por favor, seguir as normas da publicação. Atenciosamente, on 2017-06-06T21:17:21Z (GMT) / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-07-06T17:55:33Z No. of bitstreams: 1 2017_RaphaelFerreiraAlmeida_PARCIAL.pdf: 704720 bytes, checksum: 78fed5d092c3e4b2ba69f0d7e9591c9d (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-10-05T17:28:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_RaphaelFerreiraAlmeida_PARCIAL.pdf: 704720 bytes, checksum: 78fed5d092c3e4b2ba69f0d7e9591c9d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-05T17:28:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_RaphaelFerreiraAlmeida_PARCIAL.pdf: 704720 bytes, checksum: 78fed5d092c3e4b2ba69f0d7e9591c9d (MD5) Previous issue date: 2017-10-05 / O presente trabalho objetiou avaliar respostas de genitores Pisifera de dendezeiros (Elaeis guineensis Jacq.) quanto à capacidade de regeneração de plantas por embriogênese somática (ES), além de identificar proteínas envolvidas durante o processo de aquisição de competência embriogênica em híbridos Tenera contrastantes para a embriogênese somática. Num primeiro experimento, explantes foliares de quatro genótipos adultos de dendezeiro da variedade Pisifera (A251424, A251427, A251512 e A251513) foram submetidos à indução de ES utilizando-se o meio de indução (MI), composto pelos sais e vitaminas de Murashige e Skoog (MS), suplementado com 30 g.L-1 de sacarose, 0,5 g.L-1 de glutamina, 0,5 g.L-1 de caseína hidrolisada, 2,5 g.L-1 de carvão ativado, 450 µM de Picloram e gelificado com 2,5 g.L-1 de phytagel. O material permaneceu nesta condição por 360 dias, com subcultivos a cada 150 dias. Posteriormente, o material foi transferido para o meio de multiplicação de calos (MM), composto por 40 µM de Picloram, 10 µM de 2-isopenteniladenina (2iP) e 2,5 g.L-1 de phytagel, onde permaneceu por mais 90 dias. Em seguida, os calos foram colocados em meio de diferenciação (MD) formado por 12,3 µM de 2iP, 0,54 µM de ácido naftalenoacético (ANA) e de 2,5 g.L-1 de phytagel. Depois de diferenciados, os embriões somáticos foram transferidos para o meio de regeneração, desprovido de reguladores de crescimento e acrescido de 2,5 g.L-1 de phytagel e carvão ativado. Durante todo o processo, o material foi avaliado morfo e histoquimicamente para melhor caracterizar as etapas. Num segundo experimento, a proteômica diferencial de dois híbridos Tenera var. B351733 (responsivo à ES) e var. B352933 (não-responsivo à ES) foi avaliada durante o processo inicial (14 dias) e tardio (150 dias) da aquisição de competência embriogênica em dendezeiro, etapas caracterizadas pelo início de formação de calo primário e calo embriogênico, respectivamente. As proteínas extraídas foram quantificadas por Bradford e analisadas por eletroforese bidimensional (2-DE). Proteínas consideradas diferenciais pelo programa de análise de imagem Image Master Platinum foram identificadas por espectrometria de massa. A sequência foi obtida no banco NCBI por meio do GI (Gene Identifier) de cada proteína identificada nestes tempos. Com as sequências, adicionalmente foi realizada a anotação funcional destas proteínas nas plataformas AgBase e Revigo, sendo o gene onthology (GO) de cada proteína obtido. A partir dos dados também foram gerados gráficos dos processos biológicos em cada tempo. Verificou-se que o genótipo Pisifera A251424 foi o mais responsivo ao processo de ES quando comparado aos demais, com maior formação de calos ao longo do tempo (45%). Na etapa MM, calos com até 10,6 mg de massa fresca foram os que apresentaram maior incremento de biomassa em relação aos calos de maior peso inicial. Com 90 dias em meio MD, calos embriogênicos se diferenciaram em embriões somáticos e até 130 dias após, clusteres de embriões somáticos surgiram nesta condição. Nas análises morfo-anatômicas e histoquímicas, quatro tipos de calos foram observados na etapa MI, sendo o nodular amarelado, com maior adensamento de amido nesta etapa, o único a progredir até a formação de embriões somáticos. Na análise proteômica das variedades Tenera, 52 proteínas diferencialmente abundantes no tempo 14 dias foram reveladas, incluindo 17 proteínas aumentadas e 14 diminuídas no genótipo responsivo, em relação ao genótipo não-responsivo. Já aos 150 dias de indução, 74 proteínas reguladas foram detectadas, incluindo 19 aumentadas e 13 diminuídas no genótipo responsivo em relação ao não-responsivo. Um total de 40 proteínas exclusivas foram observadas no genótipo responsivo aos 150 dias de indução, enquanto que o genótipo não-responsivo apresentou somente duas. A anotação funcional evidenciou uma menor diversidade dos processos biológicos aos 14 dias para o genótipo responsivo, e aos 150 dias estes processos apresentaram maior diversidade, quando comparados ao não-responsivo. A análise 2-DE e ontologia gênica permitiram a identificação de dez proteínas importantes relacionadas com a aquisição de competência embriogênica, entre elas a isoenzima catalase 2 (spot 254), mono-dehidro-ascorbato-redutase isoforma cloroplástica X2 (spot 150), subunidade beta da pirofosfatofrutose-6-fosfato-1- fosfotransferase (spot 338). De modo geral, os resultados obtidos envolvendo a ES, morfoanatomia, histoquímica e a análise proteômica, aliada à bioinformática (anotação funcional), permitiram compreender melhor a propagação in vitro em dendezeiro, dando novos subsídios para pesquisas futuras rumo a um melhor entendimento sobre os processos de propagação clonal da espécie por embriogênese somática. / The objective of this work was to evaluate the responses of the Pisifera genus of oil palm (Elaeis guineensis Jacq.) regarding the acquisition of embryogenic competence and plant regeneration by somatic embryogenesis (SE) and to identify proteins involved in the process of acquisition of embryogenic competence in Tenera hybrids contrasting as to the embryogenic capacity. In a first experiment, leaf explants of four adult genotypes of oil palm of the Pisifera variety (A251424, A251427, A251512 and A251513) were used for SE induction using the induction medium (IM) composed of salts and vitamins of Murashige e Skoog (MS) and supplemented with 30 gL-1 of sucrose, 0.5 gL-1 of glutamine, 0.5 gL-1 of hydrolyzed casein, 2.5 gL-1 of activated charcoal, 450 μM of Picloram and solidified with 2.5 gL-1 of phytagel. The material remained in this condition for 360 days, being subcultured every 150 days. Subsequently, the material was transferred to calluses multiplication medium (MM) containing 40 μM of Picloram, 10 μM of 2-isopentenyladenine (2iP) and 2.5 gL -1 of phytagel, where it remained for 90 days. Then, calluses were transferred to differentiation medium (DM), composed of 12.3 μM 2iP, 0.54 μM of naphthaleneacetic acid (ANA) and 2.5 gL-1 of phytagel. After differentiation, the somatic embryos were transferred to regeneration medium, without growth regulators and supplemented with 2.5 g.L-1 of phytagel and activated charcoal. Throughout the process, the material was evaluated morphologically and histochemically to better characterize the steps. In a second experiment, differential proteomics of two hybrids of the Tenera variety, B351733 (responsive to SE) and B352933 (non-responsive to SE) were evaluated during the initial (14 days) and late (150 days) process of the acquisition of embryogenic competence in oil palm, steps characterized by the beginning of formation of primary and embryogenic callus, respectively. Proteins extracted were quantified by Bradford assay and analyzed by two-dimensional electrophoresis (2-DE). Differential proteins detected by the Image Master Platinum software were identified by mass spectrometry. The sequence was obtained from NCBI bank by means of the GI (Gene Identifier) of each protein identified at these times. With the sequences, it was performed the functional annotation of these proteins on the AgBase and Revigo platforms, and the gene onthology (GO) of each protein was obtained. The graphics for biological process ES were generated for both genotypes at each time. It was verified that the Pisifera genotype A251424 was the most responsive to the SE process when compared to the others, because it presented greater calluses formation over time (45%). In stage MM, calluses with lower initial weight (up to 10.6 mg) presented a greater increase of fresh biomass in relation to the calluses of greater initial weight. After 90 days on MD medium, embryogenic calluses differentiated into somatic embryos and after 130 days, clusters of somatic embryos appeared on this condition. In the morpho-anatomical and histochemical analyzes, four types of calluses were observed in stage MI, being nodular yellowish with greater starch deposition in this step and proceeded in the stages until formation of somatic embryos. At the proteomic analysis of the Tenera varieties, 52 differentially abundant proteins on time 14 days were revealed, including 17 proteins increased and 14 decreased in the responsive genotype with respect to the non-responsive genotype. Already at 150 days of induction, 74 regulated proteins were detected, including 19 increased and 13 decreased also in the responsive genotype with respect to non-responsive genotype. A total of 40 unique proteins were observed in the responsive genotype at 150 days of induction, while the non-responsive genotype showed only two. The 2-DE analysis and gene ontology allowed the identification of ten important proteins related to the acquisition of embryogenic competence, among them Catalase isozyme 2 (spot 254), Monodehydro ascorbate reductase chloroplastic isoform X2 (spot 150), Pyrophosphatefructose-6-phosphate-1-phosphotransferase subunit beta like (spot 338). In general, the results obtained involving SE, morphology, histochemistry and proteomic analysis, together with bioinformatics (functional annotation), allowed a better understanding of the in vitro propagation of oil palm, giving new subsidies for future research towards a better understanding about the processes of clonal propagation of the species by somatic embryogenesis.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:01Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-28Bitstream added on 2014-06-13T18:50:10Z : No. of bitstreams: 1 evaristo_tc_me_botfm.pdf: 1944919 bytes, checksum: f9a5a93860c79f6554bb319a05d333fe (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Injúrias traqueais são problemas na prática cirúrgica, pois apresentam dificuldades no tratamento. Atualmente, a engenharia tecidual (ET) é a única técnica para substituição traqueal que fornece promessa real. O uso de suportes naturais apresenta vantagens biológicas, mas faz-se necessário a descelularização desses materiais.Assim, o objetivo do presente trabalho é a descelularização de traquéias, com posterior aplicação das células epiteliais respiratórias (CERs) na face interna das traquéias descelularizadas; bem como, a diferenciação das células-tronco mesenquimais (CTMs) em condrócitos. O presente estudo foi efetuado com modelo em coelhos da raça Botucatu, pesando entre 3,0 e 4,0kg, provenientes do Biotério Central da Unesp. A utilização desses animais foi aprovada pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal. Foram realizados 54 diferentes protocolos de descelularização, que envolvem métodos físicos (congelamento, agitação, pressão mecânica-PM, irradiação eletromagnética não ionizante-LED 475nm e LED 630nm), associados com métodos químicos (Triton X-100, SDS e DS) e enzimáticos (DNase e RNase). Paralelamente, também foi realizado cultura celular das CTMs, com posterior diferenciação em condrócitos. A expansão ex vivo das CERs foi realizada por diferentes protocolos: fragmentos traqueais, lavado traqueal, raspado traqueal, punch dermatológico de 2mm e digestão por tripsina. As células obtidas foram aplicadas na face interna das traquéias descelularizadas. Com relação a PM, não se observa contribuição nos protocolos de descelularização. A irradiação com LED 475nm provoca remoção das células condrogênicas; já a irradiação com LED 630nm provoca aumento da proliferação celular. Sob o critério custo-benefício, a utilização dos processos enzimáticos não foi validada. Em relação aos detergentes, ocorre... / Tracheal injuries are a problem in surgical practice once they present difficulties in their treatment. Nowadays, tissue engineering (TE) is the only technique for tracheal replacement that provides real promise. There are biological benefits in using natural scaffolds, but the decellularization of such materials is necessary. Thus, the objective of this study is tracheal decellularization with subsequent application of respiratory epithelial cells (RECs) on the inner side of the decellularized cells, as well as the differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) into chondrocytes. This study was carried out with model in Botucatu rabbits weighing between 3.0 to 4.0kg from the Animal Colony at Unesp. The use of such animals was approved by the Ethics Committee of Animal Experiments. Fifty-four different decellularization protocols were used; they involved physical methods (freezing, agitation, mechanical pressure - MP, non-ionizing electromagnetic irradiation - LED 475nm and LED 630nm), associated with chemical methods (Triton X-100, SDS and DS) and enzymatic ones (DNase and RNase). At the same time, a cell culture of the MSCs was done as well, with subsequent differentiation into chondrocytes. The ex vivo expansion of RECs was performed with different protocols: tracheal fragments, tracheal wash, scraped trachea, 2mm dermatological punch, and trypsin digestion. The cells obtained were applied to the inner side of the decellularized tracheae. Regarding MP, no contribution to the decellularization protocols is observed. Irradiation with LED 475nm causes the removal of chondrogenic cells whereas the irradiation with LED 630nm increases cell proliferation. Under the cost-benefit criterion, the use of enzymatic processes was not validated. As for the detergents, there is more destruction of the extracellular matrix of the tracheae treated with SDS when compared to those treated with... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Rosemary Adriana Chiérici Marcantonio / Banca: Paulo Tambasco de Oliveira / Banca: Francisco Humberto Nociti Jr. / Banca: Valdir Gouveia Garcia / Banca: Joni augusto Cirelli / Resumo: Esse estudo teve como objetivo avaliar, em ratos, a influência da utilização do extrato de óleo insaponificável de abacate e soja (ASU) no reparo da periodontite induzida por ligaduras, na osseointegração de implantes e na integração de biomateriais osteocondutores. Para isso foram avaliadas as hipóteses de que o ASU poderia: 1)Aumentar o reparo da periodontite induzida; 2)Favorecer o reparo associado ao tratamento da periodontite induzida; 3)Acelerar a osseointegração; 4)Influenciar na integração de enxertos osteocondutores. Para a avaliação da primeira hipótese foram utilizados 84 ratos que foram submetidos a indução da periodontite por meio de ligaduras e que foram randomicamente divididos em 4 grupos: CTR: Administração do soro fisiológico(SS) no mesmo dia da indução da periodontite; ASU/-7: Administração de ASU iniciada 7 dias antes da indução de periodontite(0.6 mg/kg); ASU/0: Administração de ASU iniciada no dia da indução da periodontite; ASU/+7: Administração do ASU iniciada no dia da remoção da ligadura. As ligaduras, que foram inseridas bilateralmente nos segundos molares superiores, foram removidas após 7 dias e os medicamentos foram administrados diariamente por gavagem até o sacrifício dos animais (7, 15 e 30 dias). Foram realizadas análise microtomográfica (%volume ósseo), histomorfométricas (% osso na região da furca, distancias da junção cemento-esmalte(JCE) ao topo da crista óssea(CO) e a porção apical do epitélio juncional (aJE), imunohistoquímica (TRAP, RANKL e Fosfatase Alcalina) e de qPCR (IL1β, IL6, TNFα, RANKL e Fosfatase Alcalina). Para avaliação da segunda hipótese foram utilizados 84 ratos que foram submetidos a indução da periodontite por meio de ligaduras e que foram randomicamente divididos em 4 grupos: SRP-Administração de SS no dia do tratamento; SRP/ASU-7: Administração do ASU iniciada 7 dias antes da indução da periodontite(0.6 mg/kg); SRP/ASU0... / Abstract: The aim of this study was to evaluate in rats the effect of the avocado soybean unsaponifiables (ASU) on the bone repair in induced periodontitis, on the osseointegration of dental implants, and on the repair of the critical sized calvaria defects filled or no with biomaterials. For this purpose, the following hypothesis regarding the use of ASU were tested: 1)Improve the periodontal repair in induced periodontitis; 2)Improve the periodontal repair after the treatment of the induced periodontitis; 3) Accelerate osseointegration; 4) Improve the integration of osteoconductors bone grafts in the critical size calvaria defects. For the evaluation of the first hypothesis, eighty-four animals were randomly assigned into four equally-sized groups, receiving daily by gavage either sterile saline (CTR) or ASU (0.6 mg/kg), starting either 7 days prior to- (ASU/-7), or on the day- (ASU/0), or 7 days after (ASU/+7) periodontitis induction. Periodontitis was induced by placing silk ligatures into the gingival sulcus of the second maxillary molars for 7 days; thereafter the ligatures were removed. Seven animals from each group were euthanized at 7, 15 or 30 days after ligature removal. Bone resorption was evaluated by histomorphometry and micro CT. Immunohistochemistry was used to evaluate TRAP, RANKL, Alkaline phosphatase and qPCR to evaluate IL-1β, TNF-α, IL-6, RANKL, Alkaline phosphatase (AP). For the evaluation of the second hypothesis, periodontitis was induced in 84 rats via ligature placement around the second upper molar, which was removed after 7 days, and scaling was performed at this time. Subsequently, the rats were randomly allocated to four groups with 21 animals each: One in which saline solution (SS) was administered (SRP) and three in which ASU was administered (0.6 g/kg/day), beginning either 7 days before the induction of periodontitis (SRP/ASU-7), on the day of periodontitis induction (SRP/ASU0), or on the day of treatment... / Doutor

Orientador: Maria José Hitomi Nagata / Banca: Álvaro Francisco Bosco / Banca: Ana Lúcia Pompéia Fraga de Almeida / Banca: Wilson Roberto Poi / Resumo: O propósito deste estudo foi avaliar, histologicamente e histometricamente, a cicatrização de defeitos de fenestração periodontal criados cirurgicamente em ratos e tratados com ABM/P-15 "flow". Defeitos de fenestração periodontal (4 x 3 x 1 mm) foram realizados na mandíbula de 60 ratos, divididos em dois grupos: C (Controle) - defeito preenchido apenas com coágulo sangüíneo; T (tratado) - defeito preenchido com ABM/P-15 "flow". Cada grupo foi dividido em 3 subgrupos (n=10), para eutanásia aos 10, 30 e 60 dias pós-operatórios. Medidas lineares e de área da cicatrização periodontal foram avaliadas e calculadas como uma porcentagem do defeito original. Os dados foram submetidos à análise estatística (Análise de variância, Tukey, p < 0,05). Os grupos C e T, em todos os períodos analisados, apresentaram quantidade de novo osso e densidade óssea similares. No Grupo C, não foi observada formação de cemento nos espécimes de 10, 30 e 60 dias, enquanto no Grupo T, novo cemento foi somente observado na maioria dos espécimes de 60 dias. Dentro dos limites deste estudo, pode-se concluir que o ABM/P-15 "flow" propiciou formação de cemento em defeitos de fenestração periodontal em ratos aos 60 dias pós-operatórios. A formação de novo tecido ósseo foi similar nos defeitos tratados com ABM/P-15 "flow" e nos defeitos controle. / Abstract: This study histologically analyzed the healing of periodontal fenestration defects surgically created in rats and treated with ABM/P-15 "flow". A periodontal fenestration defect (4 x 3 x 1 mm) was made on the right side of the mandible of 60 rats. They were divided into 2 groups: C (control) - defect filled with blood clot only; and T - defect filled with ABM/P-15 "flow". These groups were divided into subgroups and euthanized at 10, 30 or 60 days postoperative. Linear and area measurements of periodontal healing were evaluated and calculated as a percentage of the original defect. Data were statistically analyzed (analysis of variance, Tukey, p < 0.05). In all periods of evaluation, Groups C and T presented similar amounts of bone formation and bone density. New cementum formation was not observed in any specimen of Group C at 10, 30 and 60 days post-operative. In Group T, new cementum was observed in most 60-days specimens only. Within the limits of this study, it can be concluded that ABM/P-15 "flow" promoted cementum formation in periodontal fenestration defects in rats at 60 days post-operative. Similar bone formation was observed in the defects treated with ABM/P-15 "flow" and in the control defects. / Mestre