Submitted by Amauri Alves (amauri.alves@ufv.br) on 2015-10-16T15:05:51Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 939004 bytes, checksum: 91690f8ed614b34a151ed34ced32bb7e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-16T15:05:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 939004 bytes, checksum: 91690f8ed614b34a151ed34ced32bb7e (MD5) Previous issue date: 2011-03-29 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / O presente trabalho teve por objetivo estudar as respostas fisiológicas e morfológicas de células de Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20 aos estresses ácido e por sais biliares, alem de identificar e realizar análises filogenética e de expressão de genes possivelmente relacionados a esses estresses. Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20 não cresce em caldo MRS pH 3,5 entretanto, células mantidas neste meio por quatro horas toleram o estresse ácido, como demonstrado por curvas de sobrevivência. A maior tolerância da bactéria aos sais biliares mistos e a menor ao ácido glicodeoxicólico são características de L. delbrueckii UFV H2b20 submetida a estes estresses, em estudo in vitro. A análise da morfologia das células por Microscopia de Força Atômica (MFA) mostrou que os estresses ácido e por sais biliares provocaram alterações na morfologia da célula - a superficie da parede se apresentou rugosa com acentuada redução na dimensão correspondente à altura, em todas as condições de estresse testadas. Em conjunto, os resultados demonstram caracteristicas de respostas fisiológicas de L. delbrueckii UFV H2b20 aos estresses ácido e por sais biliares desejáveis e necessárias em bactéria probiótica, ou seja, resistir e sobreviver em condições similares às prevalecentes no trato gastrointestinal (TGI) de humanos. Os genes clpP, clpE, clpL e cle de L. delbrueckii UFV H2b20, cujos produtos pertencem ao complexo proteolítico Clp apresentaram alta identidade de sequência, variando de 96 a 97 % com as de Lactobacillus delbreuckii subsp. bulgaricus ATCC 11842. As árvores filogenéticas reconstruídas por Inferência Bayesiana mostraram os genes clpP, clpL e clpE agrupados com os de L. delbreuckii subsp. bulgaricus ATCC 11842. As exposições das células aos meios MRS pH 3,5, MRS contendo O,l % de sais biliares mistos e a MRS contendo O,l % de ácido glicodeoxicólico por 30 e 60 minutos aumentaram a expressão dos quatro genes, enquanto a exposição a ácido taurodeoxicólico aumentou apenas a do gene clpL. Considerando o envolvimento dos genes clpP, clpL, clpE e cle nas respostas aos estresses ácido e por sais biliares infere-se que a atividade do complexo proteolítico Clp pode representar mecanismo de reparo e/ou degradação de proteínas danificadas pelas condições de estresse analisadas neste estudo. Os genes codificadores de ornitina descarboxilase e de permease de aminoácido identificados em L. delbrueckii UFV H2b20 agruparam na reconstrução filogenética com os de L. delbreuckii subsp. bulgaricus ATCC 11842, sendo de 96 a 98 % a identidade das sequências. O aumento da expressão do gene que codifica a ornitina descarboxilase após a exposição das células por 30 e 60 minutos em MRS pH 3,5, meio rico, mostra o envolvimento deste gene na resposta ao estresse ácidoem L. delbrueckii UFV H2b20 e evidencia que a proteína codificada por esse gene é a envolvida na regulação do pH intracelular. Sugere- se a descarboxilação de aminoácidos como mecanismo de adaptação à condição de acidez do meio. Com o estudo da expressão dos genes spx, dps e pax, todos envolvidos no estresse oxidativo em L. delbrueckii H2b20, caracterizou-se base molecular envolvida no fenômeno de proteção cruzada in vitro ao constatar-se a sobreposição e a inespecificidade de genes aos estresses investigados. Particularmente, o aumento da expressão do gene dps após exposição das células aos meios MRS pH 3,5 e MRS contendo 0,1 % de ácido glicodeoxicólico foi interpretado como mecanismo de proteção do DNA a acidez interna das células. No presente estudo, bases fisiológicas e moleculares que possibilitam a probiose por L. delbrueckii UFV H2b20 ficam esclarecidas no que tange à existência de mecanismos para sobrevivência e persistência em condições presentes no TGI de humanos. / The objective of this work was to study the physiological and morphological responses of Lactobacillus delbrueckiz' UFV H2b20 to acid and bile salts stress and to identify and accomplish phylogenetic and expression analysis of genes related to these stress. Lactobacz'llus delbrueckiz' UFV H2b20 does not grown MRS broth pH 3.5, however, cells treated in this medium for four hours tolerate acid stress, as demonstrated bysurvivalcurves. This bacterium is more tolerant to mixed bile salts and less tolerant to glycodeoxycolic. Analysis of cell morphology by atomic force microscopy (AFM) showed that acid stress and bile salts caused changes in cell morphology - the wall surface became rough and reducted in height, in all stress conditions tested. The results demonstrate that L. delbrueckz'z' UFV H2b20 may resist similar conditions prevailing in the gastrointestinal tract of humans. The genes clpP, clpE, clpL and cle of L. delbrueckz'z' UFV H2b20, whose products belong to the Clpproteolytic complex showed high sequence identity, ranging from 96 to 97% with those of Lactobacillus delbreuckiz' subsp.bulgaricus ATCC 11842. Phylogenetic treesreconstructedbyBayesian inferenceshowedthegenes clpP, clpE and clpL grouped with the genes of L.delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC 11842. The expression increase of the clpP, clpE, clpL and clegenesin L. delbrueckz'z' UFV H2b20 in response to acid and bile salts stress was observed after 30 and 60 minutes. The exposure of cells to MRS pH 3,5, MRS containing 0,1 % mixed mixed bile salts and MRS containing 0,1 % glycodeoxycolic acid for 30 and 60 minutes increased the expression of four genes, while exposure to taurodexycolic acid increased the expression of clpL alone. The involvement of clpP, clpE, clpL and cle in the responses to acid stress and bile salts showed that the activity of the Clp proteolytic complex may represent the mechanism of repair and/or degradation of proteins damaged by the stress conditions analyzed in this study. The genes encoding ornithine decarboxylase and amino acid permease identified in L. delbrueckz'z' UFV H2b20 grouped in phylogenetic reconstruction with those of L. delbreuckiz' subsp. bulgarz'cus ATCC 11842, with 96 to 98% identity of sequences. The expression of the gene encoding omithine decarboxylase increased after exposing the cells for 30 and 60 minutes in MRS pH 3.5, a rich medium, an evidence of the involvement of this gene in acid stress response in L. delbrueckiz' UFV H2b20 and also that the protein encoded by this gene is involved in the regulation of intracellular pH. It is suggested that the decarboxylation of amino acids as a mechanism for adaptation to acid stress. The molecular basis of the cross protection phenomenon was characterized by the expression of pr, dps and pox, all involved in oxidative stress response. There are overlaps and inespecifity in the expression of those genes to stress investigated. The increased in dps expression following exposure to pH 3.5 to 0,1 % glycodexycolic acid was interpreted as a DNA protective mechanism to low internal cell acidity. In this study, physiological and molecular basis that enable probiose in L. delbrueckz'z' UFV H2b20 are clarified with regard to the existence of mechanisms for survival and persistence under conditions present in the human gut.

Submitted by Rafael Santana (rafael.silvasantana@ufpe.br) on 2018-02-02T18:09:21Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) João Pacifico Bezerra Neto - PPGCB - Doutorado 2016.pdf: 6726842 bytes, checksum: e961cc72371215fdb0cc36db04b0fa89 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-02T18:09:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) João Pacifico Bezerra Neto - PPGCB - Doutorado 2016.pdf: 6726842 bytes, checksum: e961cc72371215fdb0cc36db04b0fa89 (MD5) Previous issue date: 2016-02-12 / FACEPE / As plantas evoluíram para sobreviver em ambientes onde muitas vezes são impostas condições adversas, tais como estresses abióticos (temperatura, luz, seca, salinidade, frio), ou bióticos (vírus, bactérias, fungos e nematoides). Para sua sobrevivência, desenvolveram inúmeros mecanismos que permitem a detecção de mudanças ambientais, bem como a indução de respostas específicas às condições estressantes impostas, minimizando as perdas. Existem genes-chave nos mecanismos de adaptação, especialmente os relacionados à desintoxicação, à homeostase e à reprogramação dos padrões de expressão gênica, envolvendo mudanças em nível fisiológico. A identificação de genes-candidatos promissores para o melhoramento de espécies cultivadas com relação aos principais estresses ainda está aquém das necessidades. Assim, a identificação e caracterização de genes relacionados com a resposta vegetal a estresses foi realizada para as culturas da soja e do feijão-caupi, em seus respectivos transcriptomas, por métodos computacionais. Quando estão sob estresse, as plantas podem ativar respostas celulares, incluindo a produção de proteínas antioxidantes, com o intuito de minimizar os danos e evitar a ação tóxica de ROS (Espécies Reativas de Oxigênio) nas células vegetais. Neste contexto, foram identificados 1.273 transcritos em feijão-caupi e 451 transcritos em soja, distribuídos em 15 categorias de genes ROS que desempenham papéis importantes no estresse oxidativo. Estes genes compõem um grupo de enzimas antioxidantes que trabalham em conjunto para manter um nível de estado estacionário intracelular, promovendo o crescimento da planta, desenvolvimento, ciclo celular, a sinalização hormonal, reforçando respostas aos estressores ambientais abióticos e bióticos, semelhante ao observado em outras espécies de plantas. Além das ROS fatores de transcrição (FTs) representam um papel crucial, como os principais reguladores da tolerância vegetal ao estresse. Nesse contexto, foi realizada uma identificação das famílias de FTs, presentes no transcriptoma de duas variedades contrastantes de feijão-caupi (sensível e tolerante a seca). Foram identificados 4.822 transcritos, classificados em 64 famílias, com expressão diferencial nos diferentes tempos de exposição ao estresse e cultivares, exibindo indução da expressão em condições de estresse. As interações entre as famílias gênicas reguladoras e os genes regulados permitiram a criação de modelos computacionais para a compreensão da arquitetura e funcionamento da rede de regulação gênica vegetal frente ao estresse, permitindo a identificação eficiente de candidatos para o melhoramento vegetal e fins biotecnológicos. / Plants evolved to survive in environments that often impose adverse conditions, such as abiotic (temperature, light, drought, salinity, cold) and biotic stresses (viruses, bacteria, fungi and nematodes). For survival, they developed several mechanisms that enable the detection of environmental changes, as well as induction of specific responses to the imposed stress conditions, minimizing losses. There are key genes associated to adaptation mechanisms; especially those related to detoxification, homeostasis and gene expression patterns reprogramming, involving changes at physiological level. The identification of promising candidate genes for cultivated species improvement related to main stresses is still far from the necessities. Thus, the identification and characterization of genes related to plant response to stress was carried out for soybean and cowpea in their transcriptome by computational methods. When under stress, plants can activate cellular responses, including production of antioxidant proteins, in order to minimize damage and avoid toxic action of ROS (Reactive Oxygen Species) in plant cells. In this context, 1,273 transcripts were identified in cowpea and 451 transcripts in soybean, distributed into 15 ROS gene categories that play important roles in oxidative stress. These genes form a group of antioxidant enzymes that work in concert to maintain a steady intracellular level state, promoting plant growth, development, cell cycle, and hormonal signaling, reinforcing responses to biotic and abiotic environmental stressors, like observed in other plant species. Apart from ROS, transcription factors (TFs) play a crucial role as the primary regulators of plant stress tolerance. In this context, the identification of TF families was conducted for transcriptome data for two contrasting cowpea varieties (sensitive and tolerant to drought). 4,822 transcripts were identified, being classified into 64 families, differentially expressed in different times of exposure to stress and cultivars, exhibiting induction of expression under stress conditions. The interactions between regulatory gene families and regulated genes allowed the creation of computational models for understanding the architecture and operation of the plant against stress gene regulation network, allowing efficient identification of candidates for plant breeding and biotechnological purposes.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-08-07T14:48:12Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1802736 bytes, checksum: e5db15c40e2dab33fc52de0674a58641 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-07T14:48:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1802736 bytes, checksum: e5db15c40e2dab33fc52de0674a58641 (MD5) Previous issue date: 2018-02-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Leishmaniose é o nome dado as enfermidades causadas por protozoários do gênero Leishmania que são capazes de gerar diversos quadros de doenças em seres humanos, dependendo da espécie envolvida na infecção podem ocorrer desde lesões cutâneas localizadas a lesões disseminadas e infecção visceral. No Brasil a leishmaniose visceral (LV) é causada principalmente por Leishmania infantum chagasi (syn Leishmania infantum). A LV tem os cães e o homem como principais espécies afetadas, é uma doença endêmica ocorrendo principalmente em regiões rurais, mas que vem apresentando tendência a urbanização. Segundo o ministério da saúde entre 1990 e 2016 foram relatados mais de 75000 casos desta doença no Brasil. As ecto-nucleotidases da família E-NTPDase são enzimas capazes de hidrolisar nucleotideos di e/ou trifostato e atuam em diversos processos relacionados a infeciosidade deste parasito, além de terem potencial para uso em diagnóstico de LV em cães. Duas isoformas são conhecidas em L. infantum chagasi, uma maior denominada LicNTPDase1 (~70kDa) e uma menor denominada LicNTPDase2 (~40kDa). Até o momento somente as NTPDases recombinates de L. infantum chagasi foram estudadas. Nosso objetivo foi estudar as enzimas nativas do parasito. Nesse trabalho foram realizadas diferentes abordagens: tentativas de purificar ambas enzimas nativas de promastigotas, avaliação da expressão do mRNA relativos às enzimas em diferentes fases evolutivas do parasito, clonagem e expressão solúvel da região que codifica para o ectodomínio da LicNTPDase2. Constatamos a secreção de uma NTPDase com aproximadamente 70 kDa por formas promastigotas. Análises por RT-qPCR mostraram que a LicNTPDase1 é mais expressa em promastigota de fase logarítmica de crescimento e em condições acidófilas, enquanto a LicNTPDase2 possui maior expressão em amastigota que é uma das formas infecciosas do parasito. Estes dados podem reforçar a participação destas enzimas no desenvolvimento e infecciosidade do parasito. Foi possível expressar a LicNTPDase2 em sua forma solúvel, o que nos ajudará em futuros estudos estruturais, enzimáticos e na produção de anticorpos estruturais contra esta proteína. / Leishmaniasis is the name given to diseases caused by protozoans of the genus Leishmania that are capable of generating several disease states in humans, depending on the Leishmania species involved in the infection, can occur from localized skin lesions to disseminated lesions and visceral infection. In Brazil the visceral leishmaniasis (VL) is caused by the species Leishmania infantum chagasi and its transmission occurs by the bite of females of the insect Lutzomya longipalpis. VL has dogs and man as main species affected, is an endemic disease occurring mainly in rural regions, but that has been showing a strong tendency to urbanization. According to the Health Ministry between 1990 and 201, more than 75,000 cases of this disease have been reported in Brazil. The Ecto-nucleotidases from the E-NTPDase family are enzymes capable of hydrolyzing di- and / or triphosphate nucleotides and act in several processes related to the infectivity of this parasite, besides being potential for use in the diagnosis of VL in dogs. Two isoforms of these enzymes are known in L. infantum chagasi, LicNTPDase1 (~70kDa) and LicNTPDase2 (~ 40kDa). Until now only the recombinants NTPDases of L. infantum chagasi were studied. Thus, our aim was to work with the native enzymes of the parasite. In this work, different approaches were carried out: attempts to purify both native promastigote enzymes, evaluation of the mRNA expression related to the enzymes in different evolutionary stages of the parasite, cloning and soluble expression of the region encoding the ectodomain of LicNTPDase2. Futhermore, we observed the secretion of an NTPDase with approximately 70kDa by promastigote forms. Analyzes by RT-qPCR showed that the LicNTPDase1 is more expressed in log-phase growth promastigotes and in acidophilic conditions, while the LicNTPDase2 has greater expression in amastigote that is one of the infectious forms of the parasite. These datacan reinforce the participation of these enzymes in parasite development and infectivity. Moreover, it was possible to express the LicNTPDase2 in its soluble form, which will help us in future structural, enzymatic studies and in the production of structural antibodies against this protein.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-07-31T15:51:32Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Diego S. Moreira.pdf: 1728287 bytes, checksum: ecbc52e7d1d381ff5278e92b6e8031b2 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-08-01T13:14:15Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Diego S. Moreira.pdf: 1728287 bytes, checksum: ecbc52e7d1d381ff5278e92b6e8031b2 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-08-01T13:14:32Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Diego S. Moreira.pdf: 1728287 bytes, checksum: ecbc52e7d1d381ff5278e92b6e8031b2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-01T13:14:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Diego S. Moreira.pdf: 1728287 bytes, checksum: ecbc52e7d1d381ff5278e92b6e8031b2 (MD5) Previous issue date: 2016-02-22 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / The interest in genetic manipulation tools increase production of heterologous proteins for biotechnological purposes, especially therapeutic proteins, industrial enzymes and significantly increased worldwide. For the production of heterologous proteins choice of expression vector & host system is essential. For the construction of a library of adjustable and promoters functional in E. coli, two-deoxy oligonucleotides degenerate regions were produced by random chemical synthesis of DNA. To obtain the double-stranded promoters, Lac operator sequences were looped and submitted by treatment with Klenow enzyme. For cloning and analysis of the functionality of the novel promoters, the edges of the double-stranded deoxy-oligonucleotide and vector were digested with Bam HI and Hind III and following were purified. Synthetic promoters were then linked to the promoter vector pKK232-8 hunting so stay in proper position for expressing the CAT reporter gene. The recombinant plasmids were then introduced into E. coli DH5α F'Iq and transformants cells were obtained and classified according to the size of the colony on Petri plates containing different concentrations of chloramphenicol in the presence and absence of the inducer IPTG. After analysis of the colonies were chosen 42 recombinant clones, their DNA extracted plamidiais and the sequences of the promoters completely certain. 6 The following recombinant plasmids were reintroduced into E. coli DH5α F'Iq and clones selected on chloramphenicol, with or without IPTG. Of these six clones, 4 were selected to examine the growth in liquid medium with chloramphenicol in the presence and absence of the inducer IPTG. All recombinant clones in E. coli demonstrated ability to grow in liquid medium, 3 of them grew better with IPTG, indicating that their promoters are regulated. The other clone did not have their growth affected by the inductor, confirmed by deficiency following the Lac operator. The results show that the methodology used to generate and clone novel promoters running and new promoters have the potential of being used for the development of new, powerful and regulated expression vectors. / O interesse por ferramentas de manipulação genética que aumentem a produção de proteínas heterólogas para fins biotecnológicos, especialmente proteínas terapêuticas e enzimas industriais, aumentou significativamente em nível mundial. Para a produção de proteínas heterólogas a escolha do sistema hospedeiro & vetor de expressão é fundamental. Para a construção de uma biblioteca de promotores reguláveis e funcionais em E. coli, dois desoxi-oligonucleotídeos com regiões degeneradas foram produzidos por meio de síntese química randômica de DNA. Para a obtenção dos promotores dupla-fita, as sequências do operador Lac foram aneladas e submetidas por tratamento com a enzima Klenow. Para a clonagem e análise da funcionalidade dos novos promotores, as bordas dos desoxi-oligonucleotídeos dupla-fita e do vetor foram digeridas com BamHI e HindIII e após foram purificados. Os promotores sintéticos foram a seguir ligados ao vetor caça-promotores pKK232-8 de forma que ficassem em posição adequada para expressar o gene repórter CAT. Os plasmídeos recombinantes foram então introduzidos em E. coli DH5α F’Iq e as células transformantes foram obtidas e classificadas de acordo com o tamanho da colônia em placas de Petri contendo diferentes concentrações de cloranfenicol na presença e ausência do indutor IPTG. Após as análises das colônias foram escolhidos 42 clones recombinantes, seus DNAs plamidiais extraídos e as sequências dos seus promotores determinadas completamente. A seguir 6 plasmídeos recombinantes foram reintroduzidos em E. coli DH5α F’Iq e os clones selecionados em cloranfenicol, com ou sem IPTG. Destes 6 clones, 4 foram escolhidos para analisar o crescimento em meio líquido com cloranfenicol na presença e ausência do indutor IPTG. Todos os clones recombinantes em E. coli demonstraram capacidade de crescer em meio líquido, sendo que 3 deles cresceram melhor com IPTG indicando que seus promotores estão sendo regulados. O outro clone não teve seu crescimento afetado pelo indutor, confirmado pela deficiência da sequência do operador Lac. Os resultados mostram que a metodologia utilizada para gerar e clonar novos promotores funciona e que os novos promotores têm potencialidade de serem utilizados para o desenvolvimento de novos, potentes e regulados vetores de expressão.

Entre as modificações sofridas pelo transcrito primário de RNA de eucariontes, o splicing é responsável pela colocação lado a lado das sequências expressas alinhando a região codificadora no RNAm. Este mecanismo, descrito na década de 1970, como o responsável pela remoção dos íntrons e junção dos éxons consecutivos, é efetuado por um complexo ribonucleoprotéico conhecido como spliceossomo. O reconhecimento por este complexo dos segmentos definidos como éxons e íntrons depende de diversas sequências presentes no RNA e reconhecidas por ligantes protéicos. A modulação desta interação resulta na geração de diferentes transcritos maduros a partir de um mesmo gene, evento conhecido como splicing alternativo, comum a maioria dos genes humanos e um dos grandes responsáveis pela geração de variabilidade proteômica dos eucariotos e sua complexidade morfo-fisiológica. O splicing alternativo é um importante gerador de diversidade funcional no sistema nervoso central, onde participa da geração de variantes para mais de 80% dos genes. Entre estes está o gene do Retardo Mental do X Frágil (FMR1), cujo transcrito primário pode sofrer splicing alternativo de quatro éxons, produzindo até vinte isoformas diferentes da FMRP. Os objetivos gerais deste projeto foram (i) a análise da expressão do éxon 12 do Fmr1 em córtex cerebral frontal, hipocampo e cerebelo de ratos em E19 e P2; e (ii) a busca por elementos em cis reguladores do splicing do éxon 12 do Fmr1 de rato. Para averiguar os níveis da expressão do éxon 12 do Fmr1, no final do período embrionário e início do pós-natal de rato, foi realizada RT-PCR em tempo real com os tecidos citados acima, em E19 e P2. Observamos significativa inclusão do éxon 12 nos transcritos do Fmr1 no córtex frontal em P2 quando comparado a E19, o que não se relacionou ao aumento geral da expressão do Fmr1. No hipocampo, houve aumento da expressão do conjunto de mensagens do Fmr1 e tendência à exclusão do éxon 12 em P2, quando comparado a E19. Estes dados revelam o córtex cerebral como fonte de proteínas ativadoras do splicing do éxon 12 do Fmr1 e onde se deve buscar pela relevância funcional das isoformas da FMRP expressando este éxon. A busca por elementos reguladores do splicing do éxon 12 se baseiou na avaliação da expressão por RT-PCR de mini-gene de segmento genômico do gene Fmr1 usado para transfectar células C6 (glioma de rato). Estas células demonstraram inclusão preferencial do éxon 12 em seus transcritos superexpressos. Um segundo clone foi gerado com uma deleção a partir do clone original, na região 5 do íntron 12, na qual observamos in silico, elementos ricos em U e C, candidatos a acentuadores da inclusão do éxon 12. A superexpressão deste clone em C6 revelou exclusão preferencial do éxon 12, um padrão invertido em relação ao anteriormente observado. Estes dados indicam o elemento rico em U e C como um forte candidato a acentuar a inclusão do éxon 12 no RNAm do Fmr1. / Splicing is an important hnRNA processing mechanism in eukaryotes, aligning exons in the mRNA. First described in the 1970s, it is performed by a molecular complex named spliceosome, which recognizes RNA sequences in the boundaries between exons and introns. Interaction modulation in the spliceosome results in mature transcripts with varying sizes, a process known as alternative splicing, common to most human genes and the major mechanism leading to proteomic diversity and morphological and functional complexity in eukaryotes. Alternative splicing is very important in generating functional diversity in the central nervous system (CNS), where it takes part in more than 80% of primary transcript processing. Among these is the Fragile Mental Retardation 1 gene (FMR1), which undergoes alternative splicing of four exons creating the possibility of 20 non-redundant FMRP isoforms. The aims of this project were (i) to analyze the expression of rat Fmr1 exon 12 in frontal cerebral cortex, hippocampus, and cerebellum at E19 and P2 days; and (ii) to search for cis-acting elements regulating exon 12 splicing. We performed real-time RT-PCR to examine Fmr1 exon 12 expression, in the above-mentioned CNS structures, between the end of embryonic period and the second postnatal day. We observed significant inclusion of exon 12 in Fmr1 mRNA in frontal cortex at P2 as compared to E19, which was unrelated to general Fmr1 expression increase. At P2 hippocampus there was a significant increase at the expression levels of Fmr1, and a trend to exclude exon 12 from the primary transcript. This data indicates that cerebral cortex is an important source of proteins activating exon 12 splicing, and also a tissue where the functional relevance of FMRP isoforms expressing exon 12 should be regarded. We adopted the mini-gene approach to search for cis elements regulating Fmr1 exon 12 splicing. RTPCR was performed to evaluate C6 (rat glioma) cells overexpressing a clone containing a genomic Fmr1 segment. Transfected cells revealed preferential inclusion of Fmr1 exon 12. A deletion construct lacking the initial bases of intron 12 was generated. The deleted segment harbor U- and C-rich sequences that had been identified in silico in a search for intronic splicing enhancers. Overexpression of the deletion construct in C6 yielded to preferential exclusion of exon 12, as opposed to the expression pattern previously observed in the original clone. Therefore, the U- and C-rich elements at Fmr1 intron 12 are strong candidates to enhance Fmr1 exon 12 splicing.

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T04:26:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kobarg_ClaudiaBandeira_D.pdf: 12392053 bytes, checksum: 66c2ce6a08c2f6b19b841868e0e5815d (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: As proteínas da família MEF2 são fatores de transcrição do tipo MADS-box que desempenham papéis importantes na regulação da miogênese e da morfogênse do miocárdio. Trabalhos desenvolvidos no nosso laboratório anteriormente, demonstraram que a rápida ativação de MEF2 por estímulo hipertrófico exerce um papel principal na ativação de c-jun, sugerindo sua importância na regulação da expressão de genes de resposta imediata por estímulo hipertrófico. o presente trabalho teve como objetivo estudar a expressão e regulação dos fatores MEF2 frente à sobrecarga mecânica. Foi demonstrado que os fatores MEF2 são ativados em resposta à sobrecarga mecânica em coração de rato. Essa ativação não ocorreu por um aumento na expressão de MEF2, mas provavelmente, por alguma modificação póstranscricional na proteína, aumentando assim a afinidade ao seu DNA consenso em ensaio de EMSA o método de duplo-híbrido em levedura foi utilizado para encontrar proteínas que interajam com MEF2 e atuem na sua regulação em resposta ao estímulo mecânico. Numa triagem de biblioteca de coração de rato previamente submetido à coarctação da aorta com uma "isca" de MEF2C, foram encontrados 4 c1ones de cDNA contendo a região C-terminal de miosina de cadeia pesada e 4 c1onescontendo a região Nterminal da proteína regulatória Ki-1I57. A interação entre MEF2C e miosina foi confirmada por imunoprecipitação em coração de rato e a interação entre MEF2C e Ki-1I57 foi confirmada por imunoprecipitação, ensaio de co-precipitação e análise microscópica de imunolocalização. A interação entre MEF2 e Ki-1I57 é dependente de estímulo mecânico no coração. Um ensaio de imunoprecipitação com anticorpo anti-MEF2 demonstrou uma associação basal entre essas duas proteínas no ventrículo esquerdo de ratos controle. No entanto, o estímulo mecânico causou uma redução significativa nesta associação. Ki-l/57 se apresentou co-Iocalizado com MEF2 no núcleo de miócitos de ratos controle. Porém, ao submeter ratos a coarctação da aorta, essa co-Iocalização não foi mais observada no núcleo dos miócitos. Ki-1I57 também exerce um efeito inibitório sobre a ligação de MEF2 a sua região consenso de DNA em ensaio de EMSA Esses resultados sugerem que a interação de Ki-l/57 com :MEF2é inibitória e que esteja envolvida com a regulação de MEF2 em resposta ao estímulo mecânico no coração / Abstract: The MEF2 proteins family is composed of MADS box transcription factors that plays important roles in the regulation of myogenesis and morphogenesis of myocardium. Previous work developed in our laboratory showed that the early activation of MEF2 proteins by mechanical overload plays a main role in the actívation of c-jun, suggestíng its importance in the regulation of irnmediate early genes response to mechanical overload The present work objective was to study the expression and regulatíon of MEF2 factors in face of mechanical overload. 1t was demonstrated that the MEF2 factors are activated in response to mechanical overload in rat heart This activation did not occur by an increase in MEF2 expression, but probably by some kind of post-transcriptíonal modification in the protein, raising the affinity ofMEF2 to its DNA in EMSA experiments. The yeast two-hybrid system was used to find proteins that interact with MEF2 and act in its regulation in response to mechanical overload In a rat heart library screening witb MEF2C as bait, four cDNA c1ones encoding a C-terminal region of Myosin Heavy Chain were isolated, as well as four c1ones encoding the N-terminaI region of the regulatory protein Ki-l/57. Tbe interaction between MEF2C and myosin was confirmed by irnmunoprecipitation in rat beart and the interactíon between MEF2C and Ki-1I57 was confirmed by immunoprecipitation, pull down assay and immunlocalization by laser confocaI microscopic analysis. The interactíon of :MEF2with Ki-l/57 is dependent on mechanical overload in the beart. An immunoprecipitation assay using anti-MEF2 antibody sbowed a basal association between these two proteins in left ventric1eof control rats. However, the mecbanical overload caused a significant reduction in this association. Ki-l/57 co-Iocalizes with MEF2 in the nuc1eusof myocytes of control rats. On the other hand, after submitting the animais to transverse aortic constriction, this co-Iocalization in the nucleus was no longer observed. Ki-1I57 also exerts an inhibitory effect upon MEF2C's DNA binding activity. These results suggest that the interaction between MEF2 and Ki-l/57 is inhibitory and that it may be involved in the regulation ofMEF2 in response to mechanical stimulus in the heart / Doutorado / Medicina Experimental / Doutor em Fisiopatologia Medica

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-12-19T15:29:42Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3143276 bytes, checksum: 5662ac450b002b393007075fdbcaca2c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-19T15:29:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3143276 bytes, checksum: 5662ac450b002b393007075fdbcaca2c (MD5) Previous issue date: 2016-02-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Mecanismos epigenéticos estão envolvidos na regulação da expressão gênica, incluindo metilação do DNA e microRNA (miRNA) que desempenham um papel crucial no desenvolvimento e manutenção de complicações metabólicas. Portanto, os objetivos deste estudo foram: 1) Avaliar o efeito de uma estratégia para perda de peso com base no padrão mediterrâneo (dieta RESMENA) na expressão de alguns genes e miRNAs relacionados com inflamação em células brancas do sangue (WBC) de indivíduos com síndrome metabólica (MetS); 2) Estudar in vitro a ação de alguns miRNAs selecionados na expressão de genes relacionados com a inflamação em células humanas de leucemia monocítica aguda (THP-1). Além disso, investigar o papel regulador de ácidos graxos (ácido palmítico, ácido oleico, ácido eicosapentaenoico e ácido docosahexaenoico) na expressão destes miRNAs em monócitos, macrófagos e macrófagos activados por LPS (AcM); 3) Explorar em células mononucleares de sangue periféricos (PBMC) de jovens adultos aparentemente saudáveis, a relação entre os níveis de metilação do DNA (LINE1, TNF e IL6) e os parâmetros antropométricos, bioquímicos, clínicos, nutricionais e marcadores do estado inflamatório e do estresse oxidativo. Para isso, 2 estudos foram conduzidos em duas populações distintas, além de um estudo in vitro. No primeiro, características clínicas, antropométricas e bioquímicas de 40 indivíduos com MetS (20 homens e 20 mulheres, idade: 48.8 ± 10 anos; IMC: 35.4 ± 4.4 kg/m 2 ) foram avaliadas antes e depois de 8 semanas de uma dieta hipocalórica (-30% das necessidades energéticas) baseada no padrão alimentar mediterrânico. A ingestão de nutrientes foi avaliada com um questionário de frequência alimentar. O RNA total foi isolado a partir de WBC e a expressão de alguns miRNAs e mRNAs (IL6, TNF, ICAM- 1, IL-18, SERPINE1, VCAM-1) foram avaliados por meio de qRT-PCR. Para melhor compreensão dos dados, um estudo in vitro foi desenvolvido. THP-1 foram diferenciadas em macrófagos e ativados com LPS durante 24 horas. Os três tipos celulares foram transfectados com miR-Let7b-5p, miR-155-3p ou controle negativo. E a expressão dos miRNAs e genes foi realizada por qRT-PCR. Para o terceiro objetivo, foram utilizados dados de um estudo transversal com 156 indivíduos (91 mulheres, 65 homens com idade média: 23.1 ± 3.5 anos; IMC: 22.0±2.9 kg/m 2 ). Foram avaliados parâmetros antropométricos, bioquímicos clínicos, e alguns componentes dos sistemas de defesa antioxidante e resposta inflamatória. Além disso, a metilação do DNA e a expressão de alguns genes foram analisadas em PBMC. A intervenção nutricional RESMENA melhorou características antropométricas e bioquímicas dos participantes. A expressão de miR-155-3p foi diminuída enquanto Let-7b foi fortemente aumentada após 8 semanas de intervenção nutricional. As alterações na expressão de let-7b, miR- 125b, miR-130a, miR-132-3p e miR-422b foram associadas com mudanças na qualidade da dieta, quando avaliada pelo índice de alimentação saudável. Além disso, o baixo consumo de lipídios e de gordura saturada foram associados com maior expressão de let-7b após o tratamento dietético. A transfecção in vitro do miR-155-3p levou ao aumento da expressão de IL6 nos três tipos celulares analisados. Da mesma forma, SERPINE1 foi regulado positivamente em monócitos e macrófagos. No entanto, TLR-4 foi regulado negativamente em monócitos e macrófagos transfectados com esse miRNA. Após transfecção com let-7b, TNF/IL6 e SERPINE1 foram reprimidos em monócitos e AcM, respectivamente. Além disso, o tratamento com ácido oleico foi capaz de aumentar a expressão de miR-155 em monócitos quando comparado com o tratamento de DHA, mas não em relação com as células controle. Por outro lado, o ácido oleico, aumentou a expressão de let-7b em macrófagos e AcM. Finalmente, os resultados de metilação do DNA mostraram que a adiposidade foi menor entre os indivíduos com maior metilação global do DNA (LINE-1). Indivíduos com maior metilação do DNA apresentaram maior ingestão diária de calorias, ferro e riboflavina. No entanto, os indivíduos que apresentaram menor porcentagem de metilação do DNA relataram maior consumo de cobre, niacina e tiamina. Curiosamente, o grupo com maior metilação de LINE-1 teve menor porcentagem de fumantes e mais pessoas que praticavam atividade física. Além disso, a porcentagem de metilação de TNF foi negativamente associada com o perímetro da cintura, relação cintura-quadril e relação cintura-estatura. Os nossos dados sugerem que a modulação da expressão de miRNAs e metilação de DNA por meio de uma abordagem nutricional podem ser uma alternativa futura ou adjunta à terapia farmacológica atual. Além disso, este estudo amplia o entendimento de como os ácidos graxos podem atuar nas células imunológicas relacionadas com a inflamação. / Epigenetic mechanisms are involved in the regulation of gene expression including microRNAs (miRNA) and DNA methylation; and play a crucial role in the development and maintenance of pathophysiological complications. Therefore, the aims of this work were: 1) To evaluate the effect of a weight loss strategy based on the Mediterranean dietary pattern (RESMENA diet) on expression of some selected inflammation-related genes and miRNAs in white blood cells (WBC) of individuals with metabolic syndrome (MetS); 2) To clarify in vitro the roles of selected miRNAs on the expression of inflammation-related genes in human acute monocytic leukemia cells (THP-1). Moreover, we investigated the regulatory role of fatty acids (palmitic acid, oleic acid, eicosapentaenoic acid and docosahesaenoic acid) on the expression of these miRNAs in monocytes, macrophages and LPS-activated macrophages (AcM); 3) To explore in young and apparently healthy adults, the relation between DNA methylation levels of LINE-1, TNF and IL6 in periferal blood monoclear cells (PBMC) and anthropometric, biochemical, clinical, dietary, inflammatory and oxidative stress parameters. To the first aim, the clinical, anthropometric, and biochemical characteristics of 40 individuals with MetS (20 men, 20 women; age: 48.8±10.02y; BMI: 35.41±4.42 kg/m 2 ) were evaluated before and after an 8 weeks hypocaloric (-30% of energy requeriments) diet based on the Mediterranean dietary pattern. Food consumption and nutrient intake were assessed with a food frequency questionnaire and 48-h weighed food records. Total RNA was isolated from WBC and the expression of some inflammation-related miRNAs and mRNAs (IL-6, TNF, ICAM-1, IL-18, SERPINE1, VCAM-1) was assessed by qRT- PCR. To achieve the second aim, THP-1 were differentiated into macrophages and activated with LPS for 24 hours. The three cell types were transfected with miR-Let-7b- 5p and miR-155-3p mimics or negative control. qRT-PCR analyses were performed to evaluate selected genes with potential role in inflammatory pathways related to these miRNAs. To the third aim, one hundred fifty-six individuals (91 women, 65 men; age: 23.1±3.5 years; BMI: 22.0±2.9 kg/m 2 ) were evaluated for anthropometric, biochemical and clinical markers, including some components of the antioxidant defense system and inflammatory response. Moreover, DNA methylation of LINE-1, TNF and IL6 and the expression of some inflammation-related genes were analyzed in PBMC. The RESMENA nutritional intervention improved mostly anthropometric and biochemical features. The expression of miR-155-3p was decreased in PBMC, whereas let-7b was strongly upregulated as a consequence of the diet treatment. However, they were not correlated with the expression of the pro inflammatory genes in the same cells. The changes in the expression of let-7b, miR-125b, miR-130a, miR-132-3p, and miR-422b were associated with changes in diet quality when assessed by the Healthy Eating Index. Moreover, low consumption of lipids and saturated fat were associated with higher expression of let-7b after the nutritional intervention. The in vitro transfection of miR-155-3p mimic led to upregulation of IL6 in the three cell types analyzed. In the same way, SERPINE1 was upregulated in monocytes and macrophages. However, TLR-4 was downregulated in transfected monocytes and macrophages. After transfection with let-7b mimic, TNF/IL6 and SERPINE1 expression were downregulated in monocytes and AcM, respectively; however, TNF, IL6 and SERPINE1 were upregulated in macrophages. In addition, oleic acid was able to increase the expression of miR-155 in monocytes when compared with the DHA treatment but not in relation with non-treated cells. On the other side, oleic acid increased the expression of Let-7b in macrophages and AcM. Finally, the results from DNA methylation in young adults showed that adiposity was lower among individuals with higher LINE-1 methylation. On the contrary, body fat-free mass was higher among those with higher LINE-1 methylation. Individuals with higher LINE-1 methylation had higher daily intakes of calories, iron and riboflavin. However, those individuals who presented lower percentages of LINE-1 methylation reported higher intakes of copper, niacin and thiamin. Interestingly, the group with higher LINE-1 methylation had a lower percentage of current smokers and more individuals practicing sport. On the other hand, TNF methylation percentage was negatively associated with waist circumference, waist-to-hip ratio and waist-to-height ratio. Our data suggest that the modulation of the expression of miRNAs and DNA methylation through a nutrition approach might be a future alternative or adjunct to current pharmacologic therapy targeting endogenous miRNAs or target genes. Furthermore, this study also expands the understanding of the role of fatty acids in the epigenetic regulation in immune cells.

Made available in DSpace on 2016-01-26T12:51:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 joicematosbiselli_tese.pdf: 4248277 bytes, checksum: 46a8e90eea3be6a03251e5b3d7d8b0e5 (MD5) Previous issue date: 2011-11-28 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo / Trisomy 21 is the genetic basis of Down syndrome (DS), the most common human chromosomal disorder. DS phenotype may include several dysmorphic features, intellectual disability, immunological alteration, congenital heart disease, high risk for specific types of leukemia and neurological alterations. There are basically two hypotheses to explain how the presence of three copies of chromosome 21 results in DS phenotype. The gene dosage effect hypothesis states that over-expression in about 50% of a specific gene or a group of genes located on chromosome 21 present in triplicate in DS individuals is directly responsible for DS features. The second hypothesis suggests the existence of secondary effects of trissomic genes that affect multiple metabolic pathways, resulting in cellular dysfunction. Recent studies show that trisomy 21 results in the over-expression of microRNAs, small molecules of noncoding RNA involved in post-transcriptional gene regulation, which could result in low expression of specific proteins and contribute to DS phenotype. Objective: To identify differentially expressed microRNAs in peripheral blood mononuclear cells of DS and non-DS children and to identify biological processes relevant to DS pathogenesis associated with predicted gene targets of microRNAs differentially expressed in DS children. Casuistic and Methods: Six children with free trisomy 21 and six control children were included in the study. Mature microRNAs were quantified using TaqMan® Low Density Arrays (Applied Biosystems), which enable the quantification of 754 mature microRNAs by real time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) using fluorescent probes. The target prediction was performed using the software TargetScanHuman v. 5.2. Information about gene targets was obtained using the software Bioprocess, a database that obtains data from the National Center for Abstract xvi Biotechnology Information (NCBI). Results: Of the 490 mature microRNAs expressed in this cell type, 49 are low-expressed in DS group. The microRNAs located in chromosome 21 did not present differential expression between the groups. Bioinformatics analysis showed that genes involved in several relevant biological process to DS, including apoptosis, reactive oxygen species metabolism, mitochondrial metabolism, immune system, cell aging, cycle and division and control of gene expression, are predicted targets of microRNAs differentially expressed in DS children. Conclusion: DS children present low expression of microRNAs not located on chromosome 21 in peripheral blood mononuclear cells, as compared to children without DS. Biological processes relevant to DS pathogenesis are associated with predicted gene targets of microRNAs differentially expressed in DS children. / A trissomia do cromossomo 21 é a base genética da síndrome de Down (SD), a cromossomopatia humana mais frequente. O fenótipo da SD pode incluir várias características dismórficas, deficiência intelectual, alterações imunológicas, cardiopatias congênitas, risco aumentado para leucemias específicas, alterações neurológicas, entre outras. Existem basicamente duas hipóteses que tentam explicar como a presença de três cópias do cromossomo 21 resulta no fenótipo Down. De acordo com a hipótese do efeito da dosagem gênica , a expressão elevada em cerca de 50% de um gene específico ou de um grupo de genes do cromossomo 21 presente em triplicata em indivíduos com SD seria diretamente responsável pela manifestação de características da síndrome. A segunda hipótese sugere a existência de efeitos secundários de genes trissômicos, que afetariam múltiplas vias metabólicas, resultando em disfunção celular. Estudos recentes mostram que a trissomia do cromossomo 21 resulta na expressão elevada de microRNAs, pequenas moléculas de RNAs nãocodificantes envolvidos na regulação gênica pós-transcricional, o que pode levar à redução da expressão de proteínas específicas e contribuir para o fenótipo da SD. Objetivo: Identificar microRNAs diferencialmente expressos em células mononucleares do sangue periférico de crianças com SD em relação a crianças sem a síndrome e identificar processos biológicos relevantes para a patogênese da SD associados a genes-alvo preditos de microRNAs diferencialmente expressos em crianças com SD. Casuística e Métodos: Foram incluídas no estudo seis crianças com trissomia livre do cromossomo 21 e seis crianças sem a síndrome. A quantificação de microRNAs maduros foi realizada utilizando-se TaqMan® Low Density Arrays (Applied Biosystems), que possibilita a investigação da expressão de 754 microRNAs maduros Resumo xiv pelo método de reação em cadeia da polimerase quantitativa (PCRq) fluorescente em tempo real. A predição de genes-alvo dos microRNAs foi realizada utilizando-se o programa TargetScanHuman v. 5.2. Para obtenção de informações sobre os genes-alvo preditos foi utilizada a ferramenta Bioprocess, um banco de dados alimentado com informações do National Center for Biotechnology Information (NCBI). Resultados: Dos 490 microRNAs maduros expressos no tipo celular investigado, 49 apresentaram expressão reduzida no grupo de crianças com SD. Os microRNAs localizados no cromossomo 21 não apresentaram expressão diferencial entre os grupos. A análise de Bionformática revelou que genes envolvidos em diversos processos biológicos relevantes para a SD, tais como apoptose, metabolismo de espécies reativas de oxigênio, metabolismo mitocondrial, sistema imunológico, envelhecimento, ciclo e divisão celular e controle da expressão gênica, são alvos preditos de microRNAs diferencialmente expressos em crianças com SD. Conclusão: Crianças com SD apresentam expressão reduzida de microRNAs não localizados no cromossomo 21 em células mononucleares do sangue periférico, em relação a crianças sem a síndrome. Processos biológicos relevantes para a patogênese da SD estão associados a genes-alvo preditos de microRNAs diferencialmente expressos em crianças com SD.

Made available in DSpace on 2016-05-19T13:08:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 173.pdf: 1047808 bytes, checksum: 48de5cc0086090a92e066047b4e59660 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / Os tripanossomatídeos possuem uma combinação não usual de mecanismos moleculares, e seus processos de regulação de expressão gênica ocorreram a nível pós-transcricional. Acredita-se que essa regulação envolva tanto o controle da estabilidade dos mRNAs, como sua tradução em proteínas, eventos em que atua a proteína de ligação à cauda poli-A (PABP - Poly-A Binding Protein), uma das principais proteínas de ligação a RNAs em eucariotos. Um grande número destas proteínas está presente nos tripanosomatídeos, se caracterizando por possuírem domínios típicos de ligação a RNA, como o domínio RRM (RNA Recognition Motif). Dentre estas se destacam as proteínas de ligação a sequências ricas em uridina (UBPs), que se mostraram capazes de interagir com homólogos de PABP. Outras proteínas hipotéticas contendo domínios de ligação a RNA foram identificadas em ensaios que buscavam parceiros diferenciais para os três homólogos de PABP de Leishmania. Este trabalho se propôs a contribuir na caracterização funcional das proteínas UBPs e das proteínas hipotéticas, através da otimização de sua expressão de forma heteróloga em L. infantum, fusionadas ao epítopo HA. Para isto, os genes codificantes dos três homólogos de UBPs, e de cinco outras proteínas de ligação a RNA que parecem interagir com PABPs, foram amplificados e clonados em vetor de expressão de Leishmania. As construções geradas foram transfectadas em L. infantum e a expressão de seis destas proteínas avaliada. Os resultados obtidos mostram uma variação no reconhecimento das proteínas geradas com anticorpos comerciais anti-HA, que parecem depender da sequência de aminoácidos da sua extremidade C-terminal. Diferenças significativas nos seus níveis de expressão também foram observadas. Entre os três homólogos de UBP, dois destes se mostraram mais abundantes enquanto que os três são representados por mais de uma banda, indicando possíveis modificações pós-traducionais

A Dnmt3b é a principal DNA metiltransferase no processo de remetilação de regiões de DNA repetitivo do genoma durante a onda de reprogramação epigenética que ocorre no desenvolvimento embrionário. Sua expressão é regulada por uma série de mecanismos, entre os quais encontram-se os microRNAs (miRNAs). O objetivo deste trabalho foi investigar o papel dos mRNAs hsa-miR-203, hsa-miR-26a e hsa-miR-26b na regulação da expressão de DNMT3B durante a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas e suas consequências para a metilação do DNA destas células. Para isto, geramos curvas de expressão dos miRNAs investigados, bem como da DNMT3B, a fim de verificar a existência de correlação entre elas. Também analisamos o efeito da superexpressão de miRNAs miméticos sobre a expressão de DMMT3B e o efeito da inibição da interação entre os miRNAs e a região 3\'UTR de DNMT3B sobre a expressão da DNA metiltransferase e sobre os níveis de metilação do DNA das células. Constatamos que a expressão de DNMT3B está inversamente correlacionada com a expressão dos miRNAs hsa-miR-203, hsa-miR-26a e hsa-miR-26b, mas não do hsa-miR-29b, regulador já validado para o controle da expressão de DNMT3B em células tumorais. Verificamos também que o impedimento da ligação do hsa-miR-203 ao segundo sítio predito para a ligação deste miRNA ao mRNA de DNMT3B ocasionou um aumento significativo na expressão da DNA metiltransferase, embora tal aumento não tenha refletido alteração nos níveis de metilação do DNA das células. Desta forma, concluímos que os miRNAs investigados fazem parte da maquinaria de regulação da DNA metiltransferase 3B na diferenciação de células-tronco embrionárias, embora o exato papel funcional de cada um deles no controle da expressão de DNMT3B e na metilação do DNA destas células ainda necessite ser melhor esclarecido / Dnmt3b is the major DNA methyltransferase in the proccess of repetitive DNA remethylation during the epigenetic reprogramming wave that occurs in the embryonic development. Its expression is regulated through several mechanisms, including microRNA (miRNAs). The aim of this study was to investigate the role of the miRNAs hsa-miR-203, hsa-miR-26a, and hsa-miR-26b in the regulation of DNMT3B expression during the differentiation of human embryonic stem-cells, and its consequences to the DNA methylation of these cells. To accomplish this, we generated expression curves for the investigated miRNAs, as well as for DNMT3B, to verify the existence of correlation between them. We also analysed the effect of superexpressing mimetic miRNAs on DNMT3B expression, and the effect of inhibiting the interaction of these miRNAs with DNMT3B 3\'UTR region on the DNA methyltransferase expression and the levels of DNA methyation. We found that DNMT3B expression is inversely correlated to hsa-miR-203, hsa-miR-26a, and hsa-miR-26b expression, but not to hsa-miR-29b, a previously validated DNMT3B regulator in tumor cells. We also verified that blocking the interaction of hsa-miR-203 to its predicted second interaction site at the DNMT3B mRNA significantly increased DNMT3B expression, but did not interfere with the levels of DNA methylation in these cells. Thus, we conclude that the investigated miRNAs are part of the DNMT3B regulatory machinery during the differentiation of embryonic stem-cells, although the exact functional role of each of them in the control of DNMT3B expression and in the DNA methylation of these cells still remains to be further explored