Orientador: Sony Dimas Bicudo / Banca: Carlos Antonio de Miranda Bomfim / Banca: André Luis Rios Rodrigues / Resumo: Objetivou-se avaliar e validar o sistema automatizado de refrigeração e congelação de fabricação nacional TK 3000, comparativamente ao sistema de refrigeração e de congelação pelo método geladeira/vapor de nitrogênio líqüido. Foram utilizados dez carneiros da raça Santa Inês sendo colhidos, por meio de vagina artificial, três ejaculados de cada reprodutor. Após as avaliações do ejaculado, o sêmen foi diluído em meio para congelação Glicina-Gema-Leite e envasado em palhetas de 0,25 Ml com 100 x 106 espermatozóides totais/doses, sob temperatura de 32° C. As amostras foram refrigeradas em geladeira e/ou com controle automatizado e posteriormente congeladas em vapor de nitrogênio líqüido e/ou com controle automatizado. Os resultados foram similares (P<0,05) entre a refrigeração em geladeira e a refrigeração com controle automatizados em todos os parâmetros avaliados pós descongelação e ao final do teste de exaustão, o mesmo observou-se entre a refrigeração em geladeira e congelação em vapor de nitrogênio líqüido e refrigeração e congelação com controle automatizado e as combinações refrigeração em geladeira e congelação com controle automatizado e refrigeração com controle automatizado e congelação em vapor de nitrogênio líqüido. Concluí-se que o sistema automatizado TK 3000 é adequado a criopreservação do sêmen ovino, com qualidade equivalente àquela processada no sistema geladeira/vapor de nitrogênio líqüido. / Abstract: The objectives of the present study were to validate and evaluate a programmed automatic system for freezing and cooling, using a national equipment TK 3000, compared to a method using refrigerator and liquid nitrogen for the same procedures. Ten rams from Santa Ines breed were submitted to semen collection by artificial vagina, with a total of three ejaculates from each sire. After the ejaculate evaluation, semen was diluted in a freezing extender Egg- Glycine - Milk and stored in a 0.25 mL straws with a total of 100 x 10 6 sperm per dose at 32° C. The samples were cooled inside a refrigerator and /or utilizing an automatic programmed system, being then frozen in liquid nitrogen vapor and/ or using automatic control. The results were simmilar (P< 0.05) between samples submitted to cooling using refrigerator and automatic control for all analyzed parameters after thawing and at the end of the resistant test. The same was observed among samples submitted to cooling in refrigerator followed by liquid nitrogen vapor for freezing, samples cooled and frozen both using an automatic control, samples processed by the combinations of cooling in refrigerator followed by freezing with an automatic control, and samples cooled with automatic control followed by freezing in liquid nitrogen vapor. In conclusion, the TK 3000 is an adequate automatic system for ovine semen cryopreservation and it provides a quality which is equivalent to semen processed in refrigerator/ liquid nitrogen vapor system. / Mestre

Orientador: Frederico Ozanam Papa / Resumo: O processo de criopreservação acarreta estresse oxidativo à célula espermática e a adição de antioxidantes aos meios de refrigeração e congelação de sêmen pode auxiliar na proteção dos espermatozoides contra o dano induzido pelas espécies reativas de oxigênio (ERO), incluindo perda da motilidade de forma irreversível, peroxidação lipídica e fragmentação do DNA, interferindo na capacidade de fertilização do espermatozoide. Dentre os diferentes antioxidantes, o Butil-hidroxitolueno (BHT) é um análogo sintético da vitamina E, cujo efeito protetor é atribuído a dois mecanismos: o aumento da fluidez da membrana plasmática após a incorporação do antioxidante, e o segundo por conter a cascata de peroxidação lipídica pela conversão de peroxil em hidroperóxido lipídico. O BHT foi testado em diversas espécies demonstrando melhora na motilidade, integridade de membrana plasmática e viabilidade espermática; porém, na espécie equina, a inclusão de BHT em diluentes para criopreservação de sêmen necessita ser melhor avaliada. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência do BHT nas células espermáticas de equinos submetidas à criopreservação e sua capacidade de conter a peroxidação lipídica e produção de espécies reativas de oxigênio quando os espermatozoides foram submetidos a estresse. / Abstract: The process of cryopreservation brings out oxidative stress to spermatic cell and the addition antioxidant of into cooling and freezing semen extenders could assist in protection of spermatozoa against the damage induced by reactive oxygen species (ROS), including irreversible loss in motility, lipid peroxidation and DNA fragmentation, interfering with the fertilizing capacity of sperm. Among different antioxidants, the butylated hydroxytoluene (BHT) is a synthetic analogue of vitamin E, whose protective effect is attributed to two mechanisms: the increase in sperm membrane fluidity after the addition of antioxidant, and the lipid peroxidation cascade for converting peroxy radicals into lipid hydroperoxides. BHT was tested in different species and the results include improvement in motility, spermatic membrane integrity and sperm viability. However, the addition of BHT in horse semen extenders for cryopreservation purposes demands further research. Thereby, the aims of this study were (1) to evaluate the influence of BHT on equine spermatic cells submitted to cryopreservation and (2) the capacity of BHT to contain the lipid peroxidation and the production of reactive species of oxygen when sperm cells were submitted to stress. / Mestre

Orientador: Maria Denise Lopes / Banca: Frederico Ozanan Papa / Banca: Gilson Hélio Toniollo / Banca: Isabel Candia Nunes da Cunha / Banca: Fabiana Ferreira de Souza / Resumo: A inseminação artificial (IA) utilizando sêmen congelado é uma ferramenta importante na reprodução de cães, visa o melhoramento genético e melhor aproveitamento do reprodutor. Além disso, a melhor metodologia para avaliar o potencial fecundante de uma amostra de sêmen é o teste in vivo. Por isso, os objetivos deste trabalho foram determinar a taxa de gestação de cadelas, utilizando sêmen congelado em meio diluente TRIS/OEP/Frutose/8%Glicerol, e comparar duas técnicas de IA: intra-uterina, por laparotomia e intravaginal. O sêmen foi colhido de um único macho, por manipulação digital do pênis e analisado, imediatamente, após a colheita e após a descongelação a 70°C, por 8 segundos. A cinética do movimento foi verificada pelo CASA (Computer Assisted Semen Analyzer), e a integridade das membranas por: sondas fluorescentes (iodeto de propídio e carboxifluoresceína), pelo teste supra vital com a coloração de eosina, e pela associação de sondas (iodeto de propídio, JC-1 e FITC-PSA). A morfologia espermática foi avaliada por meio de esfregaços corados com Karras. A congelação do sêmen foi realizada pelo método descrito por Chirinéa et al. (2006). As fêmeas foram monitoradas desde o início da fase do proestro utilizando a citologia vaginal seriada e a dosagem de progesterona sérica, a cada 48 horas. Para as inseminações, as cadelas foram divididas em dois grupos: Grupo 1 (n=6) inseminadas uma única vez, via intra-uterina, por laparotomia, com uma dose inseminante de 160 x 106 espermatozóides/2mL; e Grupo 2 (n=6) inseminadas duas vezes, via intravaginal com uma dose inseminante de 160 x 106 espermatozóides/2 mL por inseminação. Os resultados das análises do sêmen pré e pós-descongelação não apresentaram diferenças significativas, com exceção da morfologia espermática e da associação de sondas fluorescentes... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Artificial insemination (AI) using frozen semen is an important tool on dog's reproduction, aiming to genetic improvement and better use of a stud. Besides, the better way to evaluate the fecundate potential of a semen sample is an in vivo test. That way, the aim of this work was to determine the pregnancy rate in bitches, using TRIS/OEP/Fructose/8%Glycerol as the diluent medium, and to compare two AI techniques: intrauterine and intravaginal. Semen was collected from one male only, by digital manipulation. Semen was analyzed immediately after collection and after thawed at 70°C for 8 seconds. Movement kinetics were analyzed by CASA (Computer Assisted Semen Analyzer), membrane integrity using fluorescents probes (propidium iodide and carboxyfluorescein), supravital test, eosin staining, integrity of plasmatic, nuclear and mitochondrial membranes using the association of fluorescent probes (FITC-PSA, propidium iodide and JC-1) and sperm morphology. Semen was frozen using the method described by Chirinéa, 2006. Females were monitored since the beginning of proestrus, using vaginal smear and progesterone measurement, each 48hours. To inseminations, bitches were divided into two groups: Group 1, composed by 6 females, which were inseminated just once via intrauterine, with an insemination dose of 160 x 106 spermatozoids/2mL and Group 2 constituted by 6 females, which were inseminated twice, via intravaginal, using an insemination dose of 160 x 106 spermatozoids/2 mL/insemination. Results from semen analyses made before and after freezing did not show any difference, except for sperm morphology and association of fluorescents probes. Pregnancy rate was 66,6% (4/6) on Group 1 and 16,6% (1/6) on Group 2. In conclusion, the success of artificial insemination depends not only on semen quality after thawed, but also on the AI technique used. In our work, intrauterine technique by laparotomy was better than intravaginal. / Doutor

Introdução: Doze a 29 % dos ejaculados tem viscosidade seminal aumentada. Uma das técnicas recomendadas para diminuir a viscosidade do sêmen consiste num processo físico em que se passa o sêmen, 4 vezes, por uma seringa de 10 mL com agulha 18G. Ao fim desse processo, ter-se-ia modificado o comportamento molecular das fibrilas protéicas do esperma, tornando-o mais liquefeito, sem dano aparente a morfologia ou motilidade dos espermatozoides. Atualmente, discute-se sobre a total inocuidade desta técnica, uma vez que ela poderia provocar aumento da fragmentação do DNA dos espermatozoides. A hiperviscosidade seminal, além de reduzir a concentração e a motilidade dos espermatozoides, pode afetar a capacitação e a reação acrossômica, podendo ter implicações na integridade do DNA e no desenvolvimento embrionário normal. Objetivo: Comparar a fragmentação do DNA de espermatozoides humanos em amostras com viscosidade diminuída, fisiológica e aumentada, e avaliar se o processo de expulsão do sêmen através da agulha e seringa altera significativamente as taxas de fragmentação do DNA dos espermatozoides. Método: Após a coleta e avaliação dos parâmetros seminais das amostras de sêmen, aquelas que estiverem com viscosidade aumentada passarão pelo processo de expulsão através da seringa de 10 mL com agulha 18G por 4 vezes, para diminuir a viscosidade seminal. Posteriormente, serão feitas análises da fragmentação do DNA dos espermatozoides através da técnica de TUNEL em todas as amostras. Resultados: A fragmentação do DNA entre amostras com viscosidade fisiológica, diminuída e aumentada não apresentou diferença estatisticamente significativa (P=0,857). A fragmentação do DNA aumentou significativamente (P=0,035) nas amostras com viscosidade aumentada após passar na seringa e agulha quando comparadas com as mesmas amostras antes de passar pela mesma. Conclusão: O processo de expulsão do sêmen através de seringa e agulha visando redução da viscosidade seminal aumenta a fragmentação do DNA no espermatozoide, devendo este processo ser substituído por um processo inócuo. / Background: Twelve to 29 % of the ejaculated have the semen viscosity increased. One of the techniques recommended to decrease the viscosity of semen is a physical process in which the semen passes four times through a 10mL syringe with a 18G needle. At the end of this process would have modified the molecular behavior of the protein fibrils of the sperm making it more liquefied, without apparent damage to the morphology or motility of spermatozoa. Currently, the debate is about the complete safety of this technique since it could result in increased DNA fragmentation of spermatozoa. The seminal viscosity moreover reduces the concentration and motility of sperm, can affect the capacitation and acrosome reaction which may have implications for DNA integrity and normal embryonic development. Objective: To compare the DNA fragmentation in human semen samples with reduced, physiological and increased viscosity and evaluate if the process of expulsion of semen through the needle and syringe significantly alter rates of sperm DNA fragmentation. Methods: After collecting and evaluating semen parameters of semen samples, those that are with increased viscosity will pass through the process of expulsion through the 10 mL syringe with a 18G needle four times to reduce the viscosity of semen. After that, analysis of spermatozoa DNA fragmentation through the TUNEL technique will be made in all samples. Results: The fragmentation of DNA between samples with physiological, reduced and increased viscosity is not statistically significant (P=0.857). The DNA fragmentation increased significantly (P=0.035) in samples with increased viscosity after passing the syringe and needle when compared with the same samples before going through the same. Conclusion: The process of expulsion of semen through a syringe and needle in order to reduce the semen viscosity increases the DNA fragmentation in sperm, and this shall be replaced by a harmless process.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O objetivo do presente trabalho foi realizar um estudo sobre as proteÃnas do plasma seminal e dos espermatozoides e suas associaÃÃes com morfologia espermÃtica e com mÃtodos de coleta e criopreservaÃÃo de sÃmen de touros Bos indicus das raÃas Brahman e GuzerÃ, utilizando uma abordagem proteÃmica. Foram coletadas amostras de sÃmen e as proteÃnas do plasma seminal foram separadas atravÃs de eletroforese bidimensional ou eletroforese bidimensional em gel diferencial e identificadas por espectrometria de massa. O proteoma do plasma seminal dos touros Bos indicus foi descrito identificando as Binder of sperm proteins como as proteÃnas mais abundantes no fluido seminal, enquanto que as spermadhesins formaram o segundo grupo com maior expressÃo. Foram encontradas associaÃÃes positivas e negativas entre as proteÃnas do plasma seminal e a porcentagem de espermatozoides morfologicamente normais constituindo possÃveis marcadores moleculares desta caracterÃstica. Em outro aspecto, foram identificadas diferenÃas no volume do ejaculado e no perfil proteico do plasma seminal touros Bos indicus submetidos a diferentes mÃtodos de coleta de sÃmen (vagina artificial interna e eletroejaculaÃÃo). Baseado nas anÃlises dos gÃis bidimensionais, 22 spots tiveram volumes maiores nas amostras coletadas por vagina artificial interna, correspondendo a 21 proteÃnas. Em contrapartida, 33 spots correspondendo a 26 proteÃnas tiveram maiores volumes nos gÃis de amostras coletadas por eletroejaculaÃÃo. As principais proteÃnas com maior expressÃo em amostras obtidas por vagina artificial interna e eletroejaculaÃÃo eram de origem epididimÃria e das glÃndulas sexuais acessÃrias, respectivamente. No presente trabalho, ainda foram feitas associaÃÃes entre a expressÃo de proteÃnas no plasma seminal e nas cÃlulas espermÃticas com os parÃmetros do sÃmen pÃs-criopreservaÃÃo em touros Bos indicus da raÃa GuzerÃ. Os animais apresentaram, em mÃdia, peso corporal, circunferÃncia escrotal e parÃmetros seminias prÃ-criopreservaÃÃo do sÃmen sem diferenÃa estatÃstica. De acordo com os parÃmetros espermÃticos pÃs-criopreservaÃÃo obtidos pelo sistema computadorizado de anÃlise de sÃmen os animais foram divididos em grupos de alta e baixa congelabilidade. TrÃs proteÃnas do plasma seminal e cinco dos espermatozoides foram mais expressas no grupo de alta congelabilidade. Outras seis proteÃnas do plasma seminal foram mais expressas no grupo de baixa congelabilidade. Os modelos de regressÃo adotados para as intensidades dos spots do plasma seminal e das cÃlulas espermÃticas, bem como as anÃlises de interaÃÃes proteÃna-proteÃna indicam que a maioria das proteÃnas inversamente associadas com a viabilidade espermÃtica pÃs-descongelaÃÃo pode ser expressa como uma resposta a um estresse oxidativo e/ou ataque microbiano antes da criopreservaÃÃo de sÃmen de animais do grupo de baixa congelabilidade nÃo detectado pelas anÃlises convencionais do sÃmen. AtravÃs da utilizaÃÃo de uma abordagem proteÃmica, os resultados encontrados no presente trabalho podem servir de orientaÃÃo para futuras pesquisas que visem identificar marcadores moleculares de processos reprodutivos baseado na expressÃo de proteÃnas no plasma seminal e nas cÃlulas espermÃticas de touros Bos indicus. / The aim of this work was to study seminal plasma and whole sperm proteins and their association with sperm morphology and methods of semen collection and cryopreservation in Bos indicus bulls using a proteomics approach . Seminal plasma proteins were separated by two-dimensional electrophoresis or diferential gel electrophoresis and identified by mass spectrometry gel. Firstly, we described the seminal plasma proteome of Bos indicus bulls, identified the Binder of Sperm Proteins as the more abundant proteins in seminal fluid, while the spermadhesins formed the second group with higher expression. Positive and negative associations were found between seminal plasma proteins and the percentage of morphologically normal spermatozoa constituing possible molecular markers of this characteristic. In other hand, differences were identified in ejaculate volume and seminal plasma protein profile of Bos indicus bulls subjected to different methods of semen collection (internal artificial vagina and electroejaculation). Based on the analysis of two-dimensional gels, 22 spots had larger volumes in samples collected by internal artificial vagina, corresponding to 21 proteins. In contrast, 33 spots had larger volumes of samples collected by electroejaculation corresponding to 26 differents proteins. The proteins with great volume in samples obtained by internal artificial vagina and electroejaculation had epididymal and accessory sex glands origin, respectively. In the present study, others associations have been made among protein expression in seminal plasma and sperm cells and semen parameters after cryopreservation in Bos indicus bulls. The animals had not differences between body weight, scrotal circumference and seminal parameters pre-freezing. After cryopreservation, the semen parameters were analyzed by computer system (CASA) and the animals were divided into groups of low and high freezability. In the high freezability group were more expressed three proteins of seminal plasma and five proteins of sperm. For the group of low freezability were more expressed six different seminal plasma proteins. Regression models adopted for the intensities of the spots in the seminal plasma and sperm cells, as well as analysis of protein-protein interactions, indicate that most of the proteins inversely associated with post -thaw sperm viability may be expressed as a response to an oxidative stress and/or microbial attack before the semen cryopreservation of animals with low freezability. These parameters could not be detected by conventional sperm analysis. This results obtened by applying of the proteomics approach, could serve as guideline for future researchs aimed to identifed molecular markers of reproductive processes based on the expression of proteins in seminal plasma and sperm cells of Bos indicus bulls.

Introdução: Doze a 29 % dos ejaculados tem viscosidade seminal aumentada. Uma das técnicas recomendadas para diminuir a viscosidade do sêmen consiste num processo físico em que se passa o sêmen, 4 vezes, por uma seringa de 10 mL com agulha 18G. Ao fim desse processo, ter-se-ia modificado o comportamento molecular das fibrilas protéicas do esperma, tornando-o mais liquefeito, sem dano aparente a morfologia ou motilidade dos espermatozoides. Atualmente, discute-se sobre a total inocuidade desta técnica, uma vez que ela poderia provocar aumento da fragmentação do DNA dos espermatozoides. A hiperviscosidade seminal, além de reduzir a concentração e a motilidade dos espermatozoides, pode afetar a capacitação e a reação acrossômica, podendo ter implicações na integridade do DNA e no desenvolvimento embrionário normal. Objetivo: Comparar a fragmentação do DNA de espermatozoides humanos em amostras com viscosidade diminuída, fisiológica e aumentada, e avaliar se o processo de expulsão do sêmen através da agulha e seringa altera significativamente as taxas de fragmentação do DNA dos espermatozoides. Método: Após a coleta e avaliação dos parâmetros seminais das amostras de sêmen, aquelas que estiverem com viscosidade aumentada passarão pelo processo de expulsão através da seringa de 10 mL com agulha 18G por 4 vezes, para diminuir a viscosidade seminal. Posteriormente, serão feitas análises da fragmentação do DNA dos espermatozoides através da técnica de TUNEL em todas as amostras. Resultados: A fragmentação do DNA entre amostras com viscosidade fisiológica, diminuída e aumentada não apresentou diferença estatisticamente significativa (P=0,857). A fragmentação do DNA aumentou significativamente (P=0,035) nas amostras com viscosidade aumentada após passar na seringa e agulha quando comparadas com as mesmas amostras antes de passar pela mesma. Conclusão: O processo de expulsão do sêmen através de seringa e agulha visando redução da viscosidade seminal aumenta a fragmentação do DNA no espermatozoide, devendo este processo ser substituído por um processo inócuo. / Background: Twelve to 29 % of the ejaculated have the semen viscosity increased. One of the techniques recommended to decrease the viscosity of semen is a physical process in which the semen passes four times through a 10mL syringe with a 18G needle. At the end of this process would have modified the molecular behavior of the protein fibrils of the sperm making it more liquefied, without apparent damage to the morphology or motility of spermatozoa. Currently, the debate is about the complete safety of this technique since it could result in increased DNA fragmentation of spermatozoa. The seminal viscosity moreover reduces the concentration and motility of sperm, can affect the capacitation and acrosome reaction which may have implications for DNA integrity and normal embryonic development. Objective: To compare the DNA fragmentation in human semen samples with reduced, physiological and increased viscosity and evaluate if the process of expulsion of semen through the needle and syringe significantly alter rates of sperm DNA fragmentation. Methods: After collecting and evaluating semen parameters of semen samples, those that are with increased viscosity will pass through the process of expulsion through the 10 mL syringe with a 18G needle four times to reduce the viscosity of semen. After that, analysis of spermatozoa DNA fragmentation through the TUNEL technique will be made in all samples. Results: The fragmentation of DNA between samples with physiological, reduced and increased viscosity is not statistically significant (P=0.857). The DNA fragmentation increased significantly (P=0.035) in samples with increased viscosity after passing the syringe and needle when compared with the same samples before going through the same. Conclusion: The process of expulsion of semen through a syringe and needle in order to reduce the semen viscosity increases the DNA fragmentation in sperm, and this shall be replaced by a harmless process.

Orientador: Maria Luiza S. Mello / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-23T01:07:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Martins_JoaoFlavioPanattoni_M.pdf: 1565897 bytes, checksum: 4fb6eebdac2cbbdd70e0ae1e5155148e (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: A incidência de patologias do complexo DNA-proteína, medida pelo método de metacromasia induzida, bem como os parâmetros vigor e motilidade, foram estudados em espermatozóides de touro provenientes de 42 partidas seminais congeladas a partir de 1973 a 1995. Os resultados indicam que esses parâmetros diferem estatisticamente para grupos de sêmen criopreservados por tempos diferentes. As anomalias no complexo DNA-proteína foram mais elevadas para as partidas de 1973 e 1974, diferindo de todas as demais, que por sua vez não diferiram entre si. Admite-se que o tipo de envasamento e o diluidor do sêmen tenham alguma participação nesses resultados, pois apenas as partidas de 1973 e 1974 foram envasadas em ampolas. Quanto aos parâmetros vigor e motilidade, houve diminuição nos seus valores, em função do aumento no tempo de criopreservação, porém não diretamente correlacionada ao tipo de envasamento. Especialmente para o parâmetro vigor foi observada uma distribuição não simétrica de valores inclusive para tempos de criopreservação mais recentes, como 1991 a 1995. Considerando-se que as técnicas de congelação e descongelação utilizadas neste período são muito semelhantes entre si, acredita-se que a existência de partidas seminais que apresentem vigor e motilidade muito abaixo da média do grupo possa ocorrer devido a condições de manutenção da congelação fora do padrão ideal, como por exemplo, utilizando-se níveis insatisfatórios de nitrogênio líquido no botijão de armazenamento de sêmen ou por manipulação excessiva ou inadequada das partidas seminais durante o período de criopreservação, causando exposição das mesmas à temperatura ambiente por tempo excessivo. Os dados levantados sugerem cautela na utilização de sêmen criopreservado por tempos muito longos, especialmente se associado a isto tiver sido utilizada a técnica de preservação e envasamento mais antiga. Cuidados adicionais de preservação deverão ser mantidos / Abstract: The incidence of the DNA-protein complex pathologies, measured by induced metachromasy method, as welI as vigor and motility pattems, were studied in bulI sperm from 42 ftozen batches from 1973 to 1995. Results indicate that these parameters differ statistically for cryopreserved semen groups in accord to different time. Complex DNA-protein anomalies were higher for 1973 and 1974 batches, differing ftom alI the remaining, which in tum did not differ among themselves. It is acknowledged that storage type and semen dilutor have some participation in these results because on1y 1973 and 1974 batches were stored in ampules. Decrease was shown in the amounts of vigor and motility parameters, as a function of increase in cryopreservation time, however, not direct1y correlated to storage type. A non-symmetric distribution of amounts was observed especially for vigor parameter, inc1uding more recent cryopreservation time as 1991 to 1995. Considering that the fteezing and thawing techniques used by both groups during this period are very similar it is assumed that the existence of seminal batches showing vigor and motility much below group's average could be due to not maintaining ideal freezing conditions, for instance , using unsatisfying levels of liquid nytrogen in the semen storage tank or due to excessive or inadequate manipulation of semen batches during cryopreservation period, causing their exposure to environmental temperature for excessive time. ColIected data suggest caution when using cryopreserved semen for very long periods of time especialIy if the older preservation and storage technique has been utilized associated to it. Additional preservation measures need to be kept / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Ciências Biológicas

Os objetivos do estudo foram: (a) avaliar a influência da suplementação de vitamina A na dieta de cachaços nos parâmetros seminais: volume, motilidade, vigor espermático, pH, concentração espermática, número total de espermatozóides, percentual de espermatozóides vivos e anormalidades morfológicas ao longo do ano; (b) averiguar a variabilidade das características, em animais suplementados com vitamina A na dieta, frente às variações da temperatura nas estações do ano. A pesquisa foi desenvolvida no Laboratório de Pesquisa em Suínos, da FMVZ-USP, utilizando-se 10 machos de linhagem híbrida e distribuídos em dois tratamentos, controle (nível de 25.000 UI de vitamina A/animal/dia) e suplementado com a vitamina A (nível de 40.000 UI de vitamina A/animal/dia). O delineamento foi inteiramente casualizado, com medidas repetidas no tempo, sendo os dados analisados utilizando o programa estatístico Statistical Analysis System (SAS). As probabilidades de interações com o tempo foram determinadas pelo teste de Greenhouse-Geisser Epsilon, considerando o nível de significância de 5%. Em relação aos efeitos da vitamina A durante o período de 1 ano, verificou-se que não houve diferença entre os tratamentos para os parâmetros seminais, não encontrando-se efeito de interação tempo e tratamento. Detectou-se efeito de tempo para os parâmetros pH, concentração espermática, número total de espermatozóides, percentual de espermatozóides vivos e anormalidades morfológicas. Já na averiguação da variabilidade também não foi constatado efeito de tratamento, porém houve efeito de estação do ano para todos os parâmetros e de temperatura para o percentual de espermatozóides vivos, pH e anormalidades morfológicas, não sendo verificado efeito para os demais parâmetros. Inferiuse com o estudo que, dada à condição metabólica diferencial dos animais híbridas, novas averiguações devem ser perseguidas para a relação nutrição e reprodução, uma vez que, os efeitos positivos da suplementação da vitamina A na espermatogênese foram evidenciados, principalmente nas características que mais se relacionam com a formação da célula espermática, as anormalidades morfológicas, percentual de espermatozóides vivos e número total de espermatozóides no ejaculado. / The objectives of the study were: (a) to evaluate the effect of vitamin A supplementation on boars? diet considering the parameters: volume, motility, spermatic vigor, seminal pH, spermatic concentration, total number of spermatozoa, percentage of living sperm cells and morphologic abnormalities during one year; (b) to investigate the variability founded against the temperature and seasons of the year on vitamin A supplemented animals seminal parameters. The research was developed in the Laboratory of Research in Swines, the FMVZUSP, using 10 boars of hybrid lineages. Two treatments were used having the control (level of 25.000 UI of vitamin A/animal/day) and vitamin A supplemented group (level of 40.000 UI of vitamin A/animal/day). The statistical design was random, with repeated measured in time. The analyzed data used was the statistical program Statistical Analysis System (SAS). The probabilities of the interactions in time were determined by Greenhouse-Geisser Epsilon test, considering the significant level 5%. None of the evaluated parameters was significantly different and no detected interaction in time was found treatment. In relation to the effects of the vitamin A on supplementation in one year period it wasn?t have differences among treatments on seminal parameters, and also there wasn?t interaction in time and at treatment, however for pH, spermatic concentration, total number of spermatozoa, percentage of living sperm cells and morphologic abnormalities it was detected effect on time. In relation to the variability there wasn?t treatment effect, however there was for all the parameters studied effect of the season. The effect of temperature was only for the percentage of living sperm cells, pH and morphologic abnormalities. It was concluded that at a given metabolic condition of the hybrid animals, new ascertainments must be inquired for the relation nutrition and reproduction, a time that, the positive effect of the suplementation of the vitamin in spermatogenesis had been evidenced, mainly in the characteristics that more become related with the formation of the espermática cell.

Evalúa los criterios analíticos del espermatograma y cuál es su nivel de cumplimiento en laboratorios clínicos de Lima Metropolitana en el año 2016. Realiza un estudio descriptivo de tipo transversal. Utiliza listas de chequeo para la recolección de información. Participan técnicos de laboratorio y tecnólogos médicos que realizan la prueba de espermatograma; procedentes de laboratorios clínicos de Lima Metropolitana. La lista de chequeo fue validada mediante el método de juicio de expertos y completada por un observador mientras el profesional de laboratorio procesaba la muestra. Se usaron los programas Microsoft Excel 2003 y IBM SPSS Statistics Visor versión 23 para el análisis estadístico. Se obtuvieron 31 listas de chequeo; 21 tecnólogos médicos y 10 técnicos de laboratorio clínicos; en 11 laboratorios de Lima Metropolitana. Encuentra que el mayor nivel de cumplimiento en el procesamiento del espermatograma por laboratorio fue de 64% y por total de profesionales de laboratorio fue del 51%; clasifican la movilidad total en tres categorías, utilización de la coloración de Papanicolau y evaluación de la concentración espermática fueron del 36%, 9% y 100% respectivamente por laboratorio. El porcentaje de cumplimiento del protocolo de trabajo es del 63.4% para tecnólogos médicos y 56.1% para técnicos de laboratorio clínico. Concluye que el nivel de cumplimiento del espermatograma de los laboratorios clínicos no fue del cien por ciento, asimismo, se estableció que los criterios analíticos empleados son los recomendados por la OMS; pero algunos criterios analíticos son excluidos de su protocolo de trabajo según lo crea conveniente el laboratorio. Estos hallazgos sugieren una necesidad urgente de estandarizar el análisis de semen con controles de calidad aceptables para cada parámetro, y desarrollar un programa de control de calidad nacional para que los resultados sean repetibles y significativos. / Tesis

Le sperme est le vecteur principal de dissémination du VIH. Des travaux récents indiquent la présence de facteurs dans le liquide séminal (LS) des hommes non infectés qui modulent l'infectivité par le VIH de cellules in vitro. Nous avons préalablement montré que les principaux organes génitaux mâles qui contribuent à l'élaboration du sperme sont infectés par le VIH, ce qui modifie probablement la composition du LS des hommes VIH+. Pour preuve, des différences significatives dans les profils cytokiniques ont été mises en évidence dans le LS d'hommes VIH+ par rapport à celui d'hommes sains. Dans ce contexte, mes travaux de thèse se sont articulés autour de 3 axes : Effet du sperme d'hommes infectés par le VIH-1 sur l'infection des lymphocytes T CD4+ : nous avons comparé, pour la première fois à notre connaissance, l'effet du LS d'hommes infectés versus celui d'hommes sains sur l'infectivité par le VIH dans des modèles cellulaires. Nous avons mis en évidence un effet différentiel du LS d'hommes séropositifs par rapport au LS d'hommes séronégatifs. L'effet stimulateur observé du LS d'hommes VIH-non-infectés sur l'infection par le VIH-1 des cellules T CD4+ est significativement diminué pour les LS d'hommes VIH+. Cet effet différentiel serait au moins en partie lié à la surexpression de certaines cytokines dont RANTES et à la sous expression à la membrane du corécepteur CCR5. Effet du LS sur l'infection d'explants cervicaux et colo-rectaux : les muqueuses cervivo-vaginale et colorectale représentent des portes d'entrée majeures du virus dans l'organisme et sont donc des modèles particulièrement physiologiques. Nous avons montré que le LS induit une diminution de l'infection ex vivo des tissus exocervicaux alors qu'aucun effet n'est observé sur l'infection des tissus colorectaux. Fractionnement du liquide séminal et identification des facteurs à activité biologique sur l'infection par le VIH-1 : nous avons débuté une approche protéomique qui nous a permis de décomplexifier le LS par fractionnement grâce à des HPLC successives, de sélectionner des fractions biologiques actives et d'identifier des protéines candidates, par spectrométrie de masse, potentiellement responsables d'un effet inhibiteur sur l'infection par le VIH-1. Sur la base de la littérature et de nos résultats, il apparaît clairement que le LS est un fluide biologique complexe dont l'effet global sur l'infection résulte de la somme des activités biologiques de facteurs stimulateurs et inhibiteurs. En outre, l'effet du sperme sur l'infection est dépendant du modèle d'étude cellulaire ou tissulaire, et du statut sérologique du donneur. En effet, les différences de composition (cytokines, peptides antimicrobiens…) entre les spermes d'hommes infectés ou non aboutissent à des modifications dans la modulation de l'infection VIH-1 par le sperme via des mécanismes directs ou indirects qui ouvrent de nombreuses perspectives d'études. / Semen represents the main vector of HIV transmission. Several studies have recently shown that, in addition of being a carrier of HIV particles and infected cells, seminal fluid (SF) could modulate the efficiency of HIV infection of target cells through its intrinsic properties. These studies were all performed with SF from uninfected donors. But the composition of SF from HIV-infected men significantly differs from that of HIV-infected men, as demonstrated by studies on SF cytokines content, and microbiome. In addition, we showed that semen-producing organs are infected by HIV which most probably influences their seminal secretions. As a matter of fact, the volume of the ejaculate of HIV+ donors is generally less than that of uninfected men. In this context, my thesis was articulated around 2 axes: Effect of SF from HIV infected men on HIV-1 infection of Lymphocytes T CD4+: the effect of SF from HIV-infected men (HIV+SF) versus SF from uninfected donors (SF) on HIV infectivity of CD4+ T cells. We observed a significantly reduced infection of CD4+T cells by HIV-1 R5 in presence of HIV+SF as compared with SF, the latter displaying enhancing activity. This differential effect was not observed on the infectivity of the CD4+ cell line TZM-bl, or on PBMC infection by HIV-1 X4. We compared the composition of HIV+SF versus SF in terms of enhancing peptides, cytokines and prostaglandins, and investigated the impact of SF from both HIV-infected and uninfected men on CD4+T cell HIV receptors expression, activation and proliferation. HIV+SF vs HIV-SF was found to induce a significantly higher downmodulation of CCR5 expression shortly after exposure, which correlated with the concentrations of CCR5 ligands in semen. Effect of SF on HIV infection of cervix and colorectal tissues: the cervix and colorectal mucosa represent major front doors of the virus in the body and are thus particularly physiological models. We showed that the SF leads to a decrease of the infection ex vivo in exocervix tissues while no effect is observed on the infection of colorectal tissues. Fractionation of the seminal fluid and identification of factors with biologic activity on the HIV-1 infection : we had beginning a proteomic approach which allowed to decomplexified SF by successive HPLC, to select active biological fractions and to identify candidate proteins, by mass spectrometry, potentially responsible for an inhibitory effect on the infection by the HIV 1. Based on the literature and on our results, it clearly appears that SF is a complex biological fluid. Moreover, the effect of the semen on HIV-1 infection is dependent on the cellular or tissular model and on the HIV status of the donor. Indeed, the differences of composition (cytokines, antimicrobial peptides) between semen from infected men or SF from uninfected men lead to modifications of the modulation of HIV-1 infection by semen via direct or indirect mechanisms which which pave the way for further investigations.