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Avaliação dos efeitos sistêmicos induzidos por uma fosfolipase A2 isolada da peçonha da serpente Bothrops moojeni

Costa, Kellen Cristina Torres 27 July 2017 (has links)
N-Biofar - Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Nano-Biofarmacêutica / A peçonha das serpentes é considerada a mais complexa dentre as peçonhas do reino animal com uma grande mistura de componentes e propriedades tóxicas. Dentro deste conjunto de compostos orgânicos e inorgânicos destacam-se as fosfolipases A2 (PLA2s), uma superfamília de enzimas que catalisa a hidrólise de fosfofolipídeos, liberando diversos produtos de acordo com o sítio de ação no substrato. Por despertar grande interesse clínico, diversos estudos retrataram a caracterização estrutural e funcional de PLA2s isoladas da peçonha de serpentes botrópicas. O presente trabalho teve como objetivo descrever a purificação de uma PLA2 da serpente Bothrops moojeni, denominada BmooTX-I (SANTOS-FILHO et al., 2008), e avaliar os efeitos sistêmicos induzidos pela enzima em animais experimentais. A toxina foi purificada utilizando colunas de cromatografia de troca iônica (DEAE Sephacel) e de exclusão molecular (Sephadex G-75). A análise por SDS-PAGE mostrou que a BmooTX-I apresenta massa molecular aparente de 15 kDa. A atividade catalítica da toxina foi significativamente alta quando comparada com a peçonha bruta de B. moojeni. A BmooTX-I alterou parâmetros físicos-químicos na urina dos animais, e ainda, provocou importantes alterações sistêmicas relacionadas ao fígado, músculo, rins e pâncreas. Sendo assim, este trabalho pode contribuir sobremaneira para área médico-científica, uma vez que agrega informações para possíveis descobertas de terapias mais específicas para acidentes botrópicos, e ainda, pelo fato das fosfolipases A2 estarem diretamente relacionadas a diversas patologias. / Snakes venom is considered the most complex venom of the animal kingdom with a great mixture of components and toxic properties. Within this group of organic and inorganic compounds are the phospholipases A2 (PLA2s), a superfamily of enzymes that catalyzes the hydrolysis of phospholipids releasing several products according to the site of action on the substrate. Due to great clinical interest, several studies have portrayed the structural and functional characterization of PLA2s isolated from the venom of bothropic snakes. The present work aimed to describe the purification of a PLA2 isolated from Bothrops moojeni, called BmooTX-I, and evaluate evaluate the enzyme-induced systemic effects in experimental animals.. The toxin was purified using size ion-exchange (DEAE-Sephacel) and molecular exclusion (Sephadex G-75) columns. SDS-PAGE showed that BmooTX-I has an apparent molecular mass of 15 kDa. Its catalytic activity was significantly high when compared to the crude venom of B. moojeni. BmooTX-I altered physical-chemical parameters in the urine of animals and also caused important systemic changes related to the liver, muscle, kidneys and pancreas. Therefore, this work can contribute greatly to the medical-scientific area since it aggregates information for possible discoveries of more specific therapies for bothropic acidentes, and also, because phospholipases A2 are directly related to various pathologies. / Dissertação (Mestrado)
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Microbiota da cavidade oral e da peçonha de Bothrops atrox Linnaeus, 1758 (Ophidia: Viperidae)

Pereira, Heloisa Castro 27 April 2015 (has links)
Interest in research about Bothrops snake is growing, since the venom of these animals are used for therapeutic purposes. This study aimed to determine the bacteria in the oral cavity and venom in snakes of the species Bothrops atrox of a commercial breeding. We used 12 samples taken with the aid of sterile swab in the sheath region of prey, in animals with stomatitis, 30 samples of secretion in the mouth of healthy snakes and their dehydrated venom. The Samples were plated on agar- agar XLD blood and subsequently held If Gram staining and catalase tests and mannitol for Gram positive bacteria identification. For the identification of Gram negative bacteria was employed biochemical screening with Rugai medium Lysine. In the 30 healthy animals and six samples of venom the following Gram negative bacteria were isolated: Proteus spp (34.15%), Escherichia coli (26.84%), Citrobacter spp (14.63%), Serratia spp (9.75 %) and Enterobacter spp (7.31%) and Gram positive: Staphylococcus spp (4.88%) and Bacillus cereus (2.44%). In the 12 snakes with stomatitis Escherichia coli was isolated (26.31%), Citrobacter spp (21.05%), Proteus spp (15.78%), Salmonella (10.52%), and Staphylococcus spp (26.31%). Fisher\'s exact test showed a significant difference between samples of Staphylococcus spp from healthy snakes and serpents with stomatitis, suggesting that this microrganism is related to the cases of stomatitis in Bothrops atrox. / O interesse por pesquisas com serpentes do gênero Bothrops está em crescimento, já que a peçonha destes animais é utilizada para fins terapêuticos. Objetivou-se avaliar as bactérias presentes na cavidade oral e na peçonha em serpentes da espécie Bothrops atrox de um criatório comercial. Utilizaram-se 12 amostras colhidas com auxílio de swab esterilizado na região da bainha da presa, em animais que apresentavam estomatite, 30 amostras de secreção da cavidade oral em serpentes saudáveis e as respectivas peçonhas desidratadas, totalizando seis amostras de peçonha. As amostras foram encaminhadas ao Laboratório de Doenças Infectocontagiosas em meio de transporte Stuart. As amostras foram semeadas em Ágar-sangue e Ágar XLD, posteriormente realizou-se Coloração de Gram e provas de Catalase e Manitol para identificação de bactérias Gram positivas, já para identificação das bactérias Gram negativas empregou-se triagem bioquímica com o Meio de Rugai com Lisina, Kit comercial para identificação de Enterobactérias. Nos 30 animais saudáveis e seis amostras de peçonha foram isoladas as seguintes bactérias Gram negativas: Proteus spp (34,15%), Escherichia coli (26,84%), Citrobacter spp (14,63%), Serratia spp (9,75%) e Enterobacter spp (7,31%) e Gram positivas: Staphylococcus spp (4,88%) e Bacillus cereus (2,44%). Nas 12 serpentes com estomatite isolou-se Escherichia coli (26,31%), Citrobacter spp (21,05%), Proteus spp (15,78%), Salmonella spp (10,52%) e o Staphylococcus spp (26,31%). Através do Teste exato de Fisher encontrou-se diferença significativa de Staphylococcus spp entre amostras de serpentes saudáveis e serpentes com estomatite, o que sugere que este microrganismo está relacionado com os casos de estomatite em Bothrops atrox. / Mestre em Ciências Veterinárias
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Alterações dos parâmetros de comportamento de ratos tratados com peptídeo rico em prolina da serpente Bothrops jararaca, Bj-PRO-7a / Alterations of rats behavioral parameters treated with proline rich peptide of snake Bothrops jararaca, Bj-PRO-7a

Turones, Larissa Córdova 16 May 2018 (has links)
Submitted by Franciele Moreira (francielemoreyra@gmail.com) on 2018-06-22T20:27:16Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Larissa Córdova Turones - 2018.pdf: 2576144 bytes, checksum: fb628d04d3221c6ac7ccaf79cc3d60ea (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Rejected by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com), reason: on 2018-06-22T20:38:02Z (GMT) / Submitted by Franciele Moreira (francielemoreyra@gmail.com) on 2018-06-22T20:39:29Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Larissa Córdova Turones - 2018.pdf: 2494325 bytes, checksum: 52754820438d7cd88e3dc298a96a898a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-06-27T11:25:24Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Larissa Córdova Turones - 2018.pdf: 2494325 bytes, checksum: 52754820438d7cd88e3dc298a96a898a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-27T11:25:24Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Larissa Córdova Turones - 2018.pdf: 2494325 bytes, checksum: 52754820438d7cd88e3dc298a96a898a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-05-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The Bj-PRO-7a, a heptapeptide isolated and identified from Bothrops jararaca (Bj) venom, evoke potent therapeutic effects, as antihypertensive effect, natriuretic and diuretic effects, promotion of angiogenisis and vasodilatation. The effects of heptapeptide are independent of Angiotensin Converting Inhibitor (ACE), possibly dependent of Muscarinic Receptors subtype 1 (M1R) activation and oxido nitric pathways. Also, the Bj-PRO-7a actions upon central nervous system still need to be evaluated. Thus, the aims of this study were: i) to assess the effects of acute administration of Bj-PRO-7a upon behavior; ii) to reveal mechanisms involved in the effects of Bj- PRO-7a upon locomotion/exploration, anxiety and depression-like behaviors. For this purpose, adult male Wistar (WT) and Spontaneous Hypertensive Rats (SHRs) (300-380 g) received i.p. injections of Vehicle (NaCl 0.9%), Diazepam (2 mg/kg), Imipramine (15 mg/kg), Bj-PRO-7a (71, 213 or 426 nmol/kg), Pirenzepine (852 nmol/kg), α-metil-DL-tirosina (200 mg/kg) or Chlorpromazine (2 mg/kg) and were placed in the Elevated Plus Maze (EPM), Open Field (OF) and Forced Swimming (FS) tests. The heptapeptide promoted anxiolytic and antidepressantlike effects and increased the locomotion/exploration. These effects of Bj-PRO-7a seem to be strongly dependent on activation of M1R, catecholaminergic paths and dopaminergic receptors. / O Bj-PRO-7a, um heptapeptídeo isolado e identificado no veneno da Bothrops jararaca (Bj), evoca potentes efeitos terapêuticos, tais como o efeito anti-hipertensivo, efeitos natriurético e diurético, promoção da angiogênese e vasodilatação. Os efeitos do hepapeptídeo são independentes da inibição sobre a Enzima Conversora de Angiotensina (ECA), possivelmente dependentes da ativação dos Receptores Muscarínicos de Acetilcolina subtipo 1 (M1Rs) e vias do óxido nítrico. Ademais, as ações do Bj-PRO-7a sobre o sistema nervoso central ainda precisam ser avaliadas. Assim, os objetivos deste estudo foram: i) acessar os efeitos da administração aguda do Bj-PRO-7a sobre o comportamento; ii) revelar os mecanismos envolvidos nos efeitos do Bj-PRO-7a sobre a locomoção/exploração, comportamento tipo-ansiedade e depressão. Para esse propósito, ratos machos adultos Wistar (WT) e Espontaneamente Hipertensos (SHR) (300-380 g) receberam injeções i.p. de Veículo (NaCl 0,9%), Diazepam (2 mg/kg), Imipramina (15 mg/kg), Bj-PRO-7a (71, 213 ou 426 nmol/kg), Pirenzepina (852 nmol/kg), α-metil-DL-tirosina (200 mg/kg) ou Clorpromazina (2 mg/kg) e foram colocados nos testes de Labirinto em Cruz Elevado (LCE); Campo Aberto (CA) e Nado Forçado (NF). O heptapeptídeo promoveu efeito tipo-ansiolítico e antidepressivo e aumentou a locomoção/exploração. Esses efeitos parecem ser fortemente dependentes da ativação dos M1Rs, vias catecolaminérgicas e receptores dopaminérgicos.
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Inervação noradrenérgica na ativação da glândula de veneno da serpente Bothrops jararaca. / Noradrenergic innervation in activation of venom gland of Bothrops jararaca snake.

Milene Schmidt do Amaral e Luna 20 February 2008 (has links)
Neste trabalho, mostramos que a extração de veneno promove aumento na ativação dos fatores de transcrição NF<font face=\"symbol\">kB e AP-1. Noradrenalina, liberada após extração de veneno, é responsável por esse aumento. A estimulação dos adrenoceptores <font face=\"symbol\">a e <font face=\"symbol\">b estão envolvidos nessa resposta, entretanto, o grau de ativação de AP-1 é alterado dependendo do tempo. Foi verificado dimorfismo sexual na ativação dos fatores de transcrição da glândula de veneno, sendo a ativação de NF<font face=\"symbol\">kB mais rápida nas fêmeas do que nos machos e a ativação de AP-1 maior nas fêmeas. Mostramos ainda que a extração de veneno ativa a glândula de veneno através da estimulação da inervação noradrenérgica. Noradrenalina atuando em adrenoceptores <font face=\"symbol\">a e <font face=\"symbol\">b regula a síntese de proteínas da glândula de veneno e não a síntese de toxinas do veneno. Em conclusão, a estimulação da inervação noradrenérgica desencadeia o ciclo de produção de veneno regulando a síntese de proteínas da glândula que provavelmente são essenciais para sua ativação e posterior produção de veneno, através da ativação de fatores de transcrição. Thesis: Noradrenergic Innervation in activation of venom gland of Bothrops jararaca snake. / In this work we showed that venom extraction increases the activation of transcription factors like NF<font face=\"symbol\">kB and AP-1. Noradrenaline released after venom extraction is responsible for NF<font face=\"symbol\">kB and AP-1 activation. Stimulation of both <font face=\"symbol\">a- and <font face=\"symbol\">b-adrenoceptors is involved in this response, however the increase of AP-1 activation is time dependent. A sexual dimorphism has been verified in NF<font face=\"symbol\">kB and AP-1 activation. Activation of NF<font face=\"symbol\">kB occurs earlier in female than in male snakes and activation of AP-1 is greater in female than in male snakes. We also showed that venom extraction activates venom gland by stimulating noradrenergic innervation. Noradrenaline acting at both <font face=\"symbol\">a- and <font face=\"symbol\">b-adrenoceptors regulates synthesis of protein of the venom gland, but not the toxin of the venom. In conclusion, stimulation of noradrenergic innervation triggers the venom production cycle by regulating synthesis of protein that probably is essential to activate venom gland to produce venom by activating transcription factors.
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Veneno da serpente Bothrops lanceolatus: caracterização, ativação do sistema complemento e mecanismos potenciais envolvidos no envenenamento. / Bothrops lanceolatus snake venom: characterization, activation of the complement system and potential mechanisms involved in envenoming.

Marie Paule Jacqueline Delafontaine 27 June 2016 (has links)
Na Martinica, os envenenamentos por Bothrops lanceolatus apresentam um quadro clínico trombótico, acompanhado de inflamação local extensa, envolvendo edema, dor e hemorragia limitada. Neste estudo foi mostrado que vários componentes do veneno compartilham similaridades antigênicas com venenos de espécies da América do Sul. O veneno de B. lanceolatus é citotóxico para queratinócitos e células endoteliais, induzindo a produção de citocinas e quimiocinas pro-inflamatórias pelas células. O veneno de B. lanceolatus ativa a cascata do complemento, liberando anafilatoxinas, assim como o complexo terminal do complemento. Ele apresenta uma ação proteolítica sobre os componentes purificados C3, C4, C5, e o inibidor de C1, C1-INH. O veneno também desequilibra o balanço de expressão dos reguladores do complemento na membrana das células endoteliais. Estes dados demonstram que o veneno de B. lanceolatus exibe uma potente ação proinflamatória, pela ativação do sistema complemento e pela sua toxicidade em células endoteliais. / In Martinique envenomations by Bothrops lanceolatus are characterized by a systemic thrombotic syndrome and important local inflammation, involving oedema and pain, but limited haemorrhage. In this study, we show that several components of B. lanceolatus venom share antigenic similarities with South American Bothrops species. Still, B. lanceolatus venom proteases present substrate specificity. The venom is cytotoxic for keratinocytes and endothelial vascular cells, inducing the production of pro-inflammatory cytokines and chemokines. B. lanceolatus venom activates the complement cascade, releasing anaphylatoxins and the terminal complement complex. It also shows a direct proteolytic activity upon the purified complement proteins C3, C4, C5, and the inhibitor of C1, C1-INH. B. lanceolatus venom modified the balance of complement regulators on endothelial cells membrane. In conclusion, B. lanceolatus venom displays important pro-inflammatory properties, as it activates the complement cascade and impacts endothelial cells.
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Purificação e caracterização de uma fosfolipase A2 do veneno amarelo de serpentes Crotalus durissus collilinetaus / Purification and characterization of a phospholipase A2 from the venom of Crotalus durissus yellow collilinetaus

SANTANA, Pedro Henrique Camargo 29 June 2009 (has links)
Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pedro henrique(parte_2)_Recorrigida.pdf: 952650 bytes, checksum: 7afd49b434f553dda644f41af93f0152 (MD5) Previous issue date: 2009-06-29 / In Brazil, the snake Crotalus durissus collilineatus is much studied, particularly its component crotoxina. The crotoxina is the most toxic component of venom from the species cascavéis amicanas Crotalus durissus. It is composed of two different subunits, the crotapotina (acid component) and a phospholipase A2 (basic component). The enzyme phospholipase A2 is the most studied of these poisons, being largely responsible for its toxicity. Its main effects are neurotoxicity, myotoxicity, cytotoxicity, platelet aggregation, anti-coagulant and bactericide. This study aims to purify and characterize a new phospholipase A2 isolated from Crotalus durissus collilineatus, and uses it as a model for studies of compounds with potential antinflamatório. Samples (5mg) of crude venom of Crotalus durissus collilineatus were applied on a C18 column coupled to a system semipreparativa HPLC. 20 peaks were obtained for proteins / peptides, and the increased activity of fofolipase (PLA) was detected in fraction 14. This fraction was subjected to a new phase chromatography on C18 analytical column, resulting in the isolation of a new PLA. By electrophoresis, SDS-PAGE the enzyme showed high degree of purity, with molecular mass around 13 kDa. The PLA2 activity showed optimal at pH of 8.2 and at temperatures between 35-40 º C and remains stable up to temperatures of 60 º C. According to our experiments isolated PLA was inhibited Ca2 +, and activity was not changed by Cu2 +. Manaca extract, ellagic acid and quercetin strongly inhibited the PLA, showing that this enzyme has potential for the selection of compounds with potential antiinflammatory. / No Brasil, a serpente Crotalus durissus collilineatus é muito estudada, devido a sua importância médica, já que é uma das responsáveis pelo envenenamento crotálico. A crotoxina é o componente mais tóxico do veneno das cascavéis sulamericanas da espécie Crotalus durissus. É composta por duas diferentes subunidades, a crotapotina (componente ácido) e uma fosfolipase A2 (componente básico). As fosfolipases A2 é a enzima mais estudada destes venenos, sendo a maior responsável por sua toxicidade. Dentre seus principais efeitos estão os efeitos neurotóxico, miotóxico, citotóxico, agregação plaquetária, anti-coagulante e bactericída. Este estudo tem como objetivo caracterizar uma nova fosfolipase A2 isolada de Crotalus durissus collilineatus, e utilizá-la como modelo para estudos de compostos com potencial antinflamatório. Amostras do veneno bruto de Crotalus durissus collilineatus foram aplicados em uma coluna C18 semipreparativa acoplada a um sistema HPLC. Foram obtidas 20 picos de proteínas/peptídios, sendo que a maior atividade de fofolipase (PLA) foi detectada na fração 14. Esta fração foi submetida a uma nova etapa cromatográfica, em coluna C18 analítica, resultando no isolamento de uma nova PLA. Através de eletroforese, SDS-PAGE a enzima apresentou alto grau de pureza, com massa molecular em torno de 13 kDa. A PLA2 apresentou atividade ótima em pH de 8,2 e temperatura entre 35-40 ºC, e se mantendo estável em temperaturas de até 60 ºC. De acordo com nossos experimentos a PLA isolada foi inibida Ca2+, e a atividade não foi alterada por Cu2+. Extrato de manacá, ácido elágico e quercetina inibiram fortemente a PLA, mostrando que esta enzima tem potencial para a seleção de compostos com potencial antiinflamatório.
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Caracterização funcional e estrutural de uma nova fosfolipase A2 ácida de Bothrops moojeni / Functional and structural characterization of a new acidic phospholipase A2 from Bothrops moojeni

Lucas Blundi Silveira 26 January 2012 (has links)
As fosfolipases A2 (PLA2s) são enzimas que induzem vários efeitos farmacológicos e geralmente, correspondem a maior porcentagem do conteúdo protéico dos venenos de serpentes. Desta forma, o isolamento e a caracterização bioquímica, funcional e estrutural de PLA2s poderão gerar informações importantes para o melhor entendimento dos efeitos farmacológicos e de efeitos tóxicos ocasionados por estas proteínas. Através de dois métodos cromatográficos (troca-iônica em CM-Sepharose e hidrofóbica em Phenyl-Sepharose) foi isolada uma isoforma de fosfolipase A2 ácida presente na peçonha da serpente Bothrops moojeni, denominada de BmooPLA2. Quando submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida com agente desnaturante, BmooPLA2 apresentou massa molar relativa de aproximadamente 14.000. A proteína isolada, BmooPLA2, possui uma única cadeia polipeptídica, pI~5,2, é rica em aminoácidos hidrofóbicos, ácidos e possui 14 resíduos de cisteína. Esta isoforma pH-termoestável apresentou alta atividade fosfolipásica. A enzima induziu edema moderado in vivo, na concentração de 25 g. Além disso, a BmooPLA2 foi capaz de inibir a agregação plaquetária de modo dose dependente e induzir efeito hipotensor nas concentrações de 15 e 30 g . Foi realizada também a construção da biblioteca de cDNA da glândula de peçonha da serpente Bothrops moojeni, onde o cDNA que codifica a proteína BmooPLA2 foi clonado e a proteína recombinante expressa em E. coli. Todos os ESTs (Expressed Sequence Tags) foram classificados de acordo com a homologia de sua estrutura primária com sequências conhecidas. As sequencias codificando para toxinas representaram cerca de 30% do total de sequências identificadas. De acordo com o transcriptoma, as toxinas mais expressas pela serpente Bothrops moojeni são as metaloproteases (SVMP), as quais correspondem a aproximadamente 77% das toxinas encontradas. A proteína recombinante apresentou a mesma sequência de aminoácidos, atividade fosfolipásica e efeito inibitório sobre plaquetas, observados para a proteína nativa BmooPLA2, sugerindo que a recBmooPLA2 foi expressa, purificada e reenovelada em sua forma ativa. Como nenhum estudo abordou a participação das PLA2s ácidas de Bothrops nos processos inflamatórios e os mecanismos envolvidos na liberação desses mediadores, particularmente os prostanóides, as toxinas nativa e recombinante foram avaliadas quanto ao seu efeito sobre a resposta inflamatória (ensaios sobre leucócitos in vitro), avaliando a expressão da enzima COX-2 e liberação do prostanóide PGE2, além de outros mediadores como TXB4 e LTB2, após a incubação com macrófagos isolados, in vitro. Com estes resultados foi possível uma melhor compreensão da composição da peçonha desta serpente, bem como um melhor entendimento da participação das PLA2s ácidas envenenamento ofídico, abrindo novas perspectivas para sua aplicação biotecnológica. / The phospholipase A2 (PLA2s) are enzymes that induce various pharmacological effects and usually correspond to a higher percentage of the protein content of snake venoms. Thus, isolation, biochemical, functional and structural characterization of PLA2s may generate important information for a better understanding of the pharmacological effects and toxicity induced by these proteins. Through two chromatographic steps (ion exchange on CMSepharose and hydrophobic in Phenyl-Sepharose) an acidic phospholipase A2 isoform was isolated from the venom of the snake Bothrops moojeni and named BmooPLA2. Its biochemical and partial functional characterization were also performed. When submitted to electrophoresis on polyacrylamide gel with denaturing agent (SDS-PAGE), BmooPLA2 presented relative molar mass of approximately 14,000. The isolated protein, BmooPLA2, has a single polypeptidic chain, pI ~ 5.2, is rich in hydrophobic amino acids and has 14 cysteine residues. This pH-thermostable isoform showed high phospholipasic activity. The enzyme induced moderate edema in vivo, at the concentration of 25 g. In addition, BmooPLA2 was able to inhibit platelet aggregation in a dose dependent manner and showed hypotensive effect at different concentrations (15 and 30 g). It was also carried out the construction of the cDNA library from the venom gland of the snake Bothrops moojeni, where the cDNA encoding the protein BmooPLA2 was cloned and a recombinant protein expressed in E. coli. All ESTs (Expressed Sequence Tags) were classified according to their primary structure homology with known sequences. The sequences coding for toxins accounted for approximately 30% of all identified sequences. According to the transcriptome, the majority of the toxins expressed by the snake Bothrops moojeni are metalloproteases (SVMP), which correspond to approximately 77% of the toxins found. The recombinant protein presented the same amino acid sequence, phospholipase activity and inhibitory effect on platelets, observed for the native BmooPLA2, suggesting that recBmooPLA2 was expressed, purified and refolded in its active form. Since no study has addressed the involvement of acidic PLA2s from Bothrops genus upon inflammatory processes and the mechanisms involved in the release of such mediators, particularly prostanoids, native and recombinant toxins were evaluated for their effects on the inflammatory response (essays on leukocytes in vitro), evaluating the expression of COX-2 and prostanoid release of PGE2, as well as other mediators as TXB4 and LTB2, after incubation with isolated macrophages, in vitro. With these results it was possible to better understand the composition of the venom of this snake, and a better understanding of the role of acidic PLA2s on the snake envenomation, opening new perspectives for its biotechnological application.
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Estudo das interações entre fosfolipases A2 e o inibidor vegetal, ácido rosmarínico de Cordia verbenacea (Boraginaceae) por cocristalização e modelagem molecular / Study of interactions between phospholipases A2 and the plant inhibitor, rosmarinic acid from Cordia verbenacea (Boraginaceae) by co-crystallization and molecular modeling

Lorane Izabel da Silva Melim 30 October 2009 (has links)
As peçonhas de serpente do gênero Bothrops se caracterizam por induzir miotoxicidade, edema, coagulação e hemorragia. Por essa razão, alguns pesquisadores estão buscando por tratamentos alternativos contra os envenenamentos ofídicos com inibidores naturais e artificiais. O presente estudo tem como objetivo estudar as interações entre as PLA2s (Asp49 e Lys49) de veneno de serpente Bothrops jararacussu, denominadas BthTX-I e BthTX-II, respectivamente, e o inibidor vegetal isolado da espécie Cordia verbenacea. C. verbenacea apresenta diversas atividades farmacológicas já demonstradas, sendo utilizada também pela população como antiofídica. O extrato hidroalcoólico das folhas preparado à seco, foi submetido a técnicas cromatográficas como Sephadex LH-20 e CLAE, obtendo-se a purificação do princípio ativo antiofídico da planta, denominado ácido rosmarínico. A peçonha de B. jararacussu foi submetida à cromatografia de filtração em gel Sephadex G-75 e, à cromatografia de troca iônica. O ácido rosmarínico (AR) foi isolado do extrato metanólico de C. verbenacea e apresentou inibição da hemorragia provocada pela peçonha bruta de B. jararacussu. Em comparação, o ácido rosmarínico® também inibiu o efeito hemorrágico causado pela peçonha bruta de B. jararacussu. A atividade edematogênica provocada pelas toxinas BthTX-I e II foi avaliada e testada com os inibidores. Ambos AR e AR® não inibiram significativamente a induçào de edema. Resultados semelhantes foram obtidos com as atividades anticoagulante, e fosfolipásica. O ácido rosmarínico, AR e AR®, demonstrou alto efeito inibitório sobre a citotoxicidade e miotoxicidade induzida pela peçonha bruta e pela toxina BthTX-I. Ambos inibidores apresentou um menor efeito sobre a atividade miotóxica induzida pela toxina BthTX-II. Simulações de docking realizadas com três PLA2s e AR mostraram perfis de interações similares, reforçando as principais interações enzima-inibidor obtidas experimentalmente, relatadas na literatura. Os cálculos de derivação de farmacóforo baseados em diferentes inibidores relatados na literatura, assim como estudos de campos de interação molecular foram realizados, nos quais os resultados indicaram as principais modificações na estrutura do inibidor ácido rosmarínico necessárias para otimização. Nas simulações de screening virtual, novos potenciais inibidores de BthTX-I foram selecionados a partir de base de dados de compostos drug-like, direcionando os próximos passos aos testes biológicos, os quais serão realizados com esta fosfolipase e os novos candidatos a inibidores modelados. / Snake venoms from Bothrops genus are characterized by inducing myotoxicity, edema, thrombosis and hemorrhage. Thus, some researchers are searching for alternative treatments against ophidian poisoning with natural and artificial inhibitors. This work aimed study the interactions between PLA2s (Asp49 e Lys49) from Bothrops jararacussu snake venom, named BthTX-I and BthTX-II, respectively, and the inhibitor isolated from Cordia verbenacea plant. C. verbenacea presents several pharmacological activities already demonstrated, and it is also used by the population by its antiophidic activity. The hydroalcoholic extract prepared from the dried leaves, was submitted to chromatographic techniques as Sephadex LH-20 and HPLC, resulting in the purification of the antiophidian compound active from the plant, named rosmarinic acid. B. jararacussu snake venom was submitted to gel filtration chromatography on Sephadex G-75 and ion exchange chromatography. Rosmarinic acid (RA) was isolated from the C. verbenacea methanolic extract and it presented hemorrhage inhibition caused by crude venom from B. jararacussu. In comparison with this, Rosmaric acid® also inhibited the hemorrhagic effect caused by crude venom from B. jararacussu. Edematogenic activity caused by BthTX-I and II was evaluated and tested with the inhibitors. Both, RA e RA® did not inhibit the edema indution significantly. Similar results were obtained with the anticoagulant and phospholipasic activity. The rosmarinic acid, RA e RA®, presented high inhibitory effect for myotoxicity and cytotoxicity induced by crude venom and the toxin BthTX-I. Both inhibitors presented minor effect on myotoxicity activity induced by BthTX-II toxin. Docking simulations performed with three PLA2 and RA have shown similar interactions profiles, corroborating the main enzyme-inhibitor interactions experimentally obtained, reported in literature. Pharmacophore perception calculations based on different inhibitors reported in literature as well as molecular interaction fields studies were here carried out, whose results indicate the main changes in the structure of the rosmarinic acid inhibitor necessary to optimization. In the virtual screening simulations, novel potential BthTX-I inhibitors were selected from drug-like compounds databases, thus guiding next steps towards biological tests, which will must be performed with this phospholipase and the new inhibitor candidates modeled.
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A relação entre a serpente e satã em Paradise Lost

Fernandes, Marcos Aurélio Zamith 18 April 2016 (has links)
Submitted by Marta Toyoda (1144061@mackenzie.br) on 2017-01-13T13:50:19Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Marcos Aurélio Zamith Fernandes.pdf: 1276004 bytes, checksum: f558b72dc2198e6785d76d99ddd20fbf (MD5) / Approved for entry into archive by Paola Damato (repositorio@mackenzie.br) on 2017-01-27T12:59:02Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Marcos Aurélio Zamith Fernandes.pdf: 1276004 bytes, checksum: f558b72dc2198e6785d76d99ddd20fbf (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-27T12:59:02Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Marcos Aurélio Zamith Fernandes.pdf: 1276004 bytes, checksum: f558b72dc2198e6785d76d99ddd20fbf (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-04-18 / This work aims at analyzing the character of Satan in the epic work Paradise Lost by the Puritan writer John Milton (1608-1674). More specifically, it aims at offering an answer to the question: in what manner do the traits of the serpent reflect Satan? In order to do that, the analysis was divided into parts. In the first chapter, it was presented the context of the literary production and reception of the work Paradise Lost in order to show features of this corpus and to relate them to other literary works and with its historical moment. In the second chapter, concepts of the narrative theory of Mieke Bal (1997) were applied to the protagonist so that the analysis of Satan in itself and in relation to other elements of the narrative was theoretically based. Finally, in the third chapter, based on a list of features provided by Charlesworth (2010) about the animal serpent (author's expertise), these features were related to the Milton's serpent so that one comprehends traits of the character of the serpent that together relate to Satan. This analysis is justified because many works were found about the Satan of Paradise Lost, nevertheless none whose theme was delimited in that manner. Once a narrative theory and texts from the literary criticism on Milton and of his epic poem pertinent to the current theme were chosen, it is expected that this dissertation allows the reader of Paradise Lost to acquire a more accurate view on the function of the character of Satan in the plot, particularly in the form of the tempting serpent assumed by Satan. / Este trabalho visa a analisar a personagem Satã da obra épica Paradise Lost do escritor puritano John Milton (1608-1674). Mais especificamente, objetiva-se oferecer uma resposta à questão: de que maneira os traços da serpente refletem Satã? Para isso, a análise se dividiu em partes. No primeiro capítulo, apresentou-se o contexto de produção e recepção literárias da obra Paradise Lost com a finalidade de mostrar características desse corpus e relacioná-las com outras obras literárias e com seu momento histórico. No segundo capítulo, aplicaram-se à protagonista conceitos da teoria da narrativa de Mieke Bal (1997) para que fosse fundamentada teoricamente a análise de Satã em si mesmo e em relação a outros elementos da narrativa. Finalmente, no terceiro capítulo, com base numa lista de características fornecidas por Charlesworth (2010) a respeito do animal serpente (especialidade do autor), relacionaram-se essas características com a serpente de Milton de modo que se compreendessem traços da personagem serpente que em conjunto se relacionam com Satã. Esta análise se justifica na medida em que se encontraram vários trabalhos sobre o Satã de Paradise Lost, no entanto nenhum cujo tema fosse delimitado dessa forma. Escolhidos uma teoria da narrativa e textos da fortuna crítica de Milton e de sua épica pertinentes ao presente tema, espera-se que esta dissertação permita que o leitor de Paradise Lost adquira uma visão mais apurada a respeito da função da personagem Satã na trama, em particular da forma de serpente tentadora assumida por Satã.
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Proteômica e transcriptômica aplicadas ao estudo da variabilidade do veneno de Bothrops jararaca (serpentes:viperidae) / Proteomics and transcriptomics applied to the study of Bothrops jararaca venom variability (Serpentes: Viperidae)

André Zelanis Palitot Pereira 30 May 2011 (has links)
Estudos prévios demonstraram que as atividades biológicas do veneno da serpente Bothrops jararaca sofrem significantes modificações ontogenéticas. Neste estudo é apresentada uma análise comparativa do proteoma, peptidoma e transcriptoma da glândula de veneno de filhotes e adultos de B. jararaca, correlacionando os resultados obtidos com algumas características funcionais dos venenos. Venenos de 694 filhotes de até duas semanas de idade e 110 adultos, provenientes do Estado de São Paulo foram extraídos e liofilizados para as análises proteômicas/peptidômicas e funcionais. O mRNA de glândulas de veneno de 20 filhotes e 10 adultos foi obtido para a contrução de bibliotecas de cDNA e a análise de Expressed Sequence Tag (ESTs). Demonstramos que a atividade hemorrágica é similar para os venenos de filhotes e adultos, enquanto que o veneno de adultos é discretamente mais letal para camundongos; entretanto, o veneno de filhotes mostrou-se extremamente mais letal para aves, uma característica que pode garantir proteção contra potenciais predadores nas fases iniciais de vida da espécie. A atividade coagulante do veneno de filhotes é cerca de 10 vezes mais alta que aquela verificada para o veneno de adultos e é atribuída sobretudo à atividade de metaloproteinases. Essas diferenças nas atividades funcionais se refletiram nos diferentes perfis verificados por eletroforese bidimensional e identificação de spots de proteínas por digestão tripsínica in-gel seguida de análise por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem, zimografia com gelatina, imunocoloração utilizando anticorpos específicos anti-proteinases, e glicoproteínas com afinidade pela concanavalina -A. A comparação dos venenos por derivatização com tags isóbaros (iTRAQ) e a análise das ESTs revelaram diferenças claras entre os níveis de toxinas presentes nos venenos e as metaloproteinases foram a classe de toxinas mais expressa, além de serem as toxinas cujos perfis estruturais apresentaram maior mudança, como ilustrado pelo quociente PIII/PI, que é maior nos venenos de filhotes. Dimorfismo sexual foi detectado em diversas classes de toxinas no veneno de adultos por análises proteômicas e transcriptômicas e, surpreendentemente, o fator de crescimento de nervo foi detectado apenas no veneno/glândula de veneno de machos. A análise glicoproteômica mostrou que N-glicosilações parecem ser as modificações pós-traducionais mais proeminentes nas toxinas de B. jararaca, e os perfis de N-glicosilação apresentaram-se distintos para as proteínas dos venenos de filhotes e adultos. Entretanto, a composição de N-glicanos não variou entre as amostras, indicando que diferenças na utilização de motivos de N-glicosilação poderiam explicar as diferenças nos níveis de glicosilação observados pelos diferentes perfis eletroforéticos dos venenos. A análise da fração peptídica dos venenos de filhotes e adultos por espectrometria de massas resultou num perfil similar de Peptídeos Potenciadores de Bradicinina (BPPs), que foram detectados em suas formas canônicas e também com novas seqüências, cujas estruturas primárias sugerem um processamento da proteína precursora em sítios até então não descritos. Acreditamos que este seja o estudo mais abrangente sobre a variabilidade do veneno de uma serpente já realizado e os resultados demonstram que há uma relação clara entre as alterações ontogenéticas na dieta e tamanho corporal e o proteoma/peptidoma do veneno desta espécie. / Previous studies have demonstrated that the biological activities displayed by the venom of the snake Bothrops jararaca undergo a significant ontogenetic shift. In this investigation, we performed comparative proteomic, peptidomic and transcriptomic analyses of venoms and venom glands from newborn and adult specimens of B. jararaca and correlated the results with the evaluation of functional venom features. Venoms from 694 two-week old newborns and 110 adults from São Paulo state were milked and lyophilized for functional and proteomic/peptidomic analyses. Additionally, mRNA was obtained from the venom glands of 20 newborns and 10 adults and used for the construction of cDNA libraries and Expressed Sequence Tag (ESTs). We demonstrate that newborn and adult venoms have similar hemorrhagic activities, while the adult venom has a slightly higher lethal activity upon mice; however, the newborn venom is extremely more potent to kill chicks, a feature that might ensure protection against potential predators in early stages of B. jararaca life. Interestingly, the coagulant activity of the newborn venom upon human plasma is ten times higher than that of the adult venom and is contributed mainly by metalloproteinases. Differences in functional activities were clearly reflected in the venom different profiles of two-dimensional gel electrophoresis (2D-PAGE) and protein spot identification by in-gel trypsin digestion followed by liquid chromatography and tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), gelatin zimography, immunostaining using specific anti-proteinase antibodies, and concanavalin A-binding proteins. The venom comparison by isobaric tag peptide labeling (iTRAQ) and ESTs analysis revealed clear differences in toxin levels. The metalloproteinases were detected as the toxin class most expressed in the venoms in addition to being the toxins whose structural profile most changed, as illustrated by the ratio P-III/P-I class being higher in newborn venoms. Sexual dimorphism has been detected in various adult venom toxin classes by proteomic and transcriptomic analyses and, interestingly, the nerve growth factor was detected only in the male venom gland/venom. The glycoproteomic analysis showed that N-glycosylation seems to be the most prominent post-translational modification in B. jararaca toxins and the N-glycosylation profiles differed for newborn and adult venom toxins. Nevertheless, the N-glycan composition between the samples did not vary indicating that differences in the utilization of the N-glycosylation motif could be the explanation for the differences in the glycosylation levels indicated by the differential electrophoretic profiles of venom proteins. The analysis of the peptide fraction of newborn and adult venoms by mass spectrometry revealed a similar profile of Bradykinin Potentiating peptides (BPPs), however these were detected in the venoms showing their canonical sequences and also novel sequences corresponding to BPPs processed from their precursor protein at sites so far not described. To the best of our knowledge, this is the most comprehensive study on a snake venom variation and the results clearly demonstrate a relationship between the ontogenetic shift in diet and animal size, and the venom proteome/peptidome in B. jararaca species

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