The methyltranferases Suv39h1 and Suv39h2 place the trimethyl mark on lysine 9 of histone H3 (H3K9me3). Heterochromatin Protein 1 (HP1) interacts with H3K9 through its chromodomain (Nielsen et al., 2001). Kap-1, another heterochromatin associated protein interacts with HP1, and together they help to form the compact heterochromatin structure. Without these methyltransferases, cells have less heterochromatin and increased genomic instability (Peters et al., 2001). Previous work in our lab (unpublished) showed that cells lacking these enzymes were more sensitive to ionizing radiation than wild type cells. This indicated a defect in double strand break repair. We wanted to ask if these cells were also more sensitive to methylating agents that cause damage that is repaired through the BER pathway. We found that cells lacking the Suv39h2 methyltransferase treated with MMS, a methylating agent, were more resistant to methylation damage than the wild type. We also wanted to ask whether Kap-1, a heterochromatin associated protein that interacts with the Suv39h1/2 methyltransferases, was phosphorylated after MMS treatment. We found ATM dependent phosphorylation of Kap-1, indicating that cells had relaxed chromatin after treatment with MMS. We hypothesize that this relaxation of chromatin gives the cells resistance to MMS as it allows for easier repair without the need for chromatin remodeling.

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Der Transkriptionsfaktor CCAAT/Enhancer-Binding Protein alpha (C/EBPa) koordiniert Proliferationshemmung und Differenzierung von myeloiden VorlŠuferzellen und Adipozyten. C/EBPa ist ein transkriptioneller Aktivator von abstammungspezifischen Genen und blockiert den Zellzyklus durch Repression von proliferationsfšrdernden E2F Zielgenen. Die hier gezeigten Daten zeigen, dass auch umgekehrt E2F die transkriptionelle und differenzierungsfšrdernde AktivitŠt von C/EBPa entgegenwirkt. Somit besitzen E2F-C/EBPa eine zentrale Schalterfunktion zwischen Proliferation und Differenzierung. Der Repressionsmechanismus durch E2F ist in mehreren Aspekten neuartig: Zum erstenmal wurde gezeigt, dass E2F einen anderen Transkriptionsfaktor reprimieren kann. E2F reprimiert die transkriptionelle AktivitŠt von C/EBPa ohne Bindung an cis-regulatorischen Elemente, sondern durch direkte Protein-Protein Interaktionen, die die Bindung von C/EBPa an DNA verhindern. Diese Form der transkriptionellen Repression geschieht unabhŠngig von "Pocket-Proteinen''". Patienten mit Akuter Myeloiden LeukŠmie (AML) weisen hŠufig eine gestšrte DNA Bindung von C/EBPa auf, welche ursachlich fŸr granulozitŠren Funktionsstšrungen sein kšnnte. Daher wŠre es wichtig zu analysieren ob E2F die DNA Bindung von C/EBPa in AML Patienten beeintrŠchtigt und ob auf E2F gerichtete Therapien granulozitŠre Reifung wiederherstellen. C/EBPa blockiert Zellproliferation durch vielseitigen Mechanismen. Hier wurde gezeigt, dass C/EBPa mit UBF1, dem Co-Aktivator der RNA Polymerase I, an chromosomalen Foci positioniert wird. Eine €hnlichkeit zu anderen fokalen Strukturen suggeriert, dass C/EBPa die Transkription von Polymerase I regulierten rRNA Gene reprimieren und somit ribosomale Biogenese beeintrŠchtigen kšnnte. Die Assoziation zwischen C/EBPa und UBF1 wird durch die Histon-Methyltransferase SUV39H1 stimuliert. Demnach kšnnte die antiproliferative Funktion von C/EBPa nicht nur auf der Regulierung von RNA Pol II-abhŠngiger Transkription, sondern auch auf der Repression von RNA Pol I regulierter rRNA Synthese basieren. / The transcription factor CCAAT/Enhancer-Binding Protein alpha (C/EBPa) coordinates proliferation arrest and differentiation of myeloid progenitors and adipocytes. C/EBPa acts as a transcriptional activator of lineage specific genes and blocks the cell cycle by repressing transcription of E2F-regulated genes. Data presented here suggest that also inversely E2F interferes with the transcriptional activity of C/EBPa, counteracting C/EBPa-mediated differentiation processes. Thus, E2F-C/EBPa are part of a switch mechanism between proliferation and differentiation. The mechanism by which E2F suppresses C/EBPa-mediated transactivation is novel in several aspects. E2F acts as a co-repressor of another transcription factor, C/EBPa, without binding to cis-regulatory elements, but by direct protein-protein interactions that abolish the binding of C/EBPa to DNA. This mechanism of transcriptional repression occurs independent of pocket proteins. Disturbed DNA binding of C/EBPa is often observed in AML patients suggesting a causative role in granulocytic disorders. Thus, it would be of main interest to analyze whether E2F mediates disruption of C/EBPa''s DNA-binding in AML patients and whether therapies directed against E2F could restore granulocytic maturation. Despite the extensive knowledge of mechanisms involved in the inhibitory function of C/EBPa, it has not been addressed whether C/EBPa may impinge on cell proliferation by affecting the ribosomal biogenesis of a cell. This work demonstrates an association of C/EBPa to the RNA Pol I transcription factor UBF1, both proteins retained in large chromosomal foci. Similarities to other focal structures associated to UBF1, suggest that C/EBPa may repress transcription of Pol I-transcribed rRNA genes, and thus affect ribosomal biogenesis. The enrichment of C/EBPa at sites of UBF1 is induced by the histone methyltransferase SUV39H1. Thus, C/EBPa may not only control lineage commitment and cell proliferation by regulating genes transcribed by RNA Pol II, but also may act as a repressor of RNA Pol I mediated rRNA synthesis.

Chez les eucaryotes, l’expression des gènes dépend en partie du degré de compaction de la chromatine. La structure chromatinienne est régulée par des marques dites épigénétiques,telles que les modifications post-traductionnelles des protéines structurelles de la chromatine, les histones. Ainsi, la méthylation de la lysine 9 de l’histone H3 (H3K9) sur le promoteur des gènes est essentiellement associée à la répression de la transcription. H3K9 est méthylée par différentes enzymes appelées lysine méthyltransférases (KMTs). L’objectif principal de mon projet de thèse a été de mieux comprendre le rôle de principales KMTs de H3K9, que sontG9a, GLP, Suv39h1 et SETDB1, dans la régulation de l’équilibre entre prolifération et différenciation terminale. Pour cela, j’ai utilisé le modèle de différenciation terminale de cellules du muscle squelettique. En effet, durant la différenciation terminale, les myoblastes arrêtent de proliférer et fusionnent entre eux pour former de longues cellules multi nucléées que sont les myotubes. Ce processus implique, d’une part, l’expression des gènes de différenciation musculaire et, d’autre part, la répression irréversible des gènes associés à la prolifération cellulaire. L’introduction bibliographique de ce travail de thèse est séparée en trois chapitres. Le premier chapitre porte sur la chromatine et ses modifications post-traductionnelles. Le second s’attache à décrire les rôles de la méthylation de H3K9 et, en particulier, des quatre KMTs sur lesquelles j’ai travaillé durant ma thèse : G9a, GLP, SETDB1 et Suv39h1. Dans le troisième chapitre, je présente le modèle de la différenciation terminale du muscle squelettique. Dans la partie "Résultats", je décris deux des principales études que j’ai menées durant ma thèse. La première porte sur les rôles antagonistes de G9a et GLP. La seconde porte sur le rôle de SETDB1 durant la différenciation musculaire. Les résultats que j’ai obtenus sont discutés dans cette partie. Je conclus ce manuscrit en discutant mes résultats de manière plus générale et en proposant des perspectives à long terme. Enfin, une annexe présentera les autres articles de recherche auxquels j’ai participé pendant ma thèse. / In eukaryotes, gene expression partly relies on chromatin compaction degree. Chromatin status is controlled by epigenetic marks, such as histones (chromatin structural proteins) posttranslational modifications. As an example, histone H3 lysine 9 (H3K9) methylation on gene promoters is mainly associated with transcriptional repression. H3K9 is methylated by several enzymes called lysine methyltransferases (KMTs). The aim of my thesis project was to understand the role of the H3K9 KMTs, G9a, GLP, Suv39h1 and SETDB1 in regulating the balance between proliferation and terminal differentiation. For this purpose, I used skeletal muscle terminal differentiation as model. Upon muscle terminal differentiation, myoblasts exit, in an irreversible way, from the cell cycle and under go differentiation where cells fusion and form myotubes. During this process, cell cycle genes are permanently silenced and muscle specific genes are activated. Thesis introduction is divided into three chapters. The first chapter focuses on chromatin and post-translational modifications. The second chapter describes H3K9 methylation characteristics and the role of the four KMTs that I studied during my thesis project: G9a,GLP, Suv39h1 and SETDB1. In the third chapter, the skeletal muscle terminal differentiation model is described in details. Results section reports my two major studies outcomes and their discussion. The first concerns the antagonistic roles of G9a and GLP regarding the muscle terminal differentiation and the second focuses on the role of SETDB1 during muscle differentiation. Finally, I conclude this manuscript by a plainer discussion followed by long term perspectives and an appendix presents other research articles, in which I collaborated during my PhD.

Apoptose und Seneszenz sind stress-responsive, genetisch verankerte „Failsafe“- Mechanismen, welche die Zelle vor maligner Transformation schützen. Onkogenes Ras induziert zelluläre Seneszenz über den p16/Retinoblastoma (Rb)-Signalweg und führt dabei zu einem permanenten Zellzyklusarrest - das tumorsuppressive Potential von Seneszenz in vivo bleibt jedoch bis heute fraglich. In seneszenten Zellen ist die Expression von S-Phase relevanten Gene durch die lokale Ausbildung von Heterochromatin, bzw. der Methylierung von Histon H3 an Lysin 9 (H3K9me) blockiert. Dies lässt vermuten, dass Seneszenz ein epigenetische kontrollierter Prozess ist und von Proteinen wie der Rb-assozierte Histonmethyltransferase Suv39h1 reguliert wird. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Eµ-N-Ras transgene Mäuse mit heterozygoten Läsionen im Suv39h1 oder p53 Lokus aggressive T-Zell Lymphome entwickeln, die gegen Suv39h1, bzw. p53-Expression selektieren. Im Gegensatz dazu entwickeln N-Ras-transgene Wildtyp-Tiere („Kontrollen“) vorrangig nicht-lymphoide Tumoren und sterben signifikant später. In primären Lymphozyten induziert onkogenes Ras einen Suv39h1-abhängigen, H3K9me-assoziierten Proliferationsarrest und kann dadurch Lymphomgenese verhindern. Suv39h1-defiziente Lymphomzellen wachsen exponentiell und sind, entgegen p53 defizienten Zellen, sensitiv gegenüber Adriamycin-induzierten Zelltod (Apoptose). Jedoch arretieren nur Kontroll-Lymphome unter Therapie in vitro wenn Apoptose blockiert ist, nicht aber Suv39h1 oder p53-defiziente Lymphomzellen. Diese Resultate identifizieren Ras-induzierte Seneszenz als einen neuen, H3K9me-abhängigen Tumorsuppressor-Mechanismus, wobei dessen Inaktivierung die Entwicklung von aggressiven, aber dennoch Apoptose-kompetenten Lymphomen herbeiführt. / Cellular “failsafe” programs like apoptosis or senescence are genetically encoded, stress-responsive mechanisms that ultimately counteract malignant transformation. Acute induction of oncogenic Ras provokes cellular senescence that involves the p16/Retinoblastoma (Rb) pathway to induce a permanent arrest, but the tumor suppressive mechanism in vivo still remains questionable. Senescent cells display heterochromatic features on S-phase relevant genes involving methylation of histone H3 on lysine 9 (H3K9me), which may depend on the Rb-associated histone methyltransferase Suv39h1. In the present thesis it was shown that Eµ-N-Ras transgenic mice harboring targeted heterozygous lesions at the Suv39h1, or the p53 locus for comparison, succumb to invasive T cell lymphomas that lack expression of Suv39h1 or p53, respectively. By contrast, most N-Ras-transgenic wildtype (“control”) animals develop a non-lymphoid neoplasia significantly later. Proliferation of primary lymphocytes is directly stalled by a Suv39h1-dependent, H3K9me-related senescent growth arrest in response to oncogenic Ras, thereby cancelling lymphomagenesis at an initial step. Suv39h1-deficient lymphoma cells grow rapidly but, unlike p53-deficient cells, remain highly susceptible to adriamycin-induced apoptosis. In contrast, only control, but not Suv39h1-deficient or p53-deficient lymphomas senesce after drug therapy when apoptosis is blocked. These results identify H3K9me-mediated senescence as a novel Suv39h1-dependent tumour suppressor mechanism whose inactivation permits the formation of aggressive but apoptosis-competent lymphomas in response to oncogenic Ras.

Die Aufrechterhaltung der sogenannten failsafe Programme ist ein wichtiges Kennzeichen des zellulären Lebens, da das genaue Gleichgewicht zwischen Proliferation und Wachstumsarrest es sicherstellt, dass die Zelle sich selber vor potentiell gefährlichen Mutationen schützen kann. Apoptose und Seneszenz bewahren die Zellhomeostase und sind von aüsserster Bedeutung dafür, die Zelle vor maligner Transformation zu bewahren. Die Seneszens zeichnet sich dabei durch Veränderungen des Heterochromatins bei Genen aus, welche für den Eintritt in die DNA-Synthese-Phase des Zellzyklus verantwortlich sind. Insgesamt wurde die Bedeutung epigenetischer Modifikationen bei malignen Erkrankungen in den letzten Jahren immer deutlicher. So konnte gezeigt werden, dass die Rb-assoziierte Histon-Methyltransferase Suv39h1 ein entscheidender Vermittler der Seneszenz in Ras-induziertem Maus Lymphom-Modell ist. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die transgenen Eµ-myc Maüse (ähnlich dem Burkitt''s Lymphom im Menschen), wenn sie mit Suv39h1-defizienten Maüsen gekreuzt werden. Die Überexpression von Myc, wie sie in humanen und murinen Tumoren zu beobachten ist, induziert primär ein apoptotische Antwort mit dem zentralen Vermittler p53. Allerdings bewirkte die Suv39h1 Defizienz, obwohl sie die Lebenserwartung signifikant verkürzte, keine Veränderung der Apoptose-Rate in diesem Modell. Dieses Ergebnis demonstriert die Tumor-suprimierende Wirkung des Suv39h1 in Myc-getriebener Lymphomagenese. Weiterhin wurde in dieser Arbeit ein zusätzlicher Mechanismus zur Vermittlung Myc-induzierter Seneszenz unter Einbeziehung des Zytokin-Signaling identifiziert. Im Falle der Expression von intaktem Suv39h1 in der Tumorzelle kann TGF-beta die Myc-induzierte Seneszenz in vivo beeinflussen. Schliesslich ergaben die Untersuchungen, dass die Suv39h1-defizienten Lymphome über eine beeinträchtigte Therapie-Anwort verfügen, da sie keine Therapeutika-induzierte Seneszenz ausführen können. / Maintenance of cellular failsafe pathways (apoptosis and senescence) is one of the hallmarks of life, as fine equilibrium between proliferation and growth arrest ensures that the cell can protect itself from the potentially dangerous mutations. Senescence is a mechanism distinguished by heterochromatin modifications leading to silencing of the genes responsible for the entry to the DNA synthesis [S] phase of the cell cycle. Involvement of epigenetic modifications in cancer development has been subject of a more intense research in the past few years. It was shown that the Rb-associated histone methyltransferase Suv39h1 is a critical mediator of senescence in a Ras-induced mouse lymphoma model. Additional mechanisms of the senescence regulation are currently being under investigation. In this thesis Eµ-myc transgenic mice, crossed to mice deficient for Suv39h1, were shown to succumb to the same type of B-cell lymphoma (similar to Burkitt''s lymphoma in humans). Overexpression of Myc, as seen in human and mouse tumors will primarily induce an apoptotic response using p53 as a mediator of this response. In Eµ-myc, Suv39h1-/- mouse model deficiency in Suv39h1 has significantly shortened life expectancy, but it did not affect spontaneous apoptosis rates. This finding established Suv39h1 as a tumor suppressor in Myc-lymphomagenesis. Further, an additional mechanism of mediating oncogene-induced senescence involving cytokine signaling was identified and reported here. When intact Suv39h1 is present in the tumor, TGF-beta is able to mediate oncogene-induced senescence in vivo. Finally, in the treatment studies it was shown that Suv39h1 deficient lymphomas have an impaired response to chemotherapy, caused by their inability to execute drug-induced senescence. This finding can be of use for the design of novel cancer therapies.

MDM2 regulates p53 predominantly by promoting p53 ubiquitination. However, ubiquitination-independent mechanisms of MDM2 have also been implicated. Here we show that MDM2 inhibits p53 DNA binding activity in vitro and in vivo. MDM2 binding promotes p53 to adopt a mutant-like conformation, losing reactivity to antibody Pab1620, while exposing the Pab240 epitope. The acidic domain of MDM2 is required to induce p53 conformational change and inhibit p53 DNA binding. ARF binding to the MDM2 acidic domain restores p53 wild type conformation and rescues DNA binding activity. Furthermore, histone methyl transferase SUV39H1 binding to the MDM2 acidic domain also restores p53 wild type conformation and allows p53-MDM2-SUV39H1 complex to bind DNA. These results provide further evidence for an ubiquitination-independent mechanism of p53 regulation by MDM2, and reveal how MDM2-interacting repressors gain access to p53 target promoters and repress transcription. Furthermore, we show that the MDM2 inhibitor Nutlin cooperates with the proteasome inhibitor Bortezomib by stimulating p53 DNA binding and transcriptional activity, providing a rationale for combination therapy using proteasome and MDM2 inhibitors.