Esta tesis doctoral se planteó debido a la necesidad de evaluar la capacidad de los aceites esenciales y de sus compuestos como aditivos ruminales. En el primer estudio se utilizaron 8 fermentadores (1320 ml) de doble flujo continuo en dos períodos (8 d) para estudiar el efecto de una mezcla de compuestos de aceites esenciales (BEO, CRINA? RUMINANTS) sobre la fermentación microbiana y el flujo de nutrientes. Los tratamientos se distribuyeron en un diseño factorial 2 x 2, donde el tipo de ración (alta en concentrado: 90% concentrado y 10% paja; vs alta en forraje: 60% heno de alfalfa y 40% concentrado) y la adición de BEO (0 mg/l vs 1.5 mg/l) fueron los efectos principales. La adición de BEO no afectó a la digestibilidad de MS, MO, FND, FAD y PB, pero incrementó la concentración de AGV totales (122.8 vs 116.2 mM) sin modificar significativamente las proporciones individuales de AGV o el metabolismo nitrogenado. El segundo estudio consistió en varias pruebas experimentales diseñadas para estudiar el efecto de la dosis y del periodo de adaptación a la adición de BEO sobre el metabolismo nitrogenado de los microorganismos ruminales. En la primera, se utilizaron de nuevo 8 fermentadores de doble flujo continuo (1320 ml) en dos períodos (6 d de adaptación y 3 de muestreo) para estudiar el efecto de la dosis de BEO sobre la fermentación microbiana ruminal. Los tratamientos fueron: CTR (sin adición de BEO), D5 (5 mg/l de BEO), D50 (50 mg/l de BEO) y D500 (500 mg/l de BEO). En la segunda prueba experimental se utilizaron 8 ovejas (peso medio de 57 kg) para estudiar el efecto de una adaptación larga del líquido ruminal a la adición de BEO sobre la fermentación ruminal. El tratamiento CTR (sin adición de BEO) se asignó al azar a 4 ovejas, y las otras 4 ovejas se adaptaron a BEO (110 mg/d de BEO) durante 4 semanas (ADBEO). La adición de 5 mg BEO/l de líquido ruminal en cultivo continuo incrementó la concentración de AGV totales y la relación acetato:propionato después de 6 d de fermentación, pero los cambios sobre el metabolismo N sólo aparecieron en el líquido ruminal de ovejas alimentados con BEO durante 28 d.En el tercer estudio se evaluaron los efectos de cinco compuestos de aceites esenciales sobre la fermentación microbiana ruminal. En la primera prueba experimental, los efectos de 4 dosis crecientes (5, 50, 500, y 5000 mg/l) de 5 compuestos de aceites esenciales se evaluaron en incubaciones in vitro de líquido ruminal durante 24 h con dos dietas diferentes: una dieta 60:40 forraje:concentrado (18% PB; 30% FND) y la otra 10:90 forraje:concentrado (16% PB; 25% FND). Los tratamientos fueron: control (CTR), eugenol (EUG), guaiacol, limoneno, timol (TIM), y vanillin. En la segunda prueba experimental se utilizaron 8 fermentadores de doble flujo continuo (1320 ml) en 3 periodos (6 d de adaptación y 3 d de muestreo) para estudiar el efecto del TIM y del EUG sobre la fermentación microbiana ruminal y el flujo de nutrientes. Los tratamientos fueron: CTR (control negativo), MON (control positivo, 10 mg/l de monensina), T5 (5 mg/l de TIM), T50 (50 mg/l de TIM), T500 (500 mg/l de TIM), E5, E50 y E500, y se asignaron aleatoriamente a los fermentadores dentro de cada periodo. La mayoría de estos compuestos de aceites esenciales a dosis elevadas demostraron poseer actividad antimicrobiana disminuyendo la concentración total de VFA. Sin embargo, EUG en incubaciones de 24 h y T5 en cultivo continuo modificaron el perfil de AGV sin inhibir la concentración total de AGV, y EUG disminuyó la concentración de N amoniacal. Una selección cuidadosa de estos compuestos permitiría la manipulación de la fermentación microbiana ruminal. / This doctoral thesis was planned to test the potential of essential oils and their compounds as ruminal additives. In the first study, eight dual flow continuous culture fermenters (1320 ml) were used in two replicated periods (8 d each) to study the effects of a specific blend of essential oil compounds (BEO, CRINA? RUMINANTS) on rumen microbial fermentation and nutrient flow. Treatments were arranged in a 2 x 2 factorial design. Main factors were type of diet (10 to 90 vs 60 to 40 forage to concentrate ratios) and the addition of BEO (0 vs 1.5 mg/l of BEO). There were no effects of BEO on DM, OM, NDF, ADF and CP digestion. The use of BEO increased the concentration of total VFA (122.8 vs 116.2 mM) without affecting individual VFA proportions or N metabolism. The second experiment was designed to study the effect of dose of BEO and adaptation time to the addition of BEO on N metabolism of rumen microorganisms. The second study consisted in several tests. In the first, eight dual flow continuous culture fermenters (1320 ml) were used in two periods (6 d of adaptation and 3 d of sampling) to study the effects of increasing doses of a specific blend of essential oils (BEO, CRINA? RUMINANTS) on rumen microbial fermentation. Fermenters were fed with the same high forage ration of the first study and the sampling protocol and processing were identical. Treatments were: CTR (no BEO), D5 (5 mg/l of BEO), D50 (50 mg/l of BEO) and D500 (500 mg/l of BEO). In the second experiment, eight sheep (average body weight of 57 kg) were used to study the effects of long term adaptation of rumen fluid to BEO on ruminal fermentation. Four sheep were assigned at random to the CTR treatment (no BEO) and four sheep were adapted to BEO (110 mg/d of BEO) for four weeks (ADBEO). The addition of 5 mg BEO/l of rumen fluid in continuous culture increased total VFA concentration and acetate to propionate ratio after 6 d of fermentation, but changes in N metabolism were only apparent when using rumen fluid from sheep fed BEO for 28 d.In the third study, several essential oil compounds were evaluated on rumen microbial fermentation. In the first experiment, the effects of 4 different doses (5, 50, 500, and 5000 mg/l) of five essential oil compounds were evaluated in in vitro 24 h batch culture of rumen fluid with two different diets: a 60 to 40 forage to concentrate diet (18% CP; 30% NDF) and a 10 to 90 forage to concentrate diet (16% CP; 25% NDF). Treatments were: control (CTR), eugenol (EUG), guaiacol, limonene, thymol (THY), and vanillin. In the second experiment, eight dual flow continuous culture fermenters (1320 ml) were used in three periods (6 d of adaptation and 3 d of sampling) to study the effects of THY and EUG on rumen microbial fermentation and nutrient flow. Treatments were: CTR (negative control), MON (positive control, 10 mg/l of monensin), T5 (5 mg/l of THY), T50 (50 mg/l of THY), T500 (500 mg/l of THY), E5, E50 and E500, and were randomly assigned to fermenters within periods. Most of these essential oil compounds demonstrated their antimicrobial activity decreasing total VFA concentration at high doses. However, EUG in batch fermentation and T5 in continuous culture modified VFA profile without decreasing total VFA concentration, and EUG decreased ammonia N concentration. Careful selection of these essential oils compounds may allow manipulation of rumen microbial fermentation.

Los actuales sistemas de formulación para vacuno lechero se basan en el concepto de proteína digestible y en especial en el aporte de aminoácidos absorbibles en el intestino delgado. Una proporción importante de los aminoácidos que llegan al intestino delgado del rumiante proviene de la proteína de la ración. Sin embargo, a diferencia de lo que ocurre en los monogástricos, antes de llegar al intestino delgado esta proteína es sometida a la acción de los microorganismos del rumen. Varios autores (Crooker y col., 1987; Susmel y col., 1989; Erasmus y col., 1994) han observado cambios en el perfil de aminoácidos de la proteína tras su paso por el rumen, aunque los efectos que produce la fermentación ruminal sobre el perfil de aminoácidos de la proteína de la ración no estan muy claros. La proteína que no ha sido degradada fluye hacia el intestino donde debe ser digerida. De forma similar a lo que ocurre con la degradación en el rumen, existe poca información acerca de cómo afecta la digestión intestinal a los diferentes aminoácidos que componen una proteína. La incorporación de valores de degradación ruminal y digestibilidad intestinal de los aminoácidos individuales de suplementos proteicos permitiría una mejora evidente en la precisión de los sistemas de formulación de raciones para vacuno lechero. La obtención de valores precisos in vivo es difícil, dada la complejidad de la fermentación ruminal y la dificultad de controlar los factores de variación inherentes al animal que pueden confundir la interpretación de los resultados, por lo que en el presente trabajo se optó por la utilización de sistemas in Vitro. El objetivo principal de esta tesis fue la estimación de la degradabilidad ruminal y la digestibilidad intestinal de los aminoácidos de algunos suplementos proteicos utilizados frecuentemente en vacuno lechero.La tesis se estructura en tres experimentos. En los dos primeros se estudia la degradabilidad ruminal de los aminoácidos de cuatro suplementos proteicos (harina de soja, harina de gluten de maíz, harina de sangre y harina de pescado) mediante un sistema de cultivo continuo de flujo doble. Este sistema in vitro simula el proceso de fermentación que ocurre en el rumen, y a la vez permite mantener controlados los diversos factores que pueden afectar a la fermentación ruminal. De esta manera se puede diferenciar el flujo de aminoácidos procedentes de la proteína de la ración que no ha sido degradada en el rumen, y estudiar las posibles variaciones en el perfil de aminoácidos de esta proteína causadas por la fermentación ruminal. Los resultados de estos dos trabajos muestran que existen diferencias en la degradabilidad ruminal de los aminoácidos individuales de un mismo suplemento proteico, así como diferencias en la degradabilidad de aminoácidos entre distintos suplementos. No obstante, y a pesar de las estrictas medidas de control aplicadas, la variabilidad obtenida en los resultados no permite establecer valores precisos de degradación.La falta de una técnica rápida y fiable para la determinación de la digestión intestinal no sólo de proteínas sino también de aminoácidos, es la motivación del tercer experimento. En la primera parte de este experimento se desarrolló una técnica capaz de estimar de manera rápida y fiable la digestibilidad intestinal de proteínas y aminoácidos procedentes de suplementos proteicos. Para ello se modificó la técnica desarrollada por Calsamiglia y Stern (1995) adaptándola a un incubador in Vitro, con tal de agilizar la técnica y adaptarla al estudio de aminoácidos. Una vez puesta a punto la técnica, se estimó la digestibilidad intestinal de los aminoácidos procedentes de 11 suplementos proteicos de uso frecuente en vacuno lechero. Los resultados de este experimento muestran diferencias en la digestibilidad intestinal de los aminoácidos dentro de un mismo suplemento. En general, los aminoácidos esenciales se muestran más digestibles en el intestino que los no esenciales. Asimismo, los resultados reflejan diferencias en la digestión intestinal de aminoácidos entre suplementos proteicos, lo que no permite establecer valores generales de digestibilidad para cada aminoácido, ya que estos pueden diferir en función del suplemento proteico estudiado. La técnica DaisyII desarrollada en este trabajo puede ser un buen método para la obtención de valores de digestibilidad específicos para cada aminoácido de los distintos suplementos proteicos. / Current feeding systems for dairy cows include the prediction of amino acids requirements and supply to the small intestine. Supply of absorbable amino acids of dietary origin depends of the amount of dietary protein escaping ruminal degradation, intestinal digestibility of the amino acids that escape ruminal degradation, and the amino acid composition of rumen undegraded intestinally digested protein. Some authors (Crooker et al., 1987; Susmel et al., 1989; Erasmus et al., 1994) observed changes in the amino acid profile after ruminal incubation of proteins, although effects of ruminal fermentation on the amino acid profile of dietary proteins remain unclear. Rumen undegraded dietary protein flows to the small intestine to be digested. However, its digestibility in the small intestine and its amino acid profile is highly variable depending on type of feed and processing. Little information is available concerning the digestion of individual amino acids in the small intestine, which will become increasingly critical as systems that incorporate amino acid requirements are introduced. In vivo estimates of amino acid ruminal degradation and intestinal digestion are labor intensive, time consuming and subject to considerable sources of variation. The use of in vitro simulation systems offers an alternative that allows the study of the effects of microbial fermentation and intestinal digestion on amino acid composition of protein supplements under controlled conditions, and considering the potential interactions that occur on rumen fermentation. The objective of this study was to estimate rumen microbial degradation and small intestine digestion of amino acids from protein supplements of common use in dairy cow feeding.Eight dual flow continuous culture fermenters were used in three replicated periods in first and second experiment to study the effects of diets containing increasing levels of heat-treated soybean meal, corn gluten meal, fish meal or blood meal on microbial fermentation, nutrient flow and relative ruminal escape of dietary amino acids. Results from these studies suggest that the individual amino acid of a protein supplement differ in their resistance to ruminal fermentation and microbial attack, although the establishment of accurate values of ruminal degradation for individual amino acids is difficult.The lack of a fast and reliable method to estimate intestinal digestion of proteins and amino acids justified a third experiment. A three-step in vitro procedure was developed by Calsamiglia and Stern (1995) to estimate intestinal digestion of proteins in ruminants in a fast and cost-effective manner. However, this method does not allow to estimate the intestinal digestion of individual amino acids. The objective of this third study was to modify the procedure of Calsamiglia and Stern (1995), by adapting it to a Daisy II incubator, to further reduce the cost and labor involved in the determination of intestinal digestion of proteins, and to be able to estimate the intestinal digestion of individual amino acids. The intestinal digestion of 11 protein supplements and its amino acids was determined using the proposed technique. Results from the Daisy II technique show differences within and between feedstuffs in the proportion of their individual amino acids that are digested in the small intestine, and suggest a preferential digestion of essential amino acids. The use of the Daisy II technique results in a substantial reduction in cost and labor, is sensitive to differences between feedstuffs for individual amino acid digestibilities, and allows the selection of proteins with high digestibilities of those amino acids that are most likely to limit production.

En estudios in vitro e in vivo se evaluaron los efectos de extractos de plantas sobre las características de fermentación microbiana ruminal. Se midieron las concentraciones de ácidos grasos volátiles (AGV), péptidos largos (PepL), péptido pequeños y AA (PepP+AA), N amoniacal, L-lactato, número de protozoos, la ingestión de materia seca (IMS) y el consumo de agua. En el experimento 1, se evaluaron 15 mg/Kg de la mezcla de todos los extractos (MIX), y 7.5 mg/Kg de extractos de ajo (GAR), canela (CIN), yuca (YUC), anís (ANI), orégano (ORE) o pimentón (CAP) en un sistema de fermentación de doble flujo continuo (8 días de adaptación y 3 de muestreo). En el período de adaptación, el acetato fue mayor y el propionato fue menor (d 2 al 6) en CIN, GAR, ANI y ORE, comparados con el CTR. Sin embargo, estas diferencias desaparecieron después de 6 días. El CIN y YUC incrementaron PepL, GAR y ANI incrementaron PepP+AA, el ANI incrementó y el GAR redujo N amoniacal. En el experimento 2, los mismos extractos y tres compuestos puros (anetol, ATL; cinnamaldehido, CDH y eugenol EUG) se evaluaron a cinco dosis (0, 0.3, 3, 30, y 300 mg/L) en dos niveles de pH (5.5 y 7.0) en cultivos in vitro con líquido ruminal de terneros. Las dosis altas de todos los extractos de plantas inhibieron los AGV totales y N amoniacal. A pH 7.0, los efectos de los extractos de la plantas no resultaron favorables para los objetivos de los sistemas de engorde. En cambio, a pH 5.5, EUG, GAR, CAP, CDH y YUC incrementaron los AGV totales, siguiendo una baja relación acetato:propionato en ORE, GAR, CAP, CDH, y YUC. En el experimento 3, se evaluaron 30 g/d de extracto de la alfalfa (AEX; 10% malato y 1.5% saponinas), una mezcla de 180 mg/d de CDH y 90 mg/d de EUG (CIE), y una combinación de ambos tratamientos (MIX) en terneros Holstein de 360 Kg y provistos de un trocar en el rumen. Comparados con el CTR, el CIE y AEX redujeron la IMS, consumo de agua, Entodinium spp, El AEX incrementó la relación acetato:propionato, redujo Entodinium spp e Isotrichus spp. En in vitro con líquido ruminal de CIE, AEX y MIX, el CIE y MIX redujeron degradación de la proteína bruta (DPB) de soja y maíz a las 4 h de incubación. Sin embargo, no hubo ningún efecto a las 24 h de incubación. En el experimento 4, se evaluaron 2 g/d de extracto de anís (ANI; 10% anetol), 1 g/d de extracto de capsicum (CAP; 15% capsaicina), y una mezcla de 0.6 g/d de CDH y 0.3 g/d de EUG (CIE) en terneros Holstein de 450 Kg provistos de un trocar en el rumen. Comparados con el CTR, El CAP incrementó la IMS, el consumo de agua, PepP+AA, y redujo el acetato, AVG de cadena ramificada (AGVCR) y PepL. El CIE redujo el consumo de agua, acetato, AVGCR, L-lactato, N amoniacal y Entodinium spp e Isotrichus spp. y aumentó el propionato y PepP+AA. El ANI disminuyó la relación acetato:propionato, AVGCR, N amoniacal y Entodinium spp. En la prueba in vitro, ANI, CAP y CIE redujeron la DPB de la soja 4 h después de la incubación, y sólo el ANI redujo la DPB de la soja 24 h después de la incubación. Los resultados indican que los extractos de plantas pueden variar sus efectos en función de la dieta y del ambiente ruminal, y que el CIE, ANI y CAP pueden ser útiles como modificadores de la fermentación ruminal en los sistemas de cebo intensivo de terneros.

La leche es un alimento de un alto valor nutricional pero su perfil de ácidos grasos (AG) no es el más adecuado desde un punto de vista de salud humana. Esta tesis estudia cómo modificar el perfil de AG de la leche a través de la nutrición animal así como diferentes factores que pueden influir en el proceso de biohidrogenación a nivel rumimal modificando el flujo de AG a la glándula mamaria.En el primer experimento se utilizaron 356 vacas en un diseño de bloques al azar y se estudió cómo la suplementación de las dietas de vacas lecheras al inicio de la lactación con semilla de lino extrusionada afectaba a la producción y la composición de la leche, y a la reproducción. Las dietas utilizadas tenían una relación forraje:concentrado de 40:60 (17,9% PB, 27,7% FND y 6,0% EE), se administraron ad libitum y eran similares en su composición entre tratamientos, excepto en el suplemento proteico donde la dieta control (CTR) tenía un 4,9% de semilla de soja extrusionada, mientras que la dieta lino (LIN) tenía un 5,5% de semilla de lino extrusionada. La suplementación con semilla de lino extrusionada redujo el porcentaje de grasa láctea y la producción de leche corregida por grasa e incrementó el porcentaje de proteína láctea, así como también mejoró el perfil de AG de la leche hacia uno más saludable, todo ello sin modificar la ingestión de MS, la producción de leche y el rendimiento reproductivo de los animales.En el segundo estudio se utilizaron 8 fermentadores (1320 mL) de doble flujo continuo en dos periodos de 7 d (4 d adaptación y 3 d muestro) y se estudiaron, en un diseño factorial 2 × 2, los efectos del pH (Alto = 6,4 vs. Bajo = 5,6) y de la dieta (Soja (SOY) vs. Lino (LIN)) sobre la fermentación microbiana ruminal, la lipólisis y la biohidrogenación ruminal, el flujo de AG del efluyente y la concentración de DNA de bacterias implicadas en los procesos de lipólisis y biohidrogenación ruminal. Los resultados de este estudio indicaron que el pH inhibió la lipólisis y la biohidrogenación ruminal y que la grasa de la soja extrusionada parecía estar más protegida contra la lipólisis que la del lino extrusionado. Se realizó un tercer estudio donde se evaluó el efecto del pH (6,4 vs. 5,6) y de dos niveles de forraje:concentrado en las dietas (70:30 F:C (HF) vs. 30:70 F:C (LF)) sobre la fermentación microbiana ruminal, el perfil de AG del efluyente y la concentración de DNA de bacterias involucradas en los procesos de lipólisis y biohidrogenación ruminal. El sistema de cultivo continuo consistió en dos periodos de 8 d (5 d adaptación y 3 d muestreo), con un diseño factorial 2 × 2 de los tratamientos. Las dietas utilizadas tuvieron un perfil similar de AG (44,0% C18:2, 9,77% C18:3). Los resultados indican que el pH bajo es la principal causa de la acumulación de trans-10 C18:1 y trans-10, cis-12 CLA a nivel ruminal, aunque un nivel alto de concentrado en las dietas también incrementa la proporción de trans-10, cis-12 CLA en el efluyente. / Milk is a food with a high nutritive value however milk fatty acid (FA) profile does not seem to be very healthy from a human health point of view. This thesis studies how to modify the milk FA profile through animal nutrition and different factors which can affect ruminal biohydrogenation processes which determine the composition of the FA flow to the mammary gland.In the first experiment, 356 early lactation multiparous Holstein cows were used in a randomised complete block design to determine the effects of feeding extruded linseed on milk production and composition, and reproductive performance. Cows were fed a 40:60 forage to concentrate ratio diet (17.9% CP, 27.7% NDF and 6.0% EE) ad libitum that was identical in composition between treatments except for the protein supplement that was control (CTR: 4.9% extruded soybean) and linseed (LIN: 5.5% extruded linseed. Extruded linseed supplementation reduced milk fat percentage and fat corrected milk yield, and increased milk protein percentage and the content of healthy FA in milk without modifying DM intake, milk yield and reproductive performance. In the second experiment, 8 dual-flow continuous culture fermenters (1,320 mL) were used in two replicated periods of 7 d (4 d of adaptation and 3 d for sampling) to study, in a 2 × 2 factorial design, the effects of pH (High = 6.4 vs. Low = 5.6) and diet (Soybean vs. Linseed) on rumen microbial fermentation, lipolysis and apparent biohydrogenation, effluent flow of fatty acid and DNA concentration of bacteria involved in lipolysis and biohydrogenation processes. Results indicated that pH inhibited lipolysis and apparent biohydrogenation. Fat of extruded soybean seemed more protected against lipolysis than that of extruded linseed. A third experiment was designed to study the effect of pH (6.4 vs. 5.6) and two different forage to concentrate ratios (F:C) in the diets (70:30 F:C (HF) vs. 30:70 F:C (LF)) on rumen microbial fermentation, effluent FA profile and DNA concentration of bacteria involved in lipolysis and biohydrogenation processes. The continuous culture study consisted of two periods of 8 d (5 d adaptation plus 3 d sampling), with a 2 × 2 factorial arrangement of treatments. Both diets had a similar FA profile (44.0% C18:2, 9.77% C18:3). Results indicate that low pH is the main cause of the accumulation of trans-10 C18:1 and trans-10, cis-12 CLA, although concentrate rich diets also increase trans-10, cis-12 CLA proportion in the effluent.

Esta tesis doctoral se planteó con el fin de profundizar en el estudio de la acidosis ruminal y evaluar nuevas estrategias de prevención.En el experimento 1, se desarrolló la PCR cuantitativa para detectar y cuantificar Streptococcus bovis y Megasphaera elsdenii, bacterias relacionadas con la producción y utilización del lactato, respectivamente. La técnica se desarrolló con unas eficiencias del 88% (S. bovis) y 99% (M. elsdenii). Posteriormente se empleó esta técnica en los experimentos siguientes, permitiendo progresar en comprender el rol que tienen estas bacterias en el proceso de la acidosis.El experimento 2 se realizó con el objetivo de determinar los efectos de administrar altos niveles de carbohidratos no fibrosos (CNF) en la dieta sobre la fermentación ruminal y el metabolismo de vacas lecheras. Para ello se utilizaron 62 vacas Holstein en un diseño cross-over 2x2. Los tratamientos fueron: una dieta tradicional de vacas de alta producción (TR, CNF = 43%) y una dieta alta en CNF (HC, CNF = 47%). El grupo HC incrementó la producción de leche y su contenido en proteína, pero afectando negativamente a la salud de los animales (síndrome de baja grasa, mayor riesgo de cojeras, más horas a pH ruminal subóptimo).El experimento 3 consistió en describir los cambios fisiológicos en la fermentación ruminal durante la inducción a la acidosis en terneras de engorde y su control mediante una preparación comercial de anticuerpos policlonales (mayoritariamente contra S. bovis). Se utilizaron 12 terneras cruzadas que se distribuyeron completamente al azar en 2 grupos de 6 animales cada uno: el grupo control (CTR) y el grupo que recibía el tratamiento de anticuerpos (PAP). El 83,3% y el 50,0% de los animales entraron en acidosis en el grupo CTR y PAP, respectivamente, y tardaron de media 5,25 ± 0,17 d. Asimismo, el perfil de fermentación de los animales acidóticos fue similar entre tratamientos. El grupo PAP tuvo mayores valores de pH a las 0h post-alimentación en los días 16, 18 y 19 de experimento comparado con el grupo CTR. Estos resultados indican que PAP puede ser efectivo para controlar la acidosis en terneras durante una transición rápida a concentrado.El objetivo del experimento 4 fue evaluar los efectos de un inhibidor de la actividad α-amilasa (acarbosa) en el control de la acidosis ruminal sobre la fermentación ruminal y el metabolismo en vacas lecheras. Se usaron 8 vacas Holstein en un diseño cross-over 2x2. Los tratamientos fueron: control (sin aditivo, CTR) y acarbosa (0,75 g/animal/d, AMI). Se observó que el grupo AMI estuvo menos horas a pH ruminal subóptimo y tuvo un pH ruminal medio superior comparado con el grupo CTR. Microbiológicamente, los animales AMI tendieron a tener una menor ratio S. bovis:M. elsdenii comparado con los CTR. No se observaron diferencias en el resto de parámetros. Estos resultados indican que el suplemento de dietas con acarbosa en vacas lecheras alimentadas con raciones de alta producción puede ser efectivo en reducir la acidosis ruminal sin repercusiones en la fermentación ruminal del animal ni en su metabolismo. / This doctoral thesis was designed to increase our knowledge of ruminal acidosis and to valuate new strategiesIn experiment 1, quantitative PCR probes were developed to detect and quantify S. bovis and M. elsdenii, lactic acid-producing and lactic acid-utilizing bacteria, respectively. The two PCR probes had efficiencies of 88% (S. bovis) and 99% (M. elsdenii). In the following experiments of this thesis, these techniques were used to progress in the understanding of the role that these bacteria have in the development of acidosis.The experiment 2 was designed to study the effects of administrating high levels of NFC in the diet on ruminal fermentation and animal metabolism of lactating dairy cows. Sixty-two lactating Holstein cows were used in a cross-over 2x2. Treatments were: a traditional ration of high-producing dairy cows (TR, NFC = 43%) and a high-NFC ration (HC, NFC = 47%). Milk yield and milk protein content were greater in HC group, but had negative effects on animal health (milk fat depression, greater lameness risk, more hours at suboptimal pH).In experiment 3, physiological changes in rumen fermentation during acidosis induction and its control using a multivalent polyclonal antibody preparation against S. bovis (PAP) in heifers were studied. A completely randomized experiment was designed using 12 crossbred heifers. Treatments were control (CTR) and PAP. After the feeding challenge, acidosis was declared 5.25 ± 0.17 d after the start of transition, during which 83.3 and 50.0% of the animals entered in acidosis in CTR and PAP groups, respectively. However, the fermentation profile of animals with acidosis was similar between treatments. Heifers fed PAP had greater pH before feeding on days 16, 18 and 19 of the experiment compared with CTR. These results indicate that PAP may be effective in controlling acidosis of heifers during a rapid transition to a high-concentrate diet.The objective of experiment 4 was to evaluate the effects of an amylase inhibitor (acarbose) in dairy cows to control ruminal acidosis in a 2x2 cross-over design. Eight Holstein cows were used to study animal metabolism and ruminal fermentation. Treatments were: control (no additive, CTR) and acarbose (0.75 g/cow/d, AMI). AMI group stayed less hours below pH = 5.6 and had greater daily average pH compared with CTR group. AMI animals tended to have lower S. bovis to M. elsdenii ratio than CTR. These results indicate that supplementing diets with acarbose to dairy cattle fed high-NFC rations may be effective in reducing acidosis in lactating cows with no negative effects on ruminal fermentation and animal metabolism.

Durante su desarrollo los linfocitos tienen una serie de elecciones secuenciales para definir su identidad. Primero, la selección entre el linaje T (LT) o B (LB), luego la definición de su TCR como αβ o γδ posteriormente definir su identidad con los correceptores CD4 vs CD8 y, en periferia después de la activación del LT naive definir los linajes Th1, Th2, células T reguladores (Treg) o Th17. Algunos estadios de diferenciación en las células T son complejos de identificar y cuantificar. Especialmente, en sangre periférica, un ejemplo claro son las Treg o las células emigrantes tímicas recientes (RTEs). El control de la diferenciación y desarrollo de los LT se inician sin cambios en la secuencia del DNA pero con una constante activación y represión de transcritos de muchos genes. La regulación epigenética tiene un papel clave en la dinámica del genoma de los LT. Los cambios epigenéticos mantienen la estructura de la cromatina y regulan la transcripción de genes durante su desarrollo y diferenciación, principalmente por la metilación del DNA. La metilación se da en dinucleótidos CG. Sin embargo, hay unas regiones ricas en estos dinucleótidos conocidas como islas CpG (CGI), que no se metilan comúnmente y que se ubican en regiones promotoras, intergénicas o intragénicas. La metilación diferencial de estas regiones en muchos genes establecer perfiles de metilación de cada estadio de diferenciación celular y podrían ser marcadores de estadios celulares. Nuestra hipótesis es que la metilación del DNA, juega un papel clave en la diferenciación e identidad celular en humanos y que los perfiles de metilación del DNA de algunos genes, expresados diferencialmente en los estadios de maduración de los LT, como los genes que codifican para CD4 y CD8 pueden ser un marcador celular especialmente para el estadio de RTEs. Los objetivos fueron: i) analizar los patrones de metilación de los genes CD4, CD8A y CD8B durante el desarrollo de LT tímicos y periféricos; ii) diseñar una prueba molecular sensible y específica para identificar gradientes de metilación en poblaciones de LT y asociarlas con su grado de diferenciación. Estudiamos una CGI en el gen CD4 y tres CGIs en el gen CD8A en diferentes poblaciones de LT separadas por FACS sorting, de timo, sangre de cordón y sangre periférica de adultos sanos. Extrajimos el DNA, el cual se trato con bisulfito de sodio y luego se secuenció cada CGI. Nuestros resultados muestran que las CGI del gen CD4 no se metila diferencialmente en LT. La CGI-2 del gen CD8A no se metila en ningún caso, la CGI-3 presenta el mayor grado de metilación, pero sin diferencias entre linajes ni poblaciones y en la CGI-1 del gen CD8A identificamos una región diferencialmente metilada (DMR). Sobre esta región diseñamos por primera vez una prueba de PCR cuantitativa con sondas FRET, que permiten discriminar cambios en las temperaturas de melt cuando las CpG están o no metiladas en cada población de LT. Usando esta prueba pudimos analizar la DMR y pudimos discriminar claramente entre LT CD4 y CD8. Además, permite identificar en sangre periférica de adultos entre RTE CD8 y LT CD8 naive. También observamos que los LT CD4 incrementan la metilación de esta región a medida que van madurando En conclusión encontramos una región en el gen CD8A, ubicada en el extremo 5’ de la CGI-1 que puede ser un marcador epigenético para diferenciar LT CD4 y CD8 y algunos estadios de desarrollo celular. Esta región puede estar involucrada en mecanismos de regulación de la expresión del gen CD8 y con la identidad celular. / During development the lymphocytes have many choices by taking in order to define their identity. The first choice is about T (LT) or B (LB) lineage. Then the lymphocytes select their TCR αβ or γδ. Later they define their identity with CD4 vs CD8 co-receptors. Finally, in periphery they define among Th1, Th2, Th17, or regulatory T cells (Treg) lineages. Some stages of T cells differentiation are complex to identify such as Treg or Recent Thymic Emigrants (RTEs). The T cell differentiation and development are control by activation and repression a lot of specific genes. The Epigenetica and specifically the DNA methylation has a pivotal role in genome dynamics. In the human genome DNA methylation plays an important role in establishing and maintaining chromatin structures and in regulating gene transcription during development and differentiation. DNA methylation predominantly occurs at cytosine guanine dinucleotide (CpG). However, some areas are CpG rich and they are not always methylated. These regions are calling CpG islands (CGIs) and are present in many promoter genes or intragenic places. This mechanism has an important role in T-cell and lineage commitment and differentiation. The CD4 and CD8 co-receptor is coded by the CD4, and CD8A, and CD8B genes, and is the main lineage differentiation protein for T cells. CD4 gene has a CGIs upstream on the promoter and CD8A gene has three well-defined CGIs amenable to perform quantitative DNA methylation analysis. The aim of the present work is to analyze the methylation pattern of CD4 and CD8A genes and assess its possible use for staging the maturation state of CD4 and CD8 T lymphocytes. We studied three CpG islands located within promoter region of CD8A gene. The methylation analysis was performed in purified T cell populations from human thymus, cord blood and adult peripheral blood. T lymphocytes were sorted by FACS and included: i) single positive CD4 and CD8 T cells from thymus and ii) recent thymic emigrants (RTEs), naïve and memory T cells from cord blood and from adult blood. Genomic DNA from each population was treated with bisulfite and amplified by Nested-PCR with specific primers for each CpG island. The PCR products were cloned and sequenced for quantitative methylation analysis. Initial results showed that CpG Island 2 is not methylated in any of the T cell populations studied, while the CpG islands 1 and 3 have a variable degree of methylation. We identified a specific region of CD8A CpG island 1 that is differentially methylated in T cell populations. This region is clearly more methylated in CD4 T cells than in CD8 T cells. Moreover, within CD8 T cell populations there were differences between naïve and memory cells. It was also feasible to design a protocol for the rapid detection of methylation in this region. This protocol is based on the ability of FRET probes to discriminate nucleotide changes in a melting step by qPCR. Using it we were able to analyze 4 CpG positions and we determined the exact number of methylated positions (0-4) in each sample. In conclusion, we have identified a specific region in CD8A gene that is differentially methylated in T cell populations, which could be an epigenetic marker for T cell differentiation between CD4 and CD8 lymphocytes. The methylation patterns of this region are probably part of the maturation mechanisms that occur in the transition from naïve to memory cells among CD8 T lymphocytes.

La epidemiología es aquel conjunto de métodos y técnicas que se ocupa del estudio del estado de bienestar de cualquier tipo de población (humanos y animales). En consecuencia, se centra en el estudio de la evolución de los trastornos a través del tiempo y en distintas áreas geográficas con el objetivo de determinar la incidencia y prevalencia de los trastornos explorados, y determinar su distribución diferencial en las distintas áreas y en los distintos momentos temporales trabajados; y por último, establecer los factores asociados a la aparición de los diferentes trastornos, ya sean de riesgo o de protección, con la finalidad última de prevenir la aparición de los mismos en la población.En sus inicios, el campo de estudio de la epidemiología eran las enfermedades infecciosas, aunque actualmente abarca todo lo que haga referencia al estado de bienestar de los individuos, por lo que su ámbito de trabajo se caracteriza por una evidente fragmentación. Directamente relacionado con el estudio de la evolución de los trastornos en las poblaciones está el tema del procedimiento diagnóstico, aspecto de enorme importancia en cualquier estudio epidemiológico para la correcta delimitación de la prevalencia e incidencia del trastorno bajo estudio, con el objetivo de desarrollar una política de actuación adecuada para disminuir la aparición del trastorno en la población. Se trata de una área importante de investigación en el campo de la salud, y en especial en el ámbito de la psicología, debido a la baja sensibilidad y especificidad de los instrumentos diagnósticos utilizados (Anthony, Eaton y Henderson, 1995a), lo que lleva a que los diagnósticos no sean del todo correctos y ello revierte, a su vez, en la validez de los estudios llevados a cabo.Ahora bien, las técnicas que se han desarrollado hasta el momento en el ámbito de la epidemiología hacen referencia al estudio de una única ocurrencia del trastorno bajo estudio, generalmente el primer episodio. Por el contrario, muchos de los trastornos propios del campo de la salud mental no implican una sucesión de múltiples episodios, no son crónicos y tampoco suponen la muerte del sujeto por esa enfermedad. Es el caso de las esquizofrenias, los trastornos del estado de ánimo, las adicciones... Se trata de una circunstancia que también puede producirse en otros campos de la salud. El estudio de las recaídas ha sido abordado en diversas ocasiones por parte de los investigadores que trabajan en el ámbito de la epidemiología, según distintos puntos de vista. Algunos autores estudian la probabilidad de transición entre los diferentes estados, de salud a trastorno y viceversa, a partir de modelos de Markov (Tager, 1998; Beckett et al, 1996 y Hilton et al, 1997), mientras que otros intentan determinar cuáles son los factores que llevan a los individuos a recaer en su trastorno, realizando un análisis a partir de técnicas estadísticas clásicas (Fischl et al, 1981; Center et al, 1984; Brown et al 1990 y Simkin et al, 1994). También se ha propuesto la aplicación de técnicas de análisis multivariables como pueden ser el análisis discriminante, el análisis de supervivencia, la regresión logística,... (Burton et al, 1991; Coryell et al, 1991; Tohen et al, 1992; Salive et al, 1992; Verheul et al, 1998; Fava et al, 1998 y Robinson et al, 1999). Sin embargo, ninguno de todos estos autores ha abordado el fenómeno de las recaídas desde un punto de vista epidemiológico, es decir, a partir de la obtención de indicadores típicos de este ámbito de estudio.Lo explicado en el párrafo anterior pone de manifiesto el gran vacío que existe hoy en día en el abordaje del estudio de diferentes fenómenos en el ámbito epidemiológico, ya sea por la falta de técnicas adecuadas en el trabajo en diferentes materias en las que la epidemiología está desarrollando un papel importante, como por ejemplo la epidemiología genética. Así Foppa et al, 1997 propusieron una aproximación que ayude a elaborar el diseño de un estudio de caso-control adecuado en el estudio de la interacción gen-entorno, aunque los autores consideran que ésta es aplicable a cualquier estudio con un factor de exposición ordinal politómico o con factores de exposición dicotómicos. De esta investigación se desprende que aportaciones de campos concretos revierten de manera general en cualquier aproximación epidemiológica.Ya que este vacío puede ser debido a aspectos más técnicos (como pueden ser el estudio del fenómeno de las recaídas, la mejora del procedimiento diagnóstico en los diferentes ámbitos de aplicación, y en especial, en el de la Psicología), debido a la detección de este vacío, el eje vertebrador de esta tesis será una propuesta tecno-metodológica de estudio del fenómeno de las recaídas desde un punto de vista epidemiológico, con el fin de cubrir algunas de las lagunas existentes en este sector.

Fundamentos: Para algunos trastornos psiquiátricos se ha podido establecer que existe relación entre las disfunciones cognitivas y las alteraciones en el FSCr. Para el trastorno bipolar (TB), distintos trabajos previos han sugerido que los pacientes con este trastorno presentan disfunciones cognitivas. Asimismo, en distintos estudios han sido halladas alteraciones en la distribución del flujo sanguíneo cerebral regional (FSCr) de estos pacientes. No obstante, no existe ningún trabajo publicado en que se haya estudiado la relación entre ambos tipos de marcadores en pacientes con TB.Objetivos: Determinar las posibles alteraciones en el rendimiento neuropsicológico y en el FSCr de los pacientes con TB, y establecer la relación entre ambos tipos de marcadores y con la psicopatología propia del trastorno.Pacientes y métodos: Se incluyeron 43 pacientes con TB (RDC) que se clasificaron según su fase en la enfermedad a partir de la puntuación obtenida en las escalas YMRS y HDRS en fase maníaca (n=7), hipomaníaca (n=8), depresiva (n=12) o eutímica (n=3), y 6 sujetos control. Se evaluó además el estado clínico mediante las escalas PANSS y GAF, la función cognitiva mediante los tests neuropsicológicos WAIS, WCST, Stroop, TMT, CVLT, WMS y FAS/COWAT, y se obtuvieron imágenes SPECT administrando el contraste radiológico 99mTc-HMPAO. Resultados: Las principales correlaciones halladas fueron entre: función ejecutiva (WCST) y FSCr de estriado, frontal, temporal, cerebelo, parietal y cingulado; función mnésica (WMS, WAIS-dígitos) y FSCr de estriado, frontal, temporal y parietal; tareas atencionales (Stroop) y FSCr de estriado, temporal media y parietal; aprendizaje verbal (CVLT) y FSCr de frontal, temporal posterior, cingulado y occipital; alteraciones psicomotoras (TMT) y FSCr de temporal anterior; empeoramiento intelectual (WAIS-Vocabulario) y FSCr de cerebelo y parietal.Conclusiones: Los resultados del estudio corroboran las hipótesis actuales que señalan la existencia de anomalías funcionales en estructuras fronto-subcorticales, cerebelo y sistema límbico en el TB.

La Memoria plantea el estudio de la biodiversidad parasitaria de los Mamíferos de vida libre que habitan el archipiélago canario. El objetivo principal ha sido contribuir al conocimiento de la helmintofauna y ectoparasitofauna en ecosistemas aislados. Estudios de esta índole son necesarios para poder establecer comparaciones con las faunas parasitarias que aparecen en otros ecosistemas insulares, de la región circummediterránea y/o macaronésica y de áreas continentales/peninsulares próximas. En la Tesis se han analizado parasitológicamente diez especies mastozoológicas pertenecientes a cuatro Órdenes diferentes: 3 Insectívoros (Atelerix algirus, Crocidura canariensis y Suncus etruscus); 1 Carnívoro (Felis catus); 2 Artiodáctilos (Ovis aries y Ammotragus lervia); y 4 Roedores (Atlantoxerus getulus, Rattus rattus, R. norvegicus y Mus musculus). En total, han formado parte del estudio 1090 hospedadores, procedentes de diferentes enclaves de cada una de las islas que conforman el archipiélago. Los helmintos y ectoparásitos hallados han sido estudiados siguiendo las técnicas de montaje tradicionales en Helmintología y Artropodología e identificados a través del microscopio óptico. Se ha realizado el análisis molecular de algunas especies que han entrañado dudas en su taxonomía. En total, el estudio de los Mamíferos silvestres de las Islas Canarias ha dado como resultado el hallazgo de 52 especies parásitas repartidas entre: 1 Trematoda, 11 Cestoda, 29 Nematoda, 2 Acanthocephala y 9 Arthropoda. En lo que se refiere a la helmintofauna de los hospedadores estudiados, esta es, estructuralmente, muy similar ha la que poseen estos mismos vertebrados en su hábitat originario continental y, como sucede en todos los ecosistemas insulares, se caracteriza por una disminución del número de especies parásitas y de sus porcentajes de infestación. Sin embargo, esta misma regla no se ha detectado en el caso de las pulgas, ya que la biodiversidad detectada en el archipiélago es cualitativamente superior a la de muchas zonas continentales. La distribución de las especies parásitas a lo largo del archipiélago se ha visto influenciada por las características climáticas y fisiográficas de las diferentes islas. La presencia de los hospedadores intermediarios adecuados, así como el papel de los hospedadores paraténicos, posiblemente han tenido también un importante papel en la distribución de los helmintos parásitos. Las diversas especies de pulgas tienden a agregarse en los hospedadores para formar comunidades organizadas mediante ciertas reglas de ensamblaje. Los resultados indican que la densidad de la población hospedadora y una elevada abundancia de pulgas hospedador-específicas, conducen a la no aleatoriedad de las comunidades de Sifonápteros sobre sus hospedadores. / The present Thesis evaluates the parasite biodiversity of free-living Mammals inhabiting the Canary archipelago. The main goal is the contribution to the knowledge of the helminth and ectoparasite fauna in isolated ecosystems. Those types of studies are required to establish comparisons with the parasite fauna present in other insular areas of the Mediterranean and Macaronesian Regions, as well as close peninsular and continental areas. A total of ten species of Mammals belonging to four different Orders were examined for the detection of parasites: 3 Insectivora (Atelerix algirus, Crocidura canariensis and Suncus etruscus); 1 Carnivora (Felis catus); 2 Artiodactyla (Ovis aries and Ammotragus lervia); and 4 Rodents (Atlantoxerus getulus, Rattus rattus, R. norvegicus and Mus musculus). In all, 1090 hosts were studied. Animals came from different habitats of each one of the Islands. Classical techniques of general Helminthology and Arthropodology were used to find, manipulate and identify the helminths and the ectoparasites. Molecular methods were used in those species which entailed some doubts in the final diagnosis. As a result of the analysis, 52 parasite species were detected, distributed in: 1 Trematoda, 11 Cestoda, 29 Nematoda, 2 Acanthocephala and 9 Arthropoda. Results shows that, structurally, the helminth biodiversity in Mammals from the Canary Islands is very similar to those fauna displayed by those vertebrates in their native continental habitats although, as it take place in all insular ecosystems, it is characterized by a decrease both in the number of species and in the prevalence of parasitization. Nevertheless, this pattern is not detected in fleas, which biodiversity in the Canary archipelago was qualitatively higher than in continental areas. In addition, the distribution of the parasite species throughout the archipelago was influenced by the climatic and physiographic characteristics of the different islands. Furthermore, the presence of suitable intermediary hosts, as well as paratenic hosts, could have an important role in the distribution of parasites. With regard to ectoparasites, fleas tend to be aggregated on hosts following certain assembly rules. Results showed that a high host population density as well as a high abundance of host-specific fleas, lead to the non-randomness of the Siphonaptera community on their hosts.

En la present tesi un dels primers objectius era caracteritzar el model caní per tal d'avaluar les seves similituds amb el melanoma humà. En aquest sentit, el primer que es va descriure va ser la caracterització de tres línies de melanoma caní (CML-1, CML-6M i CML-10c2) quant a l'expressió de proteoglicans (PGs) i la seva resposta a factors de creixement. D'aquest objectiu en sortí el primer article (Am J Vet Res 2002; 63:1151-1158), on es conclou que el contingut de proteoglicans i la resposta al tractament de TGF- de les línies de melanoma caní CML-1 i CML-6M són similars als de les línies de melanoma humà indiferenciades. En canvi, la línia cel·lular CML-10c2 produeix una baixa quantitat de proteoglicans d'elevat pes molecular. Com que aquests PGs extracel·lulars estan involucrats en el control de l'adhesió, proliferació i migració, poden jugar un important rol en la progressió dels melanomes en el gos.En veure els resultats previs de la diferencial expressió de les isoformes de versicà en les diferents línies de melanoma humà (Touab et al., 2002) i caní (Serra et al., 2002) es decidí sobreexpressar la isoforma V3 (que no conté cadenes de glicosaminoglicans) a dues línies cel·lulars de melanoma humà i dues de melanoma caní, on una era indiferenciada i expressava les isoformes V0 i V1 de versicà, i l'altra era diferenciada i no expressava cap isoforma de versicà. Es va utilitzar el sistema de transfecció retroviral per la sobreexpressió de V3 i es van fer els corresponents controls amb el vector sol. El treball es centrà en l'estudi del complex format per àcid hialurònic (HA), CD44 i versicà. La sobreexpressió de V3 reduïa marcadament el creixement cel·lular, incrementava l'adhesió i migració cel·lulars sobre HA. Aquesta migració incrementada es bloquejava quan les cèl·lules eren pre-incubades amb HA soluble o amb anticossos bloquejants de CD44, suggerint que V3 actuava alterant la interacció de l'HA amb el CD44. Per últim, es van realitzar estudis tumorigènics d'aquestes línies. Els resultats inicials mostraren que els ratolins injectats amb les cèl·lules que sobreexpressaven V3 tenien unes latències més llargues que els animals control, resultat que coincideix amb el retard del creixement observat in vitro. A més, els tumors expressaven versicà, CD44 i HA de forma diferencial entre els animals injectats amb les cèl·lules control i els injectats amb les cèl·lules. D'aquests resultats en sorgeix el segon article (acceptat sota minor revisions). Aquest segon apartat del treball es complementa amb l'estudi de l'expressió i activitat de MMPs i d'integrines en aquestes línies cel·lulars, així com de l'estudi de la migració sobre col·lagen tipus I i l'estudi del cicle cel·lular i dels seus inhibidors. Per continuar l'estudi del gos com a model del melanoma humà, el treball es va centrar en la relació existent en el complex format per versicà, HA i CD44, el principal receptor de superfície cel·lular de l'HA i sovint sobreexpressat en les cèl·lules tumorals. D'aquest objectiu en sortí el tercer article (J Comp Pathol, 2004, 130: 171-180). Per l'estudi in vitro es van utilitzar les línies cel·lulars canines CML-1 i CML-10c2. CML-1 expressa CD44, HA i versicà, cosa que permet la formació d'una matriu pericel·lular abundant, mentre que no es veu en el cas de CML-10c2, la qual expressa CD44, però produeix molt menys HA i no expressa versicà. Es van utilitzar biòpsies canines per fer l'estudi immunohistopatològic de CD44. Es va veure que la seva expressió era més intensa en els melanomes malignes, on tendia a estar present a la perfèria del tumor, mentre que era homogènia en el cas dels melanocitomes. / One of the most important aims was to characterize the canine model to evaluate its similitude with human melanoma. In this sense, the first step was to characterize the proteoglycans profile in three canine melanoma cell lines (CML-1, CML-6M and CML-10c2) and their response to growth factors. The first paper (Am J Vet Res 2002; 63:1151-1158) was originated from these results. We described that the proteoglycans content and the response to TGF- treatment are similar between CML-1, CML-6M and undifferentiated human melanoma cell lines. In contrast, CML-10c2 cell line produce a low quantity of high molecular weight proteoglycans as the differentiated human melanoma cell lines do. These extracellular proteoglycans are involved in adhesion, proliferation and migration control, so they may have an important role in canine melanoma progression. Because of our previous results about the differential expression of versican isoforms in different human and canine melanoma cell lines (Touab et al., 2002; Serra et al., 2002; Domenzain et al., 2003) we decide to continue with the study of versican. We overexpressed V3 isoform (it has not glycosaminoglycan chains) in two human and two canine melanoma cell lines, which differ in their endogenous versican expression. Retroviral system was used and the respective controls were done with the vector only (LXSN). The work was focused on the complex formed by hyaluronic acid (HA), CD44 and versican. V3 overexpression markedly cellular growth in vitro, and it increased adhesion and migration on HA substratum. This increased migration was blocked when cells were pre-incubated with soluble HA or with blocking anti-CD44 antibody, which suggest that V3 was changing HA-CD44 interaction. Finally, we performed tumorigenic assays with the transduced cell lines. Initial results showed that mice injected intradermically with V3 cells had longer latencies than animals injected with control cells, which is similar to the observed growth rates in vitro. Furthermore, primary tumors had different expression of versican, CD44 and HA between control and V3 cells. These results are compiled in the second paper (accepted under minor revisions). This second chapter it is also complemented with the study of MMPs and integrins expression and activity, and the study of migration on type I collagen and cellular cycle as well.To continue canine study as a human model of melanoma, we focused on the relationship within the complex formed by versican, HA and CD44, the major cellular surface receptor of HA, which is often overexpressed in tumoral cells. The third paper was derived from this goal (J Comp Pathol, 2004, 130: 171-180). For in vitro studies we used CML-1 and CML-10c2 canine melanoma cell lines. CML-1 expressed CD44 and versican and produced high amounts of HA, which allowed the formation of an important pericellular coat. In contrast, we couldn't see this pericellular coat in CML-10c2 cell line, which produced little amounts of HA and didn't express versican. Canine melanocytic tumors were used to study the expression of CD44. Malignant melanomas express more CD44 than melanocytomas and the expression pattern was different between benign and malignant lesions. In malignant tumors the CD44 expression was more intense in the periphery of the tumors, whereas an homogeneous CD44 expression was showed in benign lesions.