El concepto de trastorno del espectro obsesivo-compulsivo data, como mínimo, de los estudios de Freud (Freud, 1908), quien postuló la existencia de un continuum entre la naturaleza del trastorno obsesivo-compulsivo (TOC), la neurosis y la psicosis (Stein & Stone, 1997). Posteriormente, otros teóricos de orientación psicoanalítica enfatizaron la importancia de este modelo explicativo (Salzman, 1968). El concepto de espectro obsesivo-compulsivo es un ejemplo de cómo los trastornos pueden reorganizarse en función de una patogenia presuntamente compartida. Se parte del supuesto que los trastornos poseen "elementos del mismo espectro" basándose en sus similitudes con el TOC en una variedad de dominios, no solamente en los síntomas, género, edad de inicio, curso evolutivo, comorbilidad (con trastornos de dentro y fuera del espectro), y la respuesta terapéutica, sino también en la posible etiología compartida (Klein, 1993). Actualmente la noción de trastorno del espectro obsesivo-compulsivo refleja el mayor conocimiento sobre los mecanismos psicobiológicos implicados en el TOC. Diferentes autores han descrito los procesos genéticos, químicos inmunológicos y anatómicos subyacentes en el TOC y en otros trastornos neuropsiquiátricos que presentan ciertas similitudes clínicas (Stein, 2000). La perspectiva dimensional de la sintomatología obsesivo-compulsiva está recibiendo cada vez más atención (por parte de la comunidad científica, e hipótesis integradoras sobre los mecanismos psicobiológicos parecen ser una de las líneas de más interés en los últimos años) (Lochner et al., 2005; Lochner & Stein, 2006b). Una forma de conceptualizar, los trastornos relacionados con el TOC o trastornos del espectro obsesivo-compulsivo es el planteamiento de la idea del continuum, de la dimensión impulsiva-compulsiva (El Mansari & Blier, 2006; Hollander et al., 1996; Zohar & Group, 2006). En un extremo de esta dimensión se situarán los trastornos relacionados con la evitación al daño y la aversión al riesgo; en los que las compulsiones se realizarán en un esfuerzo para reducir la ansiedad o la amenaza percibida. En este extremo, pues, se sitúan el TOC, el trastorno dismórfico corporal y la anorexia nerviosa. En el otro extremo opuesto, se encontrarían los trastornos asociados a la impulsividad o al gusto por el riesgo; en los que los individuos tendrían dificultades para valorar las consecuencias negativas de su conducta siendo mucho más relevantes para ellos aspectos cómo la gratificación/ respuesta inmediata, placer, o la activación/excitación a corto plazo. En este punto del continuum se incluirían las compulsiones sexuales, compra compulsiva, juego patológico, trastornos por atracón y cleptomanía (lo que también se han contemplado como adicciones comportamentales) (Hollander, Braun, & Simeon, 2008).En numerosos estudios se ha indicado que más de la mitad de las personas con TOC cumplen criterios de por lo menos un trastorno actual supuestamente existente del espectro obsesivo-compulsivo, y que más de dos terceras partes tienen antecedentes a lo largo de la vida de por lo menos un trastorno del espectro obsesivo-compulsivo (Angst et al., 2004; du Toit, van Kradenburg, Niehaus, & Stein, 2001; Raffray & Pelissolo, 2007; Richter, Summerfeldt, Antony, & Swinson, 2003).La defensa de la semejanza clínica entre en TOC y los trastornos del espectro obsesivo-compulsivo se basa en la presencia frecuente de pensamientos o preocupaciones reiterativos, similares en apariencia a las obsesiones (Hollander & Wong, 1995). Sin embargo, estas preocupaciones están focalizadas en aspectos concretos y relevantes de cada trastorno específico (el peso corporal en los trastornos de la conducta alimentaria, el aspecto físico en el trastorno dismórfico corporal, una enfermedad concreta en la hipocondría, etc.) y carecen de las características intrínsecas y diferenciadoras de las ideas obsesivas como la conciencia de absurdo, la egodistonía o la resistencia que el enfermo opone a las mismas (Berrios, 2000).

Hepatic fibrosis is characterized by intense tissue remodeling. In this study, we assessed whether CO3-610, a new identified neoepitope, could be used as a surrogate biomarker of liver fibrosis and portal hypertension in CCl4-induced experimental fibrosis. Serum CO3-610 was measured by ELISA. Liver fibrosis was quantified by Sirius red staining. Serum hyaluronic acid (HA) was measured with a binding-protein assay. Gene expression of collagens I and III, MMP2 and MMP9, and tissue inhibitors of matrix metalloproteinase 1 and 2 was quantified by PCR. Hemodynamic measurements were taken in a subgroup of animals. A close direct relationship was found between serum CO3-610 and hepatic collagen content (r= 0.78; P<0.001), superior to that found for serum HA (r= 0.49; P<0.05). CO3-610 levels in rats with severe fibrosis (43.5±3.3 ng/mL, P<0.001) and cirrhosis (60.6±4.3 ng/mL, P<0.001) were significantly higher than those in control animals (26.6±1.3 ng/mL). Importantly, a highly significant relationship was found between serum CO3-610 and portal hypertension (r= 0.84; P<0.001). Liver MMP9 expression increased significantly in fibrotic animals but decreased to control levels in cirrhotic ones. Circulating CO3-610 behaves as a reliable indicator of hepatic remodeling and portal hypertension in experimental fibrosis. Therefore, this peptide could ultimately be a useful marker for the management of liver disease in patients. Endocannabinoids behave as antifibrogenic agents by interacting with cannabinoid CB2 receptors, whereas the apelin (AP) system acts as a proangiogenic and profibrogenic mediator in the liver. This study assessed the effect of long-term stimulation of CB2 receptors or AP receptor (APJ) blockade on fibrosis progression in rats under a non-discontinued fibrosis induction program. The study was performed in control and CCl4-treated rats for 13 weeks. Fibrosis-induced rats received a CB2 receptor agonist (AM1241) (1 mg/kg), an APJ antagonist (F13A) (75 μg/kg), or vehicle daily during the last 5 weeks of the CCl4 inhalation program. Mean arterial pressure (MAP), portal pressure (PP), hepatic collagen content, angiogenesis, cell infiltrate, and mRNA expression of a panel of fibrosis-related genes were measured in all animals. Fibrosis-induced rats showed increased hepatic collagen content, reduced MAP, PP, and increased expression of the assessed messengers in comparison with control rats. However, fibrotic rats treated with either AM1241 or F13A had reduced hepatic collagen content, improved MAP and PP, ameliorated cell viability, and reduced angiogenesis and cell infiltrate compared with untreated fibrotic rats. These results were associated with attenuated induction of PDGFRβ, α-SMA, MMPs, and TIMPs. CB2 receptor stimulation or APJ blockade prevents fibrosis progression in CCl4-treated rats. The mechanisms underlying these phenomena are coincident despite the marked dissimilarities between the CB2 and APJ signaling pathways, thus opening new avenues for preventing fibrosis progression in liver diseases. PDGF is the most potent stimulus for proliferation and migration of stellate cells. PDGF receptor β expression is an important phenotypic change in myofibroblastic cells that mediates proliferation and chemotaxis. Here we analyzed the relationship between PDGFRβ expression, hemodynamic deterioration, and fibrosis. Thereafter, we investigated the effects produced by an adenovirus encoding a dominant-negative soluble PDGFRβ (sPDGFRβ) on hemodynamic parameters, PDGFRβ signaling pathway, and fibrosis. Hemodynamics, PDGFRβ mRNA expression, and hepatic collagen were assessed in controls and fibrosic/cirrhotic rats. Next, 30 fibrotic rats were randomized into three groups receiving iv saline and an adenovirus encoding for sPDGFRβ or β-galactosidase. After 7days, hemodynamics, serum sPDGFRβ, and hepatic collagen were measured. CCl4-treated animals for 18weeks showed a significantly higher increase in PDGFRβ mRNA compared to those treated for 13weeks and control rats. In CCl4-treated rats, the fibrous tissue area ranged from moderate to severe fibrosis. A direct relationship between the degree of fibrosis, hemodynamic changes, and PDGFRβ expression was observed. Fibrotic rats transduced with the adenovirus encoding sPDGFRβ showed increased MAP, decreased PP, lower activation of the PDGFRβ signaling pathway, and reduced hepatic collagen than fibrotic rats receiving β-gal or saline. PDGFRβ activation closely correlates with hemodynamic disorders and increased fibrosis in CCl4-treated rats. Adenoviral dominant negative soluble PDGFRβ improved fibrosis. As a result, the hemodynamic abnormalities were ameliorated. Cirrhotic patients have altered host-defense response mechanisms. Here we assessed whether impaired expression of CB2 receptor in monocytic cells of cirrhotic patients could be involved in the pathogenesis of this phenomenon. CB2 mRNA and protein expression was assessed in a differentiated human monocytic cell line (U937) stimulated with endotoxin (LPS). A PCR array of 86 different genes was assessed in U937 cells treated with LPS. A migration assay towards endocannabinoids or the CB2 antagonist, SR144528, was performed in U937 cells exposed to LPS. Finally, CB1 and CB2 mRNA expression were measured in monocytes and macrophages of cirrhotic patients with or without spontaneous bacterial peritonitis. LPS reduced CB2 expression in human monocytes. Endocannabinoids increased the migratory activity of U937 cells, which was reverted when the experiments were performed in the presence of LPS. Transcriptional profiling showed marked upregulation of 9 genes related to proinflammatory signaling. However, only two genes encoding for CB1 and CB2 were reduced in LPS-treated cells. Circulating monocytes of cirrhotic patients showed a significantly diminished mRNA expression of CB1 and CB2. Markedly low CB1 and CB2 mRNA levels were found in peritoneal macrophages of cirrhotic patients with ascites, being almost suppressed when analyzed in patients with peritonitis. LPS reduces CB2 expression in human monocytes resulting in depressed chemotactic activity and therefore impaired host defense response of these cells. / La característica más destacable de la fibrosis es la desregulación de la ME. El equilibrio que existe entre la síntesis y la degradación de la ME en un hígado normal se pierde, y como consecuencia se favorece la síntesis y acumulación de fibras de colágeno, el cual provoca la distorsión de la arquitectura del parénquima y de la red vascular hepática. El CO3-610 es un producto de degradación del colágeno III que ha mostrado estar correlacionado significativamente con el aumento de la cantidad de colágeno y progresión de la fibrosis. Los valores máximos de CO3-610 se han encontrado ratas cirróticas. El resultado más importante es que el CO3-610 ha mostrado tener una estrecha correlación con los valores de presión portal. Existe un gran interés en investigar y desarrollar terapias dirigidas a la prevención de la progresión de la fibrosis. Los endocannabinoides son moléculas lipídicas que participan en un amplio rango de procesos fisiológicos. Los efectos son mediados por dos tipos de receptores, el CB1 y el CB2. El sistema de la apelina es otro sistema endógeno que ha despertado mucho interés en los últimos años. La apelina es el único ligando conocido para el receptor APJ. El tratamiento con AM1241, un agonista selectivo de CB2 y F13A, un antagonista de APJ mejoró la función hepática, la hemodinámica sistémica y portal, y provocó una reducción significativa del grado de fibrosis hepática. Ambos tratamientos produjeron una disminución del infiltrado inflamatorio, angiogénesis y del grado de apoptosis en el parénquima hepático. El análisis de la expresión del mRNA de varios genes importantes implicados en el proceso fibrogénico, reveló que el tratamiento tanto con AM1241 como con F13A, producían una disminución de la expresión del PDGFRβ, del αSMA y de genes de remodelado tisular. La inhibición parcial de la vía de PDGF mediante la administración de un dominante negativo para la fracción soluble del receptor β de PDGF, ha demostrado que mejora la hemodinámica sistémica y la presión portal además de mejorar el grado de fibrosis. Por último, los pacientes cirróticos con ascitis tienen una mayor probabilidad de sufrir infecciones (peritonitis bacteriana espontánea, PBE). Se ha observado que estos pacientes tienen una menor expresión de CB2. In vitro se han realizado experimentos con células monocíticas (U937) y se ha observado que el LPS disminuye drásticamente la expresión de CB2 al igual que afecta a la capacidad de migración de estas células. En conjunto, se puede concluir que la evaluación de la fibrosis hepática es una herramienta muy importante para el diagnostico de la enfermedad hepática y que éste puede mejorarse a través del uso de biomarcadores no invasivos que correlacionen con la hemodinámica y el grado de fibrosis hepática. La prevención de la progresión de la fibrosis a través de fármacos o bien actuando sobre genes clave involucrados en la fibrogénesis son posibles dianas terapéuticas. Finalmente, es posible mejorar la calidad de vida de los pacientes cirróticos con ascitis con infección por PBE mediante terapias que involucren los receptores de cannabinoides CB2.

La present tesi doctoral s’emmarca en el model d’ansietat patològica del condicionament de la por. D’acord amb aquest model, l’ansietat clínica prové de processos de condicionament de la por anòmals i altres factors de diàtesi-estrès relacionats. Aquesta idea ha rebut suport d’estudis que mostren condicionament anòmal de la por en individus diagnosticats amb trastorns d’ansietat, però les evidències sobre aquestes anomalies en individus en risc d’ansietat clínica són escasses. Per aquesta raó, examinàrem les diferencies individuals en l’adquisició i la generalització de la por condicionada en participants sans que es caracteritzaven per diferents nivells de susceptibilitat a l’ansietat patològica. Dues fonts de vulnerabilitat a l’ansietat varen ser investigades: la variació al·lèlica en el polimorfisme BDNF-val66met (estudi 1) i l’ansietat tret (estudi 2). Malgrat el gruix important de recerca que s’ha portat a terme recentment sobre la relació entre el polimorfisme BDNF-val66met i l’ansietat patològica, no està clar quin dels al·lels s’associa a un major risc als trastorns d’ansietat. Per tant, esperàvem que la variació en el polimorfisme BDNF-val66met es traduiria en diferències en l’adquisició i la generalització de la por, però no teníem cap hipòtesi sobre la direcció d’aquesta associació. Per altra banda, i donat que l’ansietat tret representa un factor de risc a l’ansietat patològica, esperàvem que els individus amb elevada ansietat tret mostrarien una adquisició anòmala de la por i excessiva generalització. A banda, i donades les implicacions a nivell teòric i metodològic, també estudiàrem l’estabilitat temporal de les diferències individuals en l’adquisició i generalització de la por (estudi enviat per a la seva publicació, inclòs a l’annex). En contra de les nostres prediccions, no trobàrem cap efecte del polimorfisme BDNF-val66met, o de l’ansietat tret, en l’adquisició i la generalització de la por. En les tres mesures de por (reflex d’ensurt, resposta de conductància de la pell, i expectatives online de l’estímul incondicionat aversiu), els participants de tots dos estudis van mostrar condicionament diferencial durant l’adquisició de la por i un gradient de generalització normal, caracteritzat per una disminució gradual de la por a mesura que els estímuls de generalització eren menys semblants al senyal de perill. Per altra banda, els resultats de l’estudi sobre l’estabilitat temporal de les diferències individuals en l’adquisició i la generalització de la por semblen indicar que una part moderada de la variabilitat en aquests processos és influïda per característiques individuals estables. D’acord amb els nostres resultats, concloguérem que el polimorfisme BDNF-val66met i l’ansietat tret no s’associen amb l’adquisició o generalització anòmales de la por condicionada. Per tant, més que una diàtesi preexistent a l’ansietat patològica, l’adquisició i generalització de la por anòmales podrien ser la conseqüència d’altres factors patogènics que condueixen a l’aparició de l’ansietat patològica. / The present Ph D dissertation is framed within the fear-conditioning model of pathological anxiety. According to this model, clinical anxiety emerges from abnormal fear-conditioning processes and other related diathesis-stress factors. This has been supported by studies showing abnormal fear conditioning in individuals diagnosed with anxiety disorders, but evidence of these abnormalities in individuals at risk for clinical anxiety is rather scarce. Thus, we examined individual differences in the acquisition and generalization of conditioned fear in healthy participants characterized by different levels of susceptibility to pathological anxiety. Two sources of variability in vulnerability to anxiety were investigated: allele variation in the BDNF-val66met polymorphism (study 1) and trait anxiety (study 2). Despite the important body of research conducted recently on the relationship between the BDNF-val66met polymorphism and pathological anxiety, it is far from clear which of the polymorphism alleles is associated with increased risk for anxiety disorders. Thus, we expected that variation in BDNF-val66met polymorphism would lead to differences in the acquisition and generalization of fear, but we did not have any hypothesis about the direction of this association. On the other hand, and given that high trait anxiety represents an established risk factor for pathological anxiety, we expected that individuals with high trait anxiety would show abnormal fear acquisition and overgeneralization of fear. In addition, and given its important theoretical and methodological implications, we also tested the temporal stability of individual differences in the acquisition and generalization of conditioned fear (study submitted for publication included in the appendix). Contrary to our expectations, we did not find any effect of the BNDF-val66met polymorphism or trait anxiety on the acquisition and generalization of fear. For the three fear measures (startle reflex, skin conductance response, and online expectancies of the unconditioned aversive stimulus), participants from the two studies exhibited differential conditioning during fear acquisition and the normal generalization gradient, with a gradual decrease in fear as the generalization stimuli were less similar to the danger signal. On the other hand, the results of our unpublished study on the temporal stability of individual differences in the acquisition and generalization of fear suggest that a moderate part of the variability in these processes is influenced by stable individual characteristics. Based on our results, we concluded that the BDNF-val66met polymorphism or high trait anxiety is not associated with abnormal acquisition or generalization of conditioned fear. Thus, rather than a preexisting diathesis for pathological anxiety, abnormal acquisition and generalization of fear may be the result of other pathogenic factors that lead to the onset of an anxiety disorder.

Antecedentes A fines de los años ochenta e inicios de los noventa, bajo la influencia de organismos multilaterales como el Banco Mundial y el Fondo Monetario Internacional numerosos países empezaron reformas a los sistemas de salud basadas en modelos de mercados, a las que Colombia no escapó. Así se crea en 1993 el Sistema General de Seguridad Social en Salud (SGSSS). En 1994, se formula una comprehensiva política de participación en salud que establece la participación en la gestión, la planeación y la evaluación en varios niveles: desde la información hasta la toma de decisiones y a través de diferentes mecanismos de participación: participación ciudadana (basada en mecanismos de mercado, participación comunitaria y la participación dentro de las instituciones de salud. El conocimiento de los usuarios acerca del sistema de salud, de sus derechos en salud y de la política de participación los fortalece para una efectiva interacción con el sistema: para participar en varios aspectos del sistema de salud, para tomar decisiones informadas en salud, así como para acceder a los servicios de salud y exigir sus derechos, entre otros. Objetivo Analizar la evolución del conocimiento del SGSSS, de los derechos en salud así como el conocimiento y utilización de los mecanismos de participación de los usuarios de los servicios de salud en dos municipios de Colombia y los factores asociados, entre 2000 y el 2010. Métodos Se realizó un estudio descriptivo comparando estudios transversales basados en dos encuestas a usuarios del SGSSS de Colombia, la primera en el 2000 y la segunda en 2010. Se tomaron como áreas de estudio los municipios de Tuluá (zona urbana) y Palmira (zona rural). En ambas encuestas se hizo muestreo probabilístico multietápico, con una muestra final: en la primera encuesta de 1497 usuarios y en la segunda, 1405. Se estimaron modelos de regresión logística para comparar, los cambios en los niveles de conocimientos acerca del SGSSS, de la norma para participar y los derechos, tomando primero los dos años juntos (el 2000 como referencia) y luego uno por cada año para determinar los factores asociados con esos conocimientos. Se estimaron modelos de regresión logística para comparar los cambios en los niveles de conocimientos de los mecanismos de participación y su utilización, tomando los dos años juntos (el 2000 como referencia), y luego uno por cada año para determinar los factores asociados con el conocimiento y la utilización de los mecanismos de participación. Todos los datos fueron analizados con el SPSS v17 Resultados Si en el año 2000 el conocimiento del SGSSS, el conocimiento de los mecanismos de participación y su utilización eran limitados, en 2010 éste disminuyó significativamente, exceptuado el conocimiento con relación a las aseguradoras (EPS) y proveedores (IPS), que se incrementó un poco. En contraste, los resultados muestran que más del 90% de los entrevistados en ambas encuestas se percibían portadores de derechos en salud. Los mecanismos más conocidos y utilizados fueron los de mercado. Tener nivel socioeconómico y estudios superiores y vivir en el área urbana se asoció consistentemente a niveles de conocimiento alto del SGSSS. Tener nivel socioeconómico y estudios superiores y vivir en aérea rural, se asoció al conocimiento y utilización de los mecanismos de participación. Con relación a la actuación institucional, se observa que en el año 2000 menos del 5% refirió haber sido invitado o notificado por alguna institución o autoridad de salud. En el año 2010 esta proporción bajo, observándose que menos del 1.5% dijo haber sido invitado o notificado. Discusión y conclusiones Los usuarios más desventajados tienen bajas probabilidades de conocer el SGSSS, la política de participación, de conocer y usar los mecanismos de participación que los demás; lo que representa una barrera para tomar decisiones informadas en salud, para fortalecerse en el ejercicio de sus derechos en salud. Para revertir esta situación, se necesita una intervención decidida de las instituciones de salud y del gobierno en reducir las inequidades sociales / Background During the late 1980s and 1990s, and under the influence of multilateral organizations like the World Bank and the International Monetary Fund, numerous nations undertook reforms based on market models in their social sectors, including healthcare; Colombia was not removed from this. Thus, in 1993 the General System of Social Security in Health (Sistema General de Seguridad Social en Salud – SGSSS). In 1994, a comprehensive policy for social participation in health was also formulated, which established participation in management, planning, and evaluation at various levels: from information to decision making and through different types of health participation: citizen participation (based on a market approach), community participation and participation within healthcare institutions. Users’ awareness of the healthcare system, of their rights to healthcare and awareness of the policy participation, empowers them for effective interaction with health services: for participating in various aspects of the healthcare system; for making informed health decisions; as well as for accessing services and hence, it is one of the fundamental conditions for users to exercise their right to healthcare– among others. Objective To analyze the evolution of awareness of the SGSSS, of rights in health, as well as the awareness and use of the participation mechanisms of health service users in two municipalities in Colombia and associated factors, between 2000 and 2010. Methods A descriptive study was conducted comparing cross-sectional studies based on two surveys of users of the SGSSS in Colombia, the first in 2000, and the second in 2010. The municipalities of Tuluá (urban area) and Palmira (rural area) were taken as study areas. A multistage probability sampling was carried out in both surveys, with a final sample: in the first survey, of 1497 users, and 1405 in the second. Logistic regression models were estimated to compare, on one hand, changes in the levels of awareness of the SGSSS, the standard for participation and rights, taking first the two years together (2000 as a reference and adjusted by the explanatory variables), and then one for each year to determine the factors associated with these levels of knowledge. Moreover, the logistic regression models were estimated to compare changes in the levels of awareness of the participation mechanisms and their use, taking the two years together (2000 as reference and adjusted by explicative variables), and then one for each year to determine the factors associated with the levels of awareness and use of the participation mechanisms. All data were analyzed with the SPSS v17. Results Users’ awareness of the healthcare system, awareness and utilization of the mechanisms in 2000 was limited, and in 2010, it diminished significantly, with the exception of that relating to health insurers and providers. In contrast, results show that more than 90% of users in both surveys perceive themselves as bearers of healthcare rights. In both surveys, living in an urban area, having a higher education, and belonging to a higher socioeconomic status is consistently associated with a higher level of awareness of the SGSSS. Living in rural area, having a higher education, and belonging to a higher socioeconomic status are consistently associated with a higher level of awareness and use of the participation mechanisms. With respect to institutional performance, it is observed that in the year 2000 less than 5% stated having been invited to or notified by any institution or health authority. In the year 2010 this proportion decreased, observing that less than 1.5% said they had been invited or notified. Conclusions The most underprivileged users have lower odds of being knowledgeable of the SGSSS, the social participation norms and participation mechanisms than the others, which represents a barrier for making informed decisions and the enforcement and exercise of their rights to health. In order to reverse this situation, a decisive intervention of health institutions and government is necessary to reduce social inequities.

La incidència de reaccions al·lèrgiques espontànies en el gos, com per exemple la dermatitis atòpica, sembla anar en augment. Malgrat que la gestió d’aquest tipus de malalties combina diverses estratègies depenent de l’etiologia particular de cada una, l’aproximació terapèutica més estesa és l’ús de glucocorticoides, que pot conduir a una gran varietat d’efectes adversos, especialment en tractaments crònics. Per tant, és important el desenvolupament de noves teràpies pel control eficaç de processos al·lèrgics i inflamatoris associats amb un gran número de malalties cutànies en el gos. En aquest sentit, estudis recents han mostrat l’existència de nous mediadors endògens lipídics (endocannabinodes) amb propietats antiinflamatòries i analgèsiques, com per exemple la palmitoiletanolamida (PEA). La PEA i el seu anàleg sintètic adelmidrol pertanyen a un grup d’amides d’àcids grassos anomenats aliamides, que són capaces d’actuar a través de la regulació negativa de la degranulació dels mastòcits (MCs). Malgrat que és ben coneguda la seva eficàcia farmacològica en malalties inflamatòries de la pell, el mecanisme d’acció d’aquesta família de compostos encara no estat del tot clar. Per entendre millor els efectes cel·lulars de les aliamides en els gossos, es van incubar mastòcits canins recent aïllats de biòpsies de pell amb sèrum ric en IgE i es van estimular amb anti-IgE canina. L’alliberació d’histamina, prostaglandina D2 (PGD2) i factor de necrosi tumoral alfa (TNFα) es va mesurar en presència i absència de concentracions creixents de PEA. Els resultats van mostrar una inhibició significativa de l’alliberació d’histamina, PGD2 i TNFα en presència de PEA, mostrant la capacitat d’aquesta aliamida per regular negativament l’activació dels MCs cutanis canins. Un cop observats els efectes de la PEA sobre els MCs, l’objectiu va ser la seva eficàcia sobre la reacció inflamatòria al·lèrgica cutània induïda en gossos hipersensibles a Ascaris suum. Per això es van induir la formació de pàpules a la pell dels gossos a través d’injeccions intradèrmiques d'extracte d'Ascaris, substància P i anti-IgE canina, abans i després de l’administració oral d’una única dosi de PEA de 3, 10 i 30 mg/kg. Els resultats van mostrar una reducció significativa en les àrees de la pàpules induïdes tant per antigen com per anti-IgE canina després de l’administració de PEA per les dues dosis més altes. Finalment, es va avaluar l'eficàcia del tractament tòpic amb adelmidrol (2%) durant 8 dies consecutius en les respostes inflamatòries primerenques i tardanes induïdes en gossos hipersensibles a Ascaris. Per això, es van induir la formació de pàpules a través de repetides injeccions intradèrmiques d'extracte d'antigen i es van obtenir dues biòpsies dels punts d’injecció per cada gos (tractament amb adelmidrol i tractament amb vehicle). Els resultats van mostrar una reducció significativa en les àrees de les pàpules induïdes per antigen al quart i setè dia de tractament amb adelmidrol, mentre que no es va observar cap efecte amb el tractament de vehicle. A més, es va avaluar el reclutament cel·lular de les biòpsies obtingudes després de 8 dies de tractament amb adelmdrol i vehicle. Els resultats van revelar una reducció significativa del número de mastòcits amb el tractament amb adelmidrol en comparació amb el tractament amb vehicle. Per tant, els nostres resultats van mostrar que els efectes antiinflamatoris de la PEA i adelmidrol observats en els gossos poden ser degut, almenys en part, a la seva capacitat per inhibir l'alliberament dels mediadors mastocitaris preformats i de nova síntesi, i reduir el nombre de MCs. En conclusió, la PEA i adelmidrol podrien constituir una nova estratègia terapèutica per al tractament de malalties al·lèrgiques inflamatòries de la pell en els animals de companyia. / The incidence of spontaneous allergic reactions in dogs, e.g. atopic dermatitis, appears to be increasing. Although management of this kind of diseases combines different interventions depending on the particular aetiology, the most widespread therapeutic approach still relies on glucocorticoids, which can lead to a variety of adverse effects, especially with chronic treatments. Therefore, it is important to develop new effective therapies for controlling allergic and inflammatory processes associated with a number of skin diseases in the dog. In this sense, recent studies have shown the existence of new endogenous lipid mediators (endocannabinoids) with anti-inflammatory and analgesic properties, e.g. palmitoylethanolamide (PEA). PEA and its synthetic analogue adelmidrol belong to a group of fatty acid amides called aliamides which are able to act through the downregulation of mast cell (MC) degranulation. Although its pharmacological efficacy is well known in skin inflammatory diseases, the mechanism of action of this family of compounds is still unclear. To better understand the cellular effects of aliamides in dogs, canine mast cells freshly isolated from skin biopsies were incubated with IgE-rich serum and were challenged with anti-canine IgE. Histamine, prostaglandin D2 (PGD2) and tumour necrosis factor-alpha (TNFα) release was measured in the presence and absence of increasing concentrations of PEA. The results showed a significant inhibition of histamine, PGD2 and TNFα release in the presence of PEA, showing the ability of this aliamide to down-modulate skin MC activation. Once observed PEA effects in canine MCs, the objective was to evaluate its efficacy on the cutaneous allergic inflammatory reaction induced in hypersensitive Ascaris suum dogs. Therefore, the formation of wheals was induced in dogs skin by intradermal injections of Ascaris extract, substance P and anti-canine IgE, before and after a single oral administration of PEA at doses of 3, 10 and 30 mg/kg. The results showed a significant reduction in wheal area induced by both antigen and anti-canine IgE challenge after PEA administration at two higher doses. Finally, the efficacy of topical adelmidrol treatment during 8 consecutive days was evaluated on induced early and late inflammatory responses in Ascaris hypersensitive dogs. Therefore, the formation of wheals was performed by repeated intradermal injections of antigen extract and two biopsies per dog were obtained from injection points (adelmidrol-treatment and vehicle-treatment). The results showed a significant reduction in the antigen-induced wheal areas after 4 and 7 days of adelmidrol treatment, whereas no effects were observed with vehicle treatment. Moreover, the cellular recruitment were analysed in biopsies obtained after 8 consecutive days of topical adelmidrol or vehicle treatment. The results revealed a significant decrease of mast cell number with adelmidrol treatment in comparison with vehicle treatment. Therefore, our findings showed that the anti-inflammatory effects of PEA and adelmidrol observed in dogs could be due, at least in part, to its ability to inhibit the release of both preformed and newly synthesised MCs mediators and to reduce the MCs cell numbers. In conclusion, PEA and adelmidrol might constitute a new therapeutic strategy for the treatment of allergic inflammatory skin diseases in companion animals.

El objetivo general de esta tesis consistió en el estudio, in vitro (baño de órganos y microelectrodos), de la fisiología del cuerpo esofágico (EB) y del esfínter esofágico inferior (LES) con tejido de dos especies, humana y porcina. Permitiendo: Estudiar los neurotransmisores y mecanismos que controlan las respuestas inducidas por la estimulación de las motoneuronas (MNs) inhibitorias y excitatorias del plexo mientérico (MP) en el esófago (LES y EB) humano y animal. El modelo porcino está considerado como un modelo animal homólogo, ya que ambas especies tienen muchas similitudes tanto funcionales como estructurales respecto al tracto gastrointestinal. El objetivo del primer estudio, fue evaluar el efecto de la estimulación selectiva de las MNs inhibitorias y excitatorias en el LES porcino a través de los receptores nAChRs, 5-HT3 y P2X. Se estudiaron tiras de LES circular, de cerdos adultos, en baño de órganos. Se compararon los efectos de la estimulación de las MNs mediante estimulación eléctrica de campo (EFS:26V, 0.3-20Hz); nicotina (1-300μΜ); 5-HT y 2-Me-5-HT (1nM-30μΜ) y α,β-meATP (1-100μΜ) en tres soluciones: Krebs estándar, solución no-adrenérgica no-nitrérgica no-purinérgica (NANNNP) y solución no-adrenérgica no-colinérgica (NANC). Los resultados sugieren mecanismos selectivos para estimular las vías motoras inhibitoria y excitatoria en el LES porcino. Las MNs inhibitorias se estimulan intensamente mediante los receptores nAChRs y no responden a la estimulación de los receptores 5-HT3 y P2X. Por contra, las MNs excitatorias se estimulan a través de los receptores 5-HT3 y P2X, la estimulación a través de los nAChRs es difícil causando una respuesta débil. El objetivo del segundo estudio, fue explorar los mecanismos mientéricos de control de la motilidad esofágica humana y el efecto de los neurotransmisores nitrérgicos y no-nitrérgicos, mediante tiras esofágicas circulares en baño de órganos y microelectrodos. Se compararon las respuestas obtenidas tras la EFS de las MNs entéricas ó a través de los receptores nAChRs en el cuerpo esofágico (EB) y en las regiones clasp y sling del LES. Los resultados muestran una especialización regional en la estimulación de las MNs entéricas en el esófago humano, con respuestas inhibitorias más intensas en las fibras clasp del LES y respuestas excitatorias colinérgicas más intensas en el EB. Las respuestas inhibitorias están desencadenadas principalmente por las MNs entéricas nitrérgicas que median los potenciales postunión inhibitorios (IJP) en el LES y en el EB, la relajación-on inducida por EFS en las zonas clasp y sling del LES y la latencia en el EB. También se encontró un papel menor para las purinas (a través de receptores P2Y1) y el VIP mediando parte de la relajación no-nitrérgica en la zona clasp del LES. El objetivo del tercer estudio, fue caracterizar los neurotransmisores implicados en el origen y modulación de las contracciones del músculo liso circular del EB porcino. Se estudiaron las respuestas al EFS de las MNs de las tiras de EB en baño de órganos y microelectrodos. Se caracterizó el efecto de los antagonistas de los neurotransmisores inhibitorios (L-NAME 1mM, MRS2179 10μM) y excitatorios (atropine 1μM; SR140333 1μM-NK1ra-, GR94800 1μM-NK2ra-) y gangliónicos (hexamethonium 100μM, ondansetron 1μM, NF279 10μM). Los resultados sugieren que el timing (latencia) y amplitud de las contracciones esofágicas están determinadas por un equilibrio de interacciones complejas entre las MNs inhibitorias y excitatorias. La latencia depende de la activación de las MNs inhibitorias liberando NO y una contribución purinérgica menor a través de receptores P2Y1, y de las MNs excitatorias liberando ACh. La amplitud depende de una contribución principal de las MNs excitatorias liberando ACh y taquiquininas, y también de las MNs inhibitorias liberando NO, ATP o una purina relacionada y neurotransmisores peptidérgicos actuando como fuertes moduladores de la transmisión neuroefectora excitatoria. / The aim of this Doctoral Thesis was to study, in vitro, the physiology of the esophageal body (EB) and the lower esophageal sphincter (LES) with tissue from human and porcine species. To do these we used organ baths and microelectrodes, which have allowed us: To study both the neurotransmitters and the mechanisms that control the responses induced by stimulation of inhibitory and excitatory motorneurons (MNs) of the myenteric plexus (MP) in the human and animal esophagus (LES and EB). The porcine model is considered as a homologous animal model to human, as both species have many functional and structural similarities regarding the gastrointestinal tract. The aim of the first study was to assess the effect of selective stimulation of inhibitory and excitatory MNs in porcine LES through nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs), 5-HT3 and P2X receptors. Circular LES strips from adult pigs were studied in organ baths. We compared the effects of stimulation of MNs by electrical field stimulation (EFS: 26V, 0.3-20Hz); nicotine (1-300μΜ; 5-HT and 2-Me-5-HT (1nM-30μΜ) and α,β-meATP (1-100μΜ) in standard Krebs solution, a non-adrenergic non-nitrergic non-purinergic (NANNNP) solution and a non-adrenergic non-cholinergic (NANC) solution. Our results suggest selective mechanisms for stimulation of intrinsic excitatory and inhibitory motor pathways in porcine LES. Inhibitory MNs are strongly stimulated by nAChRs and do not respond to stimulation of 5-HT3 and P2X receptors. By contrast, excitatory MNs are stimulated through 5-HT3 and P2X receptors, stimulation through nAChRs being difficult and causing a weak response. The aim of the second study was to explore the myenteric mechanisms of control of human esophageal motility and the effect of nitrergic and nonnitrergic neurotransmitters. Human circular esophageal strips were studied in organ baths and with microelectrodes. Responses following electrical field stimulation (EFS) of enteric motorneurons (MNs) or through nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) were compared in the esophageal body (EB) and in clasp and sling regions in the lower esophageal sphincter (LES). Our study shows a regional specialization to stimulation of EMNs in the human esophagus, with stronger inhibitory responses in clasp LES fibers and stronger cholinergic excitatory responses in the EB. Inhibitory responses are mainly triggered by nitrergic enteric MNs mediating the inhibitory junction potentials (IJP) in the LES and EB, EFS on-relaxation in clasp and sling LES sides, and latency in the EB. We also found a minor role for purines (through P2Y1 receptors) and vasoactive intestinal peptide-mediating part of nonnitrergic clasp LES relaxation. The aim of the third study was to characterize the neurotransmitters involved in the origin and modulation of circular smooth muscle esophageal body (EB) contractions in the porcine esophagus. Responses of porcine EB strips to electrical stimulation of motorneurons (MNs) were assessed in organ baths and with microelectrodes. The effect of antagonists of inhibitory (L-NAME 1mM, MRS2179 10μM) and excitatory neurotransmitters (atropine 1μM; SR140333 1μM-NK1ra-, GR94800 1μM-NK2ra-) and of ganglionic neurotransmitters (hexamethonium 100μM, ondansetron 1μM, NF279 10μM) were characterized. Our results suggest that timing (latency) and amplitude of esophageal contractions are determined by a balance of complex interactions between excitatory and inhibitory MNs. Latency depends on the activation of inhibitory MNs releasing NO and a minor purinergic contribution through P2Y1 receptors, and excitatory MNs releasing ACh. Amplitude depends on a major contribution of excitatory MNs releasing ACh and tachykinins, and also on inhibitory MNs releasing NO, ATP or related purines, and peptidergic neurotransmitters acting as strong modulators of the excitatory neuroeffector transmission.

La neurotransmissió inhibitòria participa en el control de l’activitat motora del còlon. Els neurotransmissors inhibitoris hiperpolaritzen la membrana del múscul llis, generant un potencial d'unió inhibitori (”Inhibitory Junction Potential” IJP) que és la base electrofisiològica de la relaxació muscular. Així, l’adenosina trifosfat (ATP), l’òxid nítric (NO) i el sulfur d’hidrogen (H2S) són molècules de senyalització que poden exercir aquest control. L’objectiu d’aquesta tesi doctoral ha estat valorar la participació de l’ATP, el NO i el H2S en la transmissió neuromuscular inhibitòria en el còlon humà i de rata. El hidrogensulfur de sodi (NaHS) va ser utilitzat com font de H2S. Els antagonistes específics dels receptors P2Y1 van inhibir completament el component purinèrgic de l’IJP en el còlon humà i de rata (rang de potència: MRS2500>MRS2279>MRS2179). El β-NAD va produir hiperpolarització i relaxació de la musculatura del còlon humà. Tanmateix, la relaxació no va ser bloquejada pels antagonistes P2Y1. En el còlon de rata es va observar que l’alliberament de neurotransmissors inhibitoris produïa la generació d’IJP espontanis i un potencial de membrana muscular hiperpolaritzat. Mitjançant MRS2500 es va posar de manifest que els receptors P2Y1 participaven en la gènesi dels IJP espontanis. El Nω-nitro-L-arginina (L-NNA) va permetre establir que l'estat de hiperpolarització tònic del potencial de membrana era d'origen nitrèrgic. L’ús d’apamina, spadina i ODQ va permetre valorar la participació dels canals de potassi de baixa conductància activats per calci (SKCa), els canals de potassi relacionats amb TWIK tipus 1 (TREK1) i la via de la guanilat ciclasa (GC) sobre la neurotransmissió purinèrgica i nitrèrgica. L’apamina va bloquejar tots dos components amb diferents nivells d'afinitat. L’ODQ només va bloquejar la neurotransmissió nitrèrgica. D’altra banda, tot i posar de manifest la presència de canals TREK1 en el còlon de rata, la spadina, un blocador de TREK1, no va bloquejar cap dels components. L’expressió dels enzims de síntesi del H2S es va determinar immunohistoquímicament en l’epiteli, el múscul i les neurones del còlon de rata. A més, es va demostrar que el teixit de rata era capaç de produir enzimàticament H2S. Tot i que en alguns casos es van observar efectes no específics dels inhibidors dels enzims de síntesi del H2S, aquestos van produir despolarització de les cèl·lules musculars i un increment de l’activitat mecànica del còlon. En segments de còlon de rata, el NaHS administrat per serosa va causar un efecte dual sobre els patrons de motilitat. El NaHS va inhibir les contraccions d'alta amplitud, mentre que va incrementar les contraccions de baixa amplitud. El NaHS va inhibir els potencials d'unió excitador i va hiperpolaritzar el múscul. Tanmateix, l’H2S no va alterar el marcapassos colònic situat a nivell del plexe submucós. El NaHS via luminal no va modificar la motilitat del còlon. La neurotransmissió purinèrgica al còlon humà i de rata es produeix a través del receptor P2Y1. L’ATP i el NO són alliberats per les neurones inhibitòries del plexe mientèric i tenen funcions complementàries en el còlon. D'una banda, l’ATP exerceix una acció fàsica sobre el potencial de membrana i l’activitat mecànica, mentre que el NO té una acció tònica. Ambdues respostes nitrèrgica i purinèrgica son en part sensibles a apamina, suggerint que els canals SKCa poden esta involucrats en les dues vies. El NO exerceix el seu efecte sobre el potencial de membrana a través de l’activació de la via de GC però no activa els canals TREK1. El H2S és produït i alliberat endògenament en el còlon de rata i pot actuar com una molècula de senyalització amb acció moduladora sobre la motilitat colònica. El seu mecanisme d’acció implica una inhibició de la neurotransmissió colinèrgica i hiperpolarització muscular. / Inhibitory neuromuscular transmission is involved in the control of colonic motility. Inhibitory neurotransmitters cause membrane hyperpolarization of smooth muscle, that is, an inhibitory junction potential (IJP) which is the electrophysiological basis of muscle relaxation. Thus, adenosine triphosphate (ATP), nitric oxide (NO) and hydrogen sulphide (H2S) are signalling molecules which can exert this control. The aim of this thesis was to evaluate the role of ATP, NO and H2S in inhibitory neuromuscular transmission in the rat and human colon. Sodium hydrosulphide (NaHS) was used as the source of H2S. Specific P2Y1 receptor antagonists completely inhibited the purinergic component of the IJP in the human and rat colon (potency range: MRS2500> MRS2279> MRS2179). β-NAD produced smooth muscle hyperpolarization and relaxation in the human colon. However, the relaxation was not blocked by P2Y1 antagonists. In the rat colon, it was observed that the release of inhibitory neurotransmitters produced both spontaneous IJP and a sustained muscle hyperpolarization. MRS2500 revealed that P2Y1 receptors were responsible for spontaneous IJP. Nω-nitro-L-arginine (L-NNA) allowed us to establish that the tonic state of muscle hyperpolarization was nitrergic in origin. Apamin, spadin and ODQ were used to assess the involvement of small-conductance calcium-activated potassium channels (SKCa), TWIK-related potassium channels 1 (TREK1) and the guanylate cyclase (GC) pathway on purinergic and nitrergic neuromuscular transmission. Apamin blocked both components with a different relative sensitivity. ODQ only blocked nitrergic neuromuscular transmission. Furthermore, even though the presence of TREK1 channels was revealed in rat colon, none of the components was blocked by spadin, an effective TREK1 channel inhibitor. The expression of H2S-producing enzymes was determined by immunohistochemistry in the epithelium, muscle and nerve cells in the rat colon. In addition, it was demonstrated that the rat tissue was able to enzymatically produce H2S. Although in some cases the effects of H2S-producing enzymes inhibitors were not specific, they caused muscle depolarization and an increase in colonic mechanical activity. In segments of rat colon, NaHS caused a dual effect on motility patterns when administered via serosa. NaHS inhibited propulsive contractions whereas it caused an increase in the amplitude of ripples. NaHS inhibited cholinergic excitatory junction potentials and hyperpolarized smooth muscle cells. However, NaHS did not modify the colonic pacemaker located at the level of the submucosal plexus. Luminal addition of NaHS did not modify motility patterns. Purinergic neurotransmission in the rat and human colon is mediated by P2Y1 receptors. ATP and NO are released by myenteric plexus inhibitory neurons and have complementary functions in the colon. I.e. ATP produces a phasic action on membrane potential and mechanical activity and NO has a tonic effect. Both purinergic and nitrergic responses are in part apamin sensitive suggesting a possible involvement of SKCa in both pathways. NO effects on membrane potential are produced by GC activation but TREK1 channels are not involved. In the rat colon, H2S is produced and released endogenously and it might be a signalling molecule modulating action on colonic motility. H2S mechanism of action involves inhibition of neurally mediated cholinergic responses and muscle hyperpolarization.

Tesi realitzada al Laboratori de Recerca Translacional de l’Institut Català d’Oncologia – IDIBELL. / La hiperactividad del EGFR (epidermal growth factor receptor) confiere mal pronóstico. El EGFR se encuentra sobreexpresado en distintos tipos de tumores, entre ellos el cáncer de colon, pulmón, páncreas y cabeza y cuello (HNSCC). Además la cooperación con otros miembros de la familia del EGFR podría ampliar esta lista a otras neoplasias. La inhibición del EGFR es una de las vías de investigación más activa contra el cáncer. La radioterapia consigue, en un elevado porcentaje de casos, una buena respuesta. Sin embargo, la existencia de células resistentes a la radiación reduce el control tumoral. Una de las causas de la radioresistencia es la hiperactividad del EGFR. En cáncer de cabeza y cuello, el bloqueo del EGFR con el anticuerpo monoclonal anti- EGFR cetuximab aumenta el control local y la supervivencia en pacientes tratados simultáneamente con radioterapia. Sin embargo, no todos los pacientes tratados con cetuximab y radiación se benefician del tratamiento, lo que sugiere que, independientemente de la expresión del EGFR, existen mecanismos de resistencia a la combinación. La ramificación de las vías de señalización que dependen del EGFR sugiere que la topografía de la resistencia puede ser variada y múltiple. Cuanto más arriba de la vía de transmisión de señales se sitúe el by-pass, mayor debería ser la resistencia debido a que un mayor número de funciones citoprotectoras se verían liberadas. Se han descrito distintas posibilidades de by-pass al bloqueo del EGFR. Una de las oncoproteínas que podría ejercer un by-pass proximal es SRC, cuya actividad se relaciona con la progresión tumoral tanto en fases avanzadas como en lesiones premalignas. Además, SRC y EGFR comparten vías de señalización que promueven la progresión de la célula tumoral. En conjunto estos hechos sugieren que la inhibición de SRC podría aumentar la potencia antitumoral de la combinación de radioterapia y cetuximab. En este proyecto se han evaluado los efectos del tratamiento concomitante con radioterapia, cetuximab y dasatinib, y mejorado los conocimientos de los mecanismos biológicos involucrados. También se ha determinado si el uso de inhibidores de SRC podía potenciar el efecto antitumoral de la combinación de radioterapia y cetuximab en tumores dependientes del EGFR. La adición de DST al cetuximab o al cetuximab y radioterapia tuvo un efecto contrario al esperado: produjo un mayor crecimiento de los tumores, un incremento de la angiogénesis y de la síntesis de ADN, un aumento de la fosforilación de las oncoproteínas RAS, ERK1/2, AKT y STAT3; una elevación de la secreción de VEGF, y una hiperactividad del metabolismo glucolítico. El tratamiento combinado con dasatinib e inhibidores de las quinasas JAK, HER2 y MET no inhibió el exceso de fosforilación de ERK inducido por dasatinib, una respuesta reactiva similar a la descrita con C225 y que sugiere la implicación de mecanismos de acción, comunes e independientes de JAK, HER2 y MET. Por el contrario el bloqueo de EGFR por el inhibidor tirosina quinasa AG1478 dio lugar a una inhibición completa de la fosforilación de ERK y AKT a pesar de la presencia de DST, indicando que la quinasa del EGFR está implicada en el efecto antagónico inducido por dasatinib. Por último, este trabajo contribuye a la idea que la combinación de terapias moleculares puede dar lugar a antagonismos, que pueden ponerse de manifiesto durante una investigación preclínica antes de ser evaluados en ensayos clínicos. / Aberrant epidermal growth factor receptor (EGFR) signalling drives oncogenesis in many carcinomas, including head and neck squamous cell cancer (HNSCC). Irrespective of the mechanism of activation, EGFR overexpression is a major origin of resistance to cancer cell death—and a relevant cause of local failures after radiotherapy. The blockage of EGFR by the monoclonal antibody cetuximab in combination with radiotherapy has been shown to improve survival and local control in head and neck cancers. However, major responses are limited in part due to the robustness of signalling networking, which grants alternative routes to avoid blockage of EGFR. SRC-family kinases occupy a central position within the cell signal networking, which makes SRC a potential target in cancer treatment. In this project we evaluated the effects of the concomitant treatment with radiotherapy, cetuximab and dasatinib, and improved the knowledge of the biological mechanisms involved; to determine whether SRC inhibitors could potentiate the antitumor effects of radiotherapy and cetuximab combination in EGFR-dependent tumours. Unexpectedly, the addition of dasatinib to cetuximab or cetuximab and radiotherapy resulted in an antagonistic effect which was characterized by increased tumour growth; an increase in the angiogenesis and DNA synthesis; association with the inhibition of SRC; an increase in cell signalling involving phosphorylation of RAS, ERK1/2, AKT and STAT3 oncoproteins; elevation of VEGF secretion and hyperactivity of glycolytic metabolism. Also, the simultaneous blockade of SRC and JAK kinases, HER2 or MET, induced a similar reaction to that described with cetuximab suggesting the involvement of mechanisms of action, common and independent, of JAK, HER2 and MET. Conversely, blocking EGFR with the tyrosine kinase inhibitor AG1478 resulted in a complete inhibition of ERK and AKT phosphorylation, despite the presence of dasatinib, indicating that the EGFR kinase is involved in the induced antagonistic effect of dasatinib. Finally, this project contributes to the idea that the combination of molecular therapies can result in antagonism, which may become perceptible during a preclinical research before being evaluated in clinical trials.

Las variables clínicas en pacientes sometidos a cirugía cardíaca(CCA) se asocian con el pronóstico a corto y largo plazo en términos de mortalidad y morbilidad. Se han estudiado variables postoperatorias, aunque también variables pre- e intraoperatorias habituales, realizándose 5 líneas de investigación: paciente cirrótico, Acute Kidney Injury(AKI), cociente Presión parcial de oxígeno arterial/ Fracción inspirada de oxígeno (PaO2/FIO2), niveles de lactato arterial(LA), y el Índice de Masa Corporal(IMC). En el paciente cirrótico sometido a CCA la presión venosa central inicial es un factor independiente asociado a mortalidad hospitalaria, mientras que un SAPS III elevado y el volumen de orina menor en las primeras 24h fueron predictores de mortalidad a largo plazo. El MELD score(sensibilidad(S):85.7%;especificidad(E):83.7%) y el SAPS III(S:83.3%;E:64.9%)tienen el mejor poder predictivo a corto y a largo plazo respectivamente en esta población. La supervivencia global en toda la muestra(n=59) fue peor según el grado de hepatopatía (82.4% para Child A, 47.6% para Child B y 33.3% para Child C;P=0.001). Las características asociados a la fisiopatología del paciente cirrótico deben tenerse en especial consideración a la hora de someter estos pacientes a CCA. El desarrollo de AKI en el período postoperatorio tuvo una incidencia del 14%. Identificamos un mayor tiempo de circulación extracorpórea(CEC), una mayor necesidad de drogas vasoactivas y un mayor LA a las 24h tras ingresar en UCI como predictores de AKI. Una peor supervivencia se asoció a un mayor grado de AKI según la escala RIFLE modificada:74.9% para el subgrupo Risk,42.9% para el Injury, y 22.3% para el Failure(P<0.001) (seguimiento medio de 6.9±4.3años), siendo estos dos últimos asociados de manera independiente a una mayor mortalidad. El desarrollo de estrategias para la prevención de los factores de riesgo es básico para mejorar no tan sólo la incidencia de AKI, sino los resultados de la CCA en general. El cociente PaO2/FIO2 puede ser útil para la identificación de pacientes de CCA con mal pronóstico en el postoperatorio inmediato. Valores más bajos a las 3h tras el ingreso en UCI son los más útiles en términos de predicción de mortalidad. Asimismo hay una mayor mortalidad intra-UCI y complicaciones respiratorias con PaO2/FIO2<241 a las 3h. También se asoció a una peor supervivencia intrahospitalaria en comparación con PaO2/FIO2>241 a las 3h (88.8%vs.95.8%;P=0.002.Adjusted Hazard ratio(AHR):1.48;95% IC:1.293–1.786;P=0.004). El LA elevado(>3.0mmol•L-1)es frecuente en el postoperatorio de CCA y su elevación se asocia a mal pronóstico. La presencia de un LA>3.0mmol•L-1 fue un predictor para mortalidad hospitalaria(OR:1.468; 95% IC:1.239–1.739;P<0.001) y para la mortalidad a largo plazo(HR:1.511;95% IC:1.251–1.825;P<0.001). El antecedente de un infarto de miocardio(IAM) reciente y sufrir un mayor tiempo de CEC fueron predictores de un LA. El patrón dinámico del LA fue similar en supervivientes y no supervivientes pero con mayores valores en no supervivientes(ANOVA de medidas repetidas, P<0.001). Asimismo, el área bajo la curva objetivó mayores niveles de LA en los no supervivientes(80.9±68.2vs.49.71±25.8mmol•L-1•h-1;P=0.038). Nuestros resultados objetivan una dinámica parecida de la curva de LA entre supervivientes y no supervivientes con mayores valores en estos últimos, lo cual podría sugerir un mecanismo similar del LA pero con una mayor producción en los no supervivientes. Aquellos pacientes que presentaron un LA>3.0mmol•L-1 y su pico se objetivó a las 24h tuvieron peor supervivencia(79.1%vs.86.7–89.2%;P=0.03)comparados con aquellos que presentaron su pico al ingreso, a las 6h o a las 12h durante el postoperatorio. La obesidad influencia de manera notable la estratificación y planificación de la CCA. Algunos estudios han objetivado mejores resultados en la población obesa en comparación con la población con IMC normal respecto a la mortalidad y supervivencia. Tras ajustar las variables preoperatorias e intraoperatorias mediante propensity score, una peor oxigenación y mejor estado nutricional, reflejados por una peor PaO2/FiO2 y unos niveles más elevados de albúmina, fue observado en pacientes con IMC elevado. Los pacientes obesos mostraron mayor riesgo para IAM peroperatorio(OR:1.768;95% CI:1.035-3.022;P=0.037)y sepsis(OR:1.489;95% CI:1.282-1.997;P=0.005). No hubo diferencias en la mortalidad hospitalaria entre grupos, aunque los pacientes con sobrepeso mostraron una mejor supervivencia al año comparados con la población normal(91.2%vs.87.6%;P=0.029). A pesar de ello, nuestros resultados no apoyan el concepto obesity paradox, que puede ser el resultado de sesgos en los diferentes estudios publicados. La mejoría del estudio pronóstico de variables en el postoperatorio inmediato las convierte en herramientas a pie de cama que ayudan al clínico en la toma de decisiones e influyen en la supervivencia de sus pacientes. Sin lugar a dudas, una mejor precisión pronóstica conlleva una mejoría en establecer el grado de vigilancia y cuidados que requiere cada paciente, y en consecuencia, los recursos destinados. La mayor precisión en el pronóstico a largo plazo tiene obvias e importantes ventajas, tanto desde el punto de vista clínico del paciente a nivel individual como desde el punto de vista sanitario y social. / The clinical variables in patients undergoing cardiac surgery(CS) are associated with prognosis in the short and long-term scenario in terms of mortality and morbidity. Five main areas of research are discussed: cirrhosis, Acute Kidney Injury(AKI), ratio of arterial partial pressure/oxygen fraction of inspired oxygen(PaO2/FIO2), arterial blood lactate levels(LA) and Body Mass Index(BMI). In the cirrhotic patient undergoing CS central venous pressure was an independent factor associated with hospital mortality, whereas a high SAPS III and lower urine volume during the first 24h were predictors of long-term mortality. The MELD score (sensitivity(S):85.7%;specificity(E):83.7%)and SAPS III(S:83.3%;E: 64.9%)showed the best predictive power in the short and long term scenarios, respectively. Overall survival(n=59)was worse with the degree of liver disease(82.4% for Child A, 47.6% for Child B and 33.3% for Child C;P=0.001). The pathophysiology associated with cirrhosis should be taken into account when referring these patients to CS. The development of AKI in the postoperative period was 14%. We identify a longer cardiopulmonary bypass time(CPB), a greater need for vasoactive drugs and greater LA at 24h after ICU admission as predictors of AKI. Worse survival was associated with a greater degree of AKI according to the modified RIFLE scale: 74.9% for the Risk group, 42.9% for the Injury group, and 22.3% for the Failure group(P<0.001)(mean follow up 6.9±4.3years). The latter two were independently associated with increased mortality. Developing strategies for the prevention of AKI is essential to improve their incidence and also the survival after CS. The PaO2/FIO2 can be useful for identifying patients with poor prognosis in the immediate postoperative period. Lower values at 3h after admission to ICU are most useful in terms of prediction of mortality. There was also a greater intra-ICU mortality and respiratory complications with PaO2/FIO2<241 at this time. It was also associated with worse in-hospital survival compared with PaO2/FIO2>241(88.8%vs.95.8%;P=0.002.Adjusted Hazard ratio(AHR):1.48;95% CI:1293-1786;P=0.004). A higher LA(>3.0mmol•L-1)is associated with poor prognosis after CS. The presence of an LA>3.0mmol•L-1 was a predictor of hospital mortality(OR:1.468;95% CI:1.239-1.739;P<0.001)and for long-term mortality(HR:1.511;95% CI:1251-1825;P<0.001). A history of recent myocardial infarction(AMI)and a longer CPB time were predictors of higher LA. The dynamic pattern of LA was similar in survivors and non-survivors but with higher values in non-survivors(repeated measures ANOVA,P<0.001). Also, the area under the curve was higher in non-survivors(80.9±68.2vs.49.71±25.8mmol•L-1•h-1;P=0.038). This might suggest a similar pathophysiology for LA but higher production in non-survivors. Those patients who had LA>3.0mmol•L-1 and its peak was at 24h after ICU admission had worse survival(79.1%vs.86.7-89.2%;P=0.03)compared with those who had their peak on admission, at 6 or 12 h postoperatively. Obesity influences significantly stratification risk of CS. However, some studies have showed better survival in the obese population compared to normal BMI population. After adjusting for confounding factors using propensity score, a worse oxygenation and better nutritional status, reflected by a lower PaO2/FiO2 and higher albumin levels, was showed in patients with higher BMI. Obese patients showed increased risk for perioperative AMI(OR:1.768;95% CI:1035-3022;P=0.037)and sepsis (OR:1.489;95% CI:1282-1997;P=0.005). There was no difference in hospital mortality between groups, although overweight patients showed better survival at one year compared to the normal population (91.2%vs.87.6%;P=0.029). However, our results do not support the obesity paradox, which may be the result of bias in different published studies. The improvement of the knowledge of clinical variables in the immediate postoperative period becomes a tool to help physicians in making decisions and influencing the survival of the patients who undergo CS. Undoubtedly, better prognostic accuracy implies an improvement in establishing the degree of resources by each patient. Indeed more accurate long-term prognosis has obvious and important advantages, both from the clinical and social point of view.

La microscopia de fuerza atómica (AFM) permite estudiar las superficies de materiales biológicos a escala nanométrica y obtener imágenes de elevada resolución de la topografía de la muestra. En este trabajo, la utilización de esta poderosa técnica ha permitido observar, caracterizar y explorar tanto la superficie celular como la estructura del biofilm que forman distintas cepas de Candida albicans, las cuales presentan mutaciones por deleción en genes que codifican por proteínas con un dominio denominado CFEM (Common in several Fungal Extracelular Membrane), que podrían estar implicadas en la formación, desarrollo y/o mantenimiento de la estructura del biofilm en C. albicans. De este modo, se han podido realizar diversos estudios en los que se ha evaluado la rugosidad de las superficies celulares y de los biofilms, parámetro que nos ayuda a caracterizar una superficie; se ha observado la formación, estructura y complejidad de los diferentes biofilms obtenidos; explorado la influencia de diferentes tipos de sustrato en la formación de biofilms y se han analizado las fuerzas de adhesión de las distintas cepas de C. albicans estudiadas ante diversos sustratos, recubiertos con una película formada por componentes de la saliva, mediante la técnica de AFM de espectroscopia de fuerza. Por otro lado, con el fin de estudiar la eficacia de distintos tipos de luz láser de gran aplicación en el tratamiento endodóntico y evaluar el efecto de la terapia fotodinámica en la eliminación de microorganismos, la microscopia de fuerza atómica ha sido de gran utilidad para analizar las lesiones producidas sobre la superficie celular de Enterococcus faecalis tratados con luz láser y terapia fotodinámica, tanto en suspensiones celulares como formando biofilms, mediante la visualización de cambios en la morfología celular y análisis de la rugosidad de superficie. Los estudios realizados aplicando la técnica de AFM han revelado como la falta de expresión de proteínas CFEM por C. albicans puede afectar a la estructura y organización del biofilm, y se ha podido evaluar la influencia positiva de distintos tipos de superficies sobre la adhesión celular. Además, los resultados obtenidos han demostrado un enfoque práctico de la técnica de AFM para examinar alteraciones sustanciales en la superficie celular de E. faecalis, tanto en suspensiones celulares como en biofilms formados por este microorganismo, inducidas después de los tratamientos con luz láser y terapia fotodinámica. El estudio llevado a cabo indica que estos tratamientos podrían ser eficaces en la eliminación de biofilms, erradicación de células persistentes y descontaminación de superficies orales. / The atomic force microscopy (AFM) allows to study several properties of biological surfaces at the nanoscale and also to obtain high resolution images of the sample’s topography. In this work, the use of this powerful technique has allowed us to observe, characterize and explore both the cell surface and biofilm structure forming of different strains of Candida albicans, in which deletion mutations occur in genes encoding proteins with a domain named CFEM (Common in several Fungal Extracellular Membrane). Thus, it was possible to perform various studies that have evaluated the surface roughness parameter, which helped us to characterize cellular and biofilm surfaces; have observed the formation, structure and complexity of the different biofilms obtained; explored the influence of different types of substrate in the formation of biofilms and analyzed the adhesion forces of different strains of C. albicans to various substrates studied by the technique of AFM Force Spectroscopy. Furthermore, in order to study the effectiveness of various types of laser lights of wide application in endodontic treatment and to evaluate the effect of photodynamic therapy in the eradication of microorganisms, atomic force microscopy has been useful for analyzing lesions produced on the cell surface of Enterococcus faecalis treated by laser lights and photodynamic therapy, both cell suspensions as biofilms, by visualizing changes in cell morphology and analysis of surface roughness. Studies using AFM revealed that the lack of CFEM protein expression by C albicans can affect the structure and organization of the biofilm, and we assessed the positive influence of different types of surfaces on cell adhesion. Moreover, the results obtained have shown a practical approach of AFM to examine substantial alterations in cell surface of E. faecalis, both cell suspensions and biofilms formed by this microorganism, induced after treatment with laser light and photodynamic therapy. The study carried out indicated that these treatments could be effective in removing biofilms, persistent cells eradication and decontamination of oral surfaces.