El burro catalán es una raza en peligro de extinción. Las biotecnologías reproductivas son una herramienta estratégica para la conservación de recursos genéticos de especies amenazadas, pero el éxito de su aplicación ha sido limitado por la falta de estudios básicos sobre los aspectos reproductivos y la ausencia de protocolos estandarizados para estas especies. La fertilidad del semen congelado tras la inseminacion artificial en burros es muy escasa, aún cuando las características de calidad del semen a la descongelación han demostrado ser adecuadas. Esta tesis doctoral tuvo como objetivo evaluar la respuesta inflamatoria del endometrio de la burra tras la IA con semen congelado/descongelado. En el primer trabajo se determinaron las características del endometrio de la burra en celo, post-IA con semen congelado/descongelado y se evaluó el efecto del ketoprofen como tratamiento anti-inflamatorio durante el protocolo de inseminación. Se encontraron diferencias histológicas del endometrio de la burra con respecto a la yegua, como la presencia de eosinófilos en todos los grupos experimentales sin relación con otros cambios inflamatorios o degenerativos; concluyendo que estas células parecen ser una característica normal del endometrio de la burra sana. El ketoprofen presentó una eliminación rápida y escasa distribución aparente. Su mecanismo de acción sobre endometrio inflamado de la burra fue la inhibición de la expresión de ciclooxigenasa-2 (COX-2) principalmente en el estrato compacto, sin influir sobre la cantidad de neutrófilos polimorfonucleares (PMN) producidos tras la IA. En el segundo estudio se evaluó el efecto in Vitro del plasma seminal (PS) sobre los espermatozoides y los PMN endometriales. Se incubaron secreciones uterinas obtenidas a las 6 h de IA con semen congelado; con muestras de semen fresco, fresco diluido y congelado durante 4 h. La presencia de PS en el semen fresco y diluido moduló la respuesta inflamatoria, observando una menor cantidad de complejos PMN-espermatozoides, con liberación de algunos espermatozoides atrapados y además se mantuvieron por un mayor tiempo las características iniciales de motilidad del semen comparado con el semen congelado. Finalmente, se determinó el efecto in Vivo del PS sobre el endometrio de la burra post-IA con semen congelado/descongelado. La administración intrauterina de PS autólogo inmediatamente después de la IA, inhibió significativamente la expresión de COX-2 tanto en la capa luminal como en el estrato compacto hasta el punto en que no se encontraron diferencias con las muestras del endometrio no inflamado en estro (control). El PS no influyó sobre el número de PMN producidos por la inseminación artificial pero la expresión de COX-2 se correlacionó con el número de PMN de citologías y biopsias, por tanto, la quimiotáxis de PMN pudo haber sido reducida por esta vía. En conclusión, la burra sana parece ser más susceptible que la yegua a desarrollar endometritis tras la inseminación con semen congelado, posiblemente debido a las diferencias tanto histológicas como anatómicas de su tracto reproductivo. También existen diferencias en la disposición farmacológica del ketoprofen en el burro. Estos aspectos, así como el papel modulador tanto in Vitro como in Vivo del PS observado en las interacciones PMN-espermatozoides en el burro catalán, deben seguir siendo investigados para la optimización del protocolo de IA con semen congelado en burros, con el fin de mejorar los resultados de fertilidad de esta tecnología reproductiva. / The Catalan donkey is an endangered breed. Reproductive technologies constitute a strategic tool for the conservation and maintenance of the genetic resources of endangered populations but their successful application has been limited by scarcity of basic studies in reproduction and absence of standardized protocols. Fertility rates achieved by artificial insemination (AI) with frozen semen in donkeys are disappointingly low, despite the apparently adequate quality of the thawed semen. Nevertheless, fertility is not only dependent on the male, but also on the female reproductive physiology. Hence, the aim of this doctoral thesis was to evaluate the endometrial inflammatory response after insemination with frozen/thawed semen in the Jenny, with a view to help enhance fertility rates with frozen semen in donkeys. In the first study, the endometrial characteristics of the Jenny were evaluated in estrous (control), both after-AI with frozen/thawed semen and after-AI with ketoprofen administered as anti-inflammatory treatment. In contrast to mare, the presence of eosinophils in all experimental groups without any relation to other inflammatory or degenerative changes indicated that they could be a normal feature of a healthy Jenny endometrium. On the other hand, ketoprofen was rapidly eliminated of blood and had a poor apparent tissular distribution. Its mechanism of action in the inflamed endometrium was cyclooxigenase-2 (COX-2) inhibition, which was observed mainly in the stratum compactum, and had no effect on the number of polimorphonuclear neutrophils (PMN) produced after-AI. In the second study, the in Vitro effect of seminal plasma (SP) over sperm and endometrial PMN was determined. Uterine secretions obtained 6 h after-AI were incubated with samples of fresh pure, fresh diluted and frozen/thawed donkey semen during 4 h. Frozen semen showed a major lost of progressive motility and more number of PMN-sperm aggregates than fresh pure and fresh diluted semen where SP was present. Thus, a modulating effect of SP on endometrial inflammation over PMN and sperm was observed in Vitro. Finally, the in Vivo effect of SP in the Jenny endometrium after-AI with frozen/thawed semen was determined. Intrauterine administration of pre-warmed autologous SP immediately after-AI, inhibited COX-2 expression both in the luminal epithelium and stratum compactum at 6 h of insemination, to the point that there were no differences with the non-inflamed endometrium in estrous (control). The number of PMN produced 6 h after-AI was not affected by SP but COX-2 expression was correlated with PMN observed both in cytology and biopsies, so, PMN chemotaxis might actually have been reduced by this via. In conclusion, it seems that healthy Jenny is more susceptible than healthy mare to develop endometritis by AI with frozen semen, ostensibly, due to histological, physiological and anatomical differences in the reproductive tract. There are also pharmacologic differences on drug disposition (ketoprofen) in donkeys. These aspects, as well as the in Vitro and in Vivo modulator effects of SP over the PMN-sperm interactions observed in the Catalan donkey, should be further studied to optimize the insemination protocol with frozen semen in donkeys and improve the fertility rates of this reproductive technology.

La Tesis que presentamos a continuación se enmarca dentro de las líneas de investigación clásicas llevadas a cabo en el Laboratorio de Fisiología Vegetal de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Barcelona. Estas líneas abarcan temas de índole vegetal que contemplan tanto una investigación química de nuevos productos naturales de interés farmacéutico aislados de plantas, como la producción de éstos por métodos del cultivo “in vitro” o la Biotecnología Vegetal. Los objetivos buscados en esta Tesis fueron el aislamiento y elucidación estructural de alcaloides en plantas del género “Narcissus”, perteneciente a la familia vegetal de las Amarilidáceas, con un apéndice de tipo farmacológico, esto es, la evaluación farmacológica de las actividades antitumorales de estos productos y concluyendo con una tercera parte más aplicada en la cual se buscó un método para la producción de estas sustancias por medio de las técnicas del cultivo “in vitro” vegetal.

L’impuls inicial d’aquest treball és una pregunta que es pot formular amb paraules ben planeres: De quina manera allò que sabem influeix en allò que fem?. Tot el que escriurem en les pàgines següents està destinat a treballar una aproximació que permeti superar els límits, aparentment infranquejables, als que ha arribat la nostra comprensió d’aquesta pregunta. En aquest sentit, la psicologia ha fet avenços molt importants, i inicialment encoratjadors, però ha arribat a un carreró sense sortida des del que sembla que la pregunta és insoluble. Amb aquest treball volem traçar una via d’aproximació alternativa a aquesta qüestió, partint d’un canvi epistemològic que, des del nostre punt de vista, permet reformular el problema amb una llum nova, mostrant camins poc explorats i prometedors. Aquest treball, doncs, està dedicat a plantejar i desenvolupar aquesta alternativa. Evidentment, una empresa d’aquestes característiques es pot plantejar només com un inici. En les pàgines que seguiran proposarem algunes elaboracions teòriques I metodològiques, i especificarem algunes hipòtesis empíricament fonamentades, però la nostra pretensió no és, òbviament, resoldre el problema; és només plantejar una via que tingui possibilitats de resoldre’l, mostrar la potencialitat d’aquesta via per superar els límits actuals de la nostra comprensió de la qüestió, i aportar algunes contribucions teòriques, metodològiques i empíriques en aquesta direcció. Això és tot el que intentarem aconseguir en aquest treball. El pla del text és el següent. En els quatre primers capítols proposarem, des d’un punt de vista teòric, la nostra aproximació a la pregunta. En els capítols 1 i 2 partirem de les aproximacions de la psicologia central occidental per moure’ns cap a una aproximació alternativa que articularem des de la tradició psicològica hegeliana. Aquesta articulació ens obligarà a proposar certs desenvolupaments teòrics; els més importants els proposarem en els capítols 3 i 4. En el capítol 3 introduirem el constructe de situació, I en el capítol 4 esbossarem el constructe de concepte pràctic. Posant el focus sobre aquest últim constructe, el concepte pràctic, proposarem en el capítol 5 un estudi empíric que ens permeti observar-lo i estudiar-lo. Els quatre següents capítols estaran destinats a explicar els resultats d’aquest estudi empíric. En el capítol 6 examinarem la naturalesa psicològica dels conceptes pràctics, en el capítol 7 n’examinarem la seva gènesi, en el capítol 8 examinarem la seva relació amb altres tipus de concepte, i en el capítol 9 examinarem la naturalesa de l’activitat conjunta que en permet el desenvolupament. En el capítol 10 resumirem la nostra aproximació i els resultats de l’estudi empíric –a la llum de les limitacions d’aquest estudi- i assenyalarem algunes línies possibles de recerca que, esperem, mostraran la fecunditat i la potencialitat d’una via d’aproximació que, ja sense més preàmbuls, ens disposem a plantejar. / The initial impulse of this work is an apparently simple question: How what we know influences what we do?. All what is written in the following pages is oriented to work on an approach which allows overcoming the limits of our understanding of this question. Psychology has reached important achievements to this aim, but it has arrived to a cul-de-sac from which the question seems to be unsolvable. With this work we aim to draw an alternative approach to this issue, starting off from an epistemological change which, to our mind, permits to reframe the problem with a new light. This work, therefore, is aimed to propose and develop this alternative approach. Obviously, this kind of purpose can be tried only as a beginning. In the following pages we will propose theoretical and methodological elaborations, and we will specify some empirically based hypothesis, but our aim is not, obviously, to solve the problem: it is only to propose an approach with possibilities of solving it, to show the potentiality of this approach for overcoming the current limits of our understanding, and to offer some theoretical, methodological and empirical contributions in this direction. This is all what we try to manage in this work. In the first four chapters, we will propose our approach to the question. In chapters 1 and 2 we will depart from the approaches of the western psychology in order to move on toward an alternative approach which we will articulate from the Hegelian psychological tradition. This articulation will force us to propose some theoretical developments; the most important ones will be proposed in chapters 3 and 4. In chapter 3 we will introduce the construct of situation and in chapter 4 we will draw the construct of practical concept. Focusing on this last construct, the practical concept, we will propose in chapter 5 an empirical study in order to observe it. The following four chapters will be aimed to explain the results of this empirical study. In chapter 6 we will examine the psychological nature of practical concepts, in chapter 7 we will examine its genesis, in chapter 8 we will examine its relation with other types of concept, and in chapter 9 we will examine how joint activity allows its development. In chapter 10 we will resume our approach and the results of the empirical study –by considering also the limitations of this study-, and we will point out some possible research lines which, we hope, will show the potentiality of the approach presented here.

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Es tracten per alta pressió isostàtica carn recuperada mecànicament d'aviram i salsitxes que contenen aquesta carn, per millorar-ne la qualitat microbiològica i, així, poder-ne augmentar la seguretat i allargar la vida útil en refrigeració.S'apliquen diverses combinacions de pressió (de 300 a 500 MPa), temps (de 5 a 45 min, de manera continua i cíclica) i temperatura (de 2 a 80 ºC), procurant que les condicions de tractament produeixin uns canvis fisicoquímics i sensorials adequats. En alguns experiments, també s'aplica un tractament convencional per calor per poder establir comparacions.La combinació de pressió a 2 ºC amb nisina té un efecte bactericida sinèrgic en la carn recuperada mecànicament d'aviram, sobretot si aquesta s'acidifica lleugerament amb glucono-delta-lactona: es redueixen de manera considerable els recomptes de mesòfils i psicròtrofs i es prolonga la vida útil en refrigeració d'aquesta carn envasada al buit.El tractament per alta pressió és molt efectiu per inactivar recomptes alts de Listeria inoculada en carn recuperada mecànicament d'aviram i mantenir baixos els de cèl·lules supervivents durant l'emmagatzematge al buit en refrigeració.No s'observa un efecte baroprotector del greix sobre la microbiota de la carn recuperada mecànicament d'aviram. La inactivació bacteriana per pressió sembla que es veu més influïda per l'estructura alimentària globalment que no pas pel contingut en alguns components de l'aliment en particular.L'alta pressió aplicada a temperatures de 50 a 75 ºC permet obtenir salsitxes cuites de carn recuperada mecànicament d'aviram amb millor textura i aspecte que els de les cuites de manera convencional. La incorporació de certa quantitat de carn picada de porc també millora aquestes propietats.En salsitxes cuites envasades al buit, el dany subletal provocat per pressió a 65 ºC sobre les cèl·lules bacterianes dura menys que el causat per calor. Així, si en el cas de les salsitxes tractades per alta pressió es trenca la cadena del fred, la càrrega microbiana pot augmentar considerablement.L'efecte bactericida assolit en aquestes salsitxes amb els tractaments per pressió i per calor és similar: s'inactiven importants poblacions de bacteris patògens i causants de deteriorament (mesòfils, psicròtrofs, acidolàctics, enterobacteris, microbiota Baird-Parker i Listeria), la qual cosa dóna lloc a un producte segur i de llarga conservació en refrigeració.Les aplicacions més profitoses de l'alta pressió a les indústries càrnia i avícola són a temperatura moderada: d'una banda, l'elaboració de productes cuits i, de l'altra, el tractament de productes prèviament cuits que han estat manipulats (i, per tant, recontaminats) abans del seu envasament al buit. D'aquesta manera, s'obté un aliment que en refrigeració presenta una qualitat microbiològica òptima.

El potencial de desarrollo de los embriones producidos in vitro es afectado negativamente por un lado, a defectos en las cualidades intrínsecas de los ovocitos y por el otro, a las condiciones del medio de maduración in vitro. Así, el éxito de la maduración in vitro depende de la integridad de los factores intrínsecos en la maduración y la vitalidad nuclear y citoplasmática de los ovocitos, también a la adecuada combinación de los componentes empleados en el medio de maduración. En este sentido, el objetivo de esta tesis consistió en analizar la influencia de distintos componentes añadidos durante la maduración in vitro sobre la calidad del ovocito y el potencial de desarrollo del embrión, con la finalidad de mejorar el rendimiento en la producción in vitro de embriones de terneras prepúberes. En el primer trabajo, se evaluó los efectos de la adición del complejo Insulina-Transferrina-Selenio y Ácido ascórbico al medio de maduración in vitro de ovocitos de ternera prepúberes, ya que tienen un papel muy importante frente al estrés oxidativo producido en condiciones in vitro. Los resultados demostraron una mejora del potencial de desarrollo de aquellos ovocitos que fueron madurados solamente las primeras 12 horas en presencia de ITS y Ácido Ascórbico y las 12 horas restantes en un medio convencional, donde además se reveló una relación positiva entre el incremento del nivel de expresión de la ciclina B1, la distribución de los gránulos corticales hacia la periferia y la mayor tasa de blastocistos. En el segundo trabajo se analizó si la adición de leptina en distintas concentraciones incrementaba la tasa de blastocistos, porcentaje de apoptosis de las células del cúmulus y el nivel de transcripción de genes involucrados con la apoptosis y la competencia del ovocito. Los resultados indicaron que la adición de la leptina en los medios de maduración in vitro no incrementó el potencial de desarrollo embrionario, ni disminuyó los niveles de apoptosis en las células del cúmulus, existiendo un incremento en los niveles de apoptosis a mayor dosis de leptina. Por otro lado, las distintas concentraciones de leptina durante la maduración in vitro ocasionaron un bloqueo en la transcripción del receptor de la leptina (LEPR). En el tercer trabajo se propuso analizar durante la maduración in vitro la inhibición de una cisteína proteasa lisosomal, utilizando E-64 que es un inhibidor de la Catepsina B. Los resultados demostraron que la inhibición de la Catepsina B no incrementó el potencial de desarrollo embrionario, ni la calidad del embrión, incrementó los niveles de apoptosis en las células del cúmulus y la expresión de la proteína Catepsina B. Finalmente, la diferentes concentraciones de E-64 durante la maduración in vitro no produjo un efecto inhibitorio de la Catepsina B, probablemente relacionados a una degradación por aumento del estrés y el efecto tóxico de las altas concentraciones. En conclusión, nuestros estudios indican que la adición de moléculas como la leptina o E-64 durante la maduración in vitro de ovocitos de ternera prepúberes no mejora su capacidad intrínseca para el desarrollo embrionario. En cambio, los resultados obtenidos indican que es posible incrementar el porcentaje de blastocistos obtenido mediante la adición del complejo Insulina-Transferrina-Selenio y ácido ascórbico al medio durante las 12 primeras horas de maduración. / The development potential of embryos produced in vitro is adversely affected by one hand, defects in the intrinsic qualities of the oocyte and the other to the conditions of in vitro maturation medium. Thus, the success of in vitro maturation depends on the integrity and vitality of the intrinsic factors in the maturation nuclear and cytoplasmic of oocytes, also the right combination of components used in the maturation medium. In this sense, the objective of this thesis was to analyze the influence of different components added during in vitro maturation on oocyte quality and potential of embryo development, in order to improve performance in the in vitro production of embryos prepubertal calves. In the first study, we evaluated the effects of adding Insulin-Transferrin-Selenium and ascorbic acid in vitro maturation medium of oocytes from prepubertal calf, as they have an important role against oxidative stress in vitro. The results showed an improvement of the development potential of those oocytes that were matured only the first 12 hours in the presence of ITS and ascorbic acid and the remaining 12 hours in a conventional medium, where they also found a positive relationship between increased expression level of cyclin B1, the distribution of cortical granules to the periphery and the highest rate of blastocyst. In the second paper examined whether the addition of leptin at different concentrations increased the blastocyst rate, percentage of apoptotic cumulus cells and the level of transcription of genes involved with apoptosis and competence of the oocyte. The results indicated that the addition of leptin in vitro maturation media did not increase the potential of embryonic development, or decreased levels of apoptosis in cumulus cells, there an increase in levels of apoptosis at higher doses of leptin. On the other hand, different concentrations of leptin during maturation in vitro caused a blockage in the transcription of the leptin receptor (LEPR). In the third study was undertaken to analyze during maturation in vitro inhibition of a cysteine protease lysosomal using E-64 is an inhibitor of cathepsin B. The results showed that inhibition of cathepsin B did not increase the potential of embryonic development or embryo quality, increased levels of apoptosis in cumulus cells and the expression of cathepsin B protein. Finally, different concentrations of E-64 during in vitro maturation produced no inhibitory effect on cathepsin B, probably related to degradation by increased stress and the toxic effect of high concentrations. In conclusion, our studies indicate that the addition of molecules such as leptin or E-64 during in vitro maturation of oocytes from prepubertal calf does not improve its intrinsic ability to embryonic development. Instead, the results indicate that it is possible to increase the percentage of blastocysts obtained by adding the complex insulin-transferrin-selenium and ascorbic acid to the medium during the first 12 hours of maturation.

Esta tesis se enmarca en la reflexión sobre nuevas formas de investigación y acción psicosociales en el campo de las expresiones de género y, particularmente, de las identidades de género no-normativas. Su objetivo general consiste en analizar las actuales formas de investigación/acción al interior de la perspectiva psicosocial sobre el género y proponer alternativas. Ello se hace a partir de una experiencia de investigación y acción colectiva en el ámbito de las identidades transgénero. Esta experiencia sirve para interrogar y proponer transformaciones a la aproximación psicosocial instituida con respecto al género. Se utilizan las herramientas metodológicas del análisis del discurso, las producciones narrativas y la investigación-acción participante para analizar la construcción discursiva de la identidad transgénero y sus efectos psicosociales, como la patologización y la exclusión. Se concluye haciendo énfasis en la importancia del discurso y la narrativa como recursos para generar condiciones social más favorables para las identidades de género no-normativas. / This thesis is part of the reflection on new forms of psychosocial research and action in the field of gender variance and particularly on non-normative gender identities. Its overall objective is to analyze the action/research practices within the psychosocial perspective on gender and propose alternatives. This is done through a research and collective action experience in the field of transgender identities. This experience allows examining and proposing changes to dominant psychosocial approaches with respect to gender. Methodological tools of discourse analysis, narrative productions and participatory action research are used to analyze the discursive construction of transgender identity and its psychosocial effects, such as pathologization and exclusion. It concludes by emphasizing the importance of discourse and narrative as social resources to create better social conditions for non-normative gender identities.

Los tensioactivos son compuestos altamente versátiles con amplia utilización en la industria farmacéutica y cosmética. Aquellos derivados de aminoácidos presentan una baja toxicidad y elevada biodegradabilidad y, por lo tanto, tienen un abanico más amplio de aplicaciones y constituyen una alternativa a los tensioactivos sintéticos convencionales. En los últimos años, existe un interés creciente en la utilización de excipientes bioactivos con actividad lítica pHsensible en sistemas nanoestructurados, con el fin de aumentar la especificidad y eficacia de dichos vehículos para la liberación de fármacos en órganos o células dianas. En este trabajo se ha planteado estudiar dos grupos de tensioactivos derivados de lisina: tensioactivos aniónicos de doble cadena derivados de la N(α,)N(ε)-dioctanoil lisina y tensioactivos catiónicos de cadena simple derivados de la N(ε)-acil lisina o N(α)-acil lisina. En primer lugar, se ha procedido con el estudio de las propiedades de interacción de estos tensioactivos con membranas celulares en función del pH del medio, utilizando el eritrocito como modelo de membrana endosomal. Se ha demostrado que los tensioactivos aniónicos tienen actividad lítica pHdependiente independiente del contraión, mientras que las propiedades de los tensioactivos catiónicos dependen especialmente de la posición de la carga catiónica y, en menor medida, de la longitud de cadena alquílica. La actividad pH-sensible se atribuye a la presencia de la carga positiva en el grupo α-amino de la lisina, mientras que el aumento de la fluidez de la membrana y la pérdida de sus proteínas estructurales se han evidenciado como los mecanismos involucrados en el aumento de la lisis celular a pH ácidos. Una vez corroborado el potencial lítico pH-dependiente de los tensioactivos, se ha avanzado en el desarrollo, caracterización y estudio toxicológico de sistemas nanoestructurados conteniendo estos compuestos. En primer lugar, se han desarrollado nanovesículas lipídicas con los tensioactivos catiónicos y se ha procedido con el estudio de sus efectos tóxicos en células representativas de la piel, como propuesta de su potencial aplicación en formulaciones de administración tópica. Se han observado efectos citotóxicos moderados, respuesta inflamatoria leve y ausencia de fototoxicidad. A continuación, se han llevado a cabo estudios de los mecanismos involucrados en la toxicidad de las nanovesículas, además de la evaluación de su capacidad de internalización celular. Se ha propuesto que el estrés oxidativo, la disfunción mitocondrial y la apoptosis son los principales mecanismos involucrados en la toxicidad. Por otra parte, los estudios de internalización celular y estabilidad endosomal han mostrado la capacidad de las nanovesículas que contienen los tensioactivos con carga positiva en el grupo α-amino de la lisina para romper la membrana de los endosomas, lo que corrobora su actividad pH-dependiente. Por último, se han desarrollado nanopartículas poliméricas incluyendo el tensioactivo aniónico 77KL como excipiente pH-sensible. Se ha encapsulado el fármaco antitumoral metotrexato y se ha demostrado su mayor actividad en inhibir la proliferación de las células tumorales en comparación con el fármaco libre no encapsulado. Este hecho se atribuye, especialmente, a la actividad pH-dependiente de las nanopartículas. Tras la internalización y liberación específica del fármaco a nivel intracelular, la inhibición del ciclo celular, la apoptosis y, en menor medida, el daño mitocondrial y lisosomal, se han demostrado como los mecanismos involucrados en la actividad antitumoral del metotrexato encapsulado en las nanopartículas. En conclusión, es importante destacar que el desarrollo de vehículos con actividad pHdependiente es una propuesta interesante para mejorar la liberación intracelular de fármacos y para aumentar sus efectos terapéuticos. Por lo tanto, se considera que los tensioactivos derivados de lisina estudiados en esta Tesis son potenciales excipientes bioactivos en formulaciones nanoestructuradas. Del mismo modo, los métodos in vitro utilizados se mostraron eficaces en demostrar los mecanismos involucrados en los efectos tóxicos de los nanomateriales. / Surfactants are among the most versatile and widely applied excipients in cosmetics and pharmaceuticals. Amino acid-based surfactants, which have this versatility together with biocompatibility, low toxicity and pH-responsive membrane-disruptive activity, could be potential bioactive excipients in intracellular drug delivery systems. In this line, five anionic and three cationic lysine-based surfactants were studied concerning their pH-dependent properties using the erythrocyte as a model of endosomal membrane. All the anionic surfactants showed pH-sensitive activity independently on the counterion, whereas among the cationic amphiphiles, only those with the positive charge on the α-amino group of lysine displayed membrane-lytic activity dependent on the pH. Thereafter, these amphiphiles were applied in the development of pH-sensitive nanocarriers. The cationic surfactants were included in lipid-based nanovesicles, while the anionic compound 77KL was used for the preparation of methotrexate-loaded chitosan nanoparticles. It was assessed whether the cationic compounds increase the likelihood of intracellular delivery and modulate the toxicity of the nanovesicles, as a proposal for their potencial intravenous application. Due to increasing concern over animal use, in vitro alternative methods were used for all studies. The induction of mitochondrial dysfunction, oxidative stress and apoptosis were the general mechanisms underlying cytotoxicity. Fluorescence microscopy analysis demonstrated that nanovesicles were internalized by cells, and evidenced that their ability to release endocytosed materials into cell cytoplasm depends on the structural parameters of amphiphiles. Moreover, the cytotoxicity of nanovesicles was evaluated using representative skin cell lines, and the wide range of in vitro assays proved the applicability of these nanocarriers for topical administration. On the other hand, the pH-sensitive behavior of nanoparticles containing 77KL allowed accelerated release of methotrexate in an acidic medium, as well as membrane-lytic pH-dependent activity, which facilitated the cytosolic delivery of endocytosed materials. Besides, our results clearly proved that the drug encapsulated into the nanoparticles were more active against the tumor cells than the free drug. Altogether, these studies showed that the design of nanocarriers containing pHsensitive surfactants as bioactive excipients for endosome disruption is a promise approach for intracellular drug delivery and increased therapeutic effects. Furthermore, the insights into some toxicity mechanisms of these new nanomaterials contribute to reducing the uncertainty surrounding their potential health hazards.

Els mecanismes fisiopatològics del fum del tabac són poc coneguts. Alguns autors demostren un augment de radicals lliures (RL) i dany oxidatiu en relació al consum de tabac. La font serien molts components del fum del tabac, però també hi podria contribuir una disfunció mitocondrial. Pocs treballs analitzen les possibles alteracions mitocondrials en relació al fum del tabac però apunten cap a una probable interacció a nivell de la cadena respiratòria mitocondrial (CRM), implicant-ne una o més substàncies.La hipòtesi és que el fum del tabac és tòxic per a la CRM. Donat que el monòxid de carboni (CO) és un dels principals components del fum del tabac i donada la gran afinitat del CO pel grup heme, les alteracions mitocondrials als fumadors s'haurien de trobar principalment a nivell del complex IV.Els objectius són analitzar el funcionalisme mitocondrial en fumadors crònics i la possible reversibilitat dels efectes del fum del tabac en abandonar el costum tòxic, investigar l'efecte agut del fum del tabac en persones no fumadores i finalment esbrinar el paper que pot tenir el CO en la patogènesi dels possibles efectes del fum del tabac envers el funcionalisme mitocondrial.S'estableixen 4 grups de pacients: un grup de fumadors crònics sense patologia coneguda que abandonen el seu costum tòxic (A), un grup de voluntaris sans no fumadors que fumaran 5 cigarretes en 45min (B), un grup d'intoxicats per CO (C) i un grup de pacients no fumadors sotmesos a cirurgia ortopèdica per a col·locació de pròtesi de maluc (D). En tots es determinen nivells de carboxihemoglobina (COHb) mitjançant CO-oximetria i nivells de CO en aire exhalat (COAE) mitjançant un transductor electroquímic. Als grups A, B i C s'extrau una mostra de sang per a aïllar cèl·lules mononuclears mitjançant un gradient de Ficoll i quantificar el contingut proteic mitjançant el mètode de Bradford. Al grup D s'extrau una mostra de múscul per a aïllar mitocondris. Els estudis de funcionalisme mitocondrial es fan mitjançant espectrofotometria i polarografia i els de dany oxidatiu de membranes lipídiques mitjançant fluorimetria.Els fumadors mostren una inhibició del 23% de l'activitat del complex IV en relació als no fumadors, a més, d'un major dany oxidatiu en forma de peroxidació lipídica. La inhibició de l'activitat del complex IV dels fumadors progressivament es va normalitzant en abandonar el consum de tabac.En consumir tabac els no fumadors es produeix una immediata disminució de l'activitat del complex IV que es recupera en 24h.Els pacients intoxicats per CO mostren una inhibició de l'activitat del complex IV del 78% acompanyada d'un augment de la peroxidació lipídica respecte els controls no fumadors. L'estudi de l'evolució temporal del funcionalisme mitocondrial de pacients intoxicats per CO, mostra una inhibició inicial dels complexes III i IV acompanyada d'una disminució de l'activitat oxidativa pels diferents substrats, i a més, que les activitats enzimàtiques romanen alterades en el temps però amb una tendència progressiva cap a la recuperació.Els mitocondris aïllats de múscul, en ser sotmesos a concentracions creixents de CO a 0, 50, 100 i 500ppm, mostren una inhibició de l'activitat del complex IV tant més important quan major sia la concentració de CO al que els mitocondris hagin estat exposats, no resultant-ne afectat cap altre complex de la CRM.El fum del tabac altera el funcionalisme mitocondrial, principalment inhibint l'activitat del complex IV de la cadena respiratòria mitocondrial, essent en principi aquesta alteració reversible en deixar de fumar. En fumadors, aquesta alteració s'acompanya d'un augment del dany oxidatiu, cosa que no s'observa en no fumadors. El monòxid de carboni contingut al fum del tabac sembla ser el principal responsable d'aquesta toxicitat mitocondrial. / Reactive oxygen species are an important pathophysiologic mechanism of tobacco smoke. Tobacco smoke is a major source of this substances, but additionally any mitochondria dysfunction could contribute. There are few studies on the relationship between tobacco consumption and mitochondria activity then considering tobacco smoke as a mitochondria toxic. Since tobacco smoke is an important source of carbon monoxide (CO) and CO has "heme" affinity, main target in smoker mitochondria should be complex IV.The aim is to investigate mitochondria dysfunction in smokers and reversibility when stop smoking, the acute effects of tobacco smoke on non-smokers mitochondria, and the specific pathogenic mechanism of CO on the mitochondria respiratory chain (MRC) of human mitochondria.MRC function is studied in smokers (A), non-smokers (B), patients suffering from acute CO intoxication (C), and patients submitted to orthopaedic surgery (D). Carboxihaemoglobin and exhaled-CO levels are determined in all groups. Blood samples are obtained in groups A, B and C, and mononuclear cells are isolated by Ficoll's gradient and protein content is quantified according to Bradford's method. In group D, muscle sample is obtained and mitochondria are isolated. MRC function, respectively oxidative and enzymatic activities, is assessed by polarographic and spectrophotometric assays. Lipid membrane peroxidation as oxidative damage is assessed by fluorimetric assays.Results show a 23% of inhibition complex IV activity in smokers associated with an enhanced oxidative damage. Smoking cessation returns to normal levels enzyme activities. Non-smokers show a similar inhibition in complex IV activity immediately after smoking, that returns to initial levels in 24h. Patients suffering from acute CO intoxication show a 78% inhibition complex IV activity and an enhanced oxidative damage. When a follow-up is made, inhibition of complex activities remain large time but there is a tendency to improve. Finally, isolated mitochondria show a progressive inhibition of complex IV activity by increased exposures of CO concentrations, while other complexes are not affected.Tobacco smoke causes mitochondrial dysfunction, mainly through a reversible inhibition in complex IV activity. This finding coexists with an increased oxidative damage in smokers, but not in non-smokers. Carbon monoxide seems to be main responsible for the mitochondrial toxicity.