A associação de uma série de influências ambientais como dietas com excesso de gordura ou falta de atividade física regular (sedentarismo) são importantes fatores que podem levar ao desenvolvimento da obesidade e dislipidemias. Portanto, a prática de atividade física regular, caracterizada pelo treinamento, mostra-se atualmente como parte de estratégias para combater problemas como dislipidemias. Sabe-se que o aumento do gasto calórico e a melhora no desempenho podem ser atingidos com treinamentos de endurance ou intermitentes, uma vez que ambos levam à alterações fisiológicas e metabólicas semelhantes. O treinamento intermitente é caracterizado pela execução de repetidas sessões de curtos ou longos períodos, preferencialmente de alta intensidade (aproximadamente 100% do VO2máx.), intercaladas por pausas ou períodos de menor intensidade, visando a recuperação do indivíduo. Dada a importância do fígado no metabolismo lipídico em repouso e no exercício foi nosso interesse avaliarmos o comportamento do fígado frente a oito semanas de treinamento intermitente de alta intensidade e comparar tais alterações às promovidas pelo treinamento de endurance em ratos, com especial atenção a síntese e secreção de VLDL. Os animais foram divididos em três grupos: sedentário (SD), treinamento contínuo (TC) e treinamento intermitente de alta intensidade (TI). Os dois protocolos de treinamento resultaram em menor ganho de peso em comparação com o grupo SD. Ainda o grupo TI apresentou maior secreção de VLDL em comparação aos grupos TC e SD. Além disso, a expressão gênica da MTP, proteína chave na montagem da VLDL e da LPL muscular responsável por catalisar a liberação de TAG da VLDL para captação pelo músculo esquelético demonstrou aumento no grupo TI em comparação ao SD. Tais resultados inferem que o treinamento intermitente modulou o transporte de TAG para a periferia e contribui para um efeito hipotrigliceridêmico após o exercício de alta intensidade / The combination of environmental influence, including high fat diets and lack of regular physical activity (sedentary lifestyle) are important factors leading to the development of obesity and dyslipidemias. Regular practice of physical activity, characterized by training, appears as important strategy to reduce such problems. Increased caloric expenditure and improvement of physical performance can be reached with endurance or intermittent training since both lead to similar physiological and metabolic adaptations. Intermittent training is characterized by the execution of repeated bouts of physical effort (high intensity, approximately 100% of VO2max.) Due to the importance of the liver in lipid metabolism during rest and exercise, we examined the adaptations of organ to 8 weeks of high intensity intermittent training, compared with the effect of endurance exercise with special attention to VLDL synthesis and secretion. The animals were randomized into three groups: sedentary (SD), continuous training (TC) and intermittent training (TI). Both training protocols resulted in reduced weight body gain compared with SD, although IT presents higher VLDL secretion, compared with TC and SD. In addition, gene expression of MTP, a key protein in the assembly of VLDL and LPL muscle responsible for catalyzing the release of TAG for VLDL uptake by skeletal muscle, showed an increase in TI compared to SD. These results suggest that intermittent training modulated the transport of TAG to the periphery and contributed to an hypotriglyceridemic effect caused by high intensity exercise

As repetições ricas em leucina (LRR) são domínios presentes em diversas famílias de proteínas com diferentes funções, sendo responsáveis pela formação de uma estrutura capaz de estabelecer interações protéicas. Em decorrência do projeto de caracterização de um segmento do cromossomo 17 de L. amazonensis, identificamos um gene que codifica uma proteína de 72 kDa, contendo em sua região central, seis motivos LRR. Genes ortólogos estão presentes nos genomas de L. major e L. braziliensis. Observamos que o gene LRR17 é regulado de forma distinta ao longo dos ciclos biológicos de L. braziliensis e L. amazonensis. A proteína LRR17 de L. braziliensis e secretada tanto nos estágios promastigota como amastigota. Identificamos também a secreção da proteína LRR17 em promastigotas de L. amazonensis. Obtivemos mutantes hiperexpressores da proteína LRR17 em L. braziliensis e L. amazonensis. As linhagens mutantes foram mais infectivas em infecções de macrófagos in vitro quando comparadas com a linhagem selvagem. A proteína LRR17 parece estar envolvida no processo de invasão do parasita em infecções in vitro e no estabelecimento da infecção da forma amastigota de Leishmania. / Leucine-rich repeats (LRRs) are versatile binding motifs found in a variety of proteins involved in protein-protein interactions. The LaLRR17 gene, identified initially in the L. amazonensis genome, encodes a protein with 6 LRR in its central region, that is secreted to the cytoplasm of L. amazonensis-infected macrophages. An orthologue to LaLRR17 was identified in L. braziliensis chromosome 17. LRR17 gene expression is regulated differentially during the life cycle of L. braziliensis and L. amazonensis. The LbLRR17 protein is secreted in L. braziliensis promastigotes and amastigotes. To characterize the function of the LRR17 protein we obtained transgenic parasite lines of L. amazonensis overexpressing the LaLRR17 gene and of L. braziliensis overexpressing the LbLRR17 gene. The mutants were more infective to macrophages in vitro when compared with the wild type strains, indicating that the LRR17 protein may interact with macrophage molecules, modulating the cellular response to increase parasite survival.

Larvas de cisticercos de Taenia crassiceps foram deixadas em repouso em TRIS 9mM pH 7,2 com 1mM EDTA até 180 minutos, os sobrenadantes coletados e processados nos 30, 60, 120 e 180 minutos, dando origem aos antígenos de excreção e secreção (ES 30; ES 60; ES 120 e ES 180). A caracterização do antígeno de excreção e secreção de larvas de Taenia crassiceps foi feito por SDS-PAGE e imunoblot utilizando anticorpos monoclonais (AcMos) anti-T. crassiceps e anti-T. solium e anticorpos humanos. Os resultados mostraram que o rendimento do antígeno ES foi menor nos primeiros 30 minutos (0,4 µg) por larva quando comparado os demais ES (ES 60: 2,4 µg; ES 120: 2,9 µg; ES 180: 2,5 µg). O SDS-PAGE confirmou que no ES 30 há menos proteínas. No imunoblot, o ES 180 mostrou que 6 AcMos (anti-LV-Tcra; anti-ES-Tcra; anti-LV-Tso: A3; anti-T-Tso: B4, B11 e A6) reconheceram apenas as frações 18- e 14-kDa do antígeno ES 180. Os AcMos anti-E-Tso (B8) e anti-LV-Tso (B6) não reconheceram frações do antígeno ES 180. Anticorpos presentes em amostras humanas de pacientes com NC reconheceram as frações protéicas entre 94- a 30-kDa e as de 18- e 14-kDa. Utilizando antígeno ES 180 e amostras de soros de pacientes supostamente saudáveis (GC), foram identificadas proteínas acima de 30-kDa e somente uma amostra reconheceu a de 16- kDa, anômala em relação ao perfil 18- e 14-kDa. As amostras de soro de pacientes com outras parasitoses mostraram reatividade com frações ≥ de 30-kDa do ES 180 e o maior índice de reatividade foi com a proteína 71-KDa. Um total de 77%; 70%; 60% e 70% das amostras de pacientes com toxocaríase, esquistossomose mansônica, hidatidose e Chagas, respectivamente, reconheceram a fração 71-kDa do ES 180. O antígeno ES pode contribuir com futuros estudos abordando a complexa relação parasito hospedeiro na cisticercose e na produção de vacinas para o uso em suínos. / Cysticercus Larvae of Taenia crassiceps were maintained in TRIS 9mM pH 7,2 with 1mM EDTA for 180 minutes; the supernatant was collected and processed at 30; 60; 120 and 180 minutes, originating excretion-secretion antigens (ES 30; ES 60; ES 120 and ES 180). The characterization of the ES antigen was conducted through SDS-PAGE and immunoblot using anti-T. crassiceps and anti-T. solium monoclonal antibodies (AcMos) and human antibodies. The results showed that the production of ES antigen was lower in the first 30 min. (0,4 µg) compared with the others (ES 60: 2,4 µg; ES 120: 2,9 µg; ES 180: 2,5 µg). The SDS-PAGE confirmed that ES 30 presented less protein. By immunoblot,6 AcMos (anti-LV-Tcra; anti-ES-Tcra;anti-LV-Tso: A3; anti-T-Tso: B4, B11 and A6) have recognized only the 18- and 14-kDa fractions of the ES 180. The anti-E-Tso (B8) and the anti-LV-Tso (B6) AcMos did not recognize any fractions. Antibodies from human samples NC recognized the proteins from 94- to 30-kDa and from 18- and 14-kDa. Using serum samples of apparently healthy individuals (GC), the ES 180 antigen showed proteins > 30-kDa and one sample recognized the 16-kDa fraction, anomalous when compared to the 18- and 14-kDa fractions. The serum samples of subjects with other parasitoses showed reactivity ≥ 30-kDa, more frequently with 71-KDa protein. A total of 77%; 70%; 60% and 70% of the samples from subjects presenting toxocariasis, esquistossomose mansonic, hydatidosis and Chagas disease, respectively, recognized the 71-kDa fraction of ES 180. The ES antigen may contribute to further studies on the complex cysticercosis parasite/host relation as well as for the production of vaccines for swine.

The Golgi complex is an organelle responsible for receiving synthesized cargo from the endoplasmic reticulum for subsequent post-translations modifications, sorting and secretion. A family of proteins named Golgi Reassembly and Stacking Proteins (GRASP) is essential for the correct assembly and laterally tethering of the Golgi cisternae, a necessary structuration to keep this organelle working correctly. The GRASP structure is mainly composed of two regions: an N-terminal formed by two PDZ domains connected by a short loop (GRASP domain) and a non-conserved C-terminal region, rich in serine and proline residues. Although there are now a few crystal structures solved for the N-terminal domain, it is surprising to notice that no information is currently available regarding a full-length protein or even about dynamic and structural differences between the two PDZs in solution, which is the main functional region of this protein. Using a full-length GRASP model, we were capable of detecting the coexistence of regular secondary structures and large amounts of disordered regions. The overall structure is less compact than a regular globular protein and the high structural flexibility makes its hydrophobic core more accessible to solvent. GRASP coexist in a dynamic conformational ensemble of a µs-ms timescale. Our results indicate an unusual behavior of GRASP in solution, closely resembling a class of collapsed intrinsically disordered proteins called molten globule. We report here also the disorder-to-order transition propensities for a native molten globule-like protein in the presence of different mimetics of cell conditions. Changes in the dielectric constant (such as those experienced close to the membrane surface) seem to be the major factor capable of inducing several disorder-to-order transitions in GRASP, which seems to show very distinct behavior when in conditions that mimic the vicinity of the membrane surface as compared to those found when free in solution. Other folding factors such as molecular crowding, counter ions, pH and phosphorylation exhibit lower or no effect on GRASP secondary structure and/or stability. This is the first study focusing on understanding the disorder-to-order transitions of a molten globule structure without the need for any mild denaturing condition. Regarding the PDZs that form the GRASP domain, we observed that GRASPs are formed by a more unstable and flexible PDZ1 and much more stable and structurally well-behaved PDZ2. More than that, many of the unstable regions found in PDZ1 are in the predicted binding pocket, suggesting a structural promiscuity inside this domain that correlates with the functional promiscuity of interacting with multiple protein partners. This thesis presents the first structural characterization of a full-length GRASP, the first model of how GRASPs (or any molten globule-like protein) can be modulated by the cell during different cell functionalities and the first work in the community proving that the established idea that both PDZs are structurally equivalent is not completely right / O complexo de Golgi é um organela responsável pela recepção de carga sintetizada no retículo endoplasmático e por subsequente modificações pós-traducionais, classificação e secreção. Uma família de proteínas chamada Golgi Reassembly and Stacking Proteins (GRASP) é essencial para o correto empilhamento das cisternas e conexões laterais das pilhas do complexo de Golgi, uma estruturação necessária para manter essa organela funcionando corretamente. A estrutura das GRASPs é composta de duas regiões principais: uma extensão N-terminal formado por dois domínios PDZ conectados por um loop (domínio GRASP) e uma região C-terminal não conservada, rica em resíduos de serina e prolina. Embora existam algumas estruturas cristalográficas resolvidas para o domínio N-terminal, é surpreendente notar que não havia nenhuma informação na literatura sobre a construção inteira de um GRASP, ou mesmo um estudo detalhado sobre os PDZs no N-terminal em solução, que é a principal região funcional dessa proteína. Usando um modelo de GRASP em sua construção completa, fomos capazes de detectar a coexistência de estruturas secundárias regulares e grandes quantidades de regiões desordenadas. A estrutura é menos compacta do que uma proteína globular e a alta flexibilidade estrutural torna o seu núcleo hidrofóbico mais acessível ao solvente. GRASPs coexistem em um conjunto conformacional dinâmico numa escala de tempo característico de s-ms. Nossos resultados indicam um comportamento incomum da GRASP em solução, similar à de uma classe de proteínas intrinsicamente desordenadas colapsadas conhecidas como glóbulos fundidos. Nós relatamos também as propensões de transição estrutural do tipo desordem-ordem para uma proteína glóbulo fundido nativa, induzidas pela presença de diferentes miméticos de condições celulares especificas. A mudança na constante dielétrica do meio (como as experimentadas próximas à superfície da membrana biológica) é o principal modulador estrutural, capaz de induzir múltiplas transições desordem-ordem na GRASP, sugerindo um comportamento muito distinto quando em condições que imitam a vizinhança da superfície da membrana em comparação com os encontrados quando livre em solução. Outros fatores de enovelamento, tais como o molecular crowding, contra-ions, pH e a fosforilação exibem efeitos menores (ou nenhum) na estrutura secundária e/ou estabilidade da GRASP. Este é o primeiro estudo focado na compreensão das transições desordem-ordem em uma estrutura do tipo glóbulo fundido sem que houvesse a necessidade de qualquer condição desnaturante. Em relação aos PDZs que formam o domínio GRASP, observamos que as GRASPs são formadas por um PDZ1 mais instável e flexível e um PDZ2 muito mais estável e estruturalmente bem comportado. Mais do que isso, muitas das regiões instáveis encontradas no PDZ1 estão no predito bolsão de ligação, sugerindo uma promiscuidade estrutural dentro desse domínio que se correlaciona com a promiscuidade funcional de interação com múltiplos parceiros proteicos. É apresentado nesta tese a primeira caracterização estrutural de uma GRASP em sua forma completa, o primeiro modelo de como as GRASPs (ou qualquer proteína em forma de glóbulo fundido) pode ser modulada estruturalmente pela célula durante diferentes funcionalidades e o primeiro trabalho na comunidade provando que a estabelecido ideia de que ambos os PDZs são estruturalmente equivalentes não é completamente correta

A glândula acessória (GA) e o ducto primário (DP) fazem parte do aparelho glandular de veneno da serpente Bothrops jararaca. Existem poucos estudos envolvendo a GA e o DP e ainda há controvérsias se as secreções liberadas por estas regiões podem modificar o veneno formado. Nossos resultados mostraram que a GA apresenta um epitélio secretor simples com células secretoras mucosas, células seromucosas, células ricas em mitocôndrias sem secreção, células horizontais, células basais e células dark. E o DP apresenta um epitélio pseudo-estratificado com células secretoras colunares com vesículas com diferentes eletrodensidades, células ricas em mitocôndrias, células dark, células basais e células horizontais. Observamos que a GA e o DP possuem um ciclo de produção e secreção longo semelhante à glândula principal de veneno. Além disso, mostramos pela primeira vez que a secreção da GA não participa na formação do veneno total e sugerimos que a secreção liberada pelo DP possa participar do veneno total e seja esta secreção o motivo das controvérsias existentes na literatura. / The accessory gland (AG) and the primary duct (PD) are components of the venom gland apparatus of Bothrops jararaca snake. There are few studies about AG and PD and there is still controversy on whether the secretions released by these regions can modify the total venom. Our results show that AG presents simple secretory epithelium with mucous secretory cells, seromucous cells, mitochondria-rich cells without secretion, horizontal cells, basal cells and dark cells. The PD duct presents pseudo-stratified epithelium with secretory columnar cells with different electrodensity vesicles, mitochondria-rich cells, dark cells, basal cells and horizontal cells. We also observed that the AG and the PD have a long cycle of synthesis and secretion as the main venom gland. Furthermore, we show for the first time that the secretion of AG does not participate in the formation of the whole venom and suggest that the secretion released by PD could contribute to the total venom and this secretion could be the subject of controversy in the literature.

Bacteria use specialized systems, called secretion systems, in order to translocate substrates to the environment or to other cells, or even to uptake molecules from the exterior environment. Six different secretion systems have been described in Gram-negative bacteria. The Type IV Secretion System (T4SS) is involved in translocation of virulence factors, bacterial conjugation, uptake and release of DNA, and in the secretion of antibacterial toxins. The T4SS channel corresponds to a toroidal upramolecular complex consisting of 14 repetitions of the VirB7-VirB9-VirB10 heterotrimer. This channel, also called \"core complex\", is divided in two layers, an outer layer consisting of the VirB7 lipoprotein in complex with the C-terminal domains of VirB9 (VirB9CT) and VirB10 (VirB10CT), and an inner layer composed by the N-terminal domains of VirB9 (VirB9NT) and VirB10 (VirB10NT). Xanthomonas citri pv. citri (Xac) is a gram-negative bacterium that infects citrus plants causing a disease called \"citrus canker\". Although not directly involved in causing the disease, the chromosomally encoded T4SS is responsible for the secretion of toxins, working as a bacterial killing machine (Souza et al., 2015). The three-dimensional structure of Xac\'s VirB7 obtained by Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy (PDB 2L4W) revealed that, unlike the canonical VirB7, Xac\'s VirB7 consists of a flexible N-terminal domain followed by a C-terminal globular domain. The flexible N-terminal tail is involved in interaction with VirB9CT. In this thesis, the NMR structure of the complex formed between VirB9CT and a peptide derived from the N-terminal tail of Xac-VirB7 (VirB7NT) was solved. This complex is stabilized by hydrophobic interactions involving the side chains of particular amino acid residues such as Phe30, Trp34 and Val37 in VirB7, and Arg250, Tyr167 and Tyr169 in VirB9. Mutations of such amino acids affect not only the stability of the VirB9:VirB7 complex in vitro, but also reduce the T4SS activity and impairs its assembly in vivo. Furthermore, the ability of forming VirB7:VirB7 oligomers is essential for a functional T4SS, although it is not required for assembling the complex. The structural propensity and flexibility of a fragment derived from the proline-rich region (PRR) of the N-terminal tail of VirB10 (VirB10NT - residues 85 to 182) were studied. Measurements of the {1H}-15N heteronuclear NOE showed that VirB10NT is highly flexible on a sub-nanosecond time scale. Analysis of chemical shifts and NOEs showed that the ensemble and time average conformation of VirB10NT consists of a short alpha helix between residues 151-163, and that this helix is involved in interactions with VirB9NT. These findings provide the first compelling evidence for the interaction between the N-terminal domains of VirB9 and VirB10, and for the existence of significant flexibility within Xacs T4SS. / Bactérias usam sistemas especializados, denominados sistemas de secreção, a fim de translocar substratos para o ambiente ou para outras células, ou até mesmo para capturar moléculas do meio externo. Seis diferentes sistemas de secreção foram descritos em bactérias gram-negativas. O Sistema de Secreção do Tipo IV (T4SS) está envolvido na translocação de fatores de virulência, conjugação bacteriana, absorção e liberação de DNA, e secreção de toxinas antibacterianas. O canal do T4SS (core complex) corresponde a um complexo formado por 14 repetições do heterotrimero VirB7-VirB9-VirB10. A camada externa deste canal é constituída por VirB7 em complexo com os domínios C-terminal de VirB9 (VirB9CT) e VirB10 (VirB10CT). Os domínios N-terminal de VirB9 (VirB9NT) e VirB10 (VirB10NT) formam a camada interna do core complex. Xanthomonas citri pv. citri (Xac) é uma bactéria gram-negativa que infecta plantas cítricas causando uma doença chamada \"cancro cítrico\". Embora não esteja diretamente envolvido na infecção, o T4SS cromossomal secreta toxinas capazes de matar outras bactérias gram-negativas. VirB7 de Xac possui uma cauda N-terminal flexível e um domínio globular C-terminal ausente em outras proteínas VirB7. VirB7 interage com VirB9CT através de sua cauda N-terminal. Nesta tese, a estrutura de RMN do complexo formado por VirB9CT e um peptídeo derivado do segmento N-terminal de VirB7 foi resolvida. O complexo é estabilizado, principalmente, por interações hidrofóbicas envolvendo as cadeias laterais de determinados resíduos de aminoácidos, particularmente a Phe30, o Trp34 e a Val37 em VirB7 e a Arg250, a Tyr167 e a Tyr169 em VirB9. A substituição de alguns destes aminoácidos por alanina afeta não só a constante de dissociação do complexo in vitro, como também a atividade e a montagem do T4SS in vivo. Além disso, resíduos específicos envolvidos em oligomerização de VirB7 são essenciais para a manutenção de um T4SS funcional, embora não sejam essenciais para a montagem do sistema. Estudos estruturais, de dinâmica e de interações de um fragmento derivado da região rica em prolinas (proline-rich region - PRR) contida no N-terminal de VirB10 (VirB10NT - resíduos 85-182) também foram realizados. Medidas de {1H}-15N NOE heteronuclear mostraram que VirB10NT é altamente flexível. Análises de deslocamentos químicos e NOEs mostrou que VirB10NT forma uma hélice curta entre os resíduos 151-163. Ensaios de interação por RMN indicaram que esta hélice está envolvida em interações com VirB9NT. Estes resultados são a primeira evidência convincente para a especificidade de interação entre os domínios N-terminal de VirB9 e VirB10. Estes dados apontam também para a existência de flexibilidade dentro do T4SS de Xac.

Made available in DSpace on 2015-03-04T18:51:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Anexos-Final.pdf: 7146890 bytes, checksum: bb4f151b856a0b67e03a2261753fccfe (MD5) Previous issue date: 2008-10-31 / Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de Nivel Superior / The type IV secretion system can be classified as a large family of macromolecule transporters divided in three recognized sub-families involved in different bacterial functions. The major sub-family of T4SS is the conjugation system, which allows transfer of genetic material as a nucleoprotein via cell contact among bacteria. Analogously to bacterial conjugation, the T4SS can transfer genetic material from bacteria to eukaryotic cells; such is the case of T-DNA transfer of Agrobacterium tumefaciens to host plant cells. The system of effector proteins transport constitutes the second sub-family, being indispensable for infection processes of several mammalian and plants pathogens. The third sub-family corresponds to the DNA uptake/release system involved in genetic transformation competence, independently of cell contact, as it was described to the systems VirB/D4 from Campylobacter jejuni and ComB form Helicobacter pylori. Several essential features of T4SS are well known, but the knowledge in support of an uncomplicated classification or proper protein annotation of system subunits remains confusing, which in same cases can avoid making inferences about evolution of the system in bacterial species. The purpose of this work was to organize, classify and integrate the knowledge about T4SS through building a database devoted to this bacterial secretion system. The T4SS database was created using the SGBD MySQL and Perl programming language and with a web interface (HTML/CGI) that gives access to the database. Currently, this database hold genomic data from 43 bacteria and 10 plasmids acquired from the GenBank NCBI, these organisms comprise groups from Actionobacteria to Gram-negative Proteobacteria including symbiotic and pathogenic bacteria. By applying Bidirectional Best-Hits method was possible to get a core set of 75 clusters with 974 proteins involved in the T4SS. Also, during this procedure BlastP, Muscle e ClustalW algorithms were applied. The database was manually annotated supported by cross references built-in the T4SS annotation pages, such as the UniProtKB/Swiss-Prot, COG, InterPro and TCDB as well as by the methods for signal peptide and transmembrane regions prediction. All T4SS protein records scattered into 75 ortholog clusters were organized into five different classes of type IV secretion system proteins: (i) Type IVA Mpf/T4CP; (ii) Type IVA Dtr; (iii) F-type plasmid; (iv) IncP-1-type plasmid; (v) Type IVB Icm/Dot. All 974 proteins were annotated into 68 well-known families, which can be involved in conjugation, effector translocator, DNA uptake/release or even can be bifunctional proteins. Also, by using the Maximum Likelihood method were built 70 unrooted phylogenetic trees that represents just 70 clusters instead of 75, this is due to five clusters had only two protein sequences, five unrooted phylogenetic trees were built for each group of first hierarchical classification, one unrooted phylogenetic trees including proteins from archetype systems of all groups, one unrooted phylogenetic trees from 16S sequence of each organism and one rooted tree including a sequence from a Gram-positive bacteria as an external group. The phylogenetic analyses show that some proteins of T4SS are more divergent than others, which indicate that for a particular function few sequence mutations were needed, but other proteins required many sequence mutations to get another functions. Thus, these results proved that proteins belong to the same cluster show different functions: conjugation, DNA uptake/release or effector translocator. Consequently, it was possible verify that similar functions were grouped together within phylogenetic tree, which allowed to annotate a probable function of some uncharacterized proteins, that is possibly due to the sequence similarity may reveal a similar evolution to get the same function. Thus, the phylogenetic trees allowed confirming the protein annotation as well as inferring whether uncharacterized proteins would encompass a known function. The T4SS database will be an open access, given to the users searching and submission sequence tools, which will permit to get insights about classification and phylogeny of T4SS sequence of interest. T4SS Database is accessible at the URL http://www.t4ss.lncc.br. / O T4SS pode ser classificado como uma família de transportadores de macromoléculas envolvidos em diferentes funções bacterianas. A maior subfamília do T4SS é a do sistema de conjugação, o qual permite a transferência de material genético entre bactérias. Analogamente à conjugação, o sistema pode transferir material genético entre bactérias e eucariotos, tal como a transferência de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens. O sistema de transporte de proteínas efetoras constitui uma segunda subfamília do T4SS, sendo indispensável nos processos de infecção de vários patógenos de mamíferos e plantas. A última subfamília corresponde ao sistema DNA-uptake/release" que funciona independente de contato com uma célula alvo, representado pelos sistemas VirB/D4 de Campylobacter jejuni e ComB de Helicobacter pylori. Muitas características básicas do T4SS são bem conhecidas, entretanto o conhecimento para a classificação simples e intuitiva ou a anotação apropriada das proteínas ainda não está claro, impedindo em alguns casos estabelecer correlações evolutivas deste sistema em bactérias. O objetivo deste trabalho foi o de organizar, classificar e integrar o conhecimento do T4SS através da construção de um banco de dados especializado para este sistema secretório bacteriano. O banco de dados T4SS foi criado utilizando o SGBD MySQL e a linguagem de programação Perl e com uma interface web (HTML/CGI) que fornece acesso ao banco. Este banco consta atualmente com 43 genomas bacterianos e 10 plasmídeos obtidos do GenBank NCBI, estes organismos vão desde Actinobactérias até Proteobactérias Gram-negativas, incluindo simbiontes e patogênicos. Foi utilizada a metodologia do Bidirectional Best-Hits", com a qual foi possível obter um conjunto mínimo de 75 clusters" com 974 proteínas envolvidas no T4SS. Também, durante este procedimento foram utilizados os algoritmos BlastP, Muscle e ClustalW. O banco foi anotado manualmente utilizando referências cruzadas incluídas nas páginas de anotação do T4SS, tais como UniProtKB/Swiss-Prot, COG, InterPro e TCDB e métodos para predição de regiões de peptídeos sinal e transmembrana. As análises do banco T4SS permitiram criar uma classificação hierárquica e funcional para as proteínas do T4SS, consistindo em cinco grupos: (i) Type IVA Mpf/T4CP; (ii) Type IVA Dtr; (iii) F-type plasmid; (iv) IncP-1-type plasmid; (v) Type IVB Icm/Dot). As 974 proteínas foram anotadas em 68 famílias conhecidas, as quais podem estar envolvidas em conjugação, transferência de T-DNA, transferência de proteínas efetoras, DNA-uptake/release" ou bem serem proteínas bifuncionais. Também, através do método de máxima verossimilhança foram geradas 70 árvores filogenéticas não enraizadas (NR) representando apenas 70 clusters, já que cinco clusters apresentaram apenas duas seqüências de proteínas, cinco árvores filogenéticas NR foram criadas para cada grupo da primeira categoria hierárquica, uma árvore NR com representantes de todos os grupos, uma árvore NR gerada a partir das seqüências 16S de cada organismo e uma árvore de um cluster incluindo uma seqüência de bactéria Gram-positiva como grupo externo. As análises filogenéticas mostram que determinadas proteínas do sistema são mais divergentes que outras, indicando que para uma determinada função poucas mutações de seqüências foram necessárias, já outras proteínas precisaram de maiores mutações para adquirir outras funções. Por isso, verifica-se que proteínas de um mesmo cluster apresentam diferentes funções: conjugação, DNA-uptake/release", traslocadores de proteínas efetoras. Conseqüentemente, foi possível verificar que funções semelhantes se agruparam juntas nas árvores filogenéticas, permitindo anotar uma função provável das proteínas ainda não caracterizadas ( unknown"), isto possivelmente devido a que em virtude de sua semelhança de seqüências, possivelmente evoluíram para realizar a mesma função. Assim, as arvores possuíram a finalidade de confirmar a anotação e contribuíram permitindo inferir se os unknown" ou probable" podem ser de uma determinada classificação funcional. O banco T4SS será de uso público, oferecendo ao usuário ferramentas de buscas e submissão de seqüências, as quais permitirão inferir respostas sobre a classificação e filogenia da seqüência T4SS de interesse. O banco de dados T4SS pode ser acessado na URL: http://www.t4ss.lncc.br.

O estresse oxidativo e a enzima NADPH oxidase-2 (NOX2) estão associados com a diminuição da massa funcional de células-β em pacientes com diabetes do tipo 2 (DT2). Neste estudo, testamos o papel da NOX2 sobre a glicotoxicidade em células-β. Ilhotas de camundongo C57BL/6J nocautes ou não para NOX2 (NOX2-KO e WT, respectivamente) foram isoladas e cultivadas por até 3 semanas em 10 ou 30 mmol/l de glucose (G10 e G30, respectivamente). A secreção de insulina foi maior nas ilhotas NOX2-KO vs. WT sem apresentar diferenças metabólicas ou do potencial redox da glutationa citosólica (EGSH). O cultivo de ilhotas em G30 aumenta a concentração de H2O2 e a oxidação de tióis no compartimento citosólico, seguido por aumento de apoptose de células-β, mas, preservando a reposta máxima secretória. Estas respostas foram quase idênticas em ambos os tipos de ilhotas. Em conclusão, a NOX2 regula negativamente a secreção de insulina em ilhotas de camundongos C57BL/6J, mas não é um componente crítico para a sobrevivência de células β em um modelo in vitro de glicotoxicidade. / Oxidative stress and NADPH oxidase-2 (NOX2) enzyme are associated to the decline of the functional β-cell mass in type 2 diabetes (T2D). Here, we tested the role of NOX2 on β-cell glucotoxicity. NOX2 knockout (NOX2 KO) and wild type (WT) C57BL/6J mice islets were isolated and cultured up to 3 weeks at 10 or 30 mmol/l glucose concentrations (G10 and G30, respectively). The insulin secretion was higher in NOX2-KO vs. WT islets despite similar metabolic and cytosolic glutathione-redox potential (EGSH) changes. The prolonged culture at G30 increases the H2O2 concentration and cytosolic thiol oxidation, followed by increased βcell apoptosis but preserving maximal secretory response. These responses were almost identical in both types of islets. In conclusion, NOX2 is a negative regulator of insulin secretion in C57BL/6J mouse islets, but is not a critical component for β-cell survival in a model of glucotoxicity in vitro.

Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) é o causador do cancro de plantas cítricas. Entre os potenciais fatores de virulência codificados por Xac, está o Sistema de Secreção do Tipo IV (T4SS), um grande complexo multiprotéico que atravessa o periplasma e as membranas interna e externa de bactérias Gram-negativas. O T4SS está envolvido com secreção de proteínas e/ou DNA para o meio extracelular ou diretamente no interior da célula do hospedeiro. Este Sistema requer tipicamente 12 proteínas para realizar suas funções: VirB1-VirB11 e VirD4. O T4SS codificado pelo cromossomo de Xac está aparentemente incompleto, devido a não codificar nenhuma proteína com similaridade de seqüência a VirB7. Os objetivos deste trabalho são estudar a estrutura, função e interações das proteínas do T4SS de Xanthomonas. Foram clonados 23 genes que codificam proteínas ou domínios relacionados ao T4SS, e os polipeptídeos foram produzidos de forma recombinante em E. coli. Treze deles foram purificados e submetidos a estudos estruturais, espectroscópicos e de interações proteína-proteína. A estrutura em solução de Xac262224-139 foi resolvida, apresentando uma região N-terminal desenovelada de aproximadamente 30 resíduos e um domínio globular. Este polipeptídeo oligomeriza em troca química rápida na escala de tempo de RMN e o seu N-terminal desenovelado reconhece o domínio C-terminal de VirB9 (VirB9154-255) em troca lenta. Análise de RMN demonstrou que VirB9154-255 possui uma estrutura flexível em solução, sofrendo uma marcante mudança conformacional na presença de Xac262224-139. Ambas proteínas se tornam rígidas após a interação. Xac2622 é o equivalente a VirB7 em Xanthomonas, baseado na localização do seu gene no lócus do T4SS, localização subcelular predita do polipeptídeo codificado e sua interação com VirB9. Porém, diferente de outras proteínas da família VirB7, Xac2622 possui um domínio globular adicional, com topologia e estrutura similares a domínios presentes apenas em proteínas associadas à membrana externa de bactérias Gram-negativas. Nocaute do gene xac2622, contudo, não afetou a virulência de Xac na infecção de plantas de laranja pêra. O domínio enovelado de Xac2622 foi cristalizado, e os cristais obtidos difrataram até uma resolução de 1,0 Å, pertencendo ao grupo espacial C2221. O modelo preliminar possui Rfactor de 0,121 e Rfree de 0,147. Foram obtidos cristais de outras 3 proteínas relacionadas ao T4SS de Xac, porém somente um deles difratou em alta resolução (2,0 Å, pertencendo ao grupo espacial C2). O potencial sinal de secreção pelo T4SS de Xanthomonas é um domínio C-terminal conservado de aproximadamente 115 resíduos, encontrado nos substratos putativos do T4SS. Caracterizamos um destes domínios, presente na proteína Xac2609, e ele é intrinsicamente desestruturado. Essa observação pode ter implicações funcionais, visto que os substratos são desenovelados antes de sua passagem pelo canal de secreção do T4SS / Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) is a gram-negative bacterial phytopathogen that infects citrus. One possible virulence determinant is a chromosomally encoded Type IV Secretion System (T4SS), a multiprotein complex that spans the bacterial periplasm and both inner and outer membranes. The T4SS is used by some bacteria to secrete proteins and/or DNA to the extracellular milieu or the host interior. The model T4SS from Agrobacterium tumefaciens is made up of twelve structural proteins: VirB1-VirB11 and VirD4. The Xanthomonas T4SS is apparently incomplete because of the lack of a polypeptide with sequence similarity to VirB7. The aim of this project is the study of structure-function relationships in the Xanthomonas T4SS. Twenty-three T4SS protein-coding genes, including full-length proteins or domains, were cloned and the proteins were produced in different E. coli strains. Thirteen polypeptides were purified and some of them were submitted to structural, spectroscopic and protein-protein interaction studies. We used NMR to solve the solution structure of Xac262224-139 which consists of an unfolded N-terminal segment of ~30 residues followed by a globular domain. Xac262224-139 oligomerizes in fast exchange at the NMR time scale and interacts via its unfolded N-terminus with the VirB9 C-terminus (VirB9154-255) in slow exchange. NMR analysis showed that VirB9154-255 has a flexible structure in solution. However, this polypeptide undergoes a significant conformational modification in the presence of Xac2622,24-139 and both proteins become rigid upon interaction. Xac2622 is the Xanthomonas VirB7, based on the chromosomal localization of its gene, predicted subcellular localization and protein interaction analysis. But surprisingly, unlike other VirB7 proteins, Xac2622 has an extra C-terminal folded domain whose topology and structure are strikingly similar to that of periplasmic domains found in outer membrane proteins of many bacterial Secretion Systems. Knockout of the xac2622 gene, however, does not affect the Xac virulence in orange leaf infection assays. The Xac2622 folded domain was also crystallized, and these crystals diffracted up to 1.0 Å resolution and belong to the space group C2221. The preliminary refined model has Rfactor of 0.121 and Rfree of 0.147. Crystals of three other T4SS proteins have been obtained, but only one of them diffracted to high resolution (2.0 Å; space group C2). Xac2610 is a hypothetical protein whose gene is located in the T4SS locus, and its interactions were studied with VirB9, VirB11 and Xac2609, a putative T4SS substrate. The potential T4SS secretion signal is a conserved, approximately 115 residues, C-terminal domain found in the putative substrates of the Xanthomonas T4SS. This sequence mediates interactions with VirD4. We have characterized this domain from one substrate and it is mainly unfolded. This observation may have functional implications, as the substrates are unfolded before their secretion through the T4SS channel

A Arginina (Arg) regula a secreção de GH e insulina, e é o único precursor biológico do NO. Previamente demonstramos que animais tratados cronicamente com Arg (35mg/dia) desenvolvem resistência à insulina (RI), e o presente estudo investigou as suas bases moleculares. A RI baseou-se na redução da atividade e/ou expressão do IRS 1/2 e Akt, e do conteúdo de GLUT4; sendo o GH crucial na gênese desses efeitos. Doses mais elevadas de Arg (70mg/dia/30 dias), a maior geração de NO e a melhora do fluxo sangüíneo reverteram este quadro. Experimentos com células musculares demonstraram que a Arg estimula o metabolismo de glicose e lipídios, via NO/c-GMP. Esses achados indicam que a Arg pode ser benéfica para o tratamento de distúrbios metabólicos, como obesidade e DM2; e que ao estimular a secreção de GH, em doses adequadas, seria eficaz na terapia de distúrbios da secreção deste hormônio. Todavia, estudos adicionais são necessários para investigar a melhor dose e os efeitos crônicos in vivo da Arg, uma vez que o GH em excesso apresenta um efeito diabetogênico importante. / Arginine (Arg) regulates the secretion of GH and insulin, and it is the main biological precursor of NO. We have previously shown that animals chronically-treated with Arg (35 mg/day) developed insulin resistance (IR), and this study investigated its molecular basis. The RI relies on the reduction of the activity and/or expression of IRS 1/2 and Akt, and of the GLUT4 content; and GH has a crucial role in the genesis of these effects. Higher doses of Arg (70 mg/dia/30 days), the increased NO generation and the improvement of the blood flow reversed the RI. Experiments with muscle cells showed that Arg stimulates glucose and lipids metabolism, via NO/c-GMP activation. These findings indicate that Arg may be beneficial for the treatment of metabolic disorders, such as obesity and T2DM, and by stimulating GH secretion, Arg can, in appropriate doses, be effective for the therapy of GH secretion disorders. However, further studies are needed to investigate the best dose and the chronic effects of Arg in vivo, since that GH in excess is potentially diabetogenic.