Made available in DSpace on 2015-04-11T13:38:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 juliana.pdf: 1522484 bytes, checksum: 7450de4815f507bdefe6fb92d3742c8c (MD5) Previous issue date: 2010-11-29 / Quassia amara L. (Simaroubaceae) is a small tree, widely distributed in the Amazon, known as ―pau-amargo‖. The tea from its leaves and bark are used in popular medicine for gastric disorders and malaria. β-carboline and indolic alkaloids, steroids and quassinoids (quassin and neoquassin) were isolated from this plant and evaluated in animal models of malaria with promising results, but still preliminary. Previous pharmacological studies performed with non-standardized apolar extracts, reported sedative, analgesic, anti-inflammatory, emollient and anti-ulcer activities. In view of the reputation of Q. amara in folk medicine and scarce consistent results in the scientific literature, this work studied the systemic actions of the standardized extracts from the native plant collected in the region of Manaus. Semi-purified extracts and high purity fractions were obtained from the chemical standardization and were used to study the mechanisms of actions detected experimentally. In these studies, the popular use of Q. amara in malaria led us also to investigate the pharmacological actions of its extracts and purified fractions in mammalian P-ATPases (H+-K+-ATPase and Ca+2-ATPase) that have high structural homology with isoenzymes essential to the Plasmodium survival. The standardized extract was obtained by the partition of Q. amara AE in buthanol originating the buthanolic fraction (BuF) with the same pharmacological activity and fivefold more concentrated than AE. The purification of BuF by high performance liquid chromatography (HPLC) yielded 18 high purity fractions (F1 to F18), still in identification process. The pharmacological screening of AE and BuF did show remarkable action in the CNS. AE showed anti-inflammatory effect, apparently associated with the inhibition of pro-inflammatory mediators histamine and serotonin, but no analgesic action was observed. AE increased gastrointestinal motility and inhibited the gastric ulcers induced by stress and ethanol. BuF at tenfold lower doses inhibited the secretion and gastric acidity in vivo and the intermediate dose inhibited the total acidity stimulated by histamine, but did not when induced by bethanechol (muscarinic agonist), indicating a possible selective action in the histamine/cAMP pathway. The BuF and fractions isolated by HPLC F10, F14 and F15 potentiated the direct elicited twitches in the rat diaphragm muscle. In the Ca+2-ATPase isolated from skeletal muscle, the BuF and fractions F05, F06, F08, F09, F10, F13, F14, F15,F16 inhibited its activity and this effect may explain the potentiation of the diaphragm contraction. The FBut and fractions F11, F12, F13 and F16 inhibited the H+-K+-ATPase activity from the gastric mucosa in vitro; this effect may explain the anti-secretory and anti-ulcer activity observed in vivo, effects related to the mainly popular use of Q. amara. / A Quassia amara L. (Simaroubaceae) é árvore de pequeno porte, de ampla distribuição amazônica, conhecida como pau-amargo; o chá das folhas e cascas é utilizado na medicina popular para distúrbios gástricos e na malária. Da planta foram isolados alcalóides indólicos e β-carbolínicos, esteróides e quassinóides (quassina e neoquassina) avaliados em modelos do parasitismo animal com resultados promissores, mas ainda iniciais. Estudos farmacológicos anteriores realizados com extratos apolares sem padronização, descrevem atividades sedativa, analgésica, anti-inflamatória, emoliente e anti-úlcera gástrica. Em vista da reputação da Q. amara na medicina popular e da pouca consistência científica dos resultados disponíveis na literatura, este trabalho retomou o estudo das ações sistêmicas do extrato aquoso padronizado da planta nativa coletada na região de Manaus. Da padronização química foram obtidos extratos semi-purificados e frações de alto grau de pureza, que serviram também ao estudo do mecanismo das ações detectadas experimentalmente. Nesses estudos, o uso popular na malária nos levou também a investigar as ações farmacológicas dos extratos purificadas e frações nas H+-K+-ATPase e Ca+2-ATPase de mamíferos, P-ATPases essas que guardam elevada homologia estrutural com as isoenzimas do Plasmodium sp. essenciais à sua sobrevida. A padronização química do EA da Q. amara foi obtida após partição em butanol dando origem à fração butanólica (FBut) de mesma atividade e 5 vezes mais concentrada. A purificação da FBut por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) originou 18 frações de elevado grau de pureza (F1 a F18) que encontram-se em processo de identificação. A triagem farmacológica do EA e da FBut mostrou ação pouco marcada no SNC. O EA mostrou ação anti-inflamatória, aparentemente associada à inibição dos mediadores pró-inflamatórios histamina e serotonina, mas não mostrou efeito analgésico. O EA aumentou a motilidade gastrintestinal e inibiu as úlceras gástricas induzidas por estresse e por etanol. A FBut, em doses 10 vezes menores, inibiu a secreção e a acidez gástrica in vivo, a dose intermediária inibiu a acidez total estimulada pela histamina, mas não alterou quando induzida por betanecol (agonista muscarínico), indicando provável ação seletiva na via da histamina/AMPc. A FBut e as frações isoladas em CLAE F10, F14 e F15 potenciaram a contração do músculo diafragma de rato sob estímulo elétrico direto. A FBut e frações F05, F06, F08, F09, F10, F13, F14, F15 e F16 inibiram a atividade da Ca2+-ATPase de músculo esquelético; este efeito pode explicar a potenciação da contração do músculo diafragma. A FBut e as frações F11, F12, F13 e F16 inibiram a atividade da H+-K+-ATPase da mucosa gástrica in vitro; este efeito pode explicar a atividade antissecretora ácida e a atividade anti-úlcera observadas in vivo, provavelmente relacionadas com o uso popular mais freqüente.

Os ácidos graxos (AG) podem influenciar o processo secretório de insulina induzido pela glicose. Os AG ω3 interferem em diversos processos fisiológicos, sendo que nas ilhotas pancreáticas, os AG ω3 colaboram para a diminuição da lipotoxicidade induzida pelo ácido palmítico. Ao ácido palmítico são atribuídos efeitos deletérios em diversos tecidos, assim como nas células β, onde ele promove a alteração da composição dos fosfolípides de membrana, do potencial elétrico da mesma e consequentemente do processo de extrusão dos grânulos de insulina. A exposição crônica das células β ao excesso de ácido palmítico é tóxica, provocando diminuição da resposta secretória de insulina, redução da oxidação e captação de glicose e aumento de espécies reativas de oxigênio (EROs) que, em quantidades suprafisiológicas, irão contribuir para a falência e morte da célula β. As EROs podem ser de origem mitocondrial, através do metabolismo dos nutrientes ou ainda proveniente da ativação do complexo enzimático NADPH oxidase, o qual é modulado pela glicose e pelos AG, incluindo o ácido palmítico. Em contrapartida, os AG ω3 exercem efeitos anti-inflamatórios e antioxidantes em diversos sistemas, contribuindo para melhora de perfil lipídico e resistência periférica à insulina. O objetivo deste trabalho foi verificar o possível efeito protetor dos AG ω3 contra os efeitos deletérios do ácido palmítico em células β pancreáticas. Nas células β, a partir dos resultados obtidos, a presença de AG ω3 mostrou-se eficaz para prevenir o dano secretório e o aumento de EROs, além de contribuir para manutenção da viabilidade celular e da captação de glicose nas ilhotas tratadas com ácido palmítico, desempenhando um importante papel protetor na célula β. / Fatty acids (FA) may influence the process of glucose-induced insulin. The ω3 FA interferes in several physiological processes, and in the pancreatic islets collaborate to decrease the lipotoxicity induced by palmitic acid. Palmitic acid induces deleterious effects in several tissues, as well as in β cells, where it promotes the alteration of the membrane phospholipid composition, the plasma membrane electric potential, and consequently, the process of the insulin granules extrusion. Chronic exposure of β cells to high concentration of palmitic acid is toxic, leading to decreased insulin secretory response, reduced oxidation and uptake of glucose, and an increase in reactive oxygen species (ROS) which, in supraphysiological amounts, will contribute to β-cell failure and death. ROS may be of mitochondrial origin, through the metabolism of nutrients or even from the activation of the enzymatic complex NADPH oxidase, which is modulated by glucose and FA, including palmitic acid. In contrast, ω3 FA exerts anti-inflammatory and antioxidant effects in several systems, contributing to the improvement of lipid profile and peripheral resistance to insulin. The aim of this study was verify the protective possible effect of AG ω3 against the deleterious effects of palmitic acid on pancreatic β cells. Our results shown that the presence of ω3 FA was effective in preventing secretory damage and increase of EROs, also contributing to the maintenance of cell viability and glucose uptake in the islets treated with palmitic acid, playing an important β-cell protective role.

As funções fisiológicas da proteína prion (PrPc) estão sob ampla investigação e caracterização, especialmente as funções associadas ao desenvolvimento cerebral. Destaca-se que a associação de PrPc com Stress Inducible Protein 1 (STI1), induz neuritogênese e neuroproteção via proteína cinase extracelular reguladora (ERK) e proteína cinase dependente de AMPc (PKA) respectivamente. O presente estudo avaliou como a expressão de PrP cem astrócitos pode modular a interação neurônioglia e o papel de STI1 como um fator autócrino em astrócitos. PrPc modula a interação neurônio-glia, a produção de fatores tróficos solúveis e a organização da laminina secretada na matriz extracelular pelos astrócitos. Desta forma, a expressão de PrP ctanto em astrócitos quanto em neurônios é essencial para a neuritogênese e sobrevivência neuronal. O papel autócrino de STI1 em astrócitos também foi demonstrado. A interação PrPc-STI1 previne a morte celular por ativação da via de PKA, e ativa a diferenciação astrocitária, de uma forma protoplasmática para uma fibrosa pela indução de ERK1/2. De acordo com estes resultados, um menor grau de diferenciação é encontrado em camundongos deficientes para PrPc. Estes apresentam uma expresão reduzida GFAP (proteína fibrilar acídica glial) e aumentada de vimentina e nestina em comparação com aqueles derivados de animais tipo-selvagem. STI1 promove ainda parada da proliferação astrocitária ativando a via de PKC de maneira independente de PrPc. O mecanismo pelo qual STI1 é secretada por astrócitos também foi avaliado e verificou-se que este é independente da via clássica mediada pelo complexo de Golgi. STI1 secretada é encontrada numa forma solúvel e em outra associada a componentes lipídicos e foram caracterizados por microscopia eletrônica como vesículas que variam entre 20-200nm. Dentre as vias de secreção não clássicas dependentes de lipídeos, a via de \"shedding\" de membrana foi descartada visto que STI1 não é secretada em associação com lipoproteínas. STI1 está presente em frações positivas para o receptor de transferrina, Hsp70, Hsp90 e PrPc, sugerindo composição exossomal. Esses resultados indicam que STI1 pode ser classificada como um fator trófico que associado ao seu \"receptor\" ou \"co-receptor\", PrPc, modula a sobrevivência e diferenciação tanto de neurônios quanto de astrócitos / The physiological functions of PrPc are under intense investigation and characterization, particularly those associated with brain development. In neurons, the association of PrPc with its ligand, STI1, induces neuritogenesis and neuroprotection via ERK and PKA signaling pathways, respectively. The present study evaluated whether PrPc expression in astrocytes modulates neuron-glia crosstalk and the autocrine role of STI1 in astrocytes. PrPc modulates neuron-glia interaction, the production and secretion of soluble factors, and the organization of the laminin in the extracellular matrix. PrPc expression in neurons and astrocytes is essential to neuritogenesis and neuronal survival. The autocrine role of STI1 in astrocytes was also demonstrated. The PrPc-STI1 interaction prevents cell death in a PKA-dependent manner, and induces astrocyte differentiation, from a flat to a process-bearing morphology in an ERK1/2 dependent manner. We showed that PrPccnull astrocytes presented a slower rate of astrocyte maturation than wild-type ones, with reduced expression of GFAP and increased vimentin and nestin expression. STI1 inhibited proliferation of both wild-type and PrPCnull astrocytes in a PKC-dependent manner. The mechanisms by which STI1 can be secreted by astrocytes was avaliated and we demonstrated that this secretion is independent on the classical secretory pathway mediated by the Golgi apparatus. Secreted STI1 is found in a soluble form and associated with lipidic compartments and we characterized by electron microscopy as vesicles that range from 20-200nm. Among the non-classical lipid-dependent secretory pathways, STI1 secretion by shedding was ruled out since STI1 was not secreted with lipoprotein fractions. On the other hand, STI1 is present in fractions that are positive for transferrin receptor, Hsp70, Hsp90 and PrPc, suggesting an exosome identity. Taken together, these data indicate that STI1 acts as a neurotrophic factor whose activity is dependent on the expression of PrP c at the neuronal surface, modulating differentiation and survival of both neurons and astrocytes

Neste projeto, demonstramos a modulação da enzima NAD(P)H oxidase pela glicose, palmitato e interleucina - 1? através da análise da expressão protéica do componente p47PHOX e pela atividade dessa enzima via produção de superóxido e peróxido de hidrogênio. Demonstramos também a participação da enzima NAD(P)H oxidase no processo de secreção de insulina induzido pela glicose pois a inibição da enzima pelo DPI e oligonucleotídeo anti p47PHOX promoveu uma diminuição da secreção do hormônio. A partir desse dado passamos a avaliar o mecanismo de ação da enzima no processo secretório e demonstramos que a inibição dessa enzima promove uma inibição de genes essenciais no processo de secreção de insulina como GLUT-2 e glicocinase.Assim podemos concluir que a enzima NAD(P)H oxidase é modulada pela glicose, palmitato e interleucina 1? e que essa enzima participa do processo de secreção insulina modulando genes essenciais para o processo secretório como GLUT-2 e glicocinase. / The expression and activity of the componenents of NAD(P)H oxidase in pancreatic islets were described for the first time in our laboratory (OLIVEIRA, HR et ai, 2003). It was shown the gene and protein expression of the components of this enzyme in Seta cells and that enzyme activation is mediated by glucose. Glucose induced insulin secretion was followed by increase in EROS generation and this increase was in part mediated by NAD(P)H oxidase activation (the same mechanism observed in phagocytes). In this study, the modulation of NAD(P)H oxidase activity by glucose, palmitate and interleukin 1ß as investigated through protein expression of p47phox vity of this enzyme through superoxide and hydrogen peroxide production. To determinate the role of NAD(P)H oxidase in the process of glucoseinduced insulin secretion the enzyme was inhibited by DPI and oligonucleotide anti p47phox, in the both cases the enzyme inhibition produced a decrease on insulin secretion. In order to investigated NAD(P)H oxidase mechanism of action in insulin secretion, we shown that the inhibition enzyme by DPI reduced the GLUT-2 and glucokinase gene expression. We can concluded hat NAD(P)H oxidase was modulated by glucose, palmitate and interleukin 1ß and that enzyme participed in process of glucoseinduced insulin secretion through modulation of GLUT-2 and glucokinase gene expression.

O cDNA da glicoproteína do vírus da raiva (GPV) foi clonado em vetores plasmidiais (indutíveis) contendo ou não o cDNA do sinal de secreção BiP e da resistência ao antibiótico higromicina B. Esses vetores foram transfectados em células S2 e foram obtidas populações e subpopulações. A população S2MTGPV-H apresentou níveis 5x maiores na expressão da GPV em análise por FACS (~ 50% das células) e por ELISA (~ 0,65 µg/107 células). A seleção de subpopulações permitiu um aumento de aproximadamente 10x na expressão da GPV, especialmente na população S2MTGPV*-H. O tratamento com NaBu resultou em uma redução de aproximadamente 20% no crescimento celular e um aumento de 50% na GPV expressa pela população S2MTGPV*-H (~ 8,3 µg/107 células). O meio de cultura SF900 II permitiu um maior crescimento das células S2MTGPV*-H e uma maior síntese de GPV comparado com outros meios de cultura. Nossos dados mostram que a expressão da GPV pôde ser otimizada através da construção de vetores de expressão/seleção, subpopulações, da exposição da cromatina e do meio de cultura utilizado. / The cDNA encoding the entire rabies virus glycoprotein (RVGP) gene was cloned in plasmids (inductive) with or without a cDNA coding for the secretion signal and coding for the selection hygromicin antibiotic. These vectors were transfected into S2 cells and we had obtain cells populations and subpopulations S2MTRVGP-H cell population were shown to express 5 times higher of RVGP as evaluated by FACS (~ 50 %) and ELISA (~ 0.65 mg/107 cells at day 7). Sub-population selection allowed a higher RVGP expression, especially for the S2MTRVGP*-H. NaBu treatment leading to lower cell growth and higher RVGP expression allowed an even higher RVGP synthesis by S2MTRVGP*-H (~ 8.3 mg/107 cells at day 7 after induction). SF900II medium leading to a higher S2MTRVGP*-H cell growth allowed a higher final RVGP synthesis in this cell culture. The data show that RVGP synthesis may be optimized by the expression/selection vectors design, cell sub-populations selection, chromatine exposure and culture medium employed.

O estresse oxidativo e a enzima NADPH oxidase-2 (NOX2) estão associados com a diminuição da massa funcional de células-β em pacientes com diabetes do tipo 2 (DT2). Neste estudo, testamos o papel da NOX2 sobre a glicotoxicidade em células-β. Ilhotas de camundongo C57BL/6J nocautes ou não para NOX2 (NOX2-KO e WT, respectivamente) foram isoladas e cultivadas por até 3 semanas em 10 ou 30 mmol/l de glucose (G10 e G30, respectivamente). A secreção de insulina foi maior nas ilhotas NOX2-KO vs. WT sem apresentar diferenças metabólicas ou do potencial redox da glutationa citosólica (EGSH). O cultivo de ilhotas em G30 aumenta a concentração de H2O2 e a oxidação de tióis no compartimento citosólico, seguido por aumento de apoptose de células-β, mas, preservando a reposta máxima secretória. Estas respostas foram quase idênticas em ambos os tipos de ilhotas. Em conclusão, a NOX2 regula negativamente a secreção de insulina em ilhotas de camundongos C57BL/6J, mas não é um componente crítico para a sobrevivência de células β em um modelo in vitro de glicotoxicidade. / Oxidative stress and NADPH oxidase-2 (NOX2) enzyme are associated to the decline of the functional β-cell mass in type 2 diabetes (T2D). Here, we tested the role of NOX2 on β-cell glucotoxicity. NOX2 knockout (NOX2 KO) and wild type (WT) C57BL/6J mice islets were isolated and cultured up to 3 weeks at 10 or 30 mmol/l glucose concentrations (G10 and G30, respectively). The insulin secretion was higher in NOX2-KO vs. WT islets despite similar metabolic and cytosolic glutathione-redox potential (EGSH) changes. The prolonged culture at G30 increases the H2O2 concentration and cytosolic thiol oxidation, followed by increased βcell apoptosis but preserving maximal secretory response. These responses were almost identical in both types of islets. In conclusion, NOX2 is a negative regulator of insulin secretion in C57BL/6J mouse islets, but is not a critical component for β-cell survival in a model of glucotoxicity in vitro.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-11-06T15:56:00Z No. of bitstreams: 1 claudia_j_f_covas_ioc_bcm_0023_2010.pdf: 6745296 bytes, checksum: cb60c41970a2659edc6c7fd4600969bf (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-06T15:56:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 claudia_j_f_covas_ioc_bcm_0023_2010.pdf: 6745296 bytes, checksum: cb60c41970a2659edc6c7fd4600969bf (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz Instituto Oswaldo Cruz. Laboratório Interdisciplinar em Pesquisas Médicas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A leishmaniose tegumentar Americana (LTA) representa um conjunto de doenças com características clínicas e imunopatológicas distintas, cuja evolução depende, pelo menos em parte, de fatores relacionados à resposta imune do hospedeiro. A imunopatogênese da leishmaniose mucosa (LM), causadas principalmente pela L. braziliensis, é dependente de uma intensa resposta celular do tipo 1, dirigida peincipalmente pela elevada secreção das citocinas IFN-γ e TNF, que apresentam expressão aumentada em presença de IL-12. Por outro lado, várias evidências apontam que a IL-10 é a principal citocina envolvida na regulação da resposta imune em pacientes com leishmaniose, geralmente suprimindo a imunidade mediada por células. Estudos recentes vêm demonstrando que a susceptibilidade ou resistência a dor do hospedeiro a patógenos intracelulares, bem como a gravidade a várias doenças infecciosas podem ser associados com polimorfismos em genes de citocinas. Assim, com o propósito de estabelecer marcadores que possuam ter influência genética na evolução clínica da LTA, o presente trabalho teve como objetivo avaliar as freqüências dos SNPs nos genes da IL-10 -819C>T, IL-12 -1188ª>C 3’UTR, MIF -173G>C e TNF -308G>A em pacientes com histórico de LTA e controles saudáveis. Além diss, buscou-se analisar a associação dos genótipos com a produção das citocinas IL-10, IL-12p70, MIF e TNF nas diferentes formas clínicas da LTA e nos controles saudáveis.. No que se refere aos SNPs IL-10 -819 e IL-12 +1188 não foi observada uma associação dos mesmos com a LTA per se, no entanto, os SNP MIF -17 e TNF -308 sugerem risco à doença: MIF -173GC (OR=0,04; p=0,04) e TNF – 308AA (OR=3,92; p=0,0001). Nenhum dos SNPs estudados apresentou relação com a progressão para a LM, considerada a forma mais grave da LTA. Em relação à dosagem das citocinas IL-10, IL-12, MIF e TNF os indivíduos controles apresentaram níveis menores do que os pacientes com LTA (p<0,05). Na comparação da produção das citocinas entre pacientes com LC e LM, apenas para IL-10 foram observadas diferenças entre as duas formas clínicas, LC (média: 779,4±541,8 pg/mL; mediana= 615 pg/mL; n=52) mais elevados do que na LM (média: 117,5±55,36 pg/mL; mediana=113 pg/mL; n=14). Na análise da produção das citocinas em relação aos diferentes genótipos apenas para o SNP MIF -173 no grupo controle, o genótipo GG (média= 13886±7674 pg/mL; mediana= 14496 pg/mL; n=10) foi associado com altos níveis de MIF (p<0,05). Em relação à produção das citocinas nas CMSP frente aos diferentes antígenos nenhuma diferença foi encontrada para os diferentes genótipos dos SNPs IL-10 -819 e TNF -308. Em conclusão, os resultados descritos nesse trabalho permitiram que fossem gerados dados importantes sobre a influência da genética do hospedeiro na LTA, principalmente para os SNPs MIF – 173G>C e TNF – 308G>A, e sinaliza a relevância da continuidade de estudos dessa natureza para ampliar o nosso entendimento sobre a dinâmica da doença no Brasil no contexto genético do hospedeiro

A Fibrose Cística (FC) é uma doença letal, de caráter autossômico recessivo, que acomete populações de diferentes etnias. A doença caracteriza-se pelo comprometimento sistêmico das glândulas exócrinas e, na maioria dos pacientes, a doença pulmonar acaba tornando-se a patologia predominante. A infecção por P. aeruginosa é a principal causa de mortalidade dos pacientes com FC. O Sistema de Secreção Tipo III da bactéria é expresso na fase aguda da doença e é responsável por injetar proteínas citotóxicas no interior da célula eucariótica. Há um grande interesse em se investigar a resposta de anticorpos anti P. aeruginosa em pacientes com FC a fim de diagnosticar a colonização e ou infecção pulmonar antes da cultura, permitindo a antibioticoterapia preventiva, a fim de se evitar a infecção pulmonar crônica. Nesta tese, investigamos a resposta de anticorpos (IgG+IgM+IgA) contra as proteínas do SSTT de P. aeruginosa, através do Western-Blot. Participaram do estudo 51 pacientes com FC, de 1.1 a 16.8 anos acompanhados no Departamento de Pneumologia do Instituto Fernandes Figueira - FioCruz, durante um período aproximado de 2 anos. De cada paciente foram coletadas de 1 a 4 amostras de sangue, com intervalo médio de 6 meses entre as coletas. O grupo controle negativo consistiu de 28 indivíduos não fibrocísticos, de 2 a 17 anos, atendidos no Hospital Universitário Pedro Ernesto - HUPE UERJ. As proteínas do SSTT foram extraídas das cepas PAO1 e PAO&#916;ExsA (regulador da expressão do SSTT) de P. aeruginosa. Controles positivos e negativos foram utilizados em todas as reações. Para a identificação das proteínas do SSTT na reação utilizou-se antisoro de camundongos imunizados com a proteína recombinante PcrV. Doze (75%) dos 16 pacientes fibrocísticos considerados não infectados por P. aeruginosa tiveram a primeira sorologia positiva para PopB e 15 (93,75%) para ExoS/ExoT, indicando a colonização ou infecção por P. aeruginosa. Aproximadamente 25% e 35,7% dos soros do grupo controle mostraram reatividade fraca com PopB ou ExoS/ExoT, respectivamente. O tempo decorrido entre a primeira sorologia positiva e o primeiro isolamento de P. aeruginosa nestes pacientes variou de 18 a 30 meses. Concluindo, é possível fazer o diagnóstico sorológico da infecção pulmonar por P. aeruginosa antes do isolamento da bactéria pela cultura. / Cystic Fibrosis (CF) is a lethal disease of autosomal recessive character, which affects people of different ethnicities. The disease is characterized by the involvement of systemic exocrine glands and in most patients, the lung disease becomes the predominant pathology. The infection with P. aeruginosa is the leading cause of mortality in patients with CF. The Type III Secretion System (TTSS) of bacteria is expressed during acute disease and injects cytotoxic proteins inside the host cell. There is a great interesting in investigate the antibody response to P. aeruginosa in CF patients in order to diagnose a pulmonary infection or colonization before the culture. Then, preventive antibiotic treatment can be initiated before the installation of chronic lung infection. We investigated the antibody response (IgG + IgA + IgM) against TTSS proteins of P. aeruginosa by Western-blot. The study included 51 patients with CF, from 1.1 to 16.8 years attending the Pediatric Pulmonology Unit of Fernandes Figueira Institute (IFF) FIOCRUZ, Rio de Janeiro, for a period of approximately 2 years. Most patients had or 4 blood samples collected for antibody analyses. Samples were obtained with a mean interval of 6 months. The negative control group consisted of 28 non-CF individuals, from 2 to 17 years, attended at Pedro Ernesto University Hospital - HUPE - UERJ. The TTSS proteins were extracted from strains PAO1 and PAO&#916;ExsA (regulator of TTSS proteins expression) of P. aeruginosa. Positive and negative controls were used in all reactions. For the identification of TTSS proteins in the reaction we used antisera from mice immunized with the recombinant protein PcrV. Twelve (75%) of 16 CF patients considered not infected by P. aeruginosa had their first serology positive for "PopB" and 15 (93.75%) for "ExoS/ExoT. These results indicated that these patients were colonized or infected by P. aeruginosa. About 25% e 35,7% of negative control sera showed a weak reactivity with PopB or ExoS, respectively. The time between the first positive serology and the first isolation of P. aeruginosa in these patients ranged from 18 to 30 months. In conclusion, it is possible to make a serological diagnosis of pulmonary infection by P. aeruginosa before the isolation of the bacterium by culture.

The type IV secretion system can be classified as a large family of macromolecule transporters divided in three recognized sub-families involved in different bacterial functions. The major sub-family of T4SS is the conjugation system, which allows transfer of genetic material as a nucleoprotein via cell contact among bacteria. Analogously to bacterial conjugation, the T4SS can transfer genetic material from bacteria to eukaryotic cells; such is the case of T-DNA transfer of Agrobacterium tumefaciens to host plant cells. The system of effector proteins transport constitutes the second sub-family, being indispensable for infection processes of several mammalian and plants pathogens. The third sub-family corresponds to the DNA uptake/release system involved in genetic transformation competence, independently of cell contact, as it was described to the systems VirB/D4 from Campylobacter jejuni and ComB form Helicobacter pylori. Several essential features of T4SS are well known, but the knowledge in support of an uncomplicated classification or proper protein annotation of system subunits remains confusing, which in same cases can avoid making inferences about evolution of the system in bacterial species. The purpose of this work was to organize, classify and integrate the knowledge about T4SS through building a database devoted to this bacterial secretion system. The T4SS database was created using the SGBD MySQL and Perl programming language and with a web interface (HTML/CGI) that gives access to the database. Currently, this database hold genomic data from 43 bacteria and 10 plasmids acquired from the GenBank NCBI, these organisms comprise groups from Actionobacteria to Gram-negative Proteobacteria including symbiotic and pathogenic bacteria. By applying Bidirectional Best-Hits method was possible to get a core set of 75 clusters with 974 proteins involved in the T4SS. Also, during this procedure BlastP, Muscle e ClustalW algorithms were applied. The database was manually annotated supported by cross references built-in the T4SS annotation pages, such as the UniProtKB/Swiss-Prot, COG, InterPro and TCDB as well as by the methods for signal peptide and transmembrane regions prediction. All T4SS protein records scattered into 75 ortholog clusters were organized into five different classes of type IV secretion system proteins: (i) Type IVA Mpf/T4CP; (ii) Type IVA Dtr; (iii) F-type plasmid; (iv) IncP-1-type plasmid; (v) Type IVB Icm/Dot. All 974 proteins were annotated into 68 well-known families, which can be involved in conjugation, effector translocator, DNA uptake/release or even can be bifunctional proteins. Also, by using the Maximum Likelihood method were built 70 unrooted phylogenetic trees that represents just 70 clusters instead of 75, this is due to five clusters had only two protein sequences, five unrooted phylogenetic trees were built for each group of first hierarchical classification, one unrooted phylogenetic trees including proteins from archetype systems of all groups, one unrooted phylogenetic trees from 16S sequence of each organism and one rooted tree including a sequence from a Gram-positive bacteria as an external group. The phylogenetic analyses show that some proteins of T4SS are more divergent than others, which indicate that for a particular function few sequence mutations were needed, but other proteins required many sequence mutations to get another functions. Thus, these results proved that proteins belong to the same cluster show different functions: conjugation, DNA uptake/release or effector translocator. Consequently, it was possible verify that similar functions were grouped together within phylogenetic tree, which allowed to annotate a probable function of some uncharacterized proteins, that is possibly due to the sequence similarity may reveal a similar evolution to get the same function. Thus, the phylogenetic trees allowed confirming the protein annotation as well as inferring whether uncharacterized proteins would encompass a known function. The T4SS database will be an open access, given to the users searching and submission sequence tools, which will permit to get insights about classification and phylogeny of T4SS sequence of interest. T4SS Database is accessible at the URL http://www.t4ss.lncc.br. / O T4SS pode ser classificado como uma família de transportadores de macromoléculas envolvidos em diferentes funções bacterianas. A maior subfamília do T4SS é a do sistema de conjugação, o qual permite a transferência de material genético entre bactérias. Analogamente à conjugação, o sistema pode transferir material genético entre bactérias e eucariotos, tal como a transferência de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens. O sistema de transporte de proteínas efetoras constitui uma segunda subfamília do T4SS, sendo indispensável nos processos de infecção de vários patógenos de mamíferos e plantas. A última subfamília corresponde ao sistema DNA-uptake/release" que funciona independente de contato com uma célula alvo, representado pelos sistemas VirB/D4 de Campylobacter jejuni e ComB de Helicobacter pylori. Muitas características básicas do T4SS são bem conhecidas, entretanto o conhecimento para a classificação simples e intuitiva ou a anotação apropriada das proteínas ainda não está claro, impedindo em alguns casos estabelecer correlações evolutivas deste sistema em bactérias. O objetivo deste trabalho foi o de organizar, classificar e integrar o conhecimento do T4SS através da construção de um banco de dados especializado para este sistema secretório bacteriano. O banco de dados T4SS foi criado utilizando o SGBD MySQL e a linguagem de programação Perl e com uma interface web (HTML/CGI) que fornece acesso ao banco. Este banco consta atualmente com 43 genomas bacterianos e 10 plasmídeos obtidos do GenBank NCBI, estes organismos vão desde Actinobactérias até Proteobactérias Gram-negativas, incluindo simbiontes e patogênicos. Foi utilizada a metodologia do Bidirectional Best-Hits", com a qual foi possível obter um conjunto mínimo de 75 clusters" com 974 proteínas envolvidas no T4SS. Também, durante este procedimento foram utilizados os algoritmos BlastP, Muscle e ClustalW. O banco foi anotado manualmente utilizando referências cruzadas incluídas nas páginas de anotação do T4SS, tais como UniProtKB/Swiss-Prot, COG, InterPro e TCDB e métodos para predição de regiões de peptídeos sinal e transmembrana. As análises do banco T4SS permitiram criar uma classificação hierárquica e funcional para as proteínas do T4SS, consistindo em cinco grupos: (i) Type IVA Mpf/T4CP; (ii) Type IVA Dtr; (iii) F-type plasmid; (iv) IncP-1-type plasmid; (v) Type IVB Icm/Dot). As 974 proteínas foram anotadas em 68 famílias conhecidas, as quais podem estar envolvidas em conjugação, transferência de T-DNA, transferência de proteínas efetoras, DNA-uptake/release" ou bem serem proteínas bifuncionais. Também, através do método de máxima verossimilhança foram geradas 70 árvores filogenéticas não enraizadas (NR) representando apenas 70 clusters, já que cinco clusters apresentaram apenas duas seqüências de proteínas, cinco árvores filogenéticas NR foram criadas para cada grupo da primeira categoria hierárquica, uma árvore NR com representantes de todos os grupos, uma árvore NR gerada a partir das seqüências 16S de cada organismo e uma árvore de um cluster incluindo uma seqüência de bactéria Gram-positiva como grupo externo. As análises filogenéticas mostram que determinadas proteínas do sistema são mais divergentes que outras, indicando que para uma determinada função poucas mutações de seqüências foram necessárias, já outras proteínas precisaram de maiores mutações para adquirir outras funções. Por isso, verifica-se que proteínas de um mesmo cluster apresentam diferentes funções: conjugação, DNA-uptake/release", traslocadores de proteínas efetoras. Conseqüentemente, foi possível verificar que funções semelhantes se agruparam juntas nas árvores filogenéticas, permitindo anotar uma função provável das proteínas ainda não caracterizadas (unknown"), isto possivelmente devido a que em virtude de sua semelhança de seqüências, possivelmente evoluíram para realizar a mesma função. Assim, as arvores possuíram a finalidade de confirmar a anotação e contribuíram permitindo inferir se os unknown" ou probable" podem ser de uma determinada classificação funcional. O banco T4SS será de uso público, oferecendo ao usuário ferramentas de buscas e submissão de seqüências, as quais permitirão inferir respostas sobre a classificação e filogenia da seqüência T4SS de interesse. O banco de dados T4SS pode ser acessado na URL: http://www.t4ss.lncc.br.

A Fibrose Cística (FC) é uma doença letal, de caráter autossômico recessivo, que acomete populações de diferentes etnias. A doença caracteriza-se pelo comprometimento sistêmico das glândulas exócrinas e, na maioria dos pacientes, a doença pulmonar acaba tornando-se a patologia predominante. A infecção por P. aeruginosa é a principal causa de mortalidade dos pacientes com FC. O Sistema de Secreção Tipo III da bactéria é expresso na fase aguda da doença e é responsável por injetar proteínas citotóxicas no interior da célula eucariótica. Há um grande interesse em se investigar a resposta de anticorpos anti P. aeruginosa em pacientes com FC a fim de diagnosticar a colonização e ou infecção pulmonar antes da cultura, permitindo a antibioticoterapia preventiva, a fim de se evitar a infecção pulmonar crônica. Nesta tese, investigamos a resposta de anticorpos (IgG+IgM+IgA) contra as proteínas do SSTT de P. aeruginosa, através do Western-Blot. Participaram do estudo 51 pacientes com FC, de 1.1 a 16.8 anos acompanhados no Departamento de Pneumologia do Instituto Fernandes Figueira - FioCruz, durante um período aproximado de 2 anos. De cada paciente foram coletadas de 1 a 4 amostras de sangue, com intervalo médio de 6 meses entre as coletas. O grupo controle negativo consistiu de 28 indivíduos não fibrocísticos, de 2 a 17 anos, atendidos no Hospital Universitário Pedro Ernesto - HUPE UERJ. As proteínas do SSTT foram extraídas das cepas PAO1 e PAO&#916;ExsA (regulador da expressão do SSTT) de P. aeruginosa. Controles positivos e negativos foram utilizados em todas as reações. Para a identificação das proteínas do SSTT na reação utilizou-se antisoro de camundongos imunizados com a proteína recombinante PcrV. Doze (75%) dos 16 pacientes fibrocísticos considerados não infectados por P. aeruginosa tiveram a primeira sorologia positiva para PopB e 15 (93,75%) para ExoS/ExoT, indicando a colonização ou infecção por P. aeruginosa. Aproximadamente 25% e 35,7% dos soros do grupo controle mostraram reatividade fraca com PopB ou ExoS/ExoT, respectivamente. O tempo decorrido entre a primeira sorologia positiva e o primeiro isolamento de P. aeruginosa nestes pacientes variou de 18 a 30 meses. Concluindo, é possível fazer o diagnóstico sorológico da infecção pulmonar por P. aeruginosa antes do isolamento da bactéria pela cultura. / Cystic Fibrosis (CF) is a lethal disease of autosomal recessive character, which affects people of different ethnicities. The disease is characterized by the involvement of systemic exocrine glands and in most patients, the lung disease becomes the predominant pathology. The infection with P. aeruginosa is the leading cause of mortality in patients with CF. The Type III Secretion System (TTSS) of bacteria is expressed during acute disease and injects cytotoxic proteins inside the host cell. There is a great interesting in investigate the antibody response to P. aeruginosa in CF patients in order to diagnose a pulmonary infection or colonization before the culture. Then, preventive antibiotic treatment can be initiated before the installation of chronic lung infection. We investigated the antibody response (IgG + IgA + IgM) against TTSS proteins of P. aeruginosa by Western-blot. The study included 51 patients with CF, from 1.1 to 16.8 years attending the Pediatric Pulmonology Unit of Fernandes Figueira Institute (IFF) FIOCRUZ, Rio de Janeiro, for a period of approximately 2 years. Most patients had or 4 blood samples collected for antibody analyses. Samples were obtained with a mean interval of 6 months. The negative control group consisted of 28 non-CF individuals, from 2 to 17 years, attended at Pedro Ernesto University Hospital - HUPE - UERJ. The TTSS proteins were extracted from strains PAO1 and PAO&#916;ExsA (regulator of TTSS proteins expression) of P. aeruginosa. Positive and negative controls were used in all reactions. For the identification of TTSS proteins in the reaction we used antisera from mice immunized with the recombinant protein PcrV. Twelve (75%) of 16 CF patients considered not infected by P. aeruginosa had their first serology positive for "PopB" and 15 (93.75%) for "ExoS/ExoT. These results indicated that these patients were colonized or infected by P. aeruginosa. About 25% e 35,7% of negative control sera showed a weak reactivity with PopB or ExoS, respectively. The time between the first positive serology and the first isolation of P. aeruginosa in these patients ranged from 18 to 30 months. In conclusion, it is possible to make a serological diagnosis of pulmonary infection by P. aeruginosa before the isolation of the bacterium by culture.