Made available in DSpace on 2016-04-07T13:23:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 leonardo_matilde_ioc_dout_2013.pdf: 10262111 bytes, checksum: 343b14b4b2a15acbb6b250c4067d32ff (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os mosquitos Aedes albopictus (Skuse, 1894) e Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) apresentam significativa importância epidemiológica dentro da família Culicidae por serem os principais vetores da febre amarela e dos quatro sorotipos do vírus da dengue. As peptidases ou proteases são enzimas que clivam ligações peptídicas. No sistema digestivo de invertebrados as peptidases, especificamente aquelas da classe das serino-peptidases, são abundantes e participam de vários processos fisiológicos, desempenhando um papel principal na hidrólise de proteínas destinadas à nutrição. Estas enzimas podem apresentar características espécie-específicas e essas diferenças são respostas adaptativas a diferentes estilos de vida, ambientes e habilidade de sobrevivência entre as espécies. Neste trabalho descreve-se a caracterização das atividades proteolíticas detectadas em extratos totais das formas pré-imaginais de A. aegypti e A. albopictus por enzimografia em uma dimensão. A estabilidade da expressão de peptidases nessas espécies foi avaliada pela comparação do perfil proteolítico de formas larvais obtidas de ovos de insetos recém coletados no ambiente com ovos de insetos mantidos em colônia por longo período. Foram também comparados os perfis proteolíticos das pupas com seus respectivos imagos, bem como a estabilidade térmica das peptidases detectadas. Observaram-se complexos perfis de serino-peptidases do tipo tripsina em ambas as espécies vetoras Contudo esses perfis apresentam diferenças espécie-específicas e também diferenças entre os distintos estágios evolutivos dentro de uma mesma espécie. Também, neste trabalho, descreve-se a caracterização das atividades proteolíticas detectadas no intestino médio de fêmeas de A. albopictus alimentadas com açúcar bem como o primeiro mapa proteô mico e a identificação de peptidases por eletroforese bi-dimensional e espectrometria de massas neste órgão. São discutidas aqui as estratégias usadas para analisar as peptidases expressas nesse tecido. As proteínas expressas no intestino médio de A. albopictus foram identificadas por similaridade com as sequencias de genoma de A. aegypti e distintas ferramentas bioinformáticas foram usadas para obter informação funcional de muitas dessas sequencias que estão pobremente anotadas. Foram identificadas 59 proteínas entre v Resumo as quais três serino-peptidases, e dessas, duas do tipo tripsina e uma quimiotripsina. Os resultados obtidos nos permitiram atribuir de maneira confiável um local de expressão para os genes de tripsina, tripsina alfa e quimotripsina. Em outras palavras, podemos afirmar que os genes acima mencionados se expressam no intestino médio de fêmeas adultas de A. albopictus alimentadas com açúcar. Este achado representa um pequeno, mas importante passo, para a atribuição funcional, ao nível de proteína, de genes codificantes para serino-peptidases do tipo tripsina e quimiotripsina no gênero Aedes / The mosquitoes Aedes albopictus (Skuse, 1894) and Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) have significant epidemiological importance within the family Culicidae because they are the main vectors of the yellow fever virus and the four serotypes of Dengue virus. Peptidases or proteases are enzymes that hydrolyze peptide bonds. In the digestive system of invertebrates, the peptidases, specifically those from the class of serine peptidases, are abundant and participate in various physiological processes, playing a major role in the hydrolysis of proteins destined to nutrition. These enzymes may have species-specific characteristics, and such differences reflect adaptive responses to different lifestyles and environments. In this work we describe the characterization, using zymography, of the proteolytic activities detected in total extracts of larval forms of A. aegypti and A. albopictus. The stability of expression of peptidases in these species was evaluated by comparing the proteolytic profile of larval forms obtained from eggs of newly collected insects to that from eggs of insect kept in colony for a long period. We also compared the proteolytic profiles of pupae as well as the thermal stability of the peptidases detected. Complex profiles of trypsin-like serine peptidases were observed in both species. However, these profiles differ between species and also differences between the different evolutionary stages were detected within the same species. Also, in this work, we describe the characterization of the proteolytic activities detected in the midgut of A. albopictus females fed on sugar as well as the first proteome map and proteomic identification of peptidases in this organ, using two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry. The strategies used to analyze the proteases expressed in this tissue are discussed here. The proteins expressed in the midgut of A. albopictus were identified by similarity with the genome sequences of A. aegypti and various bioinformatic tools were used to obtain functional information for many of these sequences that are poorly annotated. We identified 59 proteins including three serine peptidases, and among these, two types of trypsin-like and one chymotrypsin. The results obtained here allowed us to reliably assign a localization for the expression of trypsin, trypsin-alpha and chymotrypsin genes. In other words, we can say that the above mentioned genes are expressed in the midgut of adult females of A. albopictus fed with sugar. This finding represents a small but important step for the functional assignment, at the protein level, of the genes coding for trypsin-like and chymotrypsin serine peptidases of the Aedes genus.

Orientador: Prof. Dr. Iara José de Mesias Reasson / Orientador: Prof. Dr. Angelica B. Winter Boldt / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Medicina Interna. Defesa : Curitiba, 23/05/2014 / Inclui referências / Linha de pesquisa: Associação genética a doenças / Resumo: MASP-2, a serina protease 2 associada à lectina ligante de manose ou ficolinas, é uma proteína-chave na ativação da via das lectinas do complemento. Diversos polimorfismos do gene MASP2 estão associados com concentrações séricas ou grau de atividade funcional de MASP-2. Neste trabalho, investigamos uma possível associação entre polimorfismos de MASP2 e concentrações séricas de MASP-2 com a suscetibilidade à febre reumática (FR) e a cardiopatia reumática crônica (CRC). Foram haplotipados 11 polimorfismos de MASP2 utilizando PCR multiplex sequência-específica em 145 pacientes com história de FR provenientes do sul do Brasil (103 com CRC e 42 sem acometimento cardíaco [FRo]) e 290 controles saudáveis. As concentrações de MASP-2 foram determinadas por ensaio de imunoadsorbância enzimática em 145 pacientes e 145 controles. Os polimorfismos p.377A e p.439H, associados à baixa produção de MASP-2, foram negativamente associados à CRC (p=0,02, OR=0,25). Em contraste, haplótipos com quatro polimorfismos, localizados do intron 9 ao exon 12 (CDVR) e associados a concentrações intermediárias de MASP-2, aumentaram a suscetibilidade a CRC (p=0,02, OR=4,9). Apesar disso, as concentrações de MASP-2 foram mais baixas nos pacientes, do que nos controles, provavelmente devido ao consumo da proteína pela ativação da via das lectinas (medianas 253 vs. 321 ng/ml respectivamente, p<0,0001). Logo, polimorfismos de MASP2 associados à concentração sérica de MASP-2 podem atuar como moduladores no desenvolvimento da FR. A elucidação do papel desempenhado por MASP-2 na suscetibilidade a FR poderá auxiliar no desenho de estratégias de prevenção e tratamento da doença. Palavras-chave: Febre reumática; cardiopatia reumática crônica; MASP-2; polimorfismos de MASP2 / Abstract: MASP-2, the serine protease 2 associated with mannose-binding lectin or ficolins, is a key protein in the activation of the lectin pathway of complement. Several MASP2 gene polymorphisms have been associated with serum levels or degree of functional activity of MASP-2. In this work, we investigated a possible association between MASP2 polymorphisms and MASP-2 serum levels with the susceptibility to Rheumatic Fever (RF) and Rheumatic Heart Disease (RHD). We haplotyped 11 MASP2 polymorphisms with multiplex sequence-specific PCR in 145 patients with history of RF from south Brazil (103 with RHD and 42 without cardiac lesion [RFo]) and 290 healthy controls. MASP-2 levels were determined by enzyme-linked immunoadsorbance assay in 145 patients and 145 controls. The p.377A and p.439H polymorphisms, associated with low MASP-2 production, were negatively associated with RHD (p=0.02, OR=0.25). In contrast, haplotypes comprising four polymorphisms, located from intron 9 to exon 12 (CDVR) and associated with intermediate MASP-2 concentrations, increased the susceptibility to RHD (p=0.02, OR=4.9). Nevertheless, MASP-2 levels were lower in patients than in controls, probably due to protein consumption by the activation of the lectin pathway (medians 253 vs. 321 ng/ml, p<0.0001). Thus, MASP2 polymorphisms associated MASP-2 production may act as immune modulators in the development of RF. The elucidation of the role of MASP-2 in RF susceptibility might help in the design of strategies for RF prevention and treatment. Keywords: Rheumatic fever; rheumatic heart disease; MASP-2; MASP2 polimorphysms.

Made available in DSpace on 2016-05-11T13:02:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 mariana_almeida_ioc_dout_2014.pdf: 10914971 bytes, checksum: 979497712c5a77cc8a8934caa85ef74e (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os parasitos do gênero Leishmania, protozoários veiculados por insetos flebotomíneos e responsáveis pelas leishmanioses visceral e tegumentar, se encontram amplamente distribuídos pelo mundo. O potencial adaptativo destes protozoários é um reflexo da diversidade biológica do gênero Leishmania, em especial a espécie Leishmania (Viannia) braziliensis, que se encontra em diversos biomas acometendo diferentes animais e vetores de acordo com a região que se encontra. Os estudos biológicos e de expressão gênica de fatores de virulência do parasito são importantes para auxiliar na elucidação destes mecanismos de adaptação. Portanto este trabalho tem o objetivo de avaliar variações biológicas e na expressão de genes de proteinases de L. (V.) braziliensis, cepa MCAN/BR/1998/R619 e seus clones. Inicialmente foi realizada uma análise do genoma de L. (V.) braziliensis frente aos de L. (L.) infantum, L. (L.) major e L. (L.) mexicana, com o propósito de identificar características espécie-específicas que possam contribuir para compreender as diferenças fenotípicas ou de virulência entre as espécies estudadas. Foi observado que todos os cromossomos das quatro espécies apresentam genes de proteases em diferentes quantidades; alto grau de conservação entre os alelos de proteases; e as sequências dos genes de proteases dos parasitos não apresentam similaridade entre as de genes de proteases de mamíferos. Portanto, a análise dos genomas das Leishmania spp. indica uma grande diversidade de genes da protease nestas espécies Posteriormente foram obtidos clones da cepa em estudo oriundos de um único promastigota e avaliados seu comportamento in vitro e o potencial biológico destes parasitos na infecção experimental in vitro. A cepa em estudo reúne vários clones de parasitos e estas produzem padrões distintos de infecção in vitro de macrófagos de camundongos BALB/c; com produção de citocinas no sobrenadante de forma heterogênea. Algumas são menos indutoras de IL-1\03B2 e IL-6, e as citocinas TNF-\03B1 e IL-12p70, bem como o óxido nítrico, são induzidas de forma equilibrada pelos clones estudados. Uma análise de agrupamento permitiu a classificação de dois grupos distintos dos clones obtidos neste estudo. O conjunto de dados que mais influenciou para a definição destes grupos foi os relativos à infecção em macrófagos peritoneais murinos. Isto ressalta a possibilidade de haver outros marcadores, não contemplados neste estudo, que influenciam no sucesso da adaptação da cepa em estudo ao hospedeiro vertebrado. Também foi observado que os clones da cepa expressam diferentemente os genes das quatro classes de proteinases. Os amastigotas expressam mais proteinases que os promastigotas. Entre os promastigotas há maior expressão de aspártico e metaloproteinase enquanto que os amastigotas expressam mais metalo e serino proteinases. A diversidade da espécie vista entre isolados pôde ser comprovada também dentro de uma única cepa. O conjunto de resultados agrupados aqui enfatiza a capacidade da L. (V.) braziliensis utilizar a plasticidade de seu genoma para modular seu fenótipo e aumentar suas chances de sobrevivência nos hospedeiros / Parasites of the genus Leishmania are protozoans transmitted during the bite of female phlebotomines and are the causative agents of visceral or tegumentary leishmaniasis, presenting a worldwide distribution. The adaptative potential of these protozoa is a reflection of their biological diversity, especially that of the species Leishmania (Viannia) braziliensis, which is found in many biomes and affect different animals and vectors. Studies about the biology of parasites and their expression of virulence factor genes are important to help on the elucidation of their mechanisms of adaptation. Therefore, the purpose of this work is to evaluate the the biology and expression of protease genes of L. (V.) braziliensis, strain MCAN/BR/1998/R619, checking for variations among clones of this strain. Initially, we performed a comparative analysis of L. (V.) braziliensis genome against L. (L.) infantum, L. (L.) major and L. (L.) mexicana genomes to identify species-specific features that could potentially relate to characteristic phenotypic and virulence traits of the species. We could observe that protease genes are present in all chromosomes of the studied species, but in different frequencies. Additionally, a high degree of alleles conservation was noted, as well as a prominent distinction among the protease gene sequences of parasites and those of mammals, with no similarity detected. Thus, the analysis of genome of Leishmania spp. pointed to a great diversity of protease genes in these species. In an additional analysis, we obtained clones from single promastigotes isolated from L. (V.) braziliensis strain MCAN/BR/1998/R619 and evaluated their behaviors in vitro as well as their potential to cause infection in BALB/c macrophage cultures. Our results suggested that this strain is, in fact, composed by many clones with different characteristics, as they are able to promote distinct patterns of infection in macrophages in vitro, with a heterogenic production of cytokines by these cells. While some clones induced lower IL-1β or IL-6 production, TNF-α, IL-12p70 and nitric oxide production were homogeneously induced by the clones. A cluster analysis led to the classification of two distinct groups of clones in this study. Data analysis indicated that the capacity to promote infection in murine macrophages was the feature that most contributed to the clusters definition. However, the possibility remain that other features, no analyzed in the present study, could also play important roles regarding the success the studied strain’s adaptation to the vertebrate host. It was also observed that the clones differentially expressed genes related to the four main protease classes of Leishmania: cysteine, serine, metallo and aspartic-proteinases. Generally, the amastigotes expressed higher levels of proteinases-related mRNAs than promastigotes. Also, it was observed that promastigotes express more aspartic and metalloproteinases mRNAs, while amastigotes express more metallo and serine proteinases mRNAs. Therefore, a reflection of the features diversity already reported among isolates of L. (V.) braziliensis can also be noted among clones of a single strain. The results gathered herein emphasize the ability of L. (V.) braziliensis to apply its genome plasticity to modulate its phenotype and, thus, increase its odds to survive in the vertebrate host.

Orientadora : Profª. Drª. Iara José de Messias-Reason / Co-orientadora : Profª. Drª. Angelica B. Winter Boldt / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 23/02/2015 / Inclui referências / Área de concentração: Análises clínicas / Resumo: A hanseníase é causada pelo patógeno intracelular obrigatório Mycobacterium leprae, que infecta principalmente macrófagos e células Schwann do hospedeiro. A lectina ligante de manose (MBL) e as ficolinas (FCNs) reconhecem padrões de açúcares e resíduos acetilados (PAMP), respectivamente, em uma ampla variedade de patógenos, incluindo o M. leprae. Este reconhecimento desencadeia a transativação das serina-proteases 1 e 2, associadas a MBL (MASP-1 e MASP-2), e em seguida, a ativação da via das lectinas do sistema complemento. O gene MASP1 apresenta diversos polimorfismos que estão associados à modulação das concentrações de MASP-1 e de mais duas outras proteínas, resultantes de processamento alternativo do pré-mRNA: MASP-3 e a forma não-enzimática MAp44, ambas envolvidas na regulação negativa do sistema complemento, através da competição pelos sítios de ligação aos PAMP nas moléculas de reconhecimento. Neste estudo, avaliamos possível associação entre polimorfismos do gene MASP1 e concentrações séricas de MASP-1, MASP-3 e MAp44 em 389 indivíduos da população brasileira e 210 da dinamarqueses (segundo grupo controle), assim como com a susceptibilidade à hanseníase em 196 pacientes e 193 controles do Sul do Brasil. As amostras foram genotipadas por PCR sequência-específica multiplex para g.8113G>A (rs7609662) e g.8795C>T (rs13064994), localizados no intron 01, e g.61897C>G (rs72549262), g.62223C>T (rs1109452) e g.62224G>A (rs850314), localizados no exon 12 do gene MASP1. Os níveis séricos das proteínas foram quantificados com ensaio imunofluorimétrico cronometrado (TRIFMA). Pacientes com hanseníase apresentaram concentrações séricas de MASP-3 e MAp44 menores do que controles (medianas: 4603 ng/ml vs. 5606 ng/ml para MASP-3, p<0.005; 1732 vs. 2350 ng/ml para MAp44, p<0.0001). Pacientes com a forma lepromatosa de hanseníase também apresentaram concentrações reduzidas de MASP-3 e MAp44, quando comparados a não-lepromatosos (P=0,0016 e P<0,0001). Houve também uma associação entre a presença do alelo T para o SNP rs1109452 e níveis séricos elevados de MASP-1 e diminuídos de MASP-3 nos três diferentes grupos analisados. O haplótipo GC CCG se associou com a susceptibilidade à hanseníase (P=0,028, OR=1,43 [IC95%=1,04-1,94]). O haplótipo do exon 12 apresentou associação com os níveis de MASP-3 em controles (P=0,012) e no grupo comparação (P=0,0006), e os genótipos destas variantes também apresentaram associação com níveis de MAp44 em pacientes (P=0,023), e com os níveis de MASP-3 nos controles (P=0,024) e no grupo de dinamarqueses (P<0,0001). Concentrações baixas de MAp44 e MASP-3 em pacientes com hanseníase podem ser decorrentes de polimorfismos no gene MASP1. Este efeito pode estar aliado a possível consumo das proteínas no processo da doença e/ou baixa produção das mesmas nesses indivíduos. Palavras-chave: MASP1, MASP-3, MAp44, serina protease associada a MBL, complemento, via das lectinas, hanseníase. / Abstract: Leprosy is caused by the obligate intracellular pathogen Mycobacterium leprae, which infects mainly macrophages and Schwann cells of the host. The mannose-binding lectin (MBL) and Ficolins (FCNs) recognize sugar patterns and acetylated molecules (PAMP) respectively in a wide range of pathogens including M. leprae. This recognition triggers the transactivation of mannan-binding lectin serine protease 1 and 2 (MASP-1 e MASP-2) followed by the activation of complement system lectin pathway. MASP1 gene presents several polymorphisms associated to the modulation of MASP-1 concentration as well as two other proteins resulting from alternative processing of pre-mRNA: MASP-3 and the non-enzimatic MAp44, both involved in the down-regulation of complement system by competing for PAMP binding sites at the recognition molecules. Here, we aimed to assess possible associations between MASP1 gene polymorphisms and the serum levels of MASP-1, MASP-3 and MAp44 in 389 individuals from Brazil and 210 from Denmark (second control group), as well as with susceptibility to Leprosy in 196 patients and 193 control subjects from South Brazil. Samples were genotyped by multiplex sequence-specific PCR for g.8113G>A (rs7609662) and g.8795C>T (rs13064994) located in intron 01 and g.61897C>G (rs72549262), g.62223C>T (rs1109452) and g.62224G>A (rs850314) located in exon 12 of MASP1 gene. Protein serum levels were quantified by time-resolved immunofluorometric assays (TRIFMA). Leprosy patients presented lower MASP-3 and MAp44 serum levels (median: 4603 ng/ml vs. 5606 ng/ml for MASP-3, p<0.005; 1732 vs. 2350 ng/ml for MAp44, p<0.0001). Patients presenting the lepromatous clinical form of Leprosy also showed lower MASP-3 and MAp44 serum levels when compared to non-lepromatous patients (P=0.0016 and P<0.0001). There was an association between the T allele of rs1109452 with higher MASP-1 and lower MASP-3 serum levels in all three groups. The GC CCG haplotype was related to susceptibility to Leprosy (P=0.028, OR=1.43 [CI95%=1.04-1.94]). The exon 12 haplotype distribution is associated to MASP-3 levels in controls (P=0.012) and Danish (P=0.0006), and the genotypes of this variants, also revealed an association with MAp44 levels in patients (P=0.023), with MASP-3 levels in controls (P=0.024) and MASP-3 levels in the Danish cohort group (P<0,0001). Low MASP-3 and MAp44 serum levels in leprosy may be conferred by haplotypes/genotypes of MASP1 gene in addition to possible protein consumption and/or low production in leprosy patients. Key-words: MASP1, MASP-3, MAp44, MBL-associated serine-protease, complement, lectin pathway, leprosy.

Submitted by Fabíola Silva (fabiola.silva@famerp.br) on 2016-10-04T14:10:11Z No. of bitstreams: 1 anacarolinabuzzostefanini_dissert.pdf: 2564521 bytes, checksum: fc9c0d25882e400f1002a6ed99657319 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-04T14:10:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 anacarolinabuzzostefanini_dissert.pdf: 2564521 bytes, checksum: fc9c0d25882e400f1002a6ed99657319 (MD5) Previous issue date: 2014-10-08 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Introduction - The head and neck squamous cell carcinomas (HNSCCs) are among the most frequent types of cancer, with more than 600,000 new cases per year worldwide. The five-year survival rate is low in this disease and one of the reasons is that patients with tumours in early stages frequently exhibit few symptoms, resulting in diagnosis delay and severe morbidity. The understanding of the molecular pathways involved in the initiation and progression of these tumors is therefore important not only for understanding their biology, but also for the development of more effective preventive and therapeutic approaches. In previous studies of our group, the kallikrein 8 gene (KLK8) was observed differentially expressed in laryngeal carcinomas and its surgical margins, which highlights its potential as a tumor marker, similar to another member of KLK family, kallikrein 3 or PSA. Objectives and Methodology - The overall objective of the present study was to investigate the participation of the kallikrein 8 in the HNSCC development. The specific objectives included (a) to investigate the phylogenetic relationships among KLKs genes using the MEGA program, (b) to analyze, by real time PCR, the expression pattern of the KLK8 gene and its most abundant isoform in HNSCC and their surgical margins, (c) to evaluate the effect of elevated expression of KLK8 in HNSCC secretome, using conditioned medium and proteomic and metabolomic approaches, (d) to develop molecular homology modeling of protein hK8 by bioinformatics tools. Results - The phylogenetic analysis of human kallikrein genes and their isoforms confirmed the idea that these genes evolved from a single common ancestor by successive tandem duplications and chromosomal rearrangements facilitated by repetitive elements. The results of gene expression analysis in tumor tissues showed that the variant 1 of KLK8 has significantly reduced levels in HNSCC, unlike the other five variables. The ectopic expression of this variant resulted in changes of cell morphology, increased proliferation, viability and migratory capacity, but no alterations in invasiveness. The data from cells with ectopic expression of KLK8 revealed small differences in their proteomes compared to control cells. Otherwise, these cells exhibited changes in their glycolytic pattern and in the effect of their secretome on the metabolism of other cells. Conclusion - This study was important to answer some questions and raise others questions about the role of KLK8 gene in carcinomas of the head and neck. For the first time, differences in expression of KLK8 isoforms were observed in HNSCC and the effects of ectopic KLK8 expression on the proteome and the secretome of HNSCC cells. / Introdução - Os carcinomas epidermóides de cabeeça e pescoco (CECPs) estão entre os mais frequentes tipos de câncer, com mais de 600 mil novos casos por ano no mundo e taxas de sobrevida reduzidas. Além de sua incidência e mortalidade altas, os CECPs são clinicamente relevantes por causa de sua morbidade, em geral decorrente do diagnóstico tardio. O entendimento das vias moleculares envolvidas na iniciação e na progressão desses tumores é, portanto, importante, não somente para o entendimento de sua biologia, mas também para o desenvolvimento de abordagens preventivas e terapêuticas mais eficazes. Em estudos prévios do nosso grupo, o gene da calicreína 8 (KLK8) foi observado com expressão diferencial entre carcinomas de laringe e suas margens cirúrgicas, o que evidencia seu potencial como marcador tumoral, como ocorre com outro membro de sua família, a calicreína 3 ou PSA. Objetivos e Metodologia – O presente projeto teve como objetivo geral investigar a participação da calicreína 8 no desenvolvimento de CECPs. Seus objetivos específicos compreenderam (a) investigar as relações filogenéticas entre os genes KLKs com o auxílio do programa MEGA, (b) analisar, por PCR em tempo real, o padrão de expressão do gene KLK8 e de sua isoforma mais abundante em CECP e em tecidos normais correspondentes, (c) avaliar o efeito da expressão elevada de KLK8 no secretoma de células de CECP, utilizando ensaios com meio condicionado e abordagens proteômicas e metabolômicas, (d) desenvolver a modelagem molecular por homologia da proteína hK8 com ferramentas de bioinformática. Resultados – A análise filogenética da família de genes das calicreínas humanas e suas isoformas confirmou a idéia de que esses genes evoluíram de um único ancestral comum por sucessivas duplicações em tandem e rearranjos cromossômicos facilitados por elementos repetitivos. Os dados de expressão gênica em tecidos tumorais mostraram que a variante 1 de KLK8 apresenta níveis significativamente reduzidos em CECP, ao contrário das outras cinco variantes. A indução permanente in vitro desta variante resultou em mudança da morfologia celular, aumento de proliferação, viabilidade e capacidade migratória, sem aumento concomitante de invasividade. Os dados obtidos sobre essas células com expressão ectópica de KLK8 revelaram pequenas diferenças em seu proteoma quando comparadas com células controle. Por outro lado, exibiram modificação no padrão glicolítico e no potencial de seu secretoma de afetar o metabolismo de outras células. Conclusão - O presente estudo foi importante para responder a alguns questionamentos e levantar outras questões sobre a função do gene KLK8 em carcinomas de cabeça e pescoço. O estudo identificou, pela primeira vez, as diferenças de expressão entre as isoformas de KLK8 em CECP e os efeitos da indução de sua expressão sobre o proteoma e o secretoma de suas células.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-29 / O Aedes aegypti é o vetor mais importante de arboviroses humana sendo responsável pelas transmissões de dengue e febre amarela urbana. As enzimas tipo tripsina apresentam um importante papel na digestão de estádios de vida larval e adulto de Ae. aegypti. No presente trabalho, nós identificamos as duas enzimas tipo tripsina majoritárias do intestino médio larval através da construção de uma biblioteca de fragmentos de cDNA de tripsina. Elas são AAEL005607 e AAEL006371, com frequências de expressão de 29,3% e 20%, respectivamente. Análises por PCR semi-quantitativo mostraram que a tripsina AAEL005607 foi transcrita em todos os instars larval, mas a tripsina AAEL006371 apareceu somente nos 3º e 4º instar larvais. A fim de confirmar os dados de transcrição, enzimas tipo tripsina do intestino médio de larvas de 4º instar foram purificadas por cromatografias de afinidade, troca iônica e fase reversa. A tripsina purificada apresentou massa molecular de 28 kDa por SDS-PAGE. Sua sequência de aminoácidos parcial nos permitiu sugerir que a atividade de tripsina é codificada pela sequência AAEL005607. A tripsina purificada (AAEL005607) exibiu um valor de Km de 36,4 μM para o substrato Tosyl-Gly-Pro-Arg-pNa e foi fortemente inibida por AaTI e HiTI, ambos inibidores de tripsina, com valores de Ki de 0,94 pM e 160 pM, respectivamente. Em conclusão, pela primeira vez, a enzima digestiva majoritária de 4º instar larval de Ae. aegypti foi purificada e caracterizada. / Aedes aegypti is the most important vector of human arboviral diseases and it is responsible for dengue and urban yellow fever transmissions. Trypsin-like enzymes plays an important role in the Ae. aegypti adult and larval life stages digestion. In the present work, we identified the two major trypsin-like enzymes of Ae. aegypti larval midgut through the trypsin cDNA fragments library construction. They are AAEL005607 and AAEL006371, with expression frequencies of 29.3% and 20%, respectively. Semi quantitative PCR analysis showed that the AAEL005607 was transcripted in all larval instars, but AAEL006371 appeared only in 3rd and 4th larval instars. In order to confirm the transcription data, trypsin-like enzymes from 4th instar larvae of Ae. aegypti midgut were purified by affinity, ionic exchange and reversedphase chromatographies. Purified trypsin presented molecular mass of 28 kDa by SDS-PAGE. Its partial amino acid sequence allowed us to suggest that the trypsin activity is encoding by AAEL005607 sequence. The purified trypsin (AAEL005607) showed Km value of 36.4 μM for Tosyl-Gly-Pro-Arg-pNa substrate and was strongly inhibited by AaTI and HiTI, both trypsin inhibitors, with Ki of 0.94 pM and 160 pM, respectively. In conclusion, for the first time, the major digestive enzyme of 4th larval instar of Ae. aegypti was identified and characterized. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Biblioteca da Faculdade de Farmácia (bff@ndc.uff.br) on 2018-03-12T17:36:57Z No. of bitstreams: 1 PEDRO HENRIQUE RODRIGUES DE ALENCAR AZEVEDO.pdf: 15048741 bytes, checksum: a121d29e5dc4898c7b8e4a85def01e12 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-12T17:36:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PEDRO HENRIQUE RODRIGUES DE ALENCAR AZEVEDO.pdf: 15048741 bytes, checksum: a121d29e5dc4898c7b8e4a85def01e12 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As calicreínas teciduais humanas (KLKs) compreendem uma família de 15 enzimas serina proteases (KLKs 1-15) amplamente encontradas nos tecidos humanos. Em diversas patologias como a dermatite atópica, psoríase, síndrome de Netherton, câncer de ovário, mama e testículos, as KLKs encontram-se em concentrações elevadas. Por exemplo, as KLKs 5 e 7 estão mais abundantemente expressadas na pele, na qual estão envolvidas com o processo de descamação da mesma, e também presentes em alguns tipos de carcinomas. Dessa forma, as KLKs 5 e 7 são consideradas importantes alvos terapêuticos para o tratamento de doenças onde elas encontram-se superexpressadas, enfatizando a existência de somente um fármaco comercialmente disponível como inibidor de KLK. Nesse contexto, o trabalho descreve a síntese de 3 séries de compostos peptideomiméticos, incorporando o cerne estatina e diferentes resíduos de aminoácidos, planejados como candidatos a inibidores das enzimas serina proteases do KLKs 5 e 7. Os compostos finais foram obtidos utilizando uma rota sintética eficiente tendo como reação-chave a formação da ligação peptídica entre o cerne estatina e cloridratos de aminoésteres, previamente sintetizados. Os compostos sintetizados foram identificados por técnicas de Ressonância Magnética Nuclear, Infravermelho e Espectrometria de massas de alta resolução e os produtos finais serão avaliados em testes in vitro de inibição das enzimas KLKs / Human tissue kallikreins (KLKs) comprise a family of 15 serine protease enzymes (KLKs 1-15) widely found in human tissues. In several pathologies such as atopic dermatitis, psoriasis, Netherton syndrome, ovarian, breast and testis cancer, KLKs are in high concentrations. For example, KLKs 5 and 7 are more abundantly expressed in the skin, in which they are involved in the desquamation process, and also present in some types of carcinomas. Thus, KLKs 5 and 7 are considered important therapeutic targets for the treatment of diseases where they are over expressed, emphasizing the existence of only one commercially available drug as a KLK inhibitor. In this context, the work describes the synthesis of three series of peptideomimetic compounds incorporating the statin core and different amino acid residues, designed as candidates for inhibitors of the serine protease enzymes of KLKs 5 and 7. The final compounds were obtained using an efficient synthetic route based on the reaction of formation of the peptide bond between the statin core and previously synthesized amino acid hydrochlorides. The synthesized compounds were identified by Nuclear Magnetic Resonance, Infrared and High Resolution Mass Spectrometry techniques and the final products will be evaluated in in vitro inhibition assays of the KLKs enzymes

A Lectina Ligadora de Manose (MBL) é uma proteína que reconhece carboidratos na superfície microbiana levando à ativação do sistema complemento. Este processo é mediado por Serino Proteases tal como a MASP-2. O complexo MBL/MASP-2 é responsável pela formação da C3 convertase C4bC2b. Os níveis séricos de MBL e a MASP-2 (genes MBL2 e MASP-2, respectivamente) são geneticamente determinados, e podem ser influenciados pela presença de polimorfismos em um único nucleotídeo SNPs em genes codificadores destas proteínas. OBJETIVO: Determinar os níveis séricos e polimorfismos gênicos da MBL e MASP-2 em uma amostra da população brasileira. MÉTODOS: 294 amostras de doadores de sangue [mediana = 36,51 ± 10,56; 18-63 anos; 91/294 (30,95%) sexo feminino, 203/294 (69,05%) sexo masculino] foram genotipadas para os SNPs do éxon 1 (MBL2): SNPs localizados nos códons 52 (ArgCys), 54 (GlyAsp) e 57 (GlyGlu) e SNP Asp371Tyr (D371Y, A>C ) do gene da MASP-2 (éxon 9). Foi utilizado o ensaio de temperatura de dissociação para éxon 1 (MBL2) e sequenciamento direto dos promoters (H/L, X/Y e P/Q, nas posições -550, -221 e +4, respectivamente). A combinação das variantes do éxon 1 MBL2 foram agrupadas e denominadas alelo O e o genótipo selvagem foi denominado A. O éxon 9 da MASP-2 foi genotipado através da plataforma TaqMan. RESULTADOS: MBL2: 58,5% A/A, 36,39% A/O e 5,1% O/O; promoters: 13% H/H, 39% H/L, 48% L/L; 2% X/X, 26% X/Y, 72% Y/Y; 52% P/P, 37% P/Q, 11% Q/Q; haplótipos encontrados: 15% LXPA, 28% HYPA, 8% LYQO, 12% LYPO, 11% LYPA, 22% LYQA e 4% HYPO. Quanto à produção, 56,12% produziram altos níveis de MBL, 30,61% níveis médios e 13,27% níveis baixos ou insuficientes de MBL. Para MASP-2: 38,78% A/A, 44,56% A/C e 16,67% C/C. CONCLUSÃO: A prevalência (5,1%) SNP O/O do éxon 1 (MBL2) está de acordo com a literatura brasileira, é semelhante à européia (4%) e japonesa (5%), menor que a africana (10-14%). Níveis séricos de MBL corresponderam aos genótipos determinados. Esta é a primeira avaliação da frequência do SNP D371Y do gene MASP-2 em uma população brasileira. Os resultados deste trabalho fornecem subsídios para estudos sobre repercussão de MBL e MASP-2 em situações clínicas / BACKGROUND: Mannose-binding lectin (MBL) is a protein that recognizes carbohydrates on microbial surface leading to complement activation. This process is mediated by MBL-associated serine proteases, such as MASP-2. MBL/MASP-2 complex is responsible for generating the C3 convertase C4bC2b. Both MBL and MASP-2 levels are genetically determined, and can be influenced by the presence of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the genes encoding for these proteins (namely MBL2 and MASP-2). OBJTECTIVE: to determine MBL and MASP-2 serum levels and the frequencies of MBL2 and MASP-2 gene polymorphisms in a Brazilian population sample. METHODS: 294 blood donor samples [median age = 36.51 ± 10.56 years, range 18-63, 91/294 (31%) females and 203/294 (69%) males] were genotyped for MBL2 exon 1 SNPs: single point mutation in codon 52 (ArgCys), 54 (GlyAsp) and 57 (GlyGlu), and MASP-2 polymorphism Asp371Tyr (D371Y, A>C) (exon 9). A melting temperature assay was used to perform the genotyping of MBL2 SNPs. The combination of variants of MBL2 were grouped together as allele O, wild types were indicated as A. Exon 1 promoters were evaluated by direct genotype sequencing- alleles H/L, X/Y and P/Q (positions -550, -221 and +4, respectively). MASP-2 exon 9 genotyping was performed by using TaqMan pre-developed assay. RESULTS: MBL2: 58.5% A/A, 36.39% A/O, 5.1% O/O; promoters: 13% H/H, 39% H/L, 48% L/L; 2% X/X, 26% X/Y, 72% Y/Y; 52% P/P, 37% P/Q, 11% Q/Q; haplotypes: 15% LXPA, 28% HYPA, 8% LYQO, 12% LYPO, 11% LYPA, 22% LYQA and 4% HYPO. MASP-2: 38.78% A/A, 44.56% A/C and 16.67% C/C. CONCLUSION: The prevalence (5.1%) of O/O genotype of MBL2 exon 1 SNPs in our population is in accordance with Brazilian reports, similar to European (4%) and Japanese (5%); lower than Africans (10-14%). There is a correlation between MBL serum levels and genotyping. Moreover, this is the first report of D371Y MASP-2 polymorphism frequency in a Brazilian population. Our data may contribute to new insights on the role of MBL and MASP-2 in clinical conditions

A Lectina Ligadora de Manose (MBL) é uma proteína que reconhece carboidratos na superfície microbiana levando à ativação do sistema complemento. Este processo é mediado por Serino Proteases tal como a MASP-2. O complexo MBL/MASP-2 é responsável pela formação da C3 convertase C4bC2b. Os níveis séricos de MBL e a MASP-2 (genes MBL2 e MASP-2, respectivamente) são geneticamente determinados, e podem ser influenciados pela presença de polimorfismos em um único nucleotídeo SNPs em genes codificadores destas proteínas. OBJETIVO: Determinar os níveis séricos e polimorfismos gênicos da MBL e MASP-2 em uma amostra da população brasileira. MÉTODOS: 294 amostras de doadores de sangue [mediana = 36,51 ± 10,56; 18-63 anos; 91/294 (30,95%) sexo feminino, 203/294 (69,05%) sexo masculino] foram genotipadas para os SNPs do éxon 1 (MBL2): SNPs localizados nos códons 52 (ArgCys), 54 (GlyAsp) e 57 (GlyGlu) e SNP Asp371Tyr (D371Y, A>C ) do gene da MASP-2 (éxon 9). Foi utilizado o ensaio de temperatura de dissociação para éxon 1 (MBL2) e sequenciamento direto dos promoters (H/L, X/Y e P/Q, nas posições -550, -221 e +4, respectivamente). A combinação das variantes do éxon 1 MBL2 foram agrupadas e denominadas alelo O e o genótipo selvagem foi denominado A. O éxon 9 da MASP-2 foi genotipado através da plataforma TaqMan. RESULTADOS: MBL2: 58,5% A/A, 36,39% A/O e 5,1% O/O; promoters: 13% H/H, 39% H/L, 48% L/L; 2% X/X, 26% X/Y, 72% Y/Y; 52% P/P, 37% P/Q, 11% Q/Q; haplótipos encontrados: 15% LXPA, 28% HYPA, 8% LYQO, 12% LYPO, 11% LYPA, 22% LYQA e 4% HYPO. Quanto à produção, 56,12% produziram altos níveis de MBL, 30,61% níveis médios e 13,27% níveis baixos ou insuficientes de MBL. Para MASP-2: 38,78% A/A, 44,56% A/C e 16,67% C/C. CONCLUSÃO: A prevalência (5,1%) SNP O/O do éxon 1 (MBL2) está de acordo com a literatura brasileira, é semelhante à européia (4%) e japonesa (5%), menor que a africana (10-14%). Níveis séricos de MBL corresponderam aos genótipos determinados. Esta é a primeira avaliação da frequência do SNP D371Y do gene MASP-2 em uma população brasileira. Os resultados deste trabalho fornecem subsídios para estudos sobre repercussão de MBL e MASP-2 em situações clínicas / BACKGROUND: Mannose-binding lectin (MBL) is a protein that recognizes carbohydrates on microbial surface leading to complement activation. This process is mediated by MBL-associated serine proteases, such as MASP-2. MBL/MASP-2 complex is responsible for generating the C3 convertase C4bC2b. Both MBL and MASP-2 levels are genetically determined, and can be influenced by the presence of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the genes encoding for these proteins (namely MBL2 and MASP-2). OBJTECTIVE: to determine MBL and MASP-2 serum levels and the frequencies of MBL2 and MASP-2 gene polymorphisms in a Brazilian population sample. METHODS: 294 blood donor samples [median age = 36.51 ± 10.56 years, range 18-63, 91/294 (31%) females and 203/294 (69%) males] were genotyped for MBL2 exon 1 SNPs: single point mutation in codon 52 (ArgCys), 54 (GlyAsp) and 57 (GlyGlu), and MASP-2 polymorphism Asp371Tyr (D371Y, A>C) (exon 9). A melting temperature assay was used to perform the genotyping of MBL2 SNPs. The combination of variants of MBL2 were grouped together as allele O, wild types were indicated as A. Exon 1 promoters were evaluated by direct genotype sequencing- alleles H/L, X/Y and P/Q (positions -550, -221 and +4, respectively). MASP-2 exon 9 genotyping was performed by using TaqMan pre-developed assay. RESULTS: MBL2: 58.5% A/A, 36.39% A/O, 5.1% O/O; promoters: 13% H/H, 39% H/L, 48% L/L; 2% X/X, 26% X/Y, 72% Y/Y; 52% P/P, 37% P/Q, 11% Q/Q; haplotypes: 15% LXPA, 28% HYPA, 8% LYQO, 12% LYPO, 11% LYPA, 22% LYQA and 4% HYPO. MASP-2: 38.78% A/A, 44.56% A/C and 16.67% C/C. CONCLUSION: The prevalence (5.1%) of O/O genotype of MBL2 exon 1 SNPs in our population is in accordance with Brazilian reports, similar to European (4%) and Japanese (5%); lower than Africans (10-14%). There is a correlation between MBL serum levels and genotyping. Moreover, this is the first report of D371Y MASP-2 polymorphism frequency in a Brazilian population. Our data may contribute to new insights on the role of MBL and MASP-2 in clinical conditions