Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-03-22Bitstream added on 2014-06-13T20:16:36Z : No. of bitstreams: 1 wilson_c_me_sjrp.pdf: 535059 bytes, checksum: 514dc7e27d5f6dc577b4bea8fe8ef6de (MD5) / Os venenos de serpentes são constituídos por uma complexa mistura de substâncias que apresentam características e proporções variáveis de acordo com as diferentes espécies, distribuição geográfica dos indivíduos, variação ontogenética e sexual e alimentação. Essa variabilidade na composição dos venenos é de grande interesse na pesquisa e desenvolvimento de novos fármacos, pois um elevado grau de variação aumenta o número de seus potenciais usos. De acordo com essas propriedades dos venenos de serpentes, no presente estudo procurou-se comparar algumas variações existentes nas frações do veneno de Bothrops leucurus, uma serpente da família Viperidae que se caracteriza por produzir um veneno com toxicidade variável devido a diferentes fatores. A toxicidade do veneno deve-se principalmente à sua fração proteica, constituída em sua maior parte por proteinases (metalo proteinases e serino proteinases), fosfolipases e L-aminoácido oxidases que apresentam efeitos potenciais no sistema homeostático, além de possuírem ação citotóxica, antimicrobiana e inflamatória. Neste estudo foram realizados ensaios cromatográficos para a purificação de algumas dessas enzimas e a caracterização das mesmas para a verificação de suas propriedades proteolíticas e fibrinogenolíticas, além do potencial antimicrobiano do veneno bruto. Foram purificadas duas metalo proteinases de 28 e 65 kDa, respectivamente, uma serino protease de 35 kDa, uma LAAO de 66 kDa e duas fosfolipases com 14 e 15kDa. Constatou-se que a metalo protease de 65 kDa apresentou a maior atividade fibrinogenolítica. Além disso, foi realizado o teste da mínima concentração inibitória com o veneno bruto para verificar seu efeito antimicrobiano contra uma bactéria gram-negativa e outra gram-positiva, sendo que nesta última, apresentou atividade inibitória / The snake’s venoms are constituted by a mixture of substances that exhibit character and variable proportion according to different species, geographic distribution of individuals, ontogenetic and sexual and feed variability. That variability on poisons compositions is of great interest on research and development of new drugs, because a high degree of variation increases the number of potential use. According to those properties of snake’s poisons in the actual study it was sought to compare some variations existents on fractions of Bothrops leucurus venom, a snake of family Viperidae that is characterized by production of poison with variable toxicity due different factors. The poison toxicity should principally its protein fraction consisting mostly by proteinases (metalloproteinases and serine protease), phospholipases and L-aminoacid oxidases showing potential effects on homeostatic system, beyond having cytotoxic action, bactericidal and inflammatory. This study describe chromatographic separation of some enzymes and characterization of it and to verification of its proteolytic and fibrinogenolytic properties further the bactericidal potential of crude venom. Was purified two metalloproteinases of 28 and 65 kDa respectively, a serine protease of 35 kDa, a LAAO of 66 kDa and two phospholipases of 14 and 15kDa. It was found metalloproteinase of 65 kDa show a higher fibrinogenolytic activity. Futhermore crude venom was carried out the test of minimum inhibitory concentration with crude venom to check its antimicrobial effect against a gram-negative bacterium and other gram-positive, whereas in the latter showed inhibitory effect

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-12Bitstream added on 2014-06-13T19:10:41Z : No. of bitstreams: 1 anderlini_rp_me_botfm.pdf: 335403 bytes, checksum: 9368ef42c305b23ce4f7419eafcd9557 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A administração de soros heterólogos de origem eqüina constitui o único tratamento para os acidentes ofídicos, porém estes são capazes de induzir reações de hipersensibilidade. Novos processos de hiperimunização em animais alternativos vêm sendo desenvolvidos, juntamente à ferramentas de destoxificação dos venenos e novas alternativas de adjuvantes. No presente trabalho, foi utilizado veneno de Crotalus durissus terrificus nativo (VN) e irradiado com Co60 (VIr), em quatro diferentes protocolos de hiperimunização, para uma avaliação quinzenal do perfil imunológico dos grupos de ovinos pela técnica de ELISA. Os animais foram avaliados clinicamente todos os dias e pesados a cada 14 dias. Ao final, foram inspecionados em frigorífico para aprovação de consumo e os rins, analisados histologicamente. Os soros obtidos foram avaliados quanto à capacidade de neutralização por meio de testes “in vitro”. O momento quatro (M4) apresentou o maior nível de titulação nos quatro grupos, porém o G1, inoculado com VN associado ao adjuvante incompleto de Freund (AIF), apresentou o maior nível quando comparados com os demais grupos, inoculados com VN associado à sílica nanoestruturada SBA-15 (G2), VIrr associado ao AIF (G3) e VIrr associado a SBA-15. Não houve diferença estatística entre os grupos em relação ao ganho de peso. Apenas um animal apresentou lesão no local de aplicação. Todos as carcaças obtiveram um carimbo de aprovação para consumo do Serviço de Inpeção Federa (SIF)l. Não houve alterações histológicas renais características de envenenamento crotálico. Os soros produzidos pelos quatro grupos foram capazes de neutralizar o efeito letal do veneno de Crotalus durissus terrificus, observados pelos testes de neutralização. O protocolo convencional de imunização utilizado no grupo um (G1) mostrou-se mais eficiente na neutralização do efeito letal quando comparados com os demais protocolos. / The administration of heterologous antivenoms raised in horses is considered the only treatment for envenoming by venomous animals. However, it causes hypersensitivity reactions. New hyperimmunization processes in alternatives animals have been developed, associated to detoxication of venoms an new alternatives of adjuvants. In the present study it was used the natural (NV) and Co- 60-irradiated (IrrV) Crotalus durissus terrificus venom, in four differents protocols for a evaluation every fifteen days of the immunological response of the four ovine groups by the ELISA test. The clinical evaluation of the animals was performed and the weigth obteined every fourteen days, submited to a frigorific inspection and histological kidneys analysis. The neutralization capacity of the serum produced was evaluated in “in vitro” test. The fourth moment presented the major titles for all groups. However, the first group (G1), inoculated with NV associated with Freund’s incomplet adjuvant (FIA) and aluminiun hidroxide presented the major titles when compared with the other ones, inoculated with NV associated to SBA-15 (G2), IrrV associated with FIA (G3) and IrrV associated with SBA-15 (G4). There was no estatistic difference between the groups concerning the weigth analysis. Only one animal presented lesion at the inoculation site. All the carcass obtained the consume aprovation stamp of the Federal Inspection Service (FIS). There was no kidney lesions on histological analysis. The four serum produced were able to neutralize the letal effect of Crotalus durissus terrificus venom, showed by the neutralization test. The convencional immunization protocol used for the first group (G1) showed more efficient neutralization capacity when compared with the others groups.

Made available in DSpace on 2015-10-06T13:03:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-25. Added 1 bitstream(s) on 2015-10-06T13:18:37Z : No. of bitstreams: 1 000849914.pdf: 1571481 bytes, checksum: a13d0db3f8c4f4bc8ed5e8460b1d9f2d (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-09-10Bitstream added on 2014-06-13T18:20:27Z : No. of bitstreams: 1 gasparotto_vpo_me_botfm.pdf: 823732 bytes, checksum: 72bbebb42d3239b78a28393a5aa3b0b7 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O estudo avaliou a viabilidade in vitro do biomaterial “Selante de Fibrina derivado de veneno de serpente” (SF), como arcabouço para células tronco mesenquimais (CTMs) de ratos. O SF é um material caracterizado como adesivo biológico, e foi produzido e fornecido pelo Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos, CEVAP, Brasil. As CTMs foram coletadas a partir da medula óssea de fêmures e tíbias de ratos e foram caracterizadas por meio de citometria de fluxo com auxilio de marcadores positivos: CD 44 e CD 90 (CTMs) e marcador negativo: CD 34 (células tronco hematopoiéticas). Cultivos foram induzidos para diferenciarem-se em linhagens específicas (osteogênico, condrogênico e adipogênico). Para avaliação do crescimento in vitro e a viabilidade celular em conjunto ao biomaterial foram utilizadas microscopia óptica de luz invertida, microscopia de fluorescência e microscopia eletrônica de varredura e transmissão. O SF em contato com as CTMs não induziu a diferenciação espontânea para as linhagens osteogênica, condrogênica e adipogênica. As diferentes técnicas de avaliação microscópica utilizadas mostraram que o SF foi capaz de realizar a captura e manutenção das CTMs e houve interação das células com o interior e superfície do biomaterial. Portanto, a coleta, o cultivo e a caracterização das CTMs de ratos foram possíveis. O SF mostrou-se eficiente como arcabouço biológico e interagiu com as células tronco mesenquimais mantendo-as viáveis, oferecendo-se como uma ferramenta de uso clínico-cirúrgico alternativa para processos regenerativos visando terapias mais eficientes / This study evaluated the in vitro viability of biomaterial Fibrin Sealant (FS) derived from snake venom as a scaffold for rat mesenchymal stem cells (MSCs). The FS is characterized as a biological adhesive material, and is produced and was supplied by the Center for the Study of Venoms and Venomous Animals, CEVAP, Brazil. MSCs were collected from the bone marrow of femurs and tibias of rat and were characterized using flow cytometry with CD 44 and CD 90 positive markers (MSC) and CD34 negative marker (mononuclear stem cells). Cultivations were induced to differentiate into specific cell lineage (osteogenic, chondrogenic and adipogenic). To evaluate the in vitro growth and cell viability with the biomaterial were used inverted light optical microscopy, fluorescence microscopy and scanning electron microscopy and transmission. The SF did not cause the spontaneous differentiation in contact with MSCs to osteogenic, chondrogenic and adipogenic lineage. Different microscopy techniques showed that the SF was able to accomplish the capture and maintenance of MSCs and there was interaction with the cell interior and surface of the biomaterial. Finally, the collection, cultivation and characterization of rat MSCs were possible. The SF was effective as a biological scaffold and interacted with the MSCs keeping them viable offering itself as a tool for clinical and surgical alternative providing clinical and surgical therapies more efficient for regenerative processes

A resistência bacteriana à antibióticos tem se tornado um grave problema em saúde pública. Os mecanismos de resistência estão emergindo e sendo disseminados globalmente, devido às deficiências nas condições sanitárias e uso indiscriminado de antibióticos em humanos e animais. Escherichia coli e Staphylococcus aureus estão entre as bactérias mais presentes quando se trata de resistência a antimicrobianos. Infecções causadas por Leptospira interrogans possuem limitadas opções de tratamento e pouco se progrediu a cerca desta situação nos últimos anos. O Brasil possui uma fauna rica em espécies de serpente. Dentre as serpentes peçonhentas que causam a maior parte dos acidentes ofídicos no país encontram-se os gêneros Bothrops e Crotalus. As peçonhas desses animais possuem uma diversidade de bioativos com funções biológicas, bioquímicas e farmacológicas. Por isso, diversos estudos têm sido realizados com essas substâncias a fim de se desenvolver novos fármacos. Em meio às diversas funções já descobertas sobre os bioativos das peçonhas, o potencial antimicrobiano tem sido alvo de importantes pesquisas visto o cenário mundial de resistência bacteriana. / Bacterial resistance to antibiotics has become a serious problem in public health. Resistance mechanisms are emerging and being disseminated globally due to deficiencies in health conditions and the indiscriminate use of antibiotics in humans and animals. Escherichia coli and Staphylococcus aureus are among the most present bacteria when it comes to antimicrobial resistance. Leptospira interrogans infections have limited treatment options and little progress has been made about this in last years. Brazil has an rich ecosystem in snake species. Among the venomous snakes that cause most of the ophidian accidents in the country are the genera Bothrops and Crotalus. The venom of these animals has a diversity of bioactives with biological, biochemical and pharmacological functions. Therefore, several studies have been done with these substances to develop new drugs. Regarding the several functions already discovered about venom bioactives, the antimicrobial potential has been the object of important researchs, considering the world scenario of bacterial resistance. / Dissertação (Mestrado)

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Chapter II: In the present study, a metalloproteinase named BpMPI was isolated from Bothropoides pauloensis snake venom and its biochemical, enzymatic and immunochemical characteristics were determined. BpMPI was purified in two chromatography steps on ion exchange resins CM-Sepharose Fast flow and Sephacryl S-300. This protease was homogeneous on SDS-PAGE and showed a single chain polypeptide of 23 kDa under reducing conditions. The primary structure of the enzyme showed high similarity with other SVMPs enzymes from snake venoms. BpMPI showed proteolytic activity upon azocasein and bovine fibrinogen and was inhibited by EDTA, 1,10 phenantroline and β-mercaptoethanol. Moreover, this enzyme showed stability at neutral and alkaline pH and it was inactivated at high temperatures. BpMPI was able to hidrolyse glandular and tecidual kallikrein substrates, but was unable to act upon factor Xa and plasmin substrates. The enzyme did not able to induce local hemorrhage in the dorsal region of mice even at high doses. Immunochemistry studies showed that BpMPI was high immunogenic and the antibodies anti-BpMP-I were very efficient to neutralize the hemorrhagic activity and systemic alterations induced by Bothropoides pauloensis snake venom. / Capítulo II: No presente estudo, uma metaloproteinase denominada BpMPI foi isolada da peçonha da serpente Bothropoides pauloensis e suas características bioquímicas, enzimáticas e imunoquímicas foram determinadas. BpMPI foi purificada utilizando dois passos cromatográficos em resinas de troca iônica CM-Sepharose Fast Flow e Sephacryl S-300. Esta protease mostrou-se homogênea em SDS-PAGE apresentando uma única cadeia polipeptídica de 23 kDa sob condições redutoras. A estrutura primária da enzima mostrou alta similaridade com outras enzimas SVMPs de venenos de serpentes. BpMPI mostrou atividade proteolítica sobre azocaseina e fibrinogênio bovino e foi inibida por EDTA, 1,10 fenantrolina e β- mercaptoetanol. Além disso, esta enzima apresentou estabilidade em pH neutro ou alcalino e foi inativada em temperaturas elevadas. BpMPI também foi capaz de hidrolisar os substratos da calicreína glandular e tecidual, mas foi incapaz de hidrolisar os substratos do fator Xa e plasmina. A enzima não foi capaz de induzir hemorragia local na região dorsal de camundongos mesmo em altas doses. Estudos imunoquímicos demostraram que os anticorpos anti-BpMP-I foram eficientes em neutralizar a atividade hemorrágica e as alterações sistêmicas induzidas pela peçonha de Bothropoides pauloensis. / Mestre em Genética e Bioquímica

Interest in research about Bothrops snake is growing, since the venom of these animals are used for therapeutic purposes. This study aimed to determine the bacteria in the oral cavity and venom in snakes of the species Bothrops atrox of a commercial breeding. We used 12 samples taken with the aid of sterile swab in the sheath region of prey, in animals with stomatitis, 30 samples of secretion in the mouth of healthy snakes and their dehydrated venom. The Samples were plated on agar- agar XLD blood and subsequently held If Gram staining and catalase tests and mannitol for Gram positive bacteria identification. For the identification of Gram negative bacteria was employed biochemical screening with Rugai medium Lysine. In the 30 healthy animals and six samples of venom the following Gram negative bacteria were isolated: Proteus spp (34.15%), Escherichia coli (26.84%), Citrobacter spp (14.63%), Serratia spp (9.75 %) and Enterobacter spp (7.31%) and Gram positive: Staphylococcus spp (4.88%) and Bacillus cereus (2.44%). In the 12 snakes with stomatitis Escherichia coli was isolated (26.31%), Citrobacter spp (21.05%), Proteus spp (15.78%), Salmonella (10.52%), and Staphylococcus spp (26.31%). Fisher\'s exact test showed a significant difference between samples of Staphylococcus spp from healthy snakes and serpents with stomatitis, suggesting that this microrganism is related to the cases of stomatitis in Bothrops atrox. / O interesse por pesquisas com serpentes do gênero Bothrops está em crescimento, já que a peçonha destes animais é utilizada para fins terapêuticos. Objetivou-se avaliar as bactérias presentes na cavidade oral e na peçonha em serpentes da espécie Bothrops atrox de um criatório comercial. Utilizaram-se 12 amostras colhidas com auxílio de swab esterilizado na região da bainha da presa, em animais que apresentavam estomatite, 30 amostras de secreção da cavidade oral em serpentes saudáveis e as respectivas peçonhas desidratadas, totalizando seis amostras de peçonha. As amostras foram encaminhadas ao Laboratório de Doenças Infectocontagiosas em meio de transporte Stuart. As amostras foram semeadas em Ágar-sangue e Ágar XLD, posteriormente realizou-se Coloração de Gram e provas de Catalase e Manitol para identificação de bactérias Gram positivas, já para identificação das bactérias Gram negativas empregou-se triagem bioquímica com o Meio de Rugai com Lisina, Kit comercial para identificação de Enterobactérias. Nos 30 animais saudáveis e seis amostras de peçonha foram isoladas as seguintes bactérias Gram negativas: Proteus spp (34,15%), Escherichia coli (26,84%), Citrobacter spp (14,63%), Serratia spp (9,75%) e Enterobacter spp (7,31%) e Gram positivas: Staphylococcus spp (4,88%) e Bacillus cereus (2,44%). Nas 12 serpentes com estomatite isolou-se Escherichia coli (26,31%), Citrobacter spp (21,05%), Proteus spp (15,78%), Salmonella spp (10,52%) e o Staphylococcus spp (26,31%). Através do Teste exato de Fisher encontrou-se diferença significativa de Staphylococcus spp entre amostras de serpentes saudáveis e serpentes com estomatite, o que sugere que este microrganismo está relacionado com os casos de estomatite em Bothrops atrox. / Mestre em Ciências Veterinárias

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / CHAPTER II: The snake venom is composed by a diversity of biomolecules with many actions on physiological processes. The serine peptidases are a group of proteases present in the constitution of the venom, capable of interfering on several points of hemostasis. Some serine peptidases has thrombin-like activity, what makes them targets on the development of therapeutics agentes on the treatment of many hemostatic disorders. In this study, a recombinant thrombin-like serine peptidase called rBpSP-II was obtained from the cDNA of the venom gland of the snake Bothrops pauloensis and biochemically characterized. The cDNA correspondent to rBpSP-II was cloned on the pPICZαA vector and inserted on the methylotrophic yeast Pichia pastoris KM71H for the heterologous expression. This enzyme showed single band when analised on SDS-PAGE with approximated molecular mass of 44,5 kDa under reducing conditions. The enzyme rBpSP-II showed clotting activity on bovine plasma and proteolytic activity on fibrinogen, cleaving exclusively the Aα chain. The evaluation of rBpSP-II activity on chromogenic substrates showed that the enzyme has thrombin-like activity due to its capacity to hydrolyze the thrombin substrate. / CAPÍTULO II: A peçonha de serpente é composta por uma diversidade de biomoléculas com inúmeras ações sobre os processos fisiológicos. As serinoproteases são um grupo de proteases presentes na constituição da peçonha, capazes de interferir em diversos pontos da hemostasia. Algumas serinoproteases possuem atividade semelhante à trombina, o que as tornam alvos de interesse no desenvolvimento de agentes terapêuticos no tratamento de desordens hemostáticas. Neste estudo, uma serinoprotease thrombin-like recombinante denominada rBpSP-II foi obtida a partir do cDNA da glândula da peçonha da serpente Bothrops pauloensis e caracterizada bioquimicamente. O cDNA correspondente à rBpSP-II foi clonado no vetor pPICZαA e inserido na levedura metilotrófica Pichia pastoris KM71H para a realização da expressão heteróloga. Esta enzima apresentou banda única quando analisada em SDS-PAGE com massa molecular aproximada de 44.5 kDa sob condições redutoras. A rBpSP-II apresentou atividade coagulante sobre plasma bovino e atividade proteolítica sobre o fibrinogênio, clivando preferencialmente a cadeia Aα. A avaliação da atividade da rBpSP-II sobre substratos cromogênicos demonstrou que a enzima possui atividade thrombin-like devido a sua capacidade de hidrolisar o substrato da trombina. / Mestre em Genética e Bioquímica

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Proteases are enzymes widely found in all five life being kingdoms. These proteolytic enzymes have been studied and can be used as therapeutic tools due to their actions on physiopathologic events. Metalloproteinase are hydrolytic zinc-binding dependent enzymes which interfere in physiological processes. Snake venom metalloproteinase are widely studied animal toxins. They are divided into classes (PI, PII and PIII) and PI metalloproteinase are composed of a pro-domain and a catalytic domain in its structure. In the present work, we demonstrated the biochemical and functional characteristics of a PI- metalloproteinase (BpMP-II) isolated from B. pauloensis venom. BpMP-II was purified in three chromatography steps on cation exchange resin CM-Sepharose Fast flow, filtration Sephacryl S-300 and anion exchange Capto-Q. The isolated enzyme was homogeneous on SDS-PAGE under reduction and non-reduction conditions, with a molecular weight of 23kDa determined by MALDI-TOF mass spectrometry. The isoeletric focalization demonstrated a slight acid pI (6,1) of BpMP-II. The partial sequence of protein was determined by MS/MS (MALDI-TOF/TOF) and showed high structural similarity with others SVMPs as well as a significant score match. BpMP-II showed high proteolytic activity upon azocasein and bovine fibrinogen and was inhibited by EDTA, 1,10 phenantroline and β-mercaptoethanol. Moreover, this enzyme showed stability at neutral and alkaline pH and it was inactivated at temperatures higher than 60oC. Concentrations higher than 20μg of BpMP-II was able to decrease tEnd cells viability. A slight increase in creatine kinase (CK) levels was noticed when BpMP-II was administrated an intramuscular route on mice. Therefore, the present work permitted the identification and characterization of a molecule with great therapeutic potential. / Proteases são enzimas abundantemente encontradas em todos os cinco grandes reinos de seres vivos. Essas enzimas proteolíticas provenientes da natureza têm sido alvos de estudos com a finalidade de buscar ferramentas de uso terapêutico por atuarem em diversos processos fisiopatológicos. Metaloproteases são enzimas proteolíticas da classe das hidrolases que dependem da ligação de um metal em seu sítio ativo (geralmente o zinco) para exercer suas atividades. Essas enzimas participam de diversos eventos fisiológicos e patológicos. As metaloproteases de peçonha de serpentes (SVMPs) estão entre as toxinas animais mais estudadas. Elas são divididas em classes (PI, PII e PIII) de acordo com a composição estrutural e a presença de domínios. As metaloproteases da classe PI contêm um pró-domínio e o domínio catalítico em sua estrutura. No presente trabalho, nós descrevemos as características bioquímicas e funcionais de uma metaloprotease da classe PI denominada Bothrops pauloensis Metalloproteinase-II (BpMP-II), isolada da peçonha da serpente Bothrops pauloensis. BpMP-II foi purificada utilizando-se três passos cromatográficos em resinas de troca catiônica CM-Sepharose Fast Flow, coluna de gel filtração Sephacryl S-300 e resina de troca aniônica HisTrap Capto-Q. A enzima isolada apresentou-se homogênea em eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 12,5% sob condições redutoras e não-redutoras, com uma massa molecular de 23kDa determinada por espectrometria de massas MALDI-TOF. O ensaio de focalização isoelétrica resultou em um pI levemente ácido de 6,1 para a BpMP-II. A sequência parcial da proteína determinada por MS/MS (MALDI TOF/TOF) apresentou alta similaridade estrutural com outras SVMPs com score bastante significativo. BpMP-II mostrou alta atividade proteolítica sobre azocaseína sob diferentes condições experimentais e sobre o fibrinogênio bovino com variação de dose, pH. BpMP-II foi inibida por EDTA, 1,10 fenantrolina (agentes quelantes) e β-mercaptoetanol (agente redutor ligação S-S). Além disso, esta protease apresentou estabilidade em pH neutro ou alcalino e foi inativada em temperaturas elevadas (60ºC). BpMP-II mostrou ser citotóxica para células tEnd em concentrações acima de 20μg/μL. Um leve aumento nos níveis de creatina quinase (CK) foi observado quando injetada intramuscularmente em camundongos. Assim, o presente trabalho permitiu identificar e caracterizar uma molécula com grande potencial de aplicação terapêutica. / Mestre em Genética e Bioquímica

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CAPÍTULO II: Peçonhas de serpentes são uma mistura complexa de compostos orgânicos e inorgânicos, proteínas e peptídeos, tais como as aminotransferases, acetilcolinesterases, hialuronidases, L-aminoácido-oxidases, fosfolipases A2, metaloproteases, serinoproteases, lectinas, desintegrinas, entre outros. As fosfolipases A2 influenciam direta ou indiretamente no efeito fisiopatológico no envenenamento, pois além de sua participação na digestão das presas, elas apresentam várias outras atividades como ação hemolítica indireta, neurotoxicidade, cardiotoxicidade, ação agregadora de plaquetas, atividades anticoagulante, edematogênica, miotóxica e inflamatória. Neste trabalho, descrevemos a caracterização funcional de BaltMTx, uma PLA2 de Bothrops alternatus que inibe a agregação plaquetária e apresenta efeito bactericida. A purificação de BaltMTx foi realizada por uma combinação de três passos cromatográficos (cromatografia de troca iônica em DEAE-Sephacel, seguido de cromatografia de interação hidrofóbica em Phenyl-Sepharose, e cromatografia de afinidade em Heparina HiTrap™ HP). A proteína foi purificada até à homogeneidade, tal como avaliado pelo seu perfil de migração em SDS-PAGE, corado com azul de Coomassie, que mostrou uma massa molecular de cerca de 15 kDa sob condições redutoras e cerca de 25 kDa em condições não redutoras. BaltMTx mostrou um efeito inibidor específico sobre a agregação plaquetária induzida por epinefrina em plasma humano rico em plaquetas, de uma maneira dose dependente. Todavia, apresentou pouco ou nenhum efeito sobre a agregação plaquetária induzida por colágeno e adenosinadifosfato. BaltMTx, também, mostrou atividade antibacteriana contra Staphylococcus aureus e Escherichia coli. Altas concentrações de BatlMTx estimulou a proliferação de Leishmania (Leishmania) infantum e Leishmania (Viania) braziliensis. BaltMTx induziu a produção de mediadores inflamatórios tais como IL-10, IL-12, TNF-α e NO. BaltMTx apresenta grande interesse médico, tanto como uma nova ferramenta para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos para a prevenção e tratamento de distúrbios trombóticos, quanto como agente bactericida. / CHAPTER II: Snake venoms are a complex mixture of organic and inorganic compounds, proteins and peptides such as aminotransferases, acetylcholinesterase, hyaluronidases, L-amino acid oxidase, phospholipase A2, metalloproteases, serine proteases, lectins, disintegrins, and others. Phospholipase A2 directly or indirectly influence the pathophysiological effect on envenomation, as well as their participation in the digestion of the prey. They have several other activities such as hemolytic indirect action, cardiotoxicity, aggregating of platelets, anticoagulant, edema, myotoxic and inflammatory activities. In this work, we describe the functional characterization of BaltMTx, a PLA2 from Bothrops alternatus that inhibits platelet aggregation and present bactericidal effect. The purification of BaltMTx was carried out through three chromatographic steps (ion-exchange on a DEAE-Sephacel column, followed by hydrophobic chromatography on Phenyl–Sepharose and affinity chromatography on HiTrap™ Heparin HP). The protein was purified to homogeneity as judged by its migration profile in SDS–PAGE stained with coomassie blue, and showed a molecular mass of about 15 kDa under reducing conditions and approximately 25 kDa in non-reducing conditions. BaltMTx showed a rather specific inhibitory effect on platelet aggregation induced by epinephrine in human platelet-rich plasma in a dose-dependent manner, whereas it had little or no effect on platelet aggregation induced by collagen or adenosine diphosphate. BaltMTx also showed antibacterial activity against Staphylococcus aureus and Escherichia coli. High concentrations of BatlMTx stimulated the proliferation of Leishmania (Leishmania) infantum and Leishmania (Viania) braziliensis. BaltMTx induced production of inflammatory mediators such as IL-10, IL-12, TNF-α and NO. BaltMTx could be of medical interest as a new tool for the development of novel therapeutic agents for the prevention and treatment of thrombotic disorders as well as bactericidal agent. / Dissertação (Mestrado)