Die embryonale Gonade ist bei Säugetieren das einzige bipotente Organ, das sich während der Geschlechtsbestimmung in Hoden oder Eierstock differenziert. Nach der Spezifikation produziert sie geschlechtsspezifische Hormone, die wichtige morphologische, physiologische und Verhaltensänderungen auslösen und schließlich zu reifen Fortpflanzungsorganen führen, die für die Fortpflanzung der Art unerlässlich sind. Trotz der evolutionären Bedeutung der Gonadenfunktion gibt es erhebliche Entwicklungsunterschiede zwischen den Arten, deren molekulare Mechanismen weitgehend unerforscht sind. Zur Untersuchung dieser Mechanismen wurden Einzelzell-Omics-Techniken (scRNA- und scATAC-seq) an sich entwickelnden Gonaden eingesetzt, um molekulare Faktoren für interspezifische Unterschiede während der Geschlechtsdifferenzierung zu analysieren. Bekannte Zelltypen wurden in Hoden und Eierstöcken von Schweinen (mit medullären Strängen), Mäusen (ohne medulläre Stränge), Kaninchen (mit verzögerter Meiose der Keimzellen) und Maulwürfen (mit Ovotestes) zu geschlechtsdimorphen Zeitpunkten charakterisiert. Interartspezifische Vergleiche zeigten sowohl konservierte als auch artspezifische Ereignisse auf den Ebenen der dynamischen Genexpression, Co-Expressionsnetzwerke und zellulären Kommunikation. Expressionsdaten wurden mit epigenomischen Daten integriert, um genregulatorische Netzwerke (GRNs) abzuleiten und die regulatorischen Mechanismen zu klären. Analysen zeigten die Einbeziehung artenspezifischer Transkriptionsfaktoren in konservierte GRNs und identifizierten mutmaßliche cis-regulatorische Elemente, die mit artspezifisch exprimierten Genen verknüpft sind. Die Studie legt nahe, dass unterschiedliche Kontrollmechanismen die Meiose in ovariellen Keimzellen über Arten hinweg initiieren und dass der Metabolismus steroidogener Enzyme zu einzigartigen Entwicklungsmerkmalen bei Kaninchen beitragen könnte. / In mammals, the embryonic gonad is the only bipotential organ, differentiating into either testis or ovary during sex determination. Once specified, it produces sex-specific hormones that induce key morphological, physiological, and behavioral changes, leading to mature reproductive organs essential for species perpetuation. Despite the evolutionary importance of gonadal function, significant developmental plasticity exists across species, with underlying molecular mechanisms largely unexplored. To address this, single-cell omics techniques (scRNA- and scATAC-seq) were employed on developing gonads to investigate molecular contributors to interspecies differences during sex differentiation. Known cell types were characterized in testes and ovaries of pigs (exhibiting medullary cords), mice (lacking medullary cords), rabbits (displaying delayed meiosis of germ cells), and moles (forming ovotestes) at sexually dimorphic time points. Interspecies comparative analyses revealed both conserved and species-specific events at the levels of dynamic gene expression, co-expression networks, and cellular communication. Expression data were integrated with epigenomic data to infer gene regulatory networks (GRNs), clarifying regulatory mechanisms governing these events. Analyses revealed species-specific transcription factors in conserved GRNs and identified putative cis-regulatory elements linked with species-specific expressed genes. The study suggests diverse controls initiate meiosis in ovarian germ cells across species and that steroidogenic enzyme metabolism may contribute to unique developmental features in rabbits. Overall, this study advances the understanding of mammalian gonad differentiation and highlights how gene expression program evolution has contributed to mammalian phenotype diversity.

Zusammenfassung Die molekularbiologischen Untersuchungen der variablen Genabschnitte der Immunglobulingene von Lymphomzellen zweier Patienten mit kutanen B-Zell-Lymphomen wurden in der vorliegenden Arbeit mittels Einzel-Zell-PCR-Technik durchgeführt. Die erfolgte Analyse galt bevorzugt dem Aspekt der intraklonalen Diversität. Die Sequenzanalysen der Ig-Gene für die leichte Kette aus den insgesamt 100 untersuchten Tumorzellen des Patienten WS ergaben, daß zwischen den Zellen aus drei voneinander entfernt lokalisierten Gewebeproben intraklonale Diversität vorlag. Aufgrund der Mutationsanalysen und der Zuordnung der Subklone zu den Entnahmeorten ist eine evtl. antigengetriebene Entwicklung des Tumorklons zu vermuten. Bei Patient LB konnte trotz des großen Aufwandes, der Untersuchung von insgesamt 126 Zellen aus acht räumlich getrennten Biopsien, keine intraklonale Diversität für die schwere Kette der Immunglobulingene aufgezeigt werden. Die Sequenzunterschiede der leichten Kette beruhen auf einer einzigen stummen Mutation im Bereich der CDR 1, die keinen funktionellen Einfluß auf die Aminosäuresequenz hat und deshalb geringe prognostische Bedeutung besitzt. In beiden Fällen lagen hypermutierte Immunglobulingene vor. Die Tumorzellen des Patienten WS sind aus molekularbiologischer Sicht Keimzentrumszellen, die des Patienten LB eher Nachkeimzentrumszellen zuzuordnen. Die gewonnenen Erkenntnisse zeigen, daß bei der Untersuchung und Erforschung der Pathogenese von kutanen B-Zell-Lymphomen eine gewonnene Gewebeprobe nicht repräsentativ für den gesamten Tumor sein muß. Veröffentliche Ergebnisse, bei denen Monoklonalität anhand einer Biopsie postuliert wurde, müssen daher initial überdacht werden (74;76;77;84). Es ist folglich in Betracht zu ziehen, daß bei einer exakten molekularbiologischen Zuordnung der Tumorzellen zu ihrem Entwicklungsstadium und ihrer Herkunft räumliche als auch zeitliche Faktoren zu beachten sind. Eine chronologische Untersuchung könnte aufzeigen, ob andauernde Mutationen in den Tumorzellen stattfinden. Die Mikromanipulation und die Einzel-Zell-PCR-Technik sind elegante Methoden, um intraklonale Sequenzunterschiede aufzuzeigen und einen Beitrag für die molekularbiologische Erforschung der Pathogenese von kutanen B-Zell-Lymphomen zu leisten. Eine Kontrolle von malignoproliferativen Krankheiten, ob es unter den heutigen Therapiemöglichkeiten gelingt, den malignen Tumorklon vollständig zu beseitigen oder Aussagen über Progredienz und Prognose zu treffen, wäre ein interessanter Einsatzbereich dieser Methode. / abstract The molecularbiological investigation of the immunoglobulin variable region genes of two patients suffering on primary cutaneous B-cell-lymphoma was carried out using single-cell- PCR technic. The main focus lay on the aspect on the aspect of detecting intraclonal diversity. The sequence nucleotid-analysises of the immunoglubulin light chain genes obtained from a total of 100 investigated tumor B-cells in patient WS revealed intraclonal diversity among cells isolated from three spatially separated tissue samples. Considering the mutational pattern and the subclones in dependence on the tumorcells, taken from different topographical tumorsides, an antigen-driven clonal expansion could be supposed. Despite extensive efforts and the analysis of altogether 126 tumor B-cells out of eight spatially different localised biopsies, no intraclonal diversity could be observed for the immunoglobulin heavy chain rearrangement of second patient LB. Sequence differences of the Ig light chain based on only a single silent mutation within the CDR1 region. This mutation has no functional affect of the amino acid sequence and therefore little prognostical significance. In both cases the immunoglobulin genes were somatically hypermutated in compromise to the germ-line gene. From the molecularbiological point of view, the tumor cells of patient WS descended from germinal center cells, whereas the tumor B-cells of patient LB rather can be characterized as post-germinal center cells. The results clearly demonstrate, that the investigation of a single tissue sample of primary cutaneous B-cell lymphoma using micromanipulation and single cell-PCR technic may not be representative for the whole tumor. Publications concluding monoclonality with no intraclonal diversity from the analysis of a single biopsie therefore have to be interpreted with caution (74;76;77;84). Accordingly, an appropiate molecularbiological characterization of tumor B-cells regarding their developmental stage and origin has to consider spatial and time dependant aspects. Only the investigation of sequential biopsies may reliably detect ongoing mutations in tumor B-cells. The combination of micromanipulation and single cell PCR represents an elegant method to observe intraclonal diversity. The technic will give contribution to molecularbiological investigation of the pathogenesis of primary cutaneous B-cell lymphomas. It could be of interest to apply this method to the evaluation of current therapies with respect to its capability to eradicating the malignant cell clone completely, and to draw conclusions on disease progression and prognosis.

T-Helfer-9-(Th9-)Zellen produzieren große Mengen Interleukin-(IL-)9 und lösen bei Wurm- und Tumorerkrankungen protektive Immunantworten aus. Sie sind aber auch maßgeblich an der Pathogenese chronisch entzündlicher Darmerkrankungen beteiligt. Im Widerspruch zu diesen entzündungsauslösenden Eigenschaften steht ihre Rolle bei der Erzeugung von Toleranz gegenüber allogenen Transplantaten. Diese gegensätzlichen inflammatorischen Eigenschaften deuten eine bisher nicht untersuchte funktionelle Heterogenität an. In vitro-differenzierte allo-reaktive Th9-Zellen zeigten sich in ihrer Gesamtheit pro-inflammatorisch. Dies äußerte sich nach Transfer in recombination activating gene-defiziente (Rag-/-) Mäuse durch einen akut einsetzenden Gewichtsverlust mit intestinaler Entzündung und durch die Abstoßung allogener Hauttransplantate. Mittels Einzelzell-Genexpressionsanalyse wurden zwei Th9-Subpopulationen identifiziert, die sich vor allem in ihrer CD96-Expression unterschieden (CD96low versus CD96high Th9-Zellen). Die differenzielle Expression von CD96 spiegelte sich auch im inflammatorischen Potenzial der Zellen wider. Während der Transfer von CD96low Th9-Zellen in Rag-/- Mäuse einen Gewichtsverlust mit Darmentzündung sowie die Transplantatzerstörung verursachte, zeigten CD96high-rekonstituierte Tiere kaum Entzündungsanzeichen im Transplantat bzw. im Darm. Dementsprechend verloren sie auch kein Gewicht. Es zeigte sich, dass CD96low Th9-Zellen ein höheres Potenzial zur Produktion von IL-4 und IL-9 sowie zur Expansion besaßen als CD96high Th9-Zellen. Eine Blockade von CD96 in vivo stellte die inflammatorischen Eigenschaften von CD96high Th9-Zellen wieder her, wodurch die funktionelle Relevanz der CD96-Expression unterstrichen wurde. Diese Daten belegen, dass es sich bei Th9-Zellen um eine funktionell heterogene Zellpopulation handelt. Weiterhin zeigen sie, dass CD96 – ein Molekül mit bislang unklarer Funktion in CD4+ T-Zellen – die Aktivität von Th9-Zellen negativ beeinflusst. / T helper 9 (Th9) cells are potent producers of interleukin(IL-)9 driving host immunity against worm infections and tumors. Furthermore, they are predominantly involved in the pathogenesis of chronic inflammatory bowel diseases. However, they also induce tolerance in allogeneic transplantation, which contrasts with their pro-inflammatory properties. These observations indicate a functional heterogeneity of Th9 cells not examined so far. Total in vitro differentiated allo-reactive Th9 cells injected into recombination activating gene-deficient (Rag-/-) mice caused weight loss, intestinal inflammation and rejection of allogenic skin grafts which proofed their inflammatory character. However, using single cell profiling, two subsets of Th9 cells mainly differing in their CD96 expression were identified (CD96low versus CD96high Th9 cells). Transfer of CD96low Th9 cells into Rag-/- mice induced severe weight loss, intestinal inflammation and graft destruction. In contrast, transfer of CD96high Th9 cells did cause neither weight loss nor resulted in graft rejection. Transcriptional profiling revealed a higher IL-9 and IL-4 expression potential as well as an increased expansion capacity in CD96low Th9 cells compared to CD96high Th9 cells. Blockade of CD96 in vivo restored the inflammatory properties of CD96high Th9 cells demonstrating, that expression of CD96 controls effector functions in Th9 cells. Thus, Th9 cells are heterogeneous in function. Moreover, this study suggests an inhibitory role for the co-signaling receptor CD96 – a molecule with so far unknown function in CD4+ T cells – in Th9 cells.

No description available.

No description available.

Dans le tractus gastro-intestinal, l'adhésion des bactéries commensales à l’épithélium permet leur maintien, ce qui aide à contrôler l’implantation de germes indésirables par des mécanismes de concurrence (effets nutritionnels, sites spécifiques d'adhésion ...). Bien que le rôle de la couche du mucus (principalement composée de glycoprotéines à haut poids moléculaire, appelées mucines) recouvrant la muqueuse soit connu et décrit depuis de nombreuses années, notamment pour sa fonction de barrière protectrice, l'intérêt pour décrypter les mécanismes précis d’interaction(s) avec le microbiote (bactéries commensales, pathogènes ou probiotiques) n’a que récemment émergé. Dans ce cadre, l'objectif de cette thèse, menée en collaboration entre le Laboratoire d’Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés de Toulouse et le Laboratoire d’Analyse et d’Architecture des Systèmes de Toulouse, est de caractériser in vitro le comportement muco-adhésif de Lactococcus lactis, le modèle des bactéries lactiques, en utilisant des approches de quantification multi-échelles (du niveau moléculaire à l’échelle multicellulaire) sur un large panel de souches naturelles et recombinantes. Une attention particulière est accordée au rôle des mucines, en utilisant le modèle PGM (mucine gastrique de porc ou « Pig Gastric Mucin »).La première partie du travail a porté sur la quantification à l'échelle de la cellule unique des interactions entre L. lactis et une surface abiotique (polystyrène) recouverte de PGM, en utilisant la microscopie à force atomique (AFM). La faisabilité de la méthode a tout d'abord été démontrée sur la souche modèle L. lactis ssp. cremoris MG1820. La couche de PGM a été caractérisée en utilisant des méthodes analytiques complémentaires (AFM, XPS - spectroscopie de photoélectrons induits par rayons X, QCM-D - Microbalance à Quartz à mesure de Dissipation...). En parallèle, les bactéries L. lactis ont été immobilisées sur la pointe AFM et utilisées comme « sonde de force », en considérant la souche naturelle IBB477 (L. lactis ssp. cremoris), d’origine laitière et présentant une forte persistance dans le tractus digestif du rat lors d’essais réalisés in vivo (collaboration avec l’Institut de Biochimie et de Biophysique de Varsovie, Pologne). Comparé aux conditions contrôle (i.e., surface de polystyrène sans PGM), les niveaux de force d'adhésion enregistrés entre L. lactis et PGM sont inférieurs, ceci en raison des répulsions électrostatiques, hydrophiles et stériques s’établissant entre la couche de PGM et la paroi cellulaire. La forme des courbes représentant l’évolution de la force au retrait en fonction de la distance est également différente. Une analyse détaillée souligne la contribution, conjointe et différente selon les souches testées, d’événements (i) non adhésifs, (ii) adhésifs non spécifiques (interactions électrostatiques, hydrophobes, de van der Waals) et (iii) adhésifs spécifiques (liaison de type ligand/récepteur). La contribution spécifique a ensuite été explorée plus finement en termes de constantes cinétiques d’association et de dissociation. Nous avons, par ailleurs, poursuivi notre exploitation de la biodiversité naturelle chez les lactocoques en étudiant la souche TIL448 (L. lactis ssp. lactis) d’origine végétale, en collaboration avec l’Institut MICALIS de Jouy-en-Josas. Nous avons ainsi démontré, pour la première fois chez L. lactis, le rôle combiné des protéines à domaine(s) MUB (« Mucus-Binding ») et des pili, à travers l'analyse approfondie des données AFM (force d'adhésion, répartition des événements adhésifs spécifiques/non spécifiques, distances d'interaction...). Le rôle des pili a été confirmé sur des souches recombinantes piliées (L. lactis ssp. lactis IL1403), toujours en partenariat avec l’Institut MICALIS de Jouy-en-Josas. En parallèle, en collaboration avec l’Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle de Villeneuve d'Ascq, nous avons cherché à identifier les O-glycannes de PGM (fractions neutre et acide), impliqués dans le processus d'interaction avec la surface bactérienne. Pour confirmer l’ensemble des résultats obtenus à l'échelle de la cellule unique et en mode statique par AFM (effet anti-adhésif de PGM, comportement muco-adhésif différent selon les souches de L. lactis), la deuxième partie du travail a été consacrée à des expérimentations à l’échelle de l’ensemble de la population bactérienne, en conditions dynamiques (QCM-D, chambre à écoulement cisaillé). Nous avons évalué par QCM-D chez les souches IBB477 et MG1820 les propriétés viscoélastiques des dépôts bactériens, en relation avec le comportement bio-adhésif vis-à-vis de la couche de PGM. Les données obtenues par AFM et chambre à écoulement cisaillé sur ces mêmes souches ont été confrontées pour accéder plus finement au mode d’interaction avec PGM (densité de liaisons sur la surface bactérienne). Enfin, nous avons évalué chez IL1403 l’effet des pili sur la dynamique de détachement et d’orientation sous cisaillement contrôlé.En conclusion, la combinaison des échelles d'observation et d’analyse, aussi bien au niveau de la cellule unique qu’à celui de l’ensemble de la population bactérienne, nous permet désormais de disposer de nouvelles connaissances sur les mécanismes diversifiés d'interaction entre L. lactis et PGM, visant à une meilleure compréhension des fonctionnalités de cette bactérie au niveau du tractus gastro-intestinal / In the gastrointestinal tract, adhesion of commensal bacteria to epithelial cells allows their retention, which helps to control the implementation of unwanted germs through mechanisms of competition (nutritional effects, specific sites of adhesion ...). Indeed, bacterial adhesion to the intestinal epithelium seems to be important for the balance of intestinal microbiota. Although the role of the mucus layer lining the mucosa, which is mainly composed of large glycoproteins termed mucins, is known and described for many years, particularly for its protective barrier function, the interest for unraveling precise mechanisms of interaction with bacteria (commensal, pathogens or probiotics) has just recently emerged. In this framework, the aim of the PhD thesis was to characterize in vitro muco-adhesive behavior of Lactococcus lactis, the model of Lactic Acid Bacteria, using multi-scale approaches (from molecular to multicellular levels) on a large set of natural and recombinant strains. A particular attention was paid to the role of mucins, using the PGM model (Pig Gastric Mucin).The first part of the work was focused on the quantification at nanoscale of interactions between L. lactis and adsorbed PGM, using AFM. The feasibility of the method was first demonstrated on the reference strain MG1820. PGM coating was characterized using a complementary set of analytical methods (AFM, XPS, quartz crystal microbalance with dissipation monitoring…). In parallel, L. lactis cells were immobilized onto the AFM tip and used as a living force probe, considering the natural strain IBB477 (L. lactis subsp. cremoris), isolated from Polish artisanal dairy products and previously shown to display in vivo retention in the rat gut (collaboration with the Institute of Biochemistry and Biophysics of Warsaw, Poland). Compared to control conditions (i.e., no PGM coating), adhesion force levels recorded for PGM were lower, due to the interplay of electrostatic, hydrophilic and steric repulsions. The shape of retraction force-distance curves for L. lactis/PGM interactions was also different. The detailed analysis of curve shape highlighted the contribution of non-adhesive, non-specific (electrostatic, hydrophobic, van der Waals interactions) and specific adhesive events (ligand/receptor bonding), depending on the strain under study. Specific forces were analyzed in terms of dissociation/association kinetic constants.We then explored the natural biodiversity among lactococci by studying the natural strain of L. lactis (subsp. lactis) TIL448 from plant origin, in collaboration with MICALIS (Jouy-en-Josas). We demonstrated, for the first time for L. lactis, the combined role played by “MUB-like” domain-containing protein and pili, through the thorough analysis of AFM data (adhesion force, repartition of specific/non-specific adhesive events and distances of interaction…). The role of pili was also confirmed with recombinant piliated strains (L. lactis subsp. lactis IL1403), in partnership with MICALIS (Jouy-en-Josas). In parallel, in collaboration with the “Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle de Villeneuve d'Ascq”, a first attempt was done to identify the O-glycans of PGM (neutral and acid fractions), involved in interactions with the bacterial surface.To confirm these results achieved at single-cell scale and under static mode by AFM (anti-adhesive of PGM, different muco-adhesive properties among several strains of L. lactis), the second part of the work was devoted to experiments at multicellular scale under dynamic conditions (quartz crystal microbalance with dissipation monitoring – QCM-D, shear stress flow chamber). We evaluated by QCM-D, for MG1820 and IBB477 strains, the viscoelastic properties of the cell layers, in relation with the bio-adhesive behavior towards PGM. The data obtained by AFM and shear stress flow chamber were combined to access more precisely to the interaction mode with PGM (density of bonds over the cell surface). Finally, using the recombinant piliated strain (IL1403), we focused on the effect of pili on detachment and re-orientation dynamics under shear flow

Le carcinome séreux de haut grade (CSHG) est le sous-type de cancer de l'ovaire le plus agressif et mortel. Alors qu'une meilleure survie globale des patientes soit associée à une infiltration lymphocytaire, l'immunothérapie par blocage des points de contrôle immunitaires a obtenu des résultats limités, témoignant ainsi l'importance de comprendre le fonctionnement du système immunitaire au sein de ces tumeurs malignes. L’immunologie des tumeurs intègre des cellules immunitaires innées et adaptatives et utilise des médiateurs inflammatoires pour ajuster finement l'ampleur et la durée de la réponse immunitaire. Ainsi, cette thèse a pour objectif de définir l'hétérogénéité des cellules immunitaires intratumorales et périphériques chez les patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire mais aussi à explorer les mécanismes de la réponse immunitaire. En combinant des techniques de biologie computationnelle et de séquençage de l'ARN à cellule unique nous avons pu identifier les différents composants du système immunitaire des patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire mais aussi valider nos résultats dans une plus large cohorte associant d'autres types de cancer. Dans un premier temps, nous avons étudié l'un des médiateurs de l'inflammation, la voie de signalisation extracellulaire de l'adénosine. Nous avons évalué l'impact de cette voie de signalisation sur la survie des patientes atteintes de CSHG et identifié les cellules du microenvironnement tumoral participant au fonctionnement de cette voie. Ensuite, nous avons concentré notre étude sur la dynamique des lymphocytes T et identifié leurs états cellulaires associés, déduit leur relation développementale et étudié les changements transcriptionnels déclenchés par les interactions entre les cellules dans le microenvironnement immunitaire tumoral. Nous avons démontré que les cellules de type Tfh produisent le médiateur 7α,25 dihydroxycholestérol (7α,25-HC) décrit comme régulant le positionnement des cellules immunitaires dans les organes lymphoïdes secondaires. Ainsi, notre étude suggère que les cellules de type Tfh utilise ce mécanisme pour recruter des lymphocytes T CD8 pré-effecteurs/prédysfonctionnels et des cellules dendritiques plasmacytoïdes dans les tumeurs. Finalement, nos résultats indiquent que les cellules de type Tfh exprimant l'interleukine-21 aident à promouvoir l'immunité antitumorale contre les tumeurs ovariennes en coordonnant l'action des lymphocytes et des cellules dendritiques plasmacytoïdes sensibles au 7α,25-HC. En conclusion, nos travaux de recherche ont permis d’identifier des vulnérabilités dans le microenvironnement immunitaire tumoral pouvant être ciblées dans la thérapie contre le CSHG. / High-grade serous ovarian carcinoma (HGSOC) is the most aggressive and lethal subtype of ovarian cancer. Although better overall survival is associated with lymphocytic infiltration, immunotherapy by immune checkpoint blockades achieved modest results, reinforcing the importance of understanding immunity in this malignancy. Cancer immunity integrates innate and adaptive immune cells and makes use of inflammatory mediators to finely tune the magnitude and duration of the immune response. This thesis aims to reveal the heterogeneity of intratumoral and peripheral immune cells in ovarian cancer patients and explore the mechanisms of the immune response. For this purpose, we have used the high-resolution technology of single-cell RNAsequencing and computational biology to immune profile HGSOC patients. Firstly, we explored one of the mediators of inflammation, the immunosuppressive extracellular adenosine (eADO). The ectonucleotidases CD73 and CD39 regulate the eADO signaling pathway, and their expression is prognostic in several cancer types. Since their role in HGSOC was yet largely unexplored, we hypothesized that a transcriptomic meta-analysis of eADO signaling pathway would provide the clinical impact of the pathway in this malignancy. We analyzed the transcriptome of approximately 1200 HGSOC patients to evaluate the effect of CD39 and CD73 on clinical outcomes. While high expression of both ectonucleotidases was associated with worse overall survival in HGSOC, only CD39 was associated with chemoresistance, supporting the evaluation of eADO-targeting agents in HGSOC. Subsequently, we investigated T cell dynamics. Because T cell clones expanded in both tumor and peripheral tissue associated with response to ICB, we hypothesized that the tumor immune microenvironment (TIME) modulates their function and, therefore, analysis of cell-cell interaction would identify the cells participating in this process. Thus, we identified T cell states, inferred their developmental relationship, and studied transcriptional changes triggered by cellcell interactions in the TIME. We demonstrated that exhausted CD8 T cells highly expressed the chemokines CCL4 and XCL1, previously described in the priming of CD8 T cells in secondary lymphoid organs (SLOs). Finally, we proposed that the lipid mediator 7α,25 dihydroxycholesterol (7α,25-HC), only described in SLOs, may also modulate cell-cell interactions in the tumor immune microenvironment. Collectively, our studies propose strategies to modulate TIME in HGSOC targeting the adenosine pathway and oxysterols metabolites.

RNA ist ein zentrales Molekül in der Zelle und essentiell für ihre Lebensfunktionen. Die durchschnittliche Halbwertszeit von RNA-Molekülen limitiert jedoch die zeitliche Auflösung herkömmlicher RNA-Sequenzierung, da geringe Änderungen im Transkriptom kaum zu erkennen sind, bis eine gewisse Anzahl an Molekülen akkumuliert. Durch metabolische Markierung von RNA (SLAMseq) kann die Auflösung deutlich erhöht werden. Hierfür werden der Probe markierte Nucleotide (4sU/4sUTP) zugesetzt, die dann zufällig in neu transkribierte RNA inkorporiert werden und eine Unterscheidung zwischen ‚neuer‘ und ‚alter‘ RNA erlauben. In dieser Arbeit werden eine der ersten Einzelzell-SLAMseq-Methoden, die dazugehörige Datenanalyse-Software sowie drei Anwendungen der entwickelten Methoden vorgestellt. Die erste Anwendung verwendet Einzelzell-SLAMseq, um zwischen maternaler (alter) und zygotischer (neuer) RNA in sich entwickelnden Zebrafischembryos bis zur Gastrulation zu unterscheiden. Im Rahmen des Projekts entstand der erste Einzelzell-SLAMseq-Datensatz in einem vollständigen Wirbeltier, der es außerdem erlaubt, im Vorfeld identifizierten lokalisierten maternalen Transkripten zeitlich zu folgen. Diese – vorher uncharakterisierten –Transkripte wurden während der Gastrulation in den Keimzellen angereichert gefunden, was Rückschlüsse auf ihre mögliche Funktion erlaubt. Die zweite Anwendung konzentriert sich auf die neu transkribierte RNA und verwendet (Einzelzell-)SLAMseq, um Transkripte, die in Reaktion auf Stress während der Probenaufbereitung hergestellt wurden, zu identifizieren und rechnerisch zu entfernen. Die Vorteile der Methode werden in mehreren Systemen und Geweben (Mausherz, Zebrafischlarve, Maus-Microglia) demonstriert. In der dritten Anwendung wird eine Machbarkeitsstudie für in vivo SLAMseq zur Identifikation der initialen Immunantwort nach Makrophagenstimulation präsentiert, die auf einen deutlichen Gewinn an zeitlicher Auflösung durch SLAMseq hindeutet. / RNA is a central molecule in the cell and essential to its life functions. With the average RNA half life being multiple hours, regular RNA sequencing has an intrinsic limit on temporal resolution, where small changes in the transcriptome are not picked up until a certain amount of transcripts has build up. This resolution can be greatly improved using RNA metabolic labelling (SLAMseq), where labelled nucleotides (4sU/4sUTP) are added to the samples. These nucleotides are randomly incorporated into nascent transcripts and allow distinction between RNA produced before and after introduction of the labelling agent. This thesis presents one of the first high throughput single cell SLAMseq protocols, an accompanying computational pipeline for data analysis as well as three applications for the developed methods. The first application uses single cell SLAMseq to distinguish between maternal (unlabelled) and zygotic (labelled) transcripts in early zebrafish development (up to mid-gastrulation). This project generated the first single cell SLAMseq dataset in a whole vertebrate. Additionally the data allows to follow a previously discovered set of vegetally localised maternal transcripts in time and determine that these specific transcripts are mainly enriched in the primordial germ cells at gastrulation, therefore ascribing a potential function to a set of so far uncharacterised genes. The second application focuses on newly transcribed RNA and uses (single cell) SLAMseq as a technique to identify and remove transcripts generated in response to sample preparation stress. The method’s benefits are demonstrated in multiple systems and tissues, among them mouse cardiomyocytes, zebrafish larvae and mouse microglia. Finally as the third application an in vivo proof of concept study of SLAMseq to identify first response genes in macrophage stimulation is presented, where the introduction of 4sU shows clear advantages in temporal resolution compared to unlabelled data.

Die Genexpression ist ein stochastischer Prozess, dessen strenge Regulation einen ungestörten Zellzyklusverlauf ermöglicht. Jeglicher Stress löst eine Neuprogrammierung der Expression und somit einen Stillstand des Zellzyklus aus. Um ein besseres Verständnis des eukaryotischen Zellzyklus zu erlangen, wurde in dieser Arbeit die Fluoreszenzmikroskopie einzelner Zellen (S.cerevisiae) mit stochastischer Modellierung der Hauptregulatorgene des G1/S-Übergangs (SIC1, CLN2, CLB5) kombiniert. Mithilfe des MS2-CP-Systems wurden mRNA-Level von SIC1 in lebenden Zellen bestimmt und verschiedene Transportwege von SIC1-mRNA visualisiert. RNA-FISH in Kombination mit genetischen und morphologischen Markierungen ermöglichte es, die absolute Quantifizierung von SIC1-, CLN2- und CLB5-mRNA in allen Zyklusphasen vorzunehmen. Die Auswirkung von Osmostress, in Hinblick auf eine transkriptionale Verzerrung, wurde untersucht. Basierend auf den experimentellen-Daten wurde ein stochastisches Model entwickelt, dass die Expression von SIC1, CLN2 und CLB5 mRNA und Proteinlevel in Abhängigkeit von Osmostress über den gesamten Zellzyklus hinweg abbildet. Die Modellierung ermöglichte eine in silico Synchronisation und somit die Extraktion kinetischer Parameter. Die Expression der beobachteten Gene wurde im Verlauf des Zellzyklus nicht ein- und ausgeschaltet, stattdessen kam es zu Phasen hoher oder niedriger Expression. Niedriger SIC1 Expression gewährleistete niedriger Sic1 Protein Verzerrung und robustes G1/S Timing. CLN2 und CLB5 zeigten ein maximales Expressionslevel in G1 und auch eine erhöhte Expression in der späten Mitose. Osmostress induzierte einen langanhaltenden Effekt auf die Transkription und die Dauer der Zellzyklusphasen. Der hier vorgestellte Ansatz ermöglichte quantitative Einblicke in die Genexpression und zeitliche Koordination des Zellzyklus von S.cerevisiae. Einige der hier beobachteten Regulationsmechanismen könnten allgemeine Gültigkeit im eukaryotischen Zellzyklus besitzen. / Gene expression is a stochastic process and its appropriate regulation is critical for cell cycle progression. Cellular stress response requires expression reprogramming and cell cycle arrest. Time-resolved quantitative methods on single cells are needed to understand eukaryotic cell cycle in context of noisy gene expression and external perturbations. We applied single-cell fluorescence microscopy and stochastic modeling to SIC1, CLN2 and CLB5, the main G1/S regulators in S. cerevisiae. Using MS2-CP system we estimated SIC1 mRNA levels and visualized different types of transport for SIC1 mRNA particles in living cells. With RNA-FISH combined to genetic and morphological markers we monitored absolute numbers of mRNA and transcriptional noise over cell cycle phases with and without osmostress. Stochastic modeling enabled in silico synchronization, the extraction of kinetic parameters as well as expanded the static mRNA data into time courses for mRNAs, proteins and their noise. Based on our experimental data we developed a stochastic model of G1/S timing centered on SIC1 and a second one for the entire cell cycle involving SIC1, CLN2 and CLB5 and the response to osmostress. All three genes exhibited basal expression throughout cell cycle enlightening that transcription is not divided in on and off but rather in high and low phases. A low SIC1 transcript level ensured a low protein noise and a robust timing of the G1/S transition. CLN2 and CLB5 showed main expression peaks in G1 as well as an expression upshift in late mitosis. Osmostress induced different periods of transcriptional inhibition for CLN2 and CLB5 and long-term impact on cell cycle phase duration. Our approach disclosed detailed quantitative insights into gene expression and cell cycle timing, not available from bulk experiments. Importantly some regulation mechanisms specific to SIC1, CLN2 and CLB5 might be generalized to other genes as well as to other organisms.

In dieser Dissertation modellieren und analysieren wir scRNA-Seq-Daten, um Mechanismen, die biologischen Prozessen zugrunde liegen, zu verstehen In scRNA-Seq-Experimenten wird biologisches Rauschen mit technischem Rauschen vermischt. Mittels eines vereinfachten scRNA-Seq-Modells leiten wir eine analytische Verteilungsfunktion für die beobachtete Verteilung unter Kenntnis einer Ausgangsverteilung her. Charakteristiken und sogar ein allgemeines Moment der Ausgangsverteilung können aus der beobachteten Verteilung berechnet werden. Unsere Formeln stellen den Ausgangspunkt zur Quantifizierung von Zellvariabilität dar. Wir haben eine vollständig lineare Analyse von Transkriptomdaten entwickelt, die zeigt, dass sich Zellen während des Zellzyklus auf einer ebenen zirkulären Trajektorie im Transkriptomraum bewegen. In immortalisierten Zelllinien stellen wir fest, dass die Transkriptomdynamiken des Zellzyklus hauptsächlich unabhängig von den Dynamiken anderer Zellprozesse stattfinden. Unser Algorithmus (“Revelio”) bringt eine einfache Methode mit sich, um unsynchronisierte Zellen nach der Zeit zu ordnen und ermöglicht das exakte Entfernen von Zellzykluseffekten. Die Form der Zellzyklus-Trajektorie zeigt, dass der Zellzyklus sich dazu entwickelt hat, Änderungen der transkriptionellen Aktivitäten und der damit verbundenen regulativen Anstrengungen zu minimieren. Dieses Konstruktionsprinzip könnte auch für andere Prozesse relevant sein. Durch die Verwendung von metabolischer Molekülmarkierung erweitern wir Modelle zur mRNA-Kinetik, um dynamische mRNA-Ratenparameter für Transkription, Splicing und Degradation zu erhalten und die Lösungen auf den Zellzyklus anzuwenden. Wir zeigen, dass unser Modell zwischen Genen mit ähnlicher Genexpression aber unterschiedlicher Genregulation unterscheiden kann. Zwar enthalten scRNA-Seq-Daten aktuell noch zu viel technisches Rauschen, unser Modell wird jedoch für das zukünftige Errechnen von dynamischen mRNA-Ratenparametern von großem Nutzen sein. / In this dissertation, we model and analyse scRNA-seq data to understand mechanisms underlying biological processes. In scRNA-seq experiments, biological noise gets convoluted with various sources of technical noise. With the help of a simplified scRNA-seq model, we derive an analytical probability distribution function for the observed output distribution given a true input distribution. We find that characteristics and even general moments of the input distribution can be calculated from the output distribution. Our formulas are a starting point for the quantification of cell-to-cell variability. We developed a fully linear analysis of transcriptome data which reveals that cells move along a planar circular trajectory in transcriptome space during the cell cycle. Additionally, we find in immortalized cell lines that cell cycle transcriptome dynamics occur largely independently from other cellular processes. Our algorithm (“Revelio”) offers a simple method to order unsynchronized cells in time and enables the precise removal of cell cycle effects from the data. The shape of the cell cycle trajectory indicates that the cell cycle has evolved to minimize changes of transcriptional activity and their related regulatory efforts. This design principle may be of relevance to other cellular processes. By considering metabolic labelling, we extend existing mRNA kinetic models to obtain dynamic mRNA rate parameters for transcription, splicing and degradation and apply our solutions to the cell cycle. We can distinguish genes with similar expression values but different gene regulation strategies. While current scRNA-seq data contains too much technical noise, the model will be of great value for inferring dynamic mRNA rate parameters in future research.