A leptospirose é uma zoonose causada por leptospiras patogênicas. Para estabelecer a infecção, estas bactérias desenvolveram estratégias de escape ao sistema complemento. Neste trabalho demonstramos que o sobrenadante de cultura de leptospiras patogênicas é capaz de inibir as três vias do complemento. Observamos que esse sobrenadante possui atividade proteolítica sobre C3, C3b e iC3b, além do FB (via alternativa), C2 e C4b (via clássica e das lectinas). As proteínas C3, C4, C2 e FB também foram clivadas quando soro humano normal (SHN) foi utilizado como fonte de complemento. Demonstramos que as proteases atuam em conjunto com os reguladores do hospedeiro Fator I e Fator H na clivagem de C3b. As clivagens foram inibidas pela 1,10-fenantrolina, sugerindo a participação de metaloproteases. Metaloproteases de leptospira da família das termolisinas foram produzidas como proteínas recombinantes e clivaram C3 no SHN. Concluímos que proteases de leptospiras patogênicas podem desativar moléculas do complemento e são potencias alvos para novas terapias em leptospirose. / Leptospirosis is a zoonotic disease caused by pathogenic Leptospira. To establish the infection, these bacteria have developed strategies to escape the complement system. In this work, we demonstrate that culture supernatant from pathogenic Leptospira is capable of inhibiting the three complement pathways. We observe that this supernatant possess proteolytic activity under C3, C3b and iC3b, FB (alternative pathway), C2 and C4b (classical and lectin pathways). The proteins C3, C4, C2 and FB were also cleaved when normal human serum (NHS) was used as a source of complement. We demonstrate that these proteases act together with the host regulators Factor I and Factor H in C3b cleavage. The cleavages were inhibited by 1,10-phenanthroline, suggesting the involvement of metalloproteinases. Leptospira metalloproteinases from the thermolysin family were produced as recombinant proteins and cleaved C3 in NHS. We concluded that proteases from pathogenic Leptospira can inactivate complement molecules and are potential targets for new therapies in leptospirosis.

O sistema complemento participa da patogenia da Doença Hepática Alcoólica (DHA), onde C3 contribui para o acúmulo de triglicerídeos (tg) e C5 para injúria e inflamação hepática. Investigamos o papel de C5 em modelo de DHA aplicando as linhagens B6 e A/J, e geramos a linhagem congênica B6.A-Hc0 (B6 C5def). B6 e A/J foram tratados com dieta contendo ou não etanol, ou maltodextrina, por 6, 8 e 10 semanas. Em ambas as linhagens a dieta com etanol induziu hepatomegalia, acúmulo de tg e redução de IL6 e IL12 hepáticos ao longo das semanas. Os A/J tratados com etanol exibiram aumento de leucócitos circulantes, IL10 e NO hepáticos e menor acúmulo de tg hepáticos em relação aos B6. Os B6 tratados com etanol exibiram redução de IL1b, IL10 e NO hepáticos. Tratando a linhagem congênica por 10 semanas com a dieta com etanol observamos aumento de IL17 e IL10 e redução de IL1b e TGFb hepáticos nos B6.A-Hc0 em relação aos B6. Independentemente da dieta, houve aumento sérico de AST, FA, albumina, colesterol, tg e redução hepática de IL6, IL12 e IFNg nos B6.A-Hc0. Portanto, C5 promoveu um ambiente hepático pró-inflamatório e pareceu influenciar os valores séricos das enzimas de função e síntese hepática, citocinas e do perfil lipídico no modelo de DHA. / The complement system may be involved in the pathogenesis of Alcoholic Fatty Liver Disease (ALD). Murine models of ALD showed that C3 contributes to the accumulation of triglycerides (tg) in liver and the C5 seems to be involved with hepatic inflammation. We here investigated the contribution of C5 in ALD using C57Bl/6 (B6) and A/J (C5 deficient), and B6 C5 deficient congenic mice (B6.A-Hc0). B6 and A/J were treated with modified diet containing ethanol or maltodextrin for 6-10 weeks. In both strains, the ethanol diet induced hepatomegaly, increased liver tg and decreased IL6 and IL12 levels. However, total blood leukocytes counting, IL10 and NO liver production increased only in A/J. In addition, only in B6 the IL1b levels increased while IL10 and NO decreased in liver. A/J mice suffered more inflammatory damage and accumulated less liver tg than B6. In B6.A-Hc0 IL17 and IL10 increased while of IL1b and TGFb decreased when compared to B6. Independently of the diet, levels of AST, FA, albumin, cholesterol, tg increased in B6.A-Hc0 serum and IL6, IL12 and IFNg reduced in liver. In conclusion, C5 promoted a pro-inflammatory environment in the liver and influenced the serum levels of hepatic enzymes, cytokines and lipid profile.

O sistema complemento parece ter surgido com o aparecimento de C3 e fator B (FB), os únicos componentes encontrados nos organismos mais primitivos, o que sugere que a via alternativa seja a mais antiga. Fragmentos de cDNA codificantes para FB (Lox-FB) e C3 (Lox-C3) foram sintetizados a partir do RNA total isolado da glândula de veneno de Loxosceles laeta e amplificados por técnicas de RACE-PCR. Lox-FB apresenta uma organização de domínios clássica, composta por domínios CCP, vWFA e de serino protease. Os aminoácidos envolvidos na ligação ao C3b são conservados, no entanto, a tríade catalítica clássica não foi encontrada. Lox-C3 apresenta uma configuração de domínios similar a do C3 humano, contendo dois sítios putativos de processamento: um entre as cadeias α e γ, e outro entre as cadeias α e β, indicando que Lox-C3 seja composto por três cadeias. As análises filogenéticas indicaram que Lox-C3 e Lox-FB são mais próximos evolutivamente aos componentes equivalentes da aranha Hasarius adansoni, com valores de identidade de 53% e 43%, respectivamente. / The complement system seems to have arisen with the appearance of C3 and factor B (FB), the only components found in the most primitive organisms, suggesting that the alternative pathway is the oldest. cDNA fragments coding for the complement factor B (Lox-FB) and C3 (Lox-C3) were synthesized from total RNA Loxosceles laeta venom gland and amplified using RACE-PCR techniques. Lox-FB has a classical domain organization in mosaic, composed by CCPs, vWFA and serine protease domains. The amino acids involved in binding to C3b are conserved, however, the classical calatytic triad was not found. Lox-C3 presents a similar configuration of domains to C3 human and has two putative processing sites: the first one is located between α and γ chains and other between α and β chains, indicating that Lox-C3 is composed by three chains. The phylogenetic analyses indicated that Lox-C3 and Lox-FB are evolutionary closer to the equivalent components of Hasarius adansoni, with identity values of 53% and 43%, respectively.

Embora camundongos sejam resistentes à infecção por Leptospira interrogans, eles têm sido pouco utilizados para se entender os mecanismos imunes efetores contra esta bactéria. Adler & Faine mostraram em 1976 que esta resistência é dependente da resposta imune, uma vez que camundongos imunossuprimidos tornavam-se suscetíveis à L. interrogans. Outros autores mostraram que camundongos portadores de imunodeficiência grave combinada também morriam após inoculação de L. interrogans. Sabendo da importância do Sistema Complemento em infecções bacterianas, investigamos se animais C5 deficientes (C5-) são mais suscetíveis à infecção por L. interrogans que animais C5 normais (C5+). Observamos que camundongos C5- possuem menores porcentagens de linfócitos T CD8+ na circulação periférica e maiores níveis de IL-12p40 no rim e de TNF e IL-6 no pulmão que os animais C5+. Animais C57Bl/6 (B6) C5+ possuem maior porcentagem de linfócitos T CD4+ que B6 C5-, além de lesões hepáticas mais intensas, mostrando um efeito dependente de C5 e do fundo genético dos camundongos. / Although mice are resistant to Leptospira interrogans infection, they are not usual models to study the imune response against this bacteria. Adler and Faine demonstrated in 1976 the importance of the imune response, since immunosuppressed mice were suceptible to L. interrogans. Other authors showed that mice that had severe combined immunodeficiency also died when inoculated with L. interrogans. Due to the activity of the Complement System in infections, we analyzed whether C5 deficient (C5-) mice are more susceptible than C5 sufficient (C5+) mice to L. interrogans infection. C5- mice have lower percentages of T CD8+ lymphocytes in peripheral circulation and upper levels of IL-12p40 in the kidney and TNF and IL-6 in the lungs than C5+ mice. C57Bl/6 (B6) C5+ mice has higher percentages of T CD4+ lymphocytes than B6 C5- mice, in addition to stricter liver injures, exhibiting an effect dependent of C5 and of the genetic background.

A leptospirose é uma zoonose causada por leptospiras patogênicas. Para estabelecer a infecção, estas bactérias desenvolveram estratégias de escape ao sistema complemento. Neste trabalho demonstramos que o sobrenadante de cultura de leptospiras patogênicas é capaz de inibir as três vias do complemento. Observamos que esse sobrenadante possui atividade proteolítica sobre C3, C3b e iC3b, além do FB (via alternativa), C2 e C4b (via clássica e das lectinas). As proteínas C3, C4, C2 e FB também foram clivadas quando soro humano normal (SHN) foi utilizado como fonte de complemento. Demonstramos que as proteases atuam em conjunto com os reguladores do hospedeiro Fator I e Fator H na clivagem de C3b. As clivagens foram inibidas pela 1,10-fenantrolina, sugerindo a participação de metaloproteases. Metaloproteases de leptospira da família das termolisinas foram produzidas como proteínas recombinantes e clivaram C3 no SHN. Concluímos que proteases de leptospiras patogênicas podem desativar moléculas do complemento e são potencias alvos para novas terapias em leptospirose. / Leptospirosis is a zoonotic disease caused by pathogenic Leptospira. To establish the infection, these bacteria have developed strategies to escape the complement system. In this work, we demonstrate that culture supernatant from pathogenic Leptospira is capable of inhibiting the three complement pathways. We observe that this supernatant possess proteolytic activity under C3, C3b and iC3b, FB (alternative pathway), C2 and C4b (classical and lectin pathways). The proteins C3, C4, C2 and FB were also cleaved when normal human serum (NHS) was used as a source of complement. We demonstrate that these proteases act together with the host regulators Factor I and Factor H in C3b cleavage. The cleavages were inhibited by 1,10-phenanthroline, suggesting the involvement of metalloproteinases. Leptospira metalloproteinases from the thermolysin family were produced as recombinant proteins and cleaved C3 in NHS. We concluded that proteases from pathogenic Leptospira can inactivate complement molecules and are potential targets for new therapies in leptospirosis.

O sistema complemento participa da patogenia da Doença Hepática Alcoólica (DHA), onde C3 contribui para o acúmulo de triglicerídeos (tg) e C5 para injúria e inflamação hepática. Investigamos o papel de C5 em modelo de DHA aplicando as linhagens B6 e A/J, e geramos a linhagem congênica B6.A-Hc0 (B6 C5def). B6 e A/J foram tratados com dieta contendo ou não etanol, ou maltodextrina, por 6, 8 e 10 semanas. Em ambas as linhagens a dieta com etanol induziu hepatomegalia, acúmulo de tg e redução de IL6 e IL12 hepáticos ao longo das semanas. Os A/J tratados com etanol exibiram aumento de leucócitos circulantes, IL10 e NO hepáticos e menor acúmulo de tg hepáticos em relação aos B6. Os B6 tratados com etanol exibiram redução de IL1b, IL10 e NO hepáticos. Tratando a linhagem congênica por 10 semanas com a dieta com etanol observamos aumento de IL17 e IL10 e redução de IL1b e TGFb hepáticos nos B6.A-Hc0 em relação aos B6. Independentemente da dieta, houve aumento sérico de AST, FA, albumina, colesterol, tg e redução hepática de IL6, IL12 e IFNg nos B6.A-Hc0. Portanto, C5 promoveu um ambiente hepático pró-inflamatório e pareceu influenciar os valores séricos das enzimas de função e síntese hepática, citocinas e do perfil lipídico no modelo de DHA. / The complement system may be involved in the pathogenesis of Alcoholic Fatty Liver Disease (ALD). Murine models of ALD showed that C3 contributes to the accumulation of triglycerides (tg) in liver and the C5 seems to be involved with hepatic inflammation. We here investigated the contribution of C5 in ALD using C57Bl/6 (B6) and A/J (C5 deficient), and B6 C5 deficient congenic mice (B6.A-Hc0). B6 and A/J were treated with modified diet containing ethanol or maltodextrin for 6-10 weeks. In both strains, the ethanol diet induced hepatomegaly, increased liver tg and decreased IL6 and IL12 levels. However, total blood leukocytes counting, IL10 and NO liver production increased only in A/J. In addition, only in B6 the IL1b levels increased while IL10 and NO decreased in liver. A/J mice suffered more inflammatory damage and accumulated less liver tg than B6. In B6.A-Hc0 IL17 and IL10 increased while of IL1b and TGFb decreased when compared to B6. Independently of the diet, levels of AST, FA, albumin, cholesterol, tg increased in B6.A-Hc0 serum and IL6, IL12 and IFNg reduced in liver. In conclusion, C5 promoted a pro-inflammatory environment in the liver and influenced the serum levels of hepatic enzymes, cytokines and lipid profile.

O papel do complemento na modulação da resposta de células dendríticas não é bem entendido. Neste trabalho observamos que estas células produzirem proteínas do complemento e que o componente C3 regula positivamente a expressão de DC-SIGN, HLA-DR, CD1a, CD80 e CD86 e a produção de IL-6 e IL-12 por células dendríticas humanas. Também observamos, em modelo murino, menor expressão de MHC-II em células dendríticas C5aR-/-, a qual está associada com menor expressão do transativador de MHC-II; menor expressão de moléculas coestimuladoras nas células C3aR-/-, C5aR-/- e C5L2-/- e menor produção de IL-12p40, IL-12p70 e IL-6 em resposta a ligantes de TLR2 pelas células C3aR-/- e C5aR-/-. Conseqüentemente, a ausência de sinal pelos C3aR e C5aR, regula negativamente a habilidade destas células na indução da resposta de linfócitos T CD4+, modificando os níveis de proliferação e citocinas produzidas. De maneira conjunta, observamos participação do complemento na diferenciação e maturação de células dendríticas e no desenvolvimento da resposta imune adaptativa. / The role of complement in the modulation of dendritic cells functions remains elusive. Here we show that these cells are able to produce complement proteins and that complement C3 upregulates the expression of DC-SIGN, HLA-DR, CD1a, CD80 and CD86 and the production of IL-6 e IL-12 by human dendritic cells. We also observed, in a mouse model, lower expression of MHC-II in C5aR-/- dendritic cells, which is correlated to lower expression of MHC-II transactivator; lower expression of costimmulatory molecules in C3aR-/-, C5aR-/- and C5L2-/- cells and lower production of IL-12p40, IL-12p70 and IL-6 by C3aR-/- and C5aR-/- cells in response to TLR2 stimulation. In consequence to the absence of C3aR and/or C5aR signaling we observed that these cells have lower ability to induce CD4+ T cells proliferation and production of Th1 cytokines. Together our data show a participation of complement in dendritic cell differentiation and maturation and in the polarization of adaptative immune responses.

Este trabalho relata o isolamento e caracterização bioquímica parcial de componentes do veneno de Tityus serrulatus (VTs) com ação sobre o sistema complemento (SC). O procedimento de purificação envolveu uma cromatografia de troca iônica do VTs em CM-celulose-52, em pH 7,8 e doze frações foram obtidas, denominadas de I a XIII. A fração I, que apresenta atividade sobre o SC sérico, foi filtrada em Sephacryl S-200 e dez subfrações foram obtidas e denominadas I-1 a I-10. A subfração I-1 foi recromatografada em uma coluna de DEAE-Sepharose, em pH 7,8. Cinco subfrações foram obtidas (DE-1 a DE-5) e as subfrações DE-2, DE-3 e DE-4 incubadas com soro humano normal (SHN) induziram redução da atividade lítica da via clássica/lectina (VC/L) de forma concentração-dependente. A subfração DE-2 apresentou uma banda eletroforética única no gel de eletroforese de poliacrilamida com SDS (SDS-PAGE), com peso molecular (PM) de aproximadamente 247.000 na ausência de b-mercaptoetanol e seis bandas na presença de b-mercaptoetanol. O procedimento de purificação dos componentes ativos da subfração I-4 envolveu basicamente uma cromatografia de troca iônica em Mono-Q, em pH 7,1. Sete subfrações (MQ-1 a MQ-7) foram obtidas neste passo cromatográfico. As proteínas MQ-5 e MQ-7 da subfração I-4 induziram redução da atividade hemolítica das VC/L e via alternativa (VA). Com o objetivo de investigar o mecanismo de ação sobre o SC, SHN foi incubado com a subfração I-4 ou seus componentes (MQ-5 e MQ-7). A imunoeletroforese mostrou a clivagem do fator B e de C3 por estas proteínas, similar ao induzido pela incubação de SHN com zimosan, o que confirma a hipótese de que MQ-5 e MQ-7 induzem a ativação do SC. A capacidade de gerar fatores quimiotáticos no soro foi investigada. Nas condições experimentais, a incubação de SHN com a subfração I-4, proteínas MQ-5 e MQ-7 induziu a migração de neutrófilos similar a induzida pela incubação de soro com zimosan, demonstrando que estas proteínas induzem clivagem de C3 e C5, gerando os fragmentos ativos de C3a e C5a. As proteínas MQ-5 e MQ-7 não foram capazes de lisar eritrócitos de coelho e carneiro. MQ-5 e MQ-7 não induziram redução da atividade hemolítica da VC/L após o aquecimento a 100ºC, portanto a ação destas proteínas não é conseqüência da presença de produtos bacterianos, como lipopolissacarídeos (LPS). As proteínas MQ-5 e MQ-7 apresentaram atividade fibrinogenolítica e caseinolítica e são metaloproteases, já que a atividade fibrinogenolítica foi inibida por EDTA, EGTA e 1,10-fenantrolina. Ambas proteínas apresentaram uma banda eletroforética única por SDS-PAGE, com um PM aproximado de 24.500 na ausência de b-mercaptoetanol, 33.100 na presença de b-mercaptoetanol e um ponto isoelétrico de 4,2. A seqüência N-terminal (Degradação de Edman) e a seqüência de peptídeos trípticos (Espectrometria de massa ESI-MS/MS) de MQ-5 e MQ-7 foram determinadas. Ambas proteínas apresentaram seqüência similar de aminoácidos. Em resumo, este trabalho mostrou que o VTs contém proteases (MQ-5 e MQ-7, metaloproteases) que são capazes de ativar o SC e podem ser importantes no processo inflamatório que ocorre em conseqüência do envenenamento. Além disso, estas proteínas podem ser usadas para depledar o SC em modelos experimentais de doenças em que este sistema está envolvido. / This work reports the isolation and partial biochemical characterization of components from Tityus serrulatus venom (TsV) with action on the complement system (CS). The purification procedure involved an ion-exchange chromatography of TsV on CM-celullose-52, at pH 7.8, twelve fractions were obtained and named I to XIII. Fraction I, showing activity on the serum CS, was filtered on Sephacryl S200 and ten subfractions were obtained and denominated I-1 to I-10. The subfraction I-1 was rechromatographed on a column of DEAE-sepharose, at pH 7.8. Five subfractions were obtained (DE-1 to DE-5) and subfractions DE-2, DE-3 and DE-4 incubated with NHS induced a concentration-dependent reduction in lytic activity of CP/L. Subfraction DE-2 showed a single electrophoretic band by SDS-PAGE, with a molecular weight (MW) of approximately 247,000 in the absence of -mercaptoethanol and six bands in the presence of -mercaptoethanol. The purification procedure of the active compounds of subfraction I-4 involved basically an ion-exchange chromatography on Mono-Q, at pH 7.1. Seven subfractions (MQ-1 to MQ-7) were obtained in this chromatography step. We found that proteins MQ-5 and MQ-7 of subfraction I-4 induced reduction in hemolytic activity for CP/L and AP. In order to investigate the mechanism of action on the CS, NHS was incubated with subfraction I-4 or its components (MQ-5 and MQ-7). The immunoelectrophoresis showed cleavage of factor B and C3 by these proteins, similar to that induced by incubation of NHS with zymosan, which corroborated the hypothesis that MQ-5 and MQ-7 induce activation of the CS. Their capacitiy to elicit serum-induced chemotaxis was then investigated. Under our assay conditions, incubation of NHS with subfraction I-4, protein MQ-5 and MQ-7 induced neutrophil migration similar to that induced by incubation of serum with zymosan, showing that the proteins induce cleavage of C3 and C5, thereby generating the active fragments C3a and C5a. Proteins MQ-5 and MQ-7 alone were unable to lyse rabbit or sheep erythrocytes. MQ-5 and MQ-7 did not induce reduction in hemolytic activity for CP/L after being heated to 100ºC, therefore the action of these proteins is not a consequence of the presence of bacterial products, such as lipopolyssaccharides (LPS). Proteins MQ-5 and MQ-7 showed fibrinogenolytic and caseinolytic activities and they probably are metalloproteases, since its fibrinogenolytic activity was inhibited by EDTA, EGTA and 1,10-phenantroline. Both MQ-5 and MQ-7 showed a single electrophoretic band by SDS-PAGE, with an approximate MW of 24,500 in the absence of -mercaptoethanol, 33,100 in the presence of -mercaptoethanol and an isoelectric point of 5.9. The N-terminal sequence (Edman Degradation) and the sequence of tryptic peptides (Mass spectrometry- ESI-MS/MS) from MQ-5 e MQ-7 were determined. The proteins MQ-5 e MQ-7 showed similar sequence of aminoacids. In summary, this work showed that the TsV venom contains proteases (MQ-5 and MQ-7, metalloproteases) which are able to activate the CS, and may therefore be important in the context of the inflammatory process occurring in consequence of envenomation. In addition these proteins may be used to deplete complement in experimental models of diseases involving participation of this system.

Importantes estudos voltados para a análise das secreções de anfíbios fundamentam-se na grande quantidade de componentes biologicamente ativos presentes nas mesmas, tais como aminas biogênicas, esteróides, aminopolissacarídeos, glicosídeos, inibidores de proteases e diversos outros compostos, responsáveis pela complexa sintomatologia observada no envenenamento. O gênero Bufo apresenta diversas moléculas em suas excreções que podem ser divididas em categorias como aminas biogênicas, bufadienolídeos (bufogeninas), esteróides (bufotoxinas), alcalóides, peptídeos e proteínas. Marongio (2006) verificou que o veneno do sapo Bufo paracnemis, hoje classificado como Rhinella schneideri, apresenta componente ativo sobre a via clássica do sistema complemento (SC), necessitando de melhores estudos e caracterização. Os objetivos deste trabalho foram, portanto, o isolamento e caracterização química do componente do veneno de Rhinella schneideri responsável pelos efeitos observados sobre o sistema complemento. Para a purificação, o veneno foi inicialmente submetido a uma cromatografia catiônica (CM-Celulose-52), obtendo-se 7 frações denominadas C1, C2, C3, C4, C5, C6 e C7. A fração C1 foi cromatografada em resina aniônica (DEAE-SepharoseTM), resultando em 4 subfrações denominadas D1, D2, D3, e D4. A subfração D3 apresentou atividade sobre o sistema complemento e foi submetida a uma Gel Filtração (SephacrylTMS-200), fornecendo 5 subfrações denominadas S1, S2, S3, S4, e S5. As subfrações S2 e S5 induziram redução da atividade hemolítica das vias clássica/lectinas. Ambas apresentaram resultados positivos nos ensaios de migração de neutrófilos e imunoeletroforese bidimensional. No ensaio de capacidade geradora de SC5b-9, a subfração S2 apresentou maior significância frente as demais subfrações utilizadas. Visando esclarecer o mecanismo de ação das subfrações ativas sobre o sistema complemento, testes de determinação da atividade proteolítica ou inibitória de proteases (tripsina, quimotripsina e elastase) foram realizados. No entanto, nas concentrações utilizadas, as amostras não mostraram atividade proteolítica ou inibitória de protease. Os compostos isolados foram também submetidos ao sequenciamento amino-terminal inicial. Foi possível a identificação dos primeiros 15 aminoácidos da banda protéica majoritária do gel de poliacrilamida e 10 e 5 aminoácidos das subfrações S2 e S5, respectivamente. No entanto, os resultados de sequenciamento N-terminal apresentaram baixa confiabilidade, devido à baixa quantidade de material utilizada. Neste trabalho foram isolados e caracterizados dois compostos capazes de induzir a ativação do sistema complemento. Esta ação foi evidenciada, após exposição do soro humano normal às subfrações, por induzirem à formação do complexo SC5b-9 e aumentarem a migração de neutrófilos, provavelmente por induzirem a formação de fatores quimiotáticos. Este estudo permitiu avaliar melhor alguns componentes presentes na complexa mistura que é o veneno de Rhinella schneideri, que, no futuro, poderão se tornar ferramentas farmacológicas importantes para o estudo de diversas patologias relacionadas ao sistema complemento. / Important studies focused on amphibians secretions analysis are based on large amount of biologically active components present in them, such as biogenic amines, steroids, polysaccharide amine, glycosides, protease inhibitors and several other compounds, responsible for complex symptomatology observed in the envenomation by Bufo paracnemis. The genus Bufo presents several molecules in their excretions that can be divided into categories such as biogenic amines, bufadienolides (Bufogenin), steroids (Bufotoxins), alkaloids, peptides and proteins. Marongio (2006) found in one of his studies the toad poison of Bufo paracnemis, now classified as Rhinella schneideri, has an active component of the classical pathway of the complement system (SC), which needs further studies and characterization. The purification process of this study was accomplished through cation chromatography (CM-Cellulose-52), and seven fractions were obtained, called C1, C2, C3, C4, C5, C6 e C7. The fraction C1 was chromatographed on anion-exchange resin (DEAE- SepharoseTM) resulting in 4 subfractions referred to as D1, D2, D3, and D4. The subfraction D3 showed activity on complement system and was subjected to gel filtration (SephacrylTMS-200) giving 5 subfractions termed S1, S2, S3, S4, and S5. The subfractions S2 and S5 induced reduction of the hemolytic activity of the classical/lectin pathway. Both showed positive results in the assays of migration of neutrophils and bidimensional immunoelectrophoresis. In the assay of generating capacity of SC5b-9, the subfraction S2 presented greater significance when compared to the other used subfractions. Aiming to clarify the action mechanism of the active subfractions on the complement system, tests of determination of the proteolytic or inhibitory activity of proteases (trypsin, chymotrypsin and elastase) had been done. However, in the used concentrations, the samples had not shown proteolytic or inhibitory activity of protease. The isolated compounds also had been submitted to the initial amino-terminal sequence. The identification of the first 15 aminoacids of the major proteinic band of the polyacrylamide gel and 10 and 5 aminoacids of the subfractions S2 and S5 was possible, respectively. However, the sequence of N-terminal results had presented low trustworthiness, due to the low amount of used material. In this work, were isolated and characterized two capable compounds to induce the activation of the complement system. This action was evidenced, after exposition of the normal human serum to the subfractions, for inducing to the formation of the SC5b-9 complex and will increase the migration of neutrophils, probably because they can induce the formation of chemotactic factors. This study allowed a better evaluation of some components present in the complex mixture which is the poison of Rhinella schneideri, that, in the future, important pharmacological tools for the study of diverse pathologies related the complement system.

Lipossomas (LUV) são estruturas compostas por uma bicamada lipídica que se organizam de forma semelhante a vesículas, contendo um compartimento aquoso em seu interior. Têm sido avaliados como potenciais carreadores de fármacos. No entanto, após sua administração, in vivo, opsoninas do soro adsorvem-se em sua superfície contribuindo para que o sistema fagocitário mononuclear (SFM) reconheça essas partículas, favorecendo sua remoção da circulação. O sistema complemento (SC) parece ter papel importante neste processo, principalmente por gerar fragmentos ativos do componente C3 (C3b/iC3b) que se depositam nas vesículas lipossomais e são reconhecidos por receptores do complemento presentes, por exemplo, nos polimorfonucleares. Antioxidantes, como a quercetina, têm demonstrado importantes e benéficos efeitos sobre a saúde humana, porém sua baixa solubilidade em água e biodisponibilidade limitam seu uso. Assim, o desenvolvimento apropriado de carreadores de flavonoides seria de grande importância para sua aplicabilidade in vivo. O objetivo do presente trabalho é avaliar a ativação das proteínas do SC por lipossomas compostos de fosfatidilcolina de soja e colesterol (PC:CHOL) ou colesteril-etil-éter (PC:CHOL-OET), contendo ou não quercetina. O consumo das vias clássica (VC) e alternativa (VA) provocado pelas diferentes vesículas foi analisado por ensaio hemolítico e a quantificação de iC3b e anticorpos naturais (IgG e IgM) na superfície dessas partículas foi realizada através de kits de ELISA. A ativação de C3 por vesículas contendo ou não quercetina foi avaliada por imunoeletroforese bidimensional (IEF). Os resultados mostram que lipossomas vazios, compostos por grande quantidade de colesterol, consomem mais os componentes do complemento para ambas as vias, VC e VA. Ainda, a substituição de colesterol por colesteril-etil éter reduziu o consumo das duas vias, mas a ativação do SC ainda é dependente da quantidade deste composto. A incorporação de quercetina não alterou o consumo de ambas as vias. O depósito de iC3b, IgG ou IgM nas vesículas compostas de PC:CHOL-OET na proporção de massa 3:1 foi o menor comparado aos demais. A IEF mostrou que vesículas PC:CHOL vazias induzem maior clivagem de C3 em relação às vesículas PC:CHOL-OET. Ainda, a incorporação de quercetina reduz a conversão de C3 em seus fragmentos. Essas observações sugerem que a preparação lipossomal PC:CHOL-OET em proporção de massa 3:1 parece ser a mais adequada para dar continuidade aos estudos que deverão culminar na tentativa de utilizá-la como carreadora de quercetina para administração in vivo / Liposomes (LUV) are structures composed by lipid bilayer that are organized similarly to vesicles, containing an aqueous compartment inside. They have been evaluated as potential drug carriers, however, after in vivo administration, serum opsonins are adsorb on the surface, contributing to their clearance from the circulation by mononuclear phagocytes system (MPS). The complement system (CS) seems to play an important role in this process, mainly to generate active fragments of the C3 component (C3b/iC3b) that are deposited in the liposomal vesicles and are recognized by complement receptors present, for example, in polymorphonuclear cells. Antioxidants such as quercetin have demonstrated significant and beneficial effects on human health, but its low water solubility and bioavailability limit their use. Thus, the proper development of flavonoids carriers would be of great importance to its applicability in vivo. The objective of this study is to evaluate the activation of SC proteins by liposomes composed of soy phosphatidylcholine and cholesterol (PC: CHOL) or cholesteryl ethyl ether (PC: CHOL-OET), with or without quercetin. The consumption of the classical (CP) and alternative pathway (AP) caused by the different vesicles was analyzed by hemolytic assay and quantification of iC3b and natural antibodies (IgG and IgM) on the surface of these particles was performed using ELISA kits. The activation of C3 by vesicles with or without quercetin was assessed by two-dimensional immunoelectrophoresis (IEF). The results show that empty liposomes, composed of large amounts of cholesterol, consume more CS components in both pathways, CP and AP. Moreover the replacement of cholesterol by cholesteryl ethyl ether reduced the consumption of both pathways, but the activation of the SC is still dependent on the amount of the compound. The incorporation of quercetin did not alter the consumption of both pathways. The deposition of iC3b, IgG or IgM in vesicles composed of PC: CHOL-OET at mass ratio of 3:1 was the lowest compared to the others. The IEF showed that empty vesicles of PC:CHOL induce less cleavage of C3 in relation to vesicles of PC: CHOL-OET. In addition, the incorporation of quercetin reduces the conversion of C3 into its fragments. These observation suggest that the liposomes PC:CHOL at mass ratio 3:1 seems to be the most appropriate to continue the studies that could culminate in an attempt to use it as a carrier to administrate quercetin in vivo