No description available.

L’asthme bronchique est caractérisé par un remodelage et une inflammation des voies aériennes. La masse du muscle lisse ainsi que la déposition de matrice extracellulaire sont augmentées dans la paroi des bronches asthmatiques, ce qui contribue à l’obstruction respiratoire. Peu d’études ont évalué les effets des traitements utilisés dans l’asthme sur le remodelage bronchique, et surtout peu de données sont disponibles concernant les effets sur le muscle lisse. La combinaison de corticostéroïdes et de β2-agonistes à longue durée d’action administrée par inhalation permet de mieux contrôler les crises d’asthme par rapport à la monothérapie avec des médicaments corticostéroïdes. Cependant, l’action spécifique de la combinaison sur le remodelage et sur l’inflammation des bronches périphériques n’est pas décrite. Surtout, il reste à clarifier si l’administration de la combinaison est avantageuse par rapport à la monothérapie corticostéroïde. La plupart des études réalisées chez l’homme utilisent des tissus bronchiques obtenus par biopsie endobronchique, qui ne sont pas représentatifs du processus pathologique affectant les voies respiratoires périphériques. Leur inaccessibilité par des méthodes non invasives est la raison pour laquelle si peu de données existent sur la pathophysiologie des voies périphériques chez les patients asthmatiques. L’asthme équin, aussi connu comme « le souffle », est une pathologie obstructive des chevaux adultes considérée comme un modèle animal d’asthme humain. Elle est caractérisée par un remodelage des bronches périphériques et par une inflammation bronchoalvéolaire de type neutrophilique. En étudiant le modèle équin, cette thèse a évalué la contribution des médicaments corticostéroïdes et de β2-agonistes à longue durée d’action, administrée comme monothérapies ou en combinaison, sur la réversibilité du remodelage et de l’inflammation de voies aériennes dans l’asthme bronchique. A cette fin, nous avons d’abord optimisé et validé l’application de la biopsie endobronchique et de l’échographie endobronchique chez le cheval adulte. Nos résultats indiquent que les échantillons obtenus par biopsie endobronchique sont inadéquats pour l’évaluation quantitative de la masse du muscle lisse chez le cheval. Cependant, ils permettent d’étudier les changements quantitatifs des structures épithéliales et de la lamina propria, ainsi que les aspects qualitatifs du muscle lisse. L’échographie endobronchique, quant à elle, permet d'estimer la masse du muscle lisse bronchique, et ce, chez des chevaux sains et chez des chevaux asthmatiques. Cette thèse démontre aussi que qu’un traitement de 12 semaines avec des corticostéroïdes induit une diminution significative de la masse du muscle lisse périphérique, qui n’est pas amélioré davantage par l’administration concomitante d’un β2-agoniste à longue durée d’action. Cette diminution est toutefois incomplète. Un effet positif et synergique de la combinaison a également été observé au niveau de la déposition de matrice extracellulaire. La combinaison a produit une diminution significative de la quantité de matrices déposées dans la lamina propria et dans la couche du muscle lisse dans les bronches centrales, alors que l’effet été limité à la couche du muscle lisse dans les bronches périphériques. La combinaison n’améliore pas le contrôle de l’inflammation bronchique ni bronchiolaire par rapport aux monothérapies ; cependant, elle diminue la neutrophilie bronchoalvéolaire de façon synergique. / Airway remodeling and inflammation are the hallmarks of asthma. Both airway smooth muscle (ASM) mass and extracellular matrix (ECM) deposition are increased in the central and peripheral airways of asthmatic patients, which contribute to airway obstruction. Few studies have investigated the ability of current asthma medications to reverse airway remodeling, especially the increased ASM mass. Inhaled corticosteroids (ICS) and long-acting β2-agonist combinations (ICS/LABA) are more effective than ICS monotherapy to control asthma exacerbations. However, their efficacy at modifying bronchial inflammation and remodeling at the peripheral level of the lung is not well-described. In fact, most work has been performed using endobronchial biopsy samples obtained from asthmatic subjects, which completely disregard the alterations occurring in peripheral airways. Ethical considerations limit the possibility of biopsying the peripheral airways in humans due to the invasiveness of the procedure. Equine asthma, or heaves, is a naturally-occurring disease of adult horses and a recognized animal model of human asthma characterized by neutrophilic inflammation as well as ASM and ECM remodeling of peripheral airways. This thesis has assessed the contribution of ICS and LABA, alone or combined, to the reversal of remodeling and inflammation in central and peripheral airways using the equine asthma model. To attain this goal, we have first optimized and validated the application of endobronchial biopsy and endobronchial ultrasound (EBUS) in the equine species. EBUS reliably estimates the bronchial ASM. Subsequently, asthmatic horses with ongoing airway remodeling and inflammation were treated with ICS, LABA, ICS/LABA, or antigen avoidance. Lung function, airway remodeling and inflammation were then assessed weekly for 3 months. Our results demonstrated a 30% decrease of peripheral ASM remodeling attained with ICS and ICS/LABA pharmacological treatment. A decrease of a similar magnitude of peripheral ASM was previously reported after 6 and 12 months of ICS monotherapy and antigen avoidance, respectively. A synergistic effect of ICS/LABA was observed on ECM deposition and airway lumen neutrophils. ICS/LABA decreased the ECM fraction of the ASM layer both peripherally and centrally, while the same effect on the lamina propria was observed only in central airways. Both ICS/LABA and ICS monotherapy decreased submucosal inflammation in central airways, while only ICS/LABA and antigen avoidance decreased bronchoalveolar neutrophilia. In conclusion, our results suggest that the enhanced therapeutic effect of ICS/LABA over ICS monotherapy in asthmatic horses was associated with a reduction of ECM deposition, mainly observed within the large airways, and possibly also with a decreased airway neutrophilia. However, ICS/LABA did not provide additional benefit to ICS monotherapy in terms of peripheral ASM remodeling as both induce a 30% decrease of the ASM mass in 3 months.

L’athérosclérose est une pathologie cardiovasculaire chronique impliquant de nombreux acteurs. Les cellules du muscle lisse vasculaire (CMLV) jouent un important rôle dans la pathogénicité. Lors de la formation des plaques athérosclérotiques, ces cellules entraînent l’augmentation de la taille de l’athérome, accentuent la formation du chapeau fibreux et à long terme, contribuent à l’instabilité de la plaque. Dans cette étude, nous nous sommes intéressés à l’impact d’ARF6 sur les cellules du muscle lisse vasculaire et ses implications pathologiques dans l’athérosclérose. Les ARF sont des GTPases agissant comme interrupteurs moléculaires dans divers processus physiologiques tels que le trafic vésiculaire intracellulaire et le remodelage des lipides membranaires. ARF6 est importante pour la prolifération et la migration cellulaire des CMLV, deux phénomènes importants dans le développement de l’athérosclérose. Nous émettons donc l’hypothèse que la GTPase ARF6 est impliquée dans la progression de l’athérosclérose. En premier lieu, nous avons étudié l’effet de la GTPase dans le phénomène de l’invasion cellulaire. Dans l’athérosclérose, plusieurs facteurs environnementaux influencent l’invasion des CMLV. Nous avons voulu vérifier l’effet d’ARF6 sur l’invasion des CMLV médiée par le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF-BB) et l’angiotensine II (Ang II). Dans un modèle humain, l’invasion était diminuée en l’absence d’ARF6. Nous avons démontré que ce mécanisme résultait d’un effet d’ARF6 sur l’activité de la métalloprotéinase matricielle MMP14. En second lieu, nous avons voulu évaluer l’effet d’ARF6 dans un modèle in vivo d’athérosclérose. En utilisant un modèle accéléré d’athérosclérose inductible, nous avons inhibé ARF6 dans les cellules du muscle lisse. Après dix semaines de diète riche en gras, nous avons observé une diminution de la taille des lésions athérosclérotiques dans les souris ARF6 KO, accompagnée d’une réduction de l’expression des facteurs pro-inflammatoires tels qu’IL-6. Dans un modèle in vitro, l’absence d’ARF6 réduisait l’absorption lipidique en agissant sur l’expression des transporteurs. De plus, ARF6 régulait des voies de signalisation impliquées dans l’inflammation. En somme, nous avons démontré l’importance d’ARF6 dans la modulation pathologique des CMLV dans l’athérosclérose. Ainsi, ARF6 contribue à la pathogénicité des CMLV en modulant leur invasion cellulaire tout en jouant un rôle pro-inflammatoire. / Atherosclerosis is a chronic cardiovascular disease characterized by an accumulation of lipids, followed by the infiltration of macrophages and vascular smooth muscle cells (VSMC). VSMC are responsible for the increase of lesion size, the formation of a fibrous cap, and eventually contributing to the plaque instability. In this study, we were interested in the role of ARF6 in the vascular smooth muscle cells and its pathological implications in atherosclerosis. ARF are a family of GTPases that act as molecular switches and are involved in diverse physiological mechanisms, such as vesicular traffic and membrane lipid transformation. In VSMC, ARF6 is important for cell proliferation and migration, two processes involved in atherosclerosis. We therefore hypothesize that the GTPase ARF6 is involved in the development of atherosclerosis through its impact on VSMC. First, we studied the role of ARF6 in the mechanism of cell invasion. In atherosclerosis, multiple environmental factors affect VSMC invasion. We verified the impact of ARF6 on platelet-derived growth factor (PDGF-BB) and angiotensin II (Ang II)-mediated invasion. Using a human model, we observed a reduction of invasion in the absence of ARF6. We have demonstrated that this mechanism is due to the effect of ARF6 on the activity of the matrix metalloproteinase MMP14. Second, we wanted to verify the role of ARF6 in atherosclerosis in an in vivo model. Using an accelerated inducible atherosclerosis model, we inhibited ARF6 in smooth muscle cells. After ten weeks of high-fat diet, we observed a reduction in the size of atherosclerotic lesions in ARF6 KO mice. This reduction was accompanied by a decrease in the expression of proinflammatory factors. In our in vitro model, ARF6 depletion reduced lipid uptake by downregulating the lipidic transporter expression. Also, ARF6 was responsible to activate inflammation signaling pathways. In summary, we have demonstrated the impact of ARF6 in the pathological modulation of VSMC in atherosclerosis. Indeed, ARF6 contributes to the pathogenicity of VSMC through its ability to modulate cell invasion and induce proinflammatory actions.

L’asthme est une des maladies chroniques les plus prévalentes, affectant environ 300 millions d’individus dans le monde et causant plus de 400 000 décès annuellement. La condition se caractérise par une hyperréactivité bronchique, de l’inflammation pulmonaire et des changements structuraux (remodelage) des voies respiratoires. Bien que l’inflammation soit le plus souvent de type éosinophilique dans l’asthme, une proportion importante des patients affectés par la forme sévère de la maladie présente plutôt une infiltration des voies respiratoires par les neutrophiles. Cette inflammation neutrophilique a été associée à plusieurs issues cliniques négatives, notamment à une mauvaise réponse aux traitements, à une obstruction respiratoire permanente et à la mortalité. Malgré l’importance de ces conséquences cliniques pour les patients affectés, le rôle de l’inflammation neutrophilique dans la pathophysiologie de l’asthme, dont ses effets sur le remodelage bronchique, demeure peu exploré. Dans toutes les formes d’asthme, les traitements usuels de la maladie (glucocorticoïdes et bronchodilatateurs) ne permettent pas de renverser entièrement les lésions de remodelage bronchique, dont l’augmentation de la masse du muscle lisse, et ne contrôlent pas adéquatement la neutrophilie pulmonaire. L’augmentation de la masse musculaire lisse bronchique représente pourtant une cible thérapeutique importante vu son implication dans le rétrécissement de la lumière bronchique et le bronchospasme. Les objectifs de cette thèse ont donc été d’étudier les mécanismes potentiellement impliqués dans l’association entre l’inflammation neutrophilique et la sévérité de la maladie, et d’investiguer les effets de thérapies anti-neutrophiliques sur le remodelage bronchique dans le modèle de l’asthme équin sévère. Similairement à la condition humaine, l’asthme équin sévère est caractérisé par une obstruction respiratoire fluctuante, de l’inflammation pulmonaire et un remodelage bronchique, notamment une augmentation de la masse du muscle lisse. Cette maladie se prête particulièrement bien à l’étude du phénotype neutrophilique puisque c’est cette cellule granulocytaire qui infiltre le milieu pulmonaire lors des exacerbations cliniques. Les études réalisées dans ce projet doctoral ont permis de déterminer que l’azithromycine, un macrolide possédant des propriétés immunomodulatrices, réduit l’inflammation neutrophilique dans le modèle de l’asthme équin. Toutefois, ce traitement n’a pas diminué l’obstruction bronchique ni les lésions de remodelage lorsqu’utilisé en monothérapie, et n’a pas potentialisé les effets des corticostéroïdes inhalés. Ces résultats suggèrent que l’atténuation de l’inflammation pulmonaire ne suffit pas à rétablir l’homéostasie tissulaire dans la phase chronique de la maladie. Toutefois, l’hétérogénéité phénotypique des neutrophiles pourrait rendre leur simple quantification dans les sécrétions respiratoires insuffisante pour élucider leurs répercussions dans l’asthme. Par exemple, les neutrophiles pourraient contribuer au remodelage bronchique par la relâche de vésicules extracellulaires, des nanoparticules qui peuvent modifier la biologie des cellules locales et distantes. Ainsi, les caractéristiques des vésicules neutrophiliques et leur effet prolifératif sur le muscle lisse bronchique ont été examinés. Les résultats obtenus indiquent que les vésicules produites par les neutrophiles augmentent la prolifération du muscle lisse bronchique lorsqu’elles proviennent de cellules exposées au lipopolysaccharide, un fragment bactérien omniprésent dans l’environnement et incriminé dans l’infiltration neutrophilique et le développement de l’obstruction bronchique dans l’asthme humain et équin. / Asthma is one of the most prevalent chronic diseases, affecting approximately 300 million people worldwide and causing over 400,000 deaths annually. The condition is characterized by the combination of bronchial hyperreactivity, lung inflammation, and structural changes in the airways (remodeling). Although an eosinophilic inflammation is common in asthma, a significant proportion of patients affected by the severe form of the disease have a neutrophilic airway infiltration. The neutrophilic phenotype has been associated with several negative outcomes in human asthma, including poor response to therapy, permanent airway obstruction and mortality. Despite these associations, the role of neutrophils in asthma, including its effects on airway remodeling, remains insufficiently explored. Unfortunately, standard asthma therapies (glucocorticoids and bronchodilators) do not adequately control neutrophilic inflammation and reverse only partially, if at all, bronchial remodeling lesions, including the increased airway smooth muscle mass. This structural modification is however an important therapeutic target because of its involvement in bronchial lumen narrowing and bronchospasm. The main objectives of this thesis were therefore to study mechanisms potentially involved in the association between neutrophilic inflammation and asthma severity, and to investigate the effects of anti-neutrophilic therapies on bronchial remodeling reversibility in the severe equine asthma model. Similar to the human disease, severe equine asthma is characterized by fluctuating airflow obstruction, pulmonary inflammation, and remodeling lesions, including a large increase in airway smooth muscle mass. Clinical exacerbations are characterized by a marked pulmonary neutrophilic influx, making this disease particularly suitable to study the neutrophilic phenotype. Studies conducted during this doctoral program revealed that azithromycin, a macrolide with immunomodulatory properties, reduces neutrophilic inflammation in the equine asthma model, but fails to alleviate bronchial obstruction and remodeling lesions, suggesting that the control of neutrophilic inflammation is not sufficient to restore tissue homeostasis when the disease reaches its chronic phase. However, the simple quantification of neutrophils within respiratory secretions might not elucidate comprehensively the possible functional consequences of this cell in the pathophysiology of asthma. For instance, neutrophils could lead and sustain bronchial structural lesions through the release of extracellular vesicles. Those nanoparticles can modify the biology of local and distant cells and are involved in the pathophysiology of several inflammatory diseases. Thus, the characteristics and the effect of neutrophil extracellular vesicles on airway smooth muscle proliferation were studied in horses with severe asthma. The results obtained indicate that extracellular vesicles increase bronchial smooth muscle cell proliferation when they are produced by neutrophils exposed to lipopolysaccharide, a ubiquitous environmental contaminant incriminated in the development of neutrophilic infiltration and bronchial obstruction in human and equine asthma.

L’ovaire est un organe indispensable à la fonction reproductive, car il permet la production, la maturation et la libération de la cellule germinale femelle, l’ovocyte. Malgré son rôle central dans la régulation de la reproduction chez la femme, plusieurs de ses processus physiologiques et de ses conditions pathologiques sont encore imparfaitement décrits. La caractérisation du rôle de nouveaux régulateurs pourrait permettre l’élucidation de plusieurs questionnements actuels en physiologie ovarienne. Initialement étudiée dans l’organogenèse et l’oncogenèse pour son implication dans la prolifération, la migration, la différenciation et l’apoptose cellulaire, la voie de signalisation Hippo pourrait s’avérer être un facteur déterminant dans la physiologie ovarienne. En effet, elle a été récemment rapportée comme participant à la régulation de l’activation folliculaire, de la prolifération des cellules de la granulosa et de l’ovulation. La voie Hippo consiste en une cascade de kinases menant ultimement à la phosphorylation des deux co-régulateurs transcriptionnels YAP1 (yes-associated protein 1) et TAZ (transcriptional coactivator with a PDZ-binding motif). L’objectif général de ce projet de thèse était de caractériser les rôles de Yap1/Taz dans la physiologie ovarienne en utilisant des modèles murins transgéniques d’inactivation conditionnelle de ces gènes dans les cellules de la granulosa. La première portion du projet a conduit à la caractérisation d’un phénotype inattendu de défaut des oviductes. Les souris femelles adultes étaient sous-fertiles et leur fonction ovarienne était intacte. En fait, la sous-fertilité était causée par le piégeage des embryons dans des dilatations de la paroi de l’oviducte, empêchant ainsi leur transport adéquat vers l’utérus. Nous sommes parvenus à démontrer que la perte d’expression de YAP1/TAZ dans les couches musculeuses de l’oviducte conduisait à un amincissement progressif de sa paroi et était ultimement responsable de l’échec du transport embryonnaire. Dans la seconde portion du projet, nous avons utilisé la culture primaire de cellules de la granulosa afin de décrire l’implication de la voie Hippo dans l’ovulation. Nous avons identifié la protéine kinase A comme modulateur clé de l’activation de la voie Hippo par l’hormone lutéinisante (LH). En utilisant un système adénoviral de délétion de Yap1/Taz, nous avons mis en évidence l’importance de leur expression pour l’induction de plusieurs gènes cibles de la LH. Ensuite, au moyen d’une expérience d’immunoprécipitation de la chromatine, nous avons démontré l’implication de YAP1 dans la régulation de la transcription de l’amphiréguline, un effecteur central de la cascade de signalisation de la LH. Dans son ensemble, ce projet a permis de mettre la lumière sur de nouveaux rôles de la voie de signalisation Hippo dans la régulation des cellules musculaires lisses de l’oviducte et des cellules de la granulosa durant l’ovulation chez la souris. Elles ouvrent la voie à une investigation plus précise de l’implication de la voie Hippo dans ces deux organes clés du système reproducteur femelle. / The ovary is a central organ of the female reproductive tract involved in oocyte production, maturation and release. Still, many physiological and pathological ovarian processes remain to be described more comprehensively. The precise characterization of the roles of new ovarian regulators would contribute to a better understanding of its physiology. The Hippo signaling pathway was initially studied for its roles in cellular proliferation, apoptosis, migration and differentiation during organ and tumor development. Recently, it has been shown to be involved during normal physiological processes of multiple organs, including the ovary. Hippo was shown to be involved in the activation of primordial follicles, in the proliferation of granulosa cells and during ovulation. Hippo consists of a central kinase cascade leading to the phosphorylation of YAP1 (yes-associated protein 1) and TAZ (transcriptional coactivator with a PDZ-binding motif), the two transcriptional coactivators of the pathway. The objective of this thesis was to characterize the precise roles of Yap1/Taz in ovarian physiology using transgenic mouse models of their genetic deletion in granulosa cells. The first part of this thesis project led to the characterization of an unexpected oviductal phenotype. Adult females were subfertile and their ovarian function was unaffected. The subfertility was rather caused by the entrapment of embryos in oviductal dilations, preventing their normal transport to the uterus. We demonstrated that loss of YAP1/TAZ expression in oviductal smooth muscle cells led to a gradual thinning of the oviductal wall and was responsible for the embryo transport impediment. In the second part of this project, we cultured primary mouse granulosa cells to characterize the roles of the Hippo signaling pathway during ovulation. We showed that protein kinase A is a key effector of Hippo activation following the luteinizing hormone (LH) surge. We then demonstrated that Yap1/Taz expression is required for the induction of several LH target genes. Using a chromatin immunoprecipitation experiment, we were able to show that YAP1 drives the expression of amphiregulin, a key paracrine transmitter of the LH signal, during the early events of ovulation. Together, these results identified new roles of the Hippo signaling pathway in the regulation of oviductal smooth muscle cells and of granulosa cells during ovulation. This thesis project opens the door to new avenues of investigation of Hippo involvement in the regulation of the female reproductive system.

L’asthme équin est une condition inflammatoire fréquente affectant les voies respiratoires inférieures. Cette maladie est caractérisée par une bronchoconstriction, une hyperréactivité bronchique, ainsi que des changements des différentes couches tissulaires des voies respiratoires que l’on regroupe sous le terme de remodelage pulmonaire. Le remodelage du muscle lisse bronchique dans l’asthme comprend une hyperplasie, une hypertrophie, ainsi qu’une altération des propriétés contractiles des myocytes. Bien que ces changements aient été décrits dans la forme sévère de l’asthme équin, la présence de telles altérations chez les chevaux atteints des formes légères à modérées de l’asthme demeure incertaine. L’objectif de notre étude est donc de déterminer si le muscle lisse bronchique présente un remodelage chez les chevaux asthmatiques légers à modérés. Des biopsies endobronchiques provenant de 18 chevaux asthmatiques et de 7 chevaux contrôles ont été étudiées. Le diagnostic était basé sur les signes cliniques et confirmé par cytologie du lavage bronchoalvéolaire. La prolifération des cellules du muscle lisse bronchique était évaluée par l’expression du proliferating cell nuclear antigen marqué par immunohistochimie, et l’expression génique de l’isoforme rapide de la myosine, une protéine hypercontractile, a été mesurée par RT-qPCR. Cette étude a permis de mettre en évidence une surexpression de l’isoforme rapide de la myosine chez les chevaux asthmatiques légers à modérés. Malgré l’absence de différence dans le taux de prolifération cellulaire du muscle lisse bronchique entre les groupes, le pourcentage de myocytes en prolifération était corrélé à l’inflammation pulmonaire neutrophilique ainsi qu’à l’expression de l’isoforme rapide de la myosine chez les chevaux asthmatiques. Cette première étude évaluant le remodelage du muscle lisse bronchique chez les chevaux asthmatiques légers à modérés a démontré une altération fonctionnelle du muscle lisse bronchique dans les formes légères de l’asthme équin, une possible influence de la neutrophilie pulmonaire sur la prolifération du muscle lisse, ainsi qu’une association entre les phénotypes prolifératifs et contractiles. Les altérations identifiées pourraient servir de biomarqueurs potentiels dans l’évolution de la maladie et de la réponse aux traitements. / Equine asthma is a common inflammatory condition affecting the lower airways. This disease is characterised by bronchoconstriction, airway hyperreactivity, and changes in the different tissue layers of the airways, which are referred to as airway remodelling. Remodelling of the smooth muscle in asthma includes hyperplasia, hypertrophy, and altered contractile properties of the myocytes. Although these changes have been described in severe equine asthma, their presence in horses with milder forms of asthma remains unclear. The aim of our study was therefore to determine whether airway smooth muscle remodelling occurs in horses with mild to moderate asthma. Endobronchial biopsies from 18 asthmatic horses and 7 control horses were studied. The diagnosis was based on clinical signs and confirmed by bronchoalveolar lavage cytology results. Airway smooth muscle cell proliferation was assessed by the expression of immunohistochemically labelled proliferating cell nuclear antigen, and the gene expression of the fast contracting myosin isoform, a hypercontractile protein, was measured by RT-qPCR. This study showed overexpression of the fast contracting myosin isoform in horses with mild to moderate asthma. Although there was no difference in the proliferation rate of airway smooth muscle myocyte between groups, it was correlated with neutrophilic lung inflammation as well as with the expression of the fast myosin isoform in asthmatic horses. This first study evaluating airway smooth muscle remodelling in mild to moderate asthmatic horses has demonstrated a functional alteration of airway smooth muscle in mild equine asthma, as well as a possible influence of pulmonary neutrophilia on smooth muscle proliferation, and an association between proliferative and contractile phenotypes. The identified alterations could eventually serve as biomarkers in the evolution of the disease and the response to treatments.

No description available.

Vascular remodelling due to excessive proliferation and apoptosis resistance of pulmonary arterial smooth muscle (PASMCs) and endothelial cells (ECs) has been attributed to the pathogenesis of pulmonary arterial hypertension (PAH). It is an incurable cardiovascular disorder, which leads to right heart failure and death, if left untreated. Heterozygous germline mutations in the bone morphogenetic protein receptor type II (BMPR2) have been linked with the majority (~75%) of the familial form of the disease (HPAH). Mutations in the BMPR2 gene impinge upon the BMP signalling which perturbs the balance between BMP and TGF-β pathways leading to the clinical course of the disease. Current therapies were discovered prior to the knowledge that PAH has substantial genetic components. Hence, this study aims to identify novel therapeutic intervention and provide novel insights into how the dysfunctional BMPRII signalling contributes to the pathogenesis of PAH. This work demonstrates that cryptolepines and FDA approved drugs (doxorubicin, taxol, digitoxin and podophyllotoxin) inhibit the excessive proliferation and induce apoptosis in BMPR2 mutant PASMCs by modulating the BMP and TGF-β pathways. Moreover, established drug PTC124 has also been tested but has failed to promote translational readthrough. I have also shown that dysregulated apoptosis of PASMCs and HPAECs is mediated through the BMPRII-ALK1-BclxL axis. Finally, the siRNA screen targeting approximately 1000 genes has identified novel proteins including PPP1CA, IGF-1R, MPP1, MCM5 and SRC each capable of modulating the BMPRII signalling. Taken together, this study for the very first time has identified novel compounds with pro-BMP and anti-TGFβ activities which may provide therapeutic intervention prior to or after the onset of PAH. / Commonwealth Scholarship Commission in the UK

Neointimal hyperplasia (NIH) is a cardiovascular disease characterised by increased smooth muscle cell (SMC) inflammation and proliferation. Suppressor of cytokine signalling 3 (SOCS3) limits Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) pathways involved in vascular remodelling but is limited by its short biological half-life. Therefore, mutation of all 9 Lys residues that are potential sites of ubiquitylation to Arg should produce a mutated SOCS3 resistant to ubiquitin-mediated proteasomal degradation (“Lys-less” SOCS3). This study hypothesise that enhancing SOCS3 stability and limiting JAK/STAT signalling may provide sustained inhibition of the vascular remodelling in NIH. Lentiviral transduction of WT and Lys-less SOCS3 in human saphenous vein (HSVSMCs) was highly efficient after 48 hours (>97%) and was sustained over 2 weeks. Lys-less SOCS3 was resistant to ubiquitylation contrary to WT-transduced HSVECs, and Lys-less SOCS3 was more stable (t1/2=4h) than WT (t1/2<4h) (n=6, P<0.001) in HSVSMCs. In HSVSMCs, both Lys-less SOCS3 and WT inhibited sIL-6Rα/IL-6 mediated STAT3 activation but not extracellular signal regulated protein kinase 1/2 (ERK1/2) by 80±7% (Lys-lessSOCS3/pSTAT3) and 74±6% (WT/pSTAT3) (n=3, P<0.05) and similarly inhibited PDGF-mediated STAT3 activation but not ERK1/2 by 67±17% (Lys-less SOCS3/pSTAT3) and 72±18% (WT/pSTAT3) (n=3, P<0.05). Functionally, Lys-less SOCS3 and WT were equivalent in inhibiting sIL-6Rα/IL-6 and PDGF-induced proliferation, whilst having no effects on PDGF-induced migration in HSVSMCs. Lys-less SOCS3 can be successfully transduced into primary HSVSMCs. It is more stable than WT yet retains its functional ability to ameliorate pro-inflammatory signalling and SMC proliferation, making it an attractive option for developing treatment of NIH. / University of Botswana

Nitric oxide (NO) is an important biological molecule within the body, which over production of this molecule in response to different stimulations can cause various inflammatory diseases. Over production of this molecule is caused by the induction of the inducible nitric oxide synthase (iNOS) enzyme. This enzyme uses L-arginine as a substrate and therefore the presence and transport of this amino acid into the cells can be a key factor in regulating NO over production. Different signalling mechanisms have been implicated in the regulation of this pathway and one of which involves the Mitogen Activated Protein Kinases (MAPK). This family of proteins respond to inflammatory conditions and may mediate effects induced by inflammatory mediators. Of the MAPKs, the role of the c-Jun-N-terminal kinase (JNK) pathway in the induction of iNOS is still controversial. JNK and its downstream target, the transcription factor Activator Protein-1 (AP-1), have shown contradictory effects on iNOS induction leading to controversies over their role in regulating iNOS expression in different cell systems or with various stimuli. The studies described in this thesis have determined the role of JNK/AP-1 on iNOS expression, NO production, L-arginine uptake and also on the transporters responsible for L-arginine transport into the cells. The studies were carried out in two different cell types: rat aortic smooth muscle cells (RASMCs) and J774 macrophages which are both critically associated with the over production of NO in vascular inflammatory disease states. The first approach was to block the expression of the inducible L-arginine-NO pathway using SP600125 and JNK Inhibitor VIII which are both pharmacological inhibitors of JNK. The results from these studies showed that the pharmacological intervention was without effect in RASMCs, but inhibited iNOS, NO and L-arginine transport in J774 macrophages. In contrast, the molecular approach employed using two dominant negative constructs of AP-1 (TAM-67 and a-Fos) revealed a different profile of effects in RASMCs, where a-Fos caused an induction in iNOS and NO while TAM-67 had an inhibitory effect on iNOS, NO, L-arginine transport and CAT-2B mRNA expression. The latter was unaffected in RASMCs but suppressed in J774 macrophages by SP600125. Examination of JNK isoforms expression showed the presence of JNK1 and 2 in both cell systems. Moreover, stimulation with LPS/IFN- or LPS alone resulted in JNK phosphorylation which did not reveal any difference between smooth muscle cells and macrophages. In contrast, expression and activation of AP-1 subunits revealed differences between the two cell systems. Activation of cells with LPS and IFN- (RASMCs) or LPS alone (J774 macrophages) resulted in changes in the activated status of the different AP-1 subunit which was different for the two cell systems. In both cell types c-Jun, JunD and Fra-1 were increased and in macrophages, FosB activity was also enhanced. Inhibition of JNK with SP600125 caused down-regulation in c-Jun in both cell types. Interestingly this down-regulation was in parallel with increases in the subunits JunB, JunD, c-Fos and Fra-1 in RASMCs or JunB and Fra-1 in J774 macrophages. Since, SP600125 was able to exert inhibitory effects in the latter cell type but not in RASMCs, it is possible that the compensatory up-regulation of certain AP-1 subunits in the smooth muscle cells may compensate for c-Jun inhibition thereby preventing suppression of iNOS expression. This notion clearly needs to be confirmed but it is potentially likely that hetero-dimers formed between JunB, JunD, c-Fos and Fra-1 could sustain gene transcription in the absence of c-Jun. The precise dimer required has not been addressed but unlikely to exclusively involve JunB and Fra-1 as these are up-regulated in macrophages but did not sustain iNOS, NO or induced L-arginine transport in the presence of SP600125. To further support the argument above, the dominant negatives caused varied effects on the activation of the different subunits. a-Fos down-regulated c-Jun, c-Fos, FosB, Fra-1 whereas TAM-67 reduced c-Jun and c-Fos but marginally induced Fra-1 activity. Associated with these changes was an up-regulation of iNOS-NO by a-Fos and inhibition by TAM-67. Taken together, the data proposes a complex mechanism(s) that regulate the expression of the inducible L-arginine-NO pathway in different cell systems and the complexity may reflect diverse intracellular changes that may be different in each cell type and not always be apparent using one experimental approach especially where this is pharmacological. Moreover, these findings strongly suggest exercising caution when interpreting pure pharmacological findings in cell-based systems particularly where these are inconsistent or contradictory.