Submitted by Ricardo Cedraz Duque Moliterno (ricardo.moliterno@uefs.br) on 2017-10-05T21:58:20Z No. of bitstreams: 1 TESE- MARIA MAIANY DE OLIVEIRA.pdf: 1486275 bytes, checksum: 077fcda867394bf1737e7758d79af6a2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-05T21:58:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE- MARIA MAIANY DE OLIVEIRA.pdf: 1486275 bytes, checksum: 077fcda867394bf1737e7758d79af6a2 (MD5) Previous issue date: 2017-03-29 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Banana (Musa spp.) is considered one of the most important fruits in world trade due to its nutritional and economic potential.But although there is a large number varieties on the market, the banana is still affected by many diseases.The application of the method of crosses in this species is very difficult because the majority of cultivated varieties is triploid presenting low fertility. In this case, it is necessary to use biotechnology and its tools applied to non-conventional genetic improvement to develop new varieties that have resistance to their different types of pathogens.This work was carried out with the objective of adapting the technique of obtaining embryogeniccallus of banana by means of the Scalp method in cultivars Brazilian Ma?? and Pacovan, adjusting the processes of induction of meristematic structures and multiplication of shoots and induce increased genetic variability by in vitro mutagenesis using the chemical agent ethylmethanesulfonate and, of the genetic transformation by the bombardment of microparticles. Was evaluated the callus formation, the effect of mutagenic in the in vitro cultivation of shoots and the effects of genetic transformation on shoot resistance in selection medium containing the herbicide Imazapyr. The results showed that the merystematic structures obtained have the capacity to origin callus with only one month of cultivation, and both cultivars developed friable callus with average values above 90%.The efficiency of this method was evidenced by the high capacity of induction of friable callus in the two evaluated cultivars but also by the rapidity in the process of obtaining calluses, being the first study of adaptation of the methodology for Brazilian banana cultivars.On the other hand, the evaluation of the mutation induction allowed to conclude that the survival and the capacity of bud formation decreased as a function of the increase of the concentration and the immersion time in the ethylmethanesulfonate.The surviving plants underwent a sorting with the fusaric acid selective agent in which it was possible to regenerate in vitro plants of the cultivars submitted to treatment with the mutagen and to select possible mutants with fusaric acid resistance for cultivarsMa?? and Pacovan.And the genetic transformation method proved efficient in the regeneration of shoots resulting in high values of survival and multiplication, where possible transgenic plants of banana cv. Ma?? were obtained after selection of resistance to the herbicide.Therefore, it is concluded that all the material produced, both in the mutagenic phase and in the genetic transformation, presents a greater genetic variability potentially applicable to the banana improvement. / A banana (Musa spp.) ? considerada um dos mais importantes frutos no com?rcio mundial em virtude seu potencial nutritivo e econ?mico. Mas, apesar de existir um grande n?mero de variedades no mercado, a bananeira ainda ? acometida por muitas doen?as. A aplica??o do m?todo de cruzamentos nesta esp?cie ? muito dif?cil, pois a maioria das variedades cultivadas ? triploide apresentando baixa fertilidade. Nesse caso, faz-se necess?rio o uso da biotecnologia e de suas ferramentas aplicadas ao melhoramento gen?tico n?o convencional para desenvolver novas variedades que tenham resist?ncia aos seus diferentes tipos de pat?genos. Este trabalho foi realizado com os objetivos de adaptar a t?cnica de obten??o de calos embriog?nicos de bananeira por meio do m?todo Scalp nas cvs. Ma?? e Pacovan, ajustando os processos de indu??o de estruturas polimeristem?ticas ede multiplica??o de brotos e induzir o aumento da variabilidade gen?tica por meio da mutag?nese in vitro com o uso do agente qu?mico etilmetanosulfonato e, da transforma??o gen?tica pelo bombardeamento de micropart?culas.Foram avaliados os calos formados, o efeito do mutag?nico no cultivo in vitro de brotos e, os efeitos da transforma??o gen?tica quanto ? resist?ncia dos brotos em meio de sele??o contendo o herbicida Imazapyr. Os resultados mostraram que as estruturas polimeristem?ticas obtidas t?m capacidade de originar calos com apenas um m?s de cultivo e, ambas as cultivares desenvolveram calos fri?veis com rendimentos m?dios acima de 90%. A efici?ncia desse m?todo foi comprovada pela alta capacidade de indu??o de calos fri?veis nas duas cultivares avaliadas, como tamb?m pela rapidez no processo de obten??o de calos, sendo este o primeiro estudo de adapta??o da metodologia para as cultivares Ma?? e Pacovan. Por outro lado, a avalia??o da indu??o de muta??o permitiu concluir que a sobreviv?ncia e a capacidade de forma??o de brotos diminu?ram em fun??o do aumento da concentra??o e do tempo de imers?o no etilmetanosulfonato. As plantas sobreviventes passaram por uma triagem com o agente seletivo ?cido fus?rico na qual, foi poss?vel regenerar plantas in vitro das cultivares submetidas ao tratamento com o mutag?nico e selecionar poss?veis mutantes com resist?ncia ao ?cido fus?rico para as cvs. Ma?? e Pacovan. O m?todo da transforma??o gen?tica mostrou-se eficiente na regenera??o dos brotos resultando em altos valores de sobreviv?ncia e multiplica??o, onde poss?veis plantas transg?nicas de bananeira cv. Ma?? foram obtidas, ap?s a sele??o de resist?ncia ao herbicida. Portanto, conclui-se que todo material produzido, tanto na fase mutag?nica quanto na transforma??o gen?tica, apresenta uma maior variabilidade gen?tica potencialmente aplic?vel ao melhoramento da bananeira.

Submitted by Jadson Francisco de Jesus SILVA (jadson@uefs.br) on 2018-01-30T22:51:06Z No. of bitstreams: 1 Tese Definitivo ZERGurgel.pdf: 2392487 bytes, checksum: 97870ae444449d037535f874c18b1d37 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-30T22:51:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Definitivo ZERGurgel.pdf: 2392487 bytes, checksum: 97870ae444449d037535f874c18b1d37 (MD5) Previous issue date: 2017-07-24 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Comanthera mucugensis Giul. subsp. mucugensis, an endemic species of the municipality of Mucug?-BA is threatened with extinction. To reduce extractivism in natural populations, it is necessary to develop efficient multiplication protocols; In this sense somatic embryogenesis and organogenesis may be viable and preservation cryopreservation may be a strategy for its long-term. The objectives of this study were: (1) to analyze the embryogenic competence and the indirect organogenesis of C. mucugensis; (2) to evaluate the cryopreservation of seeds and different methods of cryopreservation of C. mucugensis plants and (3) to identify the best way to store seeds in the long term. Experiments were performed to induce somatic embryogenesis with different concentrations of 2,4-D X BAP and Picloran X BAP and for indirect organogenesis BAP and ANA were used. Seeds were cryopreserved for 0 (control), 1, 7, 30, 360 and 540 days and other seeds were stored at different temperatures to verify the best form of storage. Plants were cryopreserved with the technique of vitrification and encapsulation-desiccation. Plants from cryopreserved seeds were acclimatized in sand and vegetal soil (1: 1) for 60 days. The work showed that the plant regulators Picloran and 2,4-D are promising in the induction of callus with embryogenic potential and that the plant regulator ANA at 4.9 ?M is efficient in indirect organogenesis. The seeds of C. mucugensis can be cryopreserved without compromising their physiological quality, but the techniques for cryopreservation of plants have not been efficient. / Comanthera mucugensis Giul. subsp. mucugensis, possui flor de interesse comercial que devido ao extrativismo excessivo encontra-se amea?ada de extin??o. Para suprir a demanda do mercado e evitar o decl?nio populacional, faz-se necess?rio desenvolver protocolos para sua multiplica??o, podendo a embriog?nese som?tica e a organog?nese serem alternativas vi?veis. Al?m disso, ? importante investir em estudos de conserva??o a longo prazo como, por exemplo, a criopreserva??o. O trabalho teve como objetivos: realizar estudos para tornar a micropropaga??o mais eficiente e avaliar a conserva??o de C. mucugensis em diferentes temperaturas como estrat?gia para a conserva??o do seu germoplasma. Foram testados para a indu??o da embriog?nese som?tica 2,4-D x BAP e Picloram x BAP e para organog?nese indireta BAP e ANA. Na criopreserva??o foram avaliadas sementes mantidas em nitrog?nio l?quido (-196?C) por 0, 1, 7, 30, 360 e 540 dias e as plantas inteiras foram submetidas a duas t?cnicas: vitrifica??o e encapsulamento-desidrata??o. Para avaliar o armazenamento, as sementes foram mantidas em temperatura ambiente, 4?C, -20?C, -80?C e -196?C por 30, 90 e 180 dias. Visando observar se a criopreserva??o das sementes interfere no desenvolvimento, plantas oriundas da germina??o in vitro de sementes criopreservadas foram aclimatizadas em areia e terra vegetal (1:1) por 60 dias. O trabalho demonstrou que os reguladores vegetais Picloram e 2,4-D s?o promissores na indu??o de calos com potencial embriog?nico e que o regulador vegetal ANA (4,9 ?M) ? eficiente na organog?nese indireta. As sementes de C. mucugensis podem ser criopreservadas sem comprometer sua qualidade fisiol?gica, entretanto, n?o foram eficientes as t?cnicas para criopreserva??o de plantas inteiras.

A produção de linhagens completamente homozigotas em programas de melhoramento genético de citros é difícil e demorada, e a obtenção de plantas duplo-haplóides pode ser utilizada para aumentar a eficiência de programas de melhoramento. No entanto, muitos são os fatores associados ao sucesso na regeneração de plantas haploides e/ou duplo-haplóides. Os objetivos deste projeto foram a obtenção de plantas haploides e/ou duplo-haplóides de laranja doce (Citrus sinensis) utilizando as técnicas de cultura de anteras e partenogênese in situ e in vitro, que consistem na obtenção e regeneração de embriões gaméticos a partir do desenvolvimento dos micrósporos e óvulos, respectivamente. Para tal, foram realizados estudos preliminares de biologia reprodutiva de C. sinensis, bem como a realização de trabalhos de cultura de anteras de laranja-doce, foram conduzidos testando-se aproximadamente 100 genótipos, além dos efeitos de tratamentos térmicos aplicados as anteras de laranja doce. Para os experimentos de partenogênese in situ foram testados os efeitos das doses de radiação aplicadas aos grãos de polens utilizados para a polinização e do uso de pólens de espécies consideradas distantes na obtenção de embriões e plantas haploides e duplo-haplóides de C. sinensis. Para a partenogênese in vitro foram testados os efeitos de meios de cultura na indução de embriogênese a partir de calos provenientes dos ovários. Os resultados obtidos permitiram a indução de calos, calos embriogênicos, e a regeneração de embriões a partir do cultivo in vitro de anteras. Também foi possível a seleção de genótipos mais responsivos a essa técnica e que permitirão a realização de trabalhos futuros para o processo de obtenção de plantas haploides e duplo-haplóides em laranja doce. Na maioria dos casos, os calos embriogênicos, embriões e plântulas obtidas da cultura de anteras foram diploides (2n) e molecularmente similares às plantas doadoras dos explantes. No entanto, houve a obtenção de um calo embriogênico, proveniente do cultivo de anteras de um híbrido (Citrus clementina x C. sinensis ,,Hamlin\"), que até o momento demonstrou um padrão de bandamento diferente e em homozigose para quatro conjuntos de primers microssatélites testados. A confirmação da ploidia e da origem gamética desse calo ainda é dependente da realização de análises com os embriões provenientes desses calos e de um maior número de marcadores moleculares. Nos experimentos de partenogênese in situ foram obtidos embriões e plântulas provenientes da polinização com polens irradiados, sendo identificadas plântulas com grande variação no nível de ploidia e com diferenças moleculares entre as progênies e os parentais, porém heterozigotas. A realização de cruzamentos com espécies distantes permitiram a obtenção de embriões e plântulas que apresentavam alta taxa de genes em homozigose, porém não em sua totalidade. Nas técnicas de partenogênese in vitro foi possível a obtenção de um protocolo para regeneração de embriões somáticos a partir de calos de ovários, no entanto, também não foram observadas a obtenção de plantas haploides e/ou duplo-haplóides. Os resultados obtidos confirmam a genótipo-dependência das respostas relacionadas à embriogênese gamética em Citrus, bem como do melhor entendimento dos aspectos reprodutivos de laranja doce / The production of completely homozygous lines in citrus breeding program is hard, and double-haploid plantlets (completely homozygous lines) can be used to improve these breeding programs. However, many factors are associated with the success of the regeneration of haploid or double-haploid plants. The aim of this study was the induction and regeneration of haploid and double-haploid plantlets from sweet oranges (Citrus sinensis) using the techniques of anther culture and in situ and in vitro parthenogenesis, that can result in the production of gametic embryos from microspores and ovules, respectively. To this, there were conducted preliminary studies with reproductive biology of C. sinensis, as well as, experiments with anther culture of more than 100 genotypes of sweet orange and the effects temperature treatments. To experiments of in situ parthenogenesis there were tested the effects of genotype, doses of radiation applied to the pollen grains, and also the use of pollen grains from distant species used in crossings with the aim of obtaining haploid and double-haploid embryos from sweet oranges. To in vitro parthenogenesis there was tested the effects of culture media in induction of embryogenesis from ovaries. The results showed the induction of callus and regeneration of embryos from in vitro anther culture and obtaining some responsive genotypes to anther culture, which will be useful in future works with induction and regeneration of haploid and double-haploid plants in sweet orange. The most of embryogenic callus and embryos obtained from anther culture were diploids (2n) and molecularly similar to the donor plants. However, one embryogenic callus obtained from anther culture of a hybrid (Citrus clementina x C. sinensis ,,Hamlin\") showed be different from donor plants and homozygous to four pair of microsatellite primers tested. Ploidy and the gametic origin confirmation of this embryogenic callus are still dependent of the analysis of a larger number of primers and the development and regeneration of embryos. In the in situ parthenogenesis experiments, the embryos and seedlings obtained from the pollination with irradiated pollen grains showed a larger variation of ploidy, determined by flow cytometric analysis. The analysis with molecular markers showed that these plantlets were different from the donor plants, but were heterozygous. The performance of crossings with distant species from Citrus sinensis results in production of embryos with a high rate of homozygosis, but not for all primers tested. In vitro parthenogenesis techniques shows be interesting to obtaining somatic embryos from ovary culture, however, no haploid or double-haploid embryos were obtained. The results confirm the genotype-dependent responses related to the gametic embryogenesis in Citrus, as well as, improve the knowledge about reproductive biology of sweet orange

A semelhança entre os eventos da embriogênese zigótica e somática permite que sejam estabelecidos parâmetros para o acompanhamento destes dois processos. Neste trabalho foi estudada a embriogênese somática em Ocotea catharinensis, nas fases de maturação e germinação, além do processo germinativo da semente zigótica, avaliando-se parâmetros bioquímicos, e a expressão diferencial de proteínas. O tratamento com ABA + PEG em culturas de embriões somáticos apresentou variações semelhantes a apresentadas por embriões zigóticos no estádio de maturação. Não se observou a germinação de embriões somáticos, contudo verificou-se que a desidratação prévia promoveu importantes alterações bioquímicas. Durante a germinação, não se observou à síntese de novas proteínas no embrião zigótico. Os estudos proteômicos no desenvolvimento da semente permitiram a seleção de polipeptídios, marcadores estádio-específicos. Os resultados obtidos possibilitam a otimização e melhor entendimento das etapas da embriogênese somática, em espécies com sementes recalcitrantes, como O. catharinensis. / The great similarity among the events of zygotic and somatic embryogenesis allows the establishment of parameters for accompaniment of these processes. In the present work it was studied the somatic embryogenesis in Ocotea catharinensis, in the maturation and germination phases, and the zygotic embryogenesis. The biochemical parameters and differential expression of proteins were evaluated: The treatment with ABA + PEG presented similar variations for zygotic embryos in the maturation stage. The germination was not observed for somatic embryos; however, it was verified that the previous dehydration promoted important biochemical alterations. With relation to the zygotic embryo, throughout the germination process, the synthesis of new proteins was not observed. The proteomic studies carried out throughout seed development, allowed the selection of polypeptides with differential expression. The results obtained open perspectives for the methodology optimization of the somatic embryogenesis, for species with recalcitrant seeds, like O. catharinensis.

A hibridação somática via fusão de protoplastos é um método de combinação genética que agrega integralmente os dois genomas genitores, assim como suas respectivas organelas citoplasmáticas, sendo uma ferramenta alternativa aos métodos convencionais de melhoramento. O objetivo deste trabalho foi a obtenção de híbridos somáticos interespecíficos de laranja doce (Citrus sinensis L. Osbeck) \'Pêra\' e \'Westin\' com a tangerina \'Fremont\' (C. clementina hort. ex Tan. x C. reticulata Blanco), \'Thomas\' (C. reticulata Blanco) e \'Nules\' (C. clementina hort. ex Tan), e o tangelo \'Nova\' (C. reticulata Blanco x C. paradisi Macf.) visando à produção de genitores tetraplóides com características agronômicas desejáveis. Como fontes de protoplastos foram utilizados calos embriogênicos de laranja e folhas jovens de tangerina e tangelo, coletadas de plantas cultivadas em casa-de-vegetação. Para o isolamento dos protoplastos, as células de ambas as fontes foram imersas em solução enzimática e incubadas no escuro por 14 horas, sob agitação. Após o isolamento, os protoplastos isolados de calos foram fundidos quimicamente (polietilenoglicol - PEG) com protoplastos não embriogênicos, isolados de mesofilo foliar. Em seguida, os protoplastos foram plaqueados nos meios de cultura líquido BH3, EME e BH3 + EME, e incubados em ausência de luz, sob temperatura de 27 ºC. Após 20 dias de incubação, foram iniciados subcultivos sequenciais para nutrição e redução do potencial osmótico do meio de cultura. Os microcalos desenvolvidos foram transferidos para meio de cultura EME + maltose (13 g.L-1) para a indução da embriogênese somática. Os embriões desenvolvidos foram transferidos para meio de cultura EME + sacarose (25 g.L-1) e em seguida para o meio de cultura 1500 (1,5 g.L-1 de extrato de malte) e finalmente para o meio B+ para desenvolvimento e germinação. As plantas regeneradas foram individualizadas, enraizadas ou microenxertadas e aclimatizadas em casa-devegetação. A confirmação da hibridação somática foi feita por análise morfológica, determinação da ploidia, por citometria de fluxo e análise do DNA com marcadores moleculares do tipo SSR e RAPD. Foram obtidos híbridos somáticos de três combinações (Pêra + Fremont, Pêra + Nules e Pêra + Nova) os quais serão avaliados para utilização diretamente como copa ou como genitor tetraplóide em programas de melhoramento de citros. / Somatic hybridization by protoplasts fusion is a method of genetic combination of two parental genomes, and their cytoplasmic organelles. It is an alternative tool to conventional breeding methods. The objective of this work was to obtain interspecific somatic hybrids of \'Pera\' and \'Westin\' sweet oranges (Citrus sinensis L. Osbeck) with \'Fremont\' (C. clementina hort. ex Tan. x C. reticulata Blanco), \'Thomas\' (C. reticulata Blanco) and \'Nules\' (C. clementina hort. ex Tan) mandarins and Nova tangelo (C. reticulata Blanco x C. paradisi Macf.) to produce tetraploid parents with desirable agronomic characteristics. The sources of protoplasts were sweet orange embryogenic callus and mandarin and tangelo young leaves, collected from plants cultivated in screenhouses. For protoplasts isolation, cells from both sources were immersed in enzyme solution and incubated in the dark for 14 hours (40 rpm). After isolation, the protoplasts isolated from callus were fused chemically (polyethylene glycol - PEG) with non embryogenic protoplasts, isolated from leaf mesophyll. The protoplasts were cultivated in BH3, BH3 + EME and EME liquid culture media and incubated in the dark, under temperature of 27 ºC. After 20 days of incubation, subcultures were initiated in order to reduce the osmotic potential of culture medium. The microcalus developed were transferred to EME medium supplemented with maltose (13 g.L-1) to induce somatic embryogenesis. The developed embryos were transferred into EME + sucrose (25 g.L- 1), culture medium 1500 (1.5 g.L-1 of malt extract) or B+ culture medium for development and germination. The regenerated plants were individually rooted or micrografted, and further acclimatized in screenhouse. Somatic hybridization was confirmed by analysis of leaf morphology, ploidy determination by flow cytometry and molecular analysis by SSR and RAPD markers. Somatic hybrids were obtained of the three combinations (Pera + Fremont, Pêra + Nules and Pêra + Nova) which will be evaluated for direct are as scion or as a tetraploid parent in citrus breeding programs.

Submitted by (ana.araujo@ufrpe.br) on 2017-02-07T17:17:10Z No. of bitstreams: 1 Deivid Almeida da Costa.pdf: 3034904 bytes, checksum: a3834e78a3b01627180c99a9fddc24a9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-07T17:17:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Deivid Almeida da Costa.pdf: 3034904 bytes, checksum: a3834e78a3b01627180c99a9fddc24a9 (MD5) Previous issue date: 2007-02-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The somatic embryogenesis is a technique of plant tissue culture with several application potentials, as in the clonal propagation of plants, in the regeneration of transformed cells and in the basic studies of the molecular, biochemical and morphologic events that happen duringthe embryogenesis. In spite of the several works reporting somatic embryogenesis in cotton, several problems still persist in the regeneration through embryogenesis. The most of the works is with the line cocker, due to the fact of the cotton to be recalcitrant for the somatic embryogenesis. This way, the present study was conceived with the intention of analyzing the morphogenic response of the cotton to several growth regulators and stressful agents during the induction of embryogenic callus and somatic embryos, correlating the callus production with the antioxidant enzymes expression. For induction of the embryogenic callus, hypocotyl of germinated cotton (BRS – 187 – 8H) surface-sterilized seeds was used. The embriogenic callus induction medium (MICE) consisted of the MSB medium with different combinations and concentrations of 2,4-D, Kinetin, 2iP and Picloram. For conversion of embryogenic callus, it was used the embryo induction medium (MIE) that consistes of MSB medium and MSB supplemented with zeatin; L-glutamine, asparagine; espermine, espermidine or different concentrations of NH4NO3 and KNO3. The results show that among the MICE tested, the medium with 0,1 mg L-1 2,4-D and 0,3 mg L-1 Kinetin (MSB1 medium) and the MCIM medium showed the largest average in the production of embryogenic callus by explant. Explants in the MIE-1 presented the best proliferation of the embryogenic callus. However, the formation of globular and embryogenic structures was only visualized in the embryogenic callus formed in MSB1 medium, which were transferred for MSB medium and subcultivated in MIE-4 medium. It was concluded that different growth regulators can induce the formation of embryogenic callus in cotton cultivar BRS – 187 – 8H and the suppression of the growth regulators favors the appearance of globular and pre-embryogenic structures. In the experiments of the influence of the stress in cotton callus formation and the isozymic antioxidant system expression, it was used for induction of embryogenic callus, thecombination of MSB and MSB1 medium with two concentrations of FeEDTA: the concentration standard of the MS medium; and a concentration five times larger. It wasestablished three regimes of luminous intensity: darkness; 3,4 Klx and 6,0 Klx. Embryogenic callus were obtained on the MSB1 (3,4 Klx), MSB1 (6,0 Klx) and MSB1+FeEDTA (5X) medium. The electrophoretic system of the catalase and peroxidase showed variation in the intensity of the bands. The results show that the embryogenic callus formation dependent of the action of growth regulators and of the light presence, and the isozymic standards of catalase and peroxidase present similar pattern and they are related with the embryogenic aspect of the calluses. / A embriogênese somática é uma técnica de cultura de tecidos vegetais com diversos potenciais de aplicação, como na propagação clonal de plantas, na regeneração de células transformadas geneticamente e nos estudos básicos dos eventos moleculares e bioquímicos e morfológicos que ocorrem durante a embriogênese. Apesar dos diversos trabalhos relatando embriogênese somática em algodão, vários problemas ainda persistem na regeneração via embriogênese e a maioria dos trabalhos é com a linha cocker, devido a recalcitrância do algodão a embriogênese somática. Deste modo, o presente estudo foi concebido com o intuito de analisar a resposta morfogênica do algodão a vários reguladores de crescimento e agentes estressantes durante a indução de calos embriogênicos e embriões somáticos, correlacionando a calogênese com a expressão de isoformas do sistema antioxidativo. Para indução dos calos embriogênicos utilizou-se sementes desinfestadas da cultivar de algodão BRS – 187 – 8H. Os meios de indução de calos embriogênicos (MICE) utilizados consistiram no meio MSB acrescido de varias combinações e concentrações dos reguladores de crescimento 2,4-D; Cinetina, Picloram e 2-iP. Já para conversão dos calos embriogênicos em embriões, utilizouse o meio de indução de embiões (MIE) que consiste no meio MSB e MSB acrescido dezeatina, ou diferentes concentrações de NH4NO3 e KNO3, ou acrescido de L glutamina; asparagina; espermina; espermidina. Os dados obtidos mostram que entre os MICE testados, o meio contendo 0,1 mg L-1 de 2,4-D e 0,3 mg L-1 de cinetina (meio MSB1) e o meio MCIM mostraram as maiores médias na produção de calos embriogênicos por explante. Entre os MIE, o MIE-1 apresentou melhor proliferação dos calos embriogênicos. Contudo, a formação de estruturas globulares e embriogênicas só foi visualizada nos calos embriogênicos formados em meio MSB1 e transferidos para meio MSB e subcultivados em meio MIE-4. Concluiu-se então que diferentes reguladores podem induzir a formação de calos embriogênicos na cultivar BRS – 187 – 8H, e a supressão dos reguladores de crescimento favorece o surgimento de estruturas globulares e pré-embriogênicas. Nos experimentos da influência do estresse na calogênese e a expressão de isoenzimas do sistema antioxidativo, utilizou-se para a induçãode calos embriogênicos a combinação do meio MSB e MSB1 com duas concentrações de FeEDTA: a concentração padrão do meio MS; e uma concentração cinco vezes maior. E foiestabelecido três regimes de intensidade luminosa: escuro; 3,4 Klx e 6,0 Klx. Calos embriogênicos foram obtidos nos meios MSB1(3,4 Klx), MSB1(6,0 Klx) e MSB1+FeEDTA(5X). Analises de eletroforese de isoenzimas da catalase e peroxidase mostraram variação na intensidade das bandas. Os resultados obtidos permitiram concluir que formação de calos embriogênicos é dependente da ação de reguladores de crescimento e da presença de luz, e que as isoformas de catalase e peroxidase apresentam padrão similar e estão relacionadas com o aspecto embriogênico dos calos.

Submitted by (ana.araujo@ufrpe.br) on 2017-02-20T18:31:01Z No. of bitstreams: 1 Marina Medeiros de Araujo Silva.pdf: 1111837 bytes, checksum: fa89f364f5e0242c84916270c538f88a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-20T18:31:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marina Medeiros de Araujo Silva.pdf: 1111837 bytes, checksum: fa89f364f5e0242c84916270c538f88a (MD5) Previous issue date: 2010-02-09 / The somatic embryogenesis is a technique of in vitro culture applied in clonal propagation of plants and regeneration of genetically transformed cells, in addition to supporting basic studies related to morphological, molecular and biochemical events that happen during the embryogenic process. The initial stages of this morphogenic pathway are characterized by the induction of genes related to stress, which leads to the hypothesis that somatic embryogenesis is an extreme response to stress in plant cells cultivated in vitro. In this work, were induced embryogenic pathways direct and indirect in the RB 872552 variety of sugarcane and analyzed the activity of enzymes from antioxidant system in order to assess the correlation between somatic embryogenesis and regulation of oxidative stress. For the direct pathway (ESD), were applied four treatments (TS, TD, TG e TA) based on protocols previously described for sugarcane. These protocols differed as to the composition of the medium and incubation condition (dark or light period of 16 hours) in a completely randomized design with 10 replications per treatment. For the indirect pathway (ESI), were used by eight different treatments combinations of four concentrations of 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) and two Fe-EDTA, in a factorial 4x2 and 20 replicates per treatment. Were calculated the indices of embryo formation (IFE) and callus (IFC) and evaluated the activity of catalase, peroxidase and polyphenoloxidase. Somatic embryos were visualized only in the treatment of ESD plus 2,4-D and BAP (6-benzylaminopurine), and treatment of ESI with 8 mg.L-1 2,4-D. The conversion of somatic embryos into plants was performed in culture medium without added phytoregulators. The activity of antioxidant enzymes was obtained by reading of a spectrophotometer, from the extract obtained from embryogenic and non-embryogenic tissues treatment of ESD. The polyphenoloxidase and catalase activity increased in non-embryogenic tissue, whereas peroxidase was less active in these tissues when compared to embryogenic. It was found that the induction of somatic embryogenesis in the variety studied is related to oxidative stress and that these antioxidant enzymes may become important as biochemical markers of this process. / A embriogênese somática é uma técnica de cultivo in vitro aplicada na propagação clonal de plantas e na regeneração de células transformadas geneticamente, além de auxiliar estudos básicos relacionados aos eventos morfológicos, moleculares e bioquímicos que ocorrem durante o processo embriogênico. As fases iniciais dessa via morfogênica são caracterizadas pela indução de genes relacionados ao estresse, o que leva à hipótese de que a embriogênese somática é uma resposta extrema ao estresse de células de plantas cultivadas in vitro. Neste trabalho, foram induzidas as vias embriogênicas direta e indireta na variedade RB 872552 de cana-de-açúcar e analisada a atividade de enzimas do sistema antioxidante, a fim de avaliar a correlação entre a embriogênese somática e a regulação do estresse oxidativo. Para a via direta (ESD), foram aplicados quatro tratamentos (TS, TD, TG e TA) baseados em protocolos já descritos para cana-de-açúcar. Esses protocolos diferiam quanto à composição do meio e condição de incubação (escuro ou fotoperíodo de 16 horas), em delineamento inteiramente casualizado, com 10 repetições por tratamento. Para a via indireta (ESI), foram utilizados oito tratamentos diferenciados pelas combinações de quatro concentrações de 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) e duas de Fe-EDTA, em esquema fatorial 4x2 e 20 repetições por tratamento. Foram calculados os índices de formação de embriões (IFE) e de calo (IFC) e avaliada a atividade da catalase, peroxidase e polifenoloxidase. Embriões somáticos foram visualizados apenas nos tratamentos de ESD acrescidos de 2,4-D e BAP (6-benzilaminopurina), e no tratamento de ESI com 8 mg.L-1 de 2,4-D. A conversão de embriões somáticos em plantas foi realizada em meio de cultura sem adição de fitoreguladores. A atividade das enzimas antioxidantes foi obtida através de leitura feita em espectrofotômetro, a partir do extrato obtido de tecidos embriogênicos e não embriogênicos dos tratamentos de ESD. A atividade da polifenoloxidase e da catalase aumentou em tecidos não embriogênicos, enquanto que a peroxidase foi menos ativa nesses tecidos quando comparada aos embriogênicos. Evidenciou-se que a indução da embriogênese somática na variedade estudada está relacionada ao estresse oxidativo e que estas enzimas antioxidantes podem exercer papel relevante como marcadores bioquímicos deste processo.

O. catharinensis e O. odorifera são árvores originárias da Mata Atlântica. Historicamente estas espécies foram intensamente exploradas e atualmente encontram-se vulneráveis de extinção. A embriogênese somática é uma ferramenta de grande potencial na reprodução de espécies de difícil propagação. No presente trabalho analisou-se o efeito dos meios de cultura MS e WPM e de diferentes de ANA e 2,4-D na indução da embriogênese somática nessas espécies. Em O. catharinensis a combinação WPM + 2,4-D mostrou-se mais efetiva na indução de calos. Resultados mais expressivos foram observados no tratamento WPM + 144µM 2,4-D. Os piores índices de indução foram obtidos no meio MS + 2,4-D. Em O. odorifera não foi utilizado o meio MS. Nesta espécie, mais importante do que o tipo do regulador de crescimento foi sua concentração. Maiores percentuais de calos foram observados em concentrações mais elevadas desses reguladores. WPM + ANA mostrou-se bastante efetivo em O. odorifera, ao contrário do que foi observado em O. catharinensis, onde os resultados foram pouco expressivos. / O. catharinensis and. O. odorifera are originary trees of the brazilian Rain Forest. Historically these species had been intensely explored and are currently considered vulnerable of extintion. Somatic embryogenesis is a tool of great potential in the reproduction of species of difficult propagation. In the present work was analyzed the effect of MS and WPM and different concentrations of ANA and 2,4-D in the iniciation of somatic embryogenesis in this species. In O. catharinensis WPM + 2,4-D revealed more effective in the induction of callus. More expressive results had been observed in the treatment WPM + 144µM 2,4-D. The worse rates of induction had been observed at the combination MS + 2,4-D. In O. odorifera the MS medium was not used. In this specie more important of what the type of the growth regulator was its concentration. Higher rates of callus had been observed at higher concentrations of these regulators. WPM + ANA revealed effective in O. odorifera, in contrast of what was observed in O. catharinensis, where the results had been little expressive.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 881362 bytes, checksum: 0e498263c87a06e3c091110afa80ddfe (MD5) Previous issue date: 2012-07-17 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Tissue culture techniques are often associated with the occurrence of somaclonal variation, characterized by a genetic/epigenetic alteration found in cells, embryos, organs or in vitro grown plants, due to stress conditions imposed by the system. The propagation process involving the calogenesis step has a higher susceptibility to variation, because of many cell divisions. Calli are disorganized cell masses, whose cells divide at different rates depending on where they are located in relation to the culture medium, therefore, they are not considered homogeneous materials. Flow cytometry is a tool that has been used to evaluate the competence of somatic embryogenesis in callus, both to identify the different types as possible and to detect early changes in DNA content of their cells. However, there are no reports in the literature of the flow cytometry use to determine the existence of heterogeneity in relation to the DNA content in callus. In this perspective, the present work adapted this methodology for friable Passiflora cincinnata calli in order to verify the existence of vertically regionalized heterogeneity in relation to DNA ploidy level, and relate it to factors inductors of somaclonal variation, such as cultivation time and subculture numbers. Initially, P. cincinnata cotyledonary leaves were inoculated onto semi-solid medium containing 2, 4-D and BA, for friable embryogenic callus induction. The calli were multiplied and subcultured at different times, thus generating three callus types: new, intermediate and old. Twenty calli of each type were subjected to sagittal cuts resulting two layers (I, II) in new calli, and three layers (I, II and III) in intermediate and old calli, totalizing 160 layers, which were analyzed by flow cytometry. Six different DNA ploidy levels and multiploidies were detected in the layers. In new calli, 25% were heterogeneous, i.e. at least one callus layer showed different DNA ploidy level from the others, differently from intermediate and old calli, which 75% and 63% were heterogeneous, respectively. The homogeneous new calli were predominantly diploid. The highest DNA ploidy levels were observed in the layers in contact with the culture medium on intermediate calli, and 4C and 4C/8C cells were more evident in older calli. These observations suggest that the appearance of new DNA ploidy levels between the layers and between the different callus types is related to the exposure time to the medium containing relatively high concentration of 2,4-D. It was also possible to verify that the layer in contact with the culture medium is more proliferative when compared the percentages of the G2 peaks in homogeneous diploid calli. The heterogeneity in DNA ploidy level between the layers was observed, and it implies that parts of a callus cannot infer about a whole callus. This work suggests that time influences the appearance of different DNA ploidy levels in calli induced in vitro. / Técnicas de cultura de tecidos estão frequentemente associadas com a ocorrência de variação somaclonal, caracterizada pela alteração genética e/ou epigenética encontrada em células, embriões, órgãos ou plantas cultivadas in vitro, em decorrência das condições de estresse impostas pelo sistema. O processo de propagação que envolve a etapa de calogênese apresenta maior susceptibilidade à ocorrência de variação, em função das inúmeras divisões celulares. Calos são massas celulares não organizadas, cujas células se dividem a diferentes velocidades dependendo de onde se localizam em relação ao meio de cultura; portanto, não são considerados materiais homogêneos. A citometria de fluxo é uma ferramenta que tem sido utilizada para avaliar a competência da embriogênese somática em calos, tanto para identificar seus diferentes tipos quanto para detectar precocemente possíveis alterações no conteúdo de DNA de suas células. No entanto, não há relatos na literatura da utilização da citometria de fluxo para verificar a existência da heterogeneidade quanto ao conteúdo de DNA em calos. Nesta perspectiva, o presente trabalho adaptou essa metodologia para calos friáveis de Passiflora cincinnata, a fim de verificar a existência de heterogeneidade verticalmente regionalizada, em relação à ploidia de DNA, e relacioná-la com fatores de indução de variação somaclonal, como tempo de cultivo e número de subcultivos. Inicialmente, folhas cotiledonares de P. cincinnata foram inoculadas em meio semissólido contendo 2,4-D e BA, para indução de calos embriogênicos friáveis. Os calos foram multiplicados e subcultivados em diferentes tempos, gerando, assim, três tipos de calos, denominados como novos, intermediários e velhos. Vinte calos de cada tipo foram submetidos a cortes sagitais que resultaram duas camadas (I e II) em calos novos, e três camadas (I, II e III) em calos intermediários e velhos, totalizando 160 amostras que foram analisadas por citometria de fluxo. Seis diferentes ploidias de DNA e multiploidias foram detectadas nas camadas. Em calos novos, 25% deles foram heterogêneos, ou seja, pelo menos uma camada apresentou nível de ploidia de DNA diferente das demais, diferentemente dos calos intermediários e velhos, os quais 75% e 63% foram heterogêneos, respectivamente. Os calos novos homogêneos foram predominantemente diploides. As ploidias de DNA mais altas foram observadas nas camadas em contato com o meio de cultura em calos intermediários, e células 4C e 4C/8C foram mais evidentes em calos velhos. Essas observações sugerem que o surgimento de novos níveis de ploidia entre as camadas e entre os calos de diferentes tipos está relacionado com o tempo de exposição ao meio contendo concentração relativamente alta de 2,4-D. Foi possível, também, verificar que a camada em contato com o meio é mais proliferativa quando se comparou os percentuais dos picos G2 de calos diploides homogêneos. A heterogeneidade quanto ao nível de ploidia de DNA entre as camadas foi constatada e isto implica que partes de um calo não podem inferir sobre um calo inteiro. Esse trabalho sugere que o tempo influenciou o surgimento de diferentes ploidias de DNA em calos induzidos in vitro.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-06-19T17:53:57Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 1 - Tese Talita Balzon.pdf: 3215171 bytes, checksum: 43e908272811472a37f4b2257cfe3a4a (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-06-19T17:54:10Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 1 - Tese Talita Balzon.pdf: 3215171 bytes, checksum: 43e908272811472a37f4b2257cfe3a4a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-19T17:54:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) 1 - Tese Talita Balzon.pdf: 3215171 bytes, checksum: 43e908272811472a37f4b2257cfe3a4a (MD5) Previous issue date: 2017-10-27 / In this work, three Chapters are proposed: 1) Optimization of somatic embryogenesis in oil palm (Elaeis spp.) from mature zygotic embryos; 2) Influence of initial cutting thickness on somatic embryos differentiation in oil palm (Elaeis spp.) using the thin cell layer technique (TCL), and; 3) Vegetative reproduction and molecular analysis of interspecific backcrosses of oil palm regenerated by somatic embryogenesis. In the first Chapter, we developed an efficient and simple system for inducing somatic embryogenesis and regenerating plantlets from mature zygotic embryos of oil palm. Embryogenic calli were induced from mature zygotic embryos of oil palm on modified Murashige and Skoog medium with 2,4-dichlorophenoxyacetic acid or picloram, alone or in combination with activated charcoal. The greatest frequency of embryogenic callus induction (97.5%) was obtained by culturing mature zygotic embryos on callus induction medium with 450 μM picloram and 2.5 gL−1 activated charcoal. Embryogenic calli proliferated on a medium with a reduced concentration of picloram. Embryogenic calli were then subcultured on a medium supplemented with 12.3 μM 2-isopentenyladenine and 0.54 μM naphthaleneacetic acid, with subcultures at 4-wk intervals. Somatic embryos were regenerated on a medium with Murashige and Skoog macro- and micronutrients at halfstrength concentrations supplemented with 20 g.L−1 sucrose, 2.5 g.L−1 activated charcoal, and 2.5 g.L−1 Phytagel. Detailed histological analysis revealed that somatic embryogenesis followed an indirect pathway. Primary calli were observed after 4–6 wk of culture and progressed to embryogenic calli at 12 wk. Embryogenic cells exhibited dense protoplasm, a high nucleoplasmic ratio, and small starch grains. Proembryos, which seemed to have a multicellular origin, formed after 16–20 wk of culture and successive cell divisions. Differentiated somatic embryos had a haustorium, a plumule, and the first and second foliar sheaths. In differentiated embryos, the radicular protrusion was not apparent because it generally does not appear until after the first true leaves emerge. In the second Chapter, 1, 2 and 3 mm thick TCL explants obtained from in vitro germinated plants were established on MS culture medium with Picloram (450 μM). It was observed that the TCL technique can efficiently induce somatic embryogenesis in oil palm. Genotypes and thickness of the explants used exert a strong influence on the induction of somatic embryogenesis. Explants with a thickness of up to 2 mm are more responsive. Genotypes also exert a strong influence on the induction of somatic embryogenesis, because shown important differences in the percentage of callus with somatic embryos and number of somatic embryos formed per callus. Finally, the third Chapter proposed a method for the vegetative reproduction of zygotic embryos (ZE) from interspecific backcrosses of palm oil by somatic embryogenesis, as well as to analyze genetically and epigenetically the regenerated plants through ISSR and AFLP markers. To this end, 195, 281 and 198 ZE from the respective interspecific backcrosses SQ150, SR78 and SR84 were cultured in vitro under the experimental conditions developed in Chapter 1, with minor modifications. From the regenerated plants, 36 individuals of three different zygotic embryos (considered as matrices) were randomly evaluated by ISSR and AFLP (MSAP) markers for possible genetic and epigenetic variations. After 36 months of cultivation, plant regeneration rates ranged from 6.2% to 34.2%. When the regenerants were evaluated by ISSR, it was possible to infer that regenerated individuals of ZE can present between 97.5% and 100% of similarity when evaluated within the same matrix that originated them (intrapopulations). However, when individuals are compared with regenerated plants from other ZE used as matrices, they showed genetic variability of more than 20%, that is, genetic similarity of only 80% (interpopulations). In the analysis performed by the AFLP (MSAP), 357 loci were amplified. In these amplifications, it was verified that 69% of these regions were sensitive to methylation and of these, 58% were caused by the gain of fragments, that is, by the hypomethylation of the genomic DNA. / Neste trabalho, três capítulos são propostos: 1) Otimização da embriogênese somática em palma de óleo (Elaeis spp.) a partir de embriões zigóticos maturos; 2) Influência da espessura inicial de corte sobre a diferenciação de embriões somáticos em palma de óleo utilizando a técnica Thin Cell Layer (TCL) e; 3) Reprodução vegetativa de retrocruzamentos interespecíficos de palma de óleo por embriogênese somática. No primeiro capítulo foi desenvolvido um sistema para a indução de embriogênese somática e regeneração de plantas a partir de embriões zigóticos maturos de palma de óleo. Calos embriogênicos (CE) foram induzidos por embriões zigóticos (EZ) maturos em meio de Murashige e Skoog (MS) modificado, com o ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) ou picloram e em combinação ou não com carvão ativado. A maior percentagem de indução de CE (97,5%) foi obtida através da cultura de embriões zigóticos maturos no meio de MS modificado com 450 μM de picloram e 2,5 g.L-1 de carvão ativado. Os CE proliferaram facilmente em meios com concentrações reduzidas de picloram. Esses CE foram repicados em meio de MS suplementado com 12,3 μM de 2-isopenteniladenina (2iP) e 0,54 μM de ácido naftalenoacético (ANA), com subcultivos em intervalos de 4 semanas. Os embriões somáticos foram convertidos em plantas em meio de MS modificado com macro e micronutrientes, suplementado com 20 g.L-1 de sacarose, 2,5 g.L-1 de carvão ativado e 2,5 g.L-1 de Phytagel®. A análise revelou que morfohistologicamente a embriogênese somática seguiu uma via indireta. Calos primários foram observados após 4-6 semanas de cultura que progrediram para CE em 12 semanas. Células embriogênicas exibiram um protoplasma denso, uma relação nucleoplásmica alta, e pequenos grãos de amido. Proembriões formados após 16-20 semanas de cultura e com sucessivas divisões celulares, têm origem multicelular. Embriões somáticos diferenciados apresentaram haustório, plúmula, e a primeira e segunda bainhas foliares. Nesta fase, a protrusão radicular não foi aparente, pois isso ocorre geralmente após emersão das primeiras folhas verdadeiras. No segundo capítulo, explantes obtidos por cortes de plantas de 1 mm, 2 mm e 3 mm de espessura foram estabelecidos em meio de cultura de MS, com Picloram (450 μM). Utilizando TCL foi possível induzir eficientemente a embriogênese somática em palma de óleo. Os genótipos e a espessura dos explantes exerceram influência na indução da embriogênese somática, mas explantes de menor espessura (até 2 mm de espessura) se mostram os mais responsivos. Os genótipos também exercem uma forte influência na indução da embriogênese somática, pois mostraram importantes diferenças quanto à percentagem de calos embriogênicos e número de embriões somáticos por calo. Por fim, o terceiro capítulo propôs um método para a reprodução vegetativa de EZ de retrocruzamentos interespecíficos de palma de óleo por embriogênese somática, bem como, analisar a fidelidade genética e epigenética por meio da utilização de marcadores ISSR e AFLP das plantas regeneradas. Para tanto, 195, 281 e 198 embriões zigóticos de sementes maduras dos respectivos retrocruzamentos interespecíficos SQ150, SR78 e SR84 foram cultivados sob as condições do experimento desenvolvido no Capítulo 1, com pequenas modificações. Dos regenerantes, 36 plantas de 3 diferentes embriões zigóticos foram aleatoriamente avaliadas por marcadores ISSR e AFLP (MSAP) quanto a possíveis variações genéticas e epigenéticas. Após 36 meses do início do cultivo, as taxas de regeneração de plantas alcançaram entre 6,2% e 34,2% dos EZ inoculados inicialmente. Quando se avaliou os regenerantes por ISSR foi possível inferir que indivíduos regenerados de EZ podem apresentar entre 97,5% e 100% de similaridade quando avaliadas dentro da mesma matriz que lhe deu origem (intrapopulações). No entanto, quando os indivíduos são comparados com plantas regeneradas de outros EZ utilizados como matrizes, eles podem apresentar variabilidade genética superior a 20%, ou seja, similaridade genética de apenas 80% (interpopulações). Na análise por AFLP (MSAP) verificou-se a amplificação de 357 locos nas 36 plantas avaliadas. Nessas amplificações, constatou-se que 69% destas regiões revelaram-se sensíveis à metilação e, destas, 58% foram ocasionadas pelo ganho de fragmentos, ou seja, pela hipometilação do DNA genômico.