O coito interrompido à um mÃtodo de anticoncepÃÃo usado desde a antiguidade, por homens de todas as idades, credos e raÃas, perpetuando-se aos dias atuais. Apesar disto, dÃvida quanto à presenÃa de espermatozoides no lÃquido prÃ-ejaculatÃrio, em quantidade e qualidade viÃveis à fecundaÃÃo, permanece como lacuna do conhecimento. Neste contexto, estabeleceu-se a tese: ausÃncia de espermatozoides no lÃquido prÃ-ejaculatÃrio de homens com espermograma normal contribui para eficÃcia do coito interrompido. Para sua defesa, realizou-se pesquisa transversal, laboratorial, com objetivo de analisar o mÃtodo anticoncepcional coito interrompido nas perspectivas de prevalÃncia do uso, percepÃÃes masculinas e prova laboratorial do lÃquido prÃ-ejaculatÃrio. Foi realizado no Hospital Geral de Fortaleza (Hospital do ExÃrcito), CearÃ, Brasil, com 43 homens, quantitativo mÃximo atingido no perÃodo delimitado para coleta de dados, junho a novembro de 2012. Os critÃrios de inclusÃo foram: idade mÃnima de 18 anos e laudo do espermograma normal. Realizou-se entrevista seguindo formulÃrio prÃ-estabelecido. ApÃs responderem à entrevista, os participantes eram exaustivamente orientados e preparados pela autora para coleta do lÃquido prÃ-ejaculatÃrio e do sÃmen. Os dados foram processados pelo Statistical Package for the Social Sciences versÃo 18.0 e analisados por meio de estatÃstica descritiva e para comparaÃÃo de mÃdias foram utilizados os testes t de Student e de Mann-Whitney. As proporÃÃes entre a presenÃa ou nÃo de espermatozoides foram comparadas por meio do teste z para proporÃÃes. Para todas as anÃlises, fixou-se como estatisticamente significante p<0,05. Falas de participantes foram tomadas para ilustrar pontos relevantes da discussÃo. A idade dos homens foi em mÃdia de 33,2Â8,6; mÃdia de anos de estudo foi de 10,6Â1,74 anos; 39 (90,7%) relataram companheira fixa; a renda mensal teve mÃdia de R$ 1789,50Â1300,00; 31(72,1%) homens nÃo tinham filhos; 37 (86,0%) nÃo utilizavam mÃtodos anticoncepcionais e 2 (4,7%) homens afirmaram uso do CI como mÃtodo; 29 (67,4%) haviam praticado CI alguma vez; interromper o coito para ejacular fora da vagina foi o principal obstÃculo apresentado pelos homens; predominou a crenÃa da baixa eficÃcia do CI. Dos 43 (100%) participantes, 37 (86,0%) conseguiram coletar o sÃmen e destes, todos tiveram o laudo do espermograma normal; 33 (89,1%) conseguiram coletar o lÃquido prÃ-ejaculatÃrio e destes, apenas dois (6,0%) apresentaram raros espermatozoides no lÃquido prÃ-ejaculatÃrio, sendo o tempo mÃdio entre a Ãltima ejaculaÃÃo e a coleta de espÃcimes de 4,24Â3,07 dias. Aplicando-se o teste z de proporÃÃo e comparando a proporÃÃo dos que nÃo apresentaram espermatozoides no lÃquido prÃ-ejaculatÃrio (0,94) com os que apresentaram (0,06), pode-se afirmar que a presenÃa de espermatozoides no lÃquido prÃ-ejaculatÃrio, na amostra estudada, foi devido ao acaso (p<0,0001). Homens com espermograma normal nÃo apresentam espermatozoides no lÃquido prÃ-ejaculatÃrio. Mediante o exposto, confirma-se a tese de que a ausÃncia de espermatozoides no lÃquido prÃ-ejaculatÃrio de homens com espermograma normal contribui para eficÃcia do coito interrompido.

O desvio de segregação, processo biológico definido pela formação de progênie cujas proporções genotípicas diferem das predições mendelianas, pode apresentar diferentes causas: a segregação não aleatória dos cromossomos durante a meiose, a seleção gamética e a viabilidade pós-zigótica diferencial. A fim de investigar a distorção de segregação em humanos, estudamos uma família com transmissão preferencial paterna de uma alteração patogênica no gene CAPN3(CAPN3 c.759_761del), previamente associada à distrofia muscular de cinturas do tipo 2A (LGMD2A). Inicialmente, definimos uma região com 2,1 Mb de extensão, presente na maior parte dos indivíduos da família. O sequenciamento direto de 14 genes contidos nesse intervalo não revelou variantes raras que pudessem estar diretamente associadas à vantagem da subpopulação de gametas portadores da alteração em CAPN3. Entretanto, a presença de variantes comuns distribuídas em cinco genes da região pode indicar que a distorção de segregação observada é consequência da interação, em nível proteico, de pequenas alterações genômicas, resultando no desempenho diferencial de tais células gaméticas. Além disso, utilizamos outra abordagem: espermatozoides de indivíduos saudáveis foram selecionados segundo sua motilidade e as frequências alélicas de cada loco em heterozigose foram comparadas entre células lentas e rápidas, a fim de identificarmos regiões suscetíveis ao desvio de segregação. Alguns resultados estatisticamente significantes foram obtidos para regiões que contêm genes envolvidos na reação acrossômica e na motilidade espermática, como PDE1C e PDE4D. Isso nos sugere que tais processos constituem alvos da seleção, o que pode culminar em formação de progênie com proporções que fogem às predições mendelianas. Esses achados são importantes porque possibilitam a ampliação de nossos conhecimentos acerca do desvio de segregação e seu impacto na espécie humana, considerando ainda possíveis efeitos na fertilidade masculina / The transmission ratio distortion (TRD), a biological process defined as a deviation from Mendelian predictions, is caused by different mechanisms: nonrandom segregation of chromosomes during meiosis or gametic and postzygotic viability selection. In order to investigate TRD in humans, we have studied a family with an overtransmitted pathogenic deletion in the CAPN3 gene (CAPN3 c.759_761del), previously associated to limb-girdle muscular dystrophy type 2A (LGMD2A). Initially, it was possible to define a 2.1 Mb region which was present in most of the individuals. The direct sequencing of 14 genes contained in this interval did not reveal rare variants that could be responsible for the advantage of gametes carrying the CAPN3 mutation. Nevertheless, common variants identified in five genes could indicate that the observed transmission distortion is caused by the interaction among proteins with small dissimilarities, resulting in differential performance of these gametic cells. Subsequently we developed another approach: spermatozoa from healthy individuals were sorted according to their motility and allelic frequencies at each locus in heterozygous state were compared in order to identify genomic regions susceptible to TRD. Surprisingly, some statistically significant results were achieved for regions containing genes involved with acrosome reaction and sperm motility, as PDE1 and PDE4, suggesting these processes are targets of the selection that ends in offspring with proportions skewed away from the Mendelian predictions. These results are important for enlarge our knowledge about TRD and its impact in humans, considering possible effects in male fertility

O objetivo deste estudo foi avaliar a qualidade do sêmen fresco e congelado de tambaqui (Colossoma macropomum), submetido à contaminação com diferentes fontes. O estudo foi conduzido na região da amazônia brasileira, estado de Rondônia, durante fevereiro e março de 2012. Foram utilizadas amostras de sêmen de 13 machos, divididas em quatro tratamentos: controle (sem contaminante) e contaminado com 10% de urina, sangue ou fezes. Foram avaliadas a motilidade e tempo de duração da motilidade espermática das amostras frescas, e motilidade, integridade de membrana, integridade de DNA, e funcionalidade de mitocôndria das amostras congeladas. A motilidade do sêmen fresco não diferiu (P<0,05) entre as amostras contaminadas por sangue, urina ou fezes (79,6; 76,1 e 78,8%, respectivamente) mas foi inferior em relação ao grupo controle (96,1%). Já nas amostras congeladas, não houve diferença (P>0,05) na motilidade entre as amostras contaminadas com sangue, urina ou fezes (11,1; 22,3 e 34,6%, respectivamente) e as amostras sem contaminantes (40,8%). O tempo de duração da motilidade das amostras, fresco, sem contaminantes (125,5 s) foi superior (P<0,05) ao das amostras contaminadas com sangue ou fezes (85,7 e 77,0 s, respectivamente), e as contaminadas com urina (98,7 s) não diferiram dos outros tratamentos. Os tratamentos contaminados com urina ou fezes (94,0 e 102,5 s, respectivamente) não diferiram (P>0,05) entre si ou em relação aos demais tratamentos. Para a análise de integridade de membrana, os valores 72,4; 77,0 e 68,0% obtidos no sêmen contaminado com sangue, urina e fezes, respectivamente, foram menores (P<0,05) que o controle cuja média foi 91,5%. O tratamento contaminado com urina foi inferior (P<0,05) ao tratamento controle para a integridade de DNA (82,8 e 93,4%, respectivamente) e para a funcionalidade de mitocôndrias (87,1% e 94,9%, respectivamente). Assim, a qualidade seminal é prejudicada com a inclusão dos contaminantes testados (fezes, urina ou sangue), em concentração de 10%, para a maioria dos parâmetros avaliados. / The objective was to evaluate the quality of fresh and thawed semen of C. macropomum, subject to contamination from various sources. The study was conducted in the Brazilian Amazon region, state of Rondônia, during February and March of 2012. Semen samples of 13 males were divided into four treatments: control (no contaminants) and 10% contaminated with urine, blood or feces. Motility was evaluated in fresh and thawed samples whereas membrane integrity, DNA integrity, and functionality of mitochondria were evaluated in thawed samples. The motility of fresh semen was lower (P <0.05) in samples contaminated by blood, urine or feces (79.6, 76.1 and 78.8%, respectively) when compared with control group (96.1%), but did not differ among them. However in post thawed samples, motility was similar (P> 0.05) in samples contaminated with blood, urine or feces (11.1, 22.3 and 34.6%, respectively) compared to samples without contaminants (40.8%). In post thawed semen, only blood contaminated semen (71.2 s) was lower than the control treatment (140.8 s). Treatments contaminated with urine or feces (94.0 and 102.5 s, respectively) did not differ (P> 0.05) among themselves or with respect to other treatments. For the membrane integrity analysis, values of 72.4, 77.0 and 68.0% obtained in semen contaminated with blood, urine and feces, respectively, were lower (P <0.05) than the control whose average was 91.5%. Treatment contaminated with urine was lower (P <0.05) than the control treatment for DNA integrity (82.8 and 93.4%, respectively) and mitochondria functionality (87.1% and 94.9%, respectively). Therefore, most parameters of semen quality were impaired by the inclusion of contaminants tested (feces, urine or blood) at a concentration of 10%.

Dissertaçao(mestrado)- Universidade Federal do Rio Grande, Programa de Pós-Graduação em Aqüicultura, Instituto de Oceanografia, 2008. / Submitted by Cristiane Silva (cristiane_gomides@hotmail.com) on 2012-07-10T00:50:00Z No. of bitstreams: 1 CarlosFrederico.pdf: 3216882 bytes, checksum: 2323f88ad7d58d3bbb5164aa5335dd23 (MD5) / Approved for entry into archive by Bruna Vieira(bruninha_vieira@ibest.com.br) on 2012-11-06T16:46:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 CarlosFrederico.pdf: 3216882 bytes, checksum: 2323f88ad7d58d3bbb5164aa5335dd23 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-06T16:46:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CarlosFrederico.pdf: 3216882 bytes, checksum: 2323f88ad7d58d3bbb5164aa5335dd23 (MD5) Previous issue date: 2008 / O linguado Paralichthys orbignyanus é um importante recurso pesqueiro do oceano Atlântico Sul e é considerado uma espécie com grande potencial para a aqüicultura. A qualidade do sêmen é uma importante variável no manejo reprodutivo de espécies cultivadas, influenciando diretamente na produção de ovos viáveis. Além disso, o conhecimento das características físicas e químicas do sêmen é um importante fator no desenvolvimento de protocolos de resfriamento e criopreservação do sêmen. O objetivo deste trabalho foi caracterizar o sêmen de P. orbignyanus ao longo da estação reprodutiva e utilizar essas informações para auxiliar no processo de criopreservação do sêmen e no desenvolvimento de um protocolo de transferência de genes mediada por espermatozóides (TGME). Na primeira etapa deste estudo, amostras de sêmen de linguados selvagens foram coletadas ao longo da estação reprodutiva. Através dos resultados obtidos foi verificado que a produção de espermatozóides e a motilidade progressiva aumentam significativamente à medida que a estação reprodutiva progride para o seu final (P<0.05). A motilidade progressiva dos espermatozóides durou em média 10 min, porém o tempo total de motilidade alcançou cerca de 100 min. Com relação ao pH, a osmolalidade e a concentração dos íons K+, Cl- e Mg+ dosados no plasma seminal, assim como, para o percentual de células móveis, nenhuma diferença foi verificada ao longo da estação reprodutiva. No meio da estação foi observada uma diminuição na concentração do íon Ca2+, a qual coincidiu com o menor tempo de motilidade dos espermatozóides. A concentração de Na+ foi aumentando ao longo dos períodos monitorados, atingindo a maior concentração no fim da estação reprodutiva (P<0,05). Na segunda parte deste estudo, a criopreservação do sêmen do linguado P.orbignyanus foi realizada. Para isso, foram testadas duas soluções crioprotetoras: uma contendo glicerol diluído numa solução a base de sais e outra contendo DMSO (dimetilsulfóxido) diluído numa solução à base de sacarose. Os dados de fertilização, eclosão e viabilidade larval demonstraram que as duas soluções utilizadas são eficientes na criopreservação do sêmen do linguado. Na última etapa deste estudo, alguns fatores limitantes na TGME em peixes foram avaliados e um protocolo de incorporação de DNA exógeno pelos espermatozóides foi desenvolvido. Os resultados obtidos nesta parte do trabalho demonstraram que o plasma seminal do P.orbignyanus apresenta uma forte atividade da enzima DNase. Entretanto, a atividade dessa enzima pode ser eliminada ou diminuída lavando o sêmen com soluções contendo EDTA. Além disso,foi verificado que uma quantidade de DNA exógeno similar ou inferior a 50 ng/106 espermatozóides deve ser usada na TGME em peixes. Por último, foi demonstrado que os espermatozóides do linguado P. orbignyanus são capazes de incorporar o DNA exógeno espontaneamente após a eliminação da atividade das DNases. Isto ficou evidente através da amplificação do DNA exógeno através de PCR. Desta forma, os resultados obtidos neste estudo podem auxiliar no manejo reprodutivo dessa espécie e,conseqüentemente, na implementação de programas de melhoramento genético tanto da forma clássica através da criopreservação do sêmen dos reprodutores que apresentam as melhores características fenotípicas, como através de técnicas modernas como a TGME. / The Brazilian flounder Paralichthys orbignyanus is an important fishing resource from southern Atlantic coast of America and it has being considered for aquaculture. The sperm quality is an important variable in reproductive management of cultured species, influencing directly on the production of viable eggs. Moreover, the adequate knowledge of physical and chemical characteristics of the sperm is an important factor for developing short-term storage and cryopreservation protocols of sperm. The aim of this study was to characterize the P. orbignyanus sperm throughout the reproductive season to facilitate the sperm cryopreservation and to help in development of a sperm mediated gene transfer (SMGT) protocol. In the first part of this study, sperm samples were collected from wild flounders throughout the reproductive season. It was verified that the sperm production and the progressive motility of spermatozoa increased significantly towards the end of reproductive season (P<0.05). The mean time of progressive motility of spermatozoa was 10 min, however the total time of motility reached about 100 min. No difference was observed during the reproductive season in pH, osmolality and concentrations of K+, Cl- e Mg+ measured in seminal plasma as well as in percentage of cells motility. In the middle of the breeding season was observed a reduction in Ca+2 concentration which has coincided with the lesser motility time of spermatozoa. The Na+ concentration increased throughout the season, reaching the highest concentration at the end of reproductive period (P<0.05). In the second part of this study, the cryopreservation of the flounder sperm was carried out. Two different cryosolutions were tested: glycerol saline and DMSO - sucrose. The results of fertilization, hatching rate and larval viability demonstrate that both solutions are efficient in the cryopreservation of the flounder sperm. In the last part of this study, some limitant factors for exogenous DNA uptake by spermatozoa were evaluated and a SMGT protocol was developed. It was observed a strong DNase activity in P.orbignyanus seminal plasma. However, it was verified that DNase activity can be eliminated or decreased washing the sperm with EDTA-containing solutions. Moreover, it was verified that an amount of exogenous DNA similar or inferior to 50 ng/106 cells should be used in fish SMGT. At last, it was demonstrated that fish spermatozoa are capable to uptake exogenous DNA spontaneously after DNase activity elimination. This was evidenced through exogenous DNA amplification by PCR. The results of the present study should help in reproductive management of this species and consequently in implementation of genetic improvement programs based not only in the sperm cryopreservation, but also using modern techniques such as SMGT.

Submitted by Anaclaudia Mattos Villalba (anaclaudiamattosvillalba@gmail.com) on 2016-04-09T23:49:33Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao-Josie-Schwartz-Caldas.pdf: 794588 bytes, checksum: edeac2ef5d199f65023941d4036fc463 (MD5) / Approved for entry into archive by cleuza maria medina dos santos (cleuzamai@yahoo.com.br) on 2016-05-09T14:06:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao-Josie-Schwartz-Caldas.pdf: 794588 bytes, checksum: edeac2ef5d199f65023941d4036fc463 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-09T14:06:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao-Josie-Schwartz-Caldas.pdf: 794588 bytes, checksum: edeac2ef5d199f65023941d4036fc463 (MD5) Previous issue date: 2014 / O peixe Geophagus brasiliensis, nativo brasileiro é explorado comercialmente como peixe ornamental, podendo, no futuro, ter reduzidos os estoques naturais. Com isso, a criopreservação pode garantir a sobrevivência e diversidade genética dessa espécie nativa. O objetivo deste estudo foi testar a eficiência crioprotetora e do Dimetil sulfóxido, Etileno glicol e Glicerol em sêmen de G. brasiliensis, utilizando os parâmetros espermáticos motilidade (taxa e tempo de motilidade), integridade de membrana e DNA, funcionalidade mitocondrial e espécies reativas de oxigênio (ERO). Os machos (n=12) foram obtidos de pescadores profissionais da Laguna dos Patos, tiveram seu sêmen coletado por massagem abdominal e diluído (1:9 v/v) em Betsville Thawing Solution para avaliação dos parâmetros espermáticos. As amostras seminais foram diluídas nos difentes tratamentos com crioprotetores DMSO, EG e GLI nas concentrações (5, 10, 15 e 20%). Sendo então, congeladas em Dryshipper e posteriormente armazenadas em botijão de Nitrogênio líquido à -196ºC, por no mínimo 15 dias. Posteriormente, descongeladas em banho-maria a 37º C por 8 segundos e as análises espermáticas refeitas. Todas as análises espermáticas foram realizadas por citometria de fluxo, exceto a motilidade (taxa e tempo) analisada ao microscópio de contraste de fases. Os resultados foram avaliados estatísticamente no programa Statistix 9.0 (2008). Os tratamentos com BTS, DMSO e EG, nas concentrações de 5%, não diferiram na quantidade de ERO (P>0.05). Os tratamentos com DMSO 10, 15 e 20% obtiveram os melhores resultados de integridade de membrana (P<0.05). A Funcionalidade mitocondrial foi semelhante nos grupos com DMSO 10 e 15% e EG 5% (P>0,05). Todos os tratamentos mantiveram a integridade do DNA (P>0,05). O DMSO 10% apresentou melhores médias de motilidade (taxa e tempo), sendo essas de 24% e de 160 segundos. O DMSO 10% foi o tratamento mais eficiente na criopreservação seminal de G. brasiliensis. / The Geophagus brasiliensis fish, Brazilian native is commercially exploited as ornamental fish, and may in the future have reduced the natural stocks. Thus, cryopreservation can ensure the survival and genetic diversity of this and other native species. The aim of this study was to test the efficiency of the cryoprotectant dimethyl sulfoxide, ethylene glycol and glycerol in semen G. brasiliensis, using the sperm motility parameters (rate and time), membrane and DNA integrity, mitochondrial function and reactive oxygen species (ROS). The fishes (n = 12) were obtained from fishermen of the Patos Lagoon, The semen was collected by abdominal massage and diluted (1:9 v / v) in Betsville Thawing Solution (BTS) for evaluation of sperm parameters. The samples were diluted in cryoprotectant treatments, DMSO, EG and GLI at different concentrations (5, 10, 15 and 20%) and frozen in Dryshipper and subsequently stored in liquid nitrogen (-196 ° C) for at least 15 days. Subsequently thawed in a water bath at 37 ° C for 8 seconds and remade sperm analysis. All analyzes were performed by flow cytometry, except motility (rate and time) analyzed by phase contrast microscopy. The results were evaluated statistically in Statistix 9.0 (2008) program. Treatments with BTS, EG and DMSO, at concentrations of 5%, did not differ in the amount of ROS (p> 0.05). Treatment with DMSO 10, 15 and 20% achieved the best results of membrane integrity (P <0.05). Mitochondrial functionality was similar in the groups with 10 and 15% DMSO and 5% EG (P> 0.05). All treatments were maintained the integrity of DNA (P> 0.05). The 10% DMSO showed better average motility (rate and time) which are 24% and 160 seconds. DMSO 10% was the most effective treatment cryopreservation of semen in G. brasiliensis.

Durante o processo de criopreservação o espermatozoide passa por diversas mudanças físico-químicas, podendo ocasionar variados graus de lesões as células espermáticas. Determinar o momento do processo de congelação pelo qual o espermatozoide está mais suscetível às injúrias seria importante passo para progresso do processo de congelação e, com isso, a fertilização. O objetivo foi avaliar o efeito do processo de congelação na integridade das membranas plasmática, acrossomal e potencial mitocondrial (PIAIA) integridade das membranas plasmática (MPI), acrossomal (AI), potencial mitocondrial (APM) e citoesqueleto de espermatozoides equinos in natura diluído, 5°C, -55°C e -196°C. Além de, estudar as etapas de refrigeração, congelação e dentro da congelação, a etapa de supercooling. Assim como, verificar o efeito de duas curvas de congelação (-15°C/min e -33°C/min) durante o supercooling 5°C à -55°C, para isto, foram utilizadas duas máquinas de congelação modelo TK 3000. Para desenvolvimento do experimento, o sêmen foi envasado em palhetas de 0,5mL com concentrações de 100x106 espermatozoides/palheta e submetidos a uma curva 1 (rápida; -0,25°C/min de 22°C até 5°C, com período de 20 minutos para estabilização, -33°C/min de 5°C até -80°C e, -10°C/min de -80°C para -120°C) e a outra para uma curva 2 (lenta; -0,25°C/min de 22°C até 5°C, com período de 20 minutos para estabilização, -15°C/min de 5°C até -80°C e, -10°C/min de -80°C até -120°C). Para realização do experimento foram utilizados 4 garanhões com 6 repetições. Os dados obtidos dos procedimentos experimentais foram analisados com auxílio do software Statistical Analysis System for Windows SAS&reg;, versão 9.3 (SAS, 2005). Não houve diferença estatística significativa (P&gt;0,05) entre as duas curvas de congelação usadas. No entanto, houve efeito de tempo (P&lt;0,05) para todas as características estudadas. Quando foi analisado progressivamente a criopreservação in natura diluído, 5°C, -55°C e -196°C, foi observado que as lesões progrediram com a congelação. Entretanto, quando estudado, as etapas do processo de congelação, a refrigeração in natura diluído até 5°C, supercooling dentro da congelação de 5°C até -55°C e congelação -55°C até -196°C, assim, o citoesqueleto sofreu maior despolimerização durante a refrigeração, entretanto, a membrana acrossomal, sofreu danos reduzidos durante esta etapa. Para MPI e APM ocorreu maior porcentagem de redução da integridade no momento final da congelação -55°C até -196°C, assim, como PIAIA influenciada pela redução de MPI e APM, sofrerem mais injúrias, nessa etapa. De uma forma geral, o processo de congelação causa danos irreversíveis ao espermatozoide equino. Sendo que, a refrigeração causou maior despolimerização do citoesqueleto, porém, praticamente não afetou o acrossomo. A redução de células com MPI, APM e PIAIA, ocorre no momento final da congelação -55°C e -196°C. O acrossomo é a membrana que menos lesa com o processo de congelação. Também, observamos similaridade entre as curvas de congelação rápida (-33°C/min) e lenta (-15°C/min), para os parâmetros estudados. Assim, este estudo permitiu avaliar progressivamente a resposta biológica do espermatozoide durante a criopreservação, obtendo um compreensão dinâmica e quantitativa, dos momentos mais críticos para o espermatozoide, para as características avaliadas e técnicas utilizadas. / During the cryopreservation process the sperm cells undergo several physico-chemical changes, which can cause varying degrees of injury to the sperm cells. Determining the timing of the freezing process by which sperm is most susceptible to injury would be an important step in progressing the freezing process and thus fertilization. The objective was to evaluate the effect of the freezing process on the integrity of plasma membranes, acrosomal and mitochondrial potential (PIAIA) plasma membranes integrity (MPI), acrosomal (AI), mitochondrial potential (APM) and equine spermatozoa diluted in natura, 5°C, -55°C and -196°C. In addition to, study the steps of refrigeration, freezing and within freezing, the stage of supercooling. The freezing curves -15°C/min and -33°C/min during supercooling 5°C to -55°C were used to verify the effect of two freezing machines model TK 3000. For the development of the experiment, the semen was packed in 0.5mL straw with concentrations of 100x106 spermatozoa/straws and su-mitted to a curve 1 (fast; -0.25°C/min from 22°C to 5°C, with a period of 20 minutes for stabi-lization, -33°C/min from 5°C to -80°C and -10°C/min from -80°C to -120°C) and the other for a curve 2 (with a period of 20 minutes for stabilization, -15°C/min from -5°C to -80°C and -10°C/min from -80°C to -120°C). For the experiment, 4 stallions with 6 replicates were used. The data obtained from the experimental procedures were analyzed with the aid of Statistical Analysis System for Windows SAS&reg;, version 9.3 (SAS, 2005). There was no significant statistical difference (P&gt; 0.05) between the two freezing curves used. However, there was a time effect (P &lt;0.05) for all the characteristics studied. When cryopreservation was progressively analyzed (semen extender, 5°C, -55°C and -196°C), it was observed that the lesions progressed with freezing. However, when studied, the steps of the freezing process, refrigeration (in natura diluted to 5°C), supercooling within freezing 5°C to -55°C and freezing -55°C to -196°C, thus, the cytoskeleton underwent greater depolymerization during refrigeration; however, the acrosomal membrane was almost not damaged during this stage. For MPI and APM, a higher percentage of integride reduction occurred at the final freezing point -55°C to -196°C, thus, as PIAIA, probably due to MPI and APM, suffered more injuries at this stage. In general, the freezing process causes irreversible damage to the equine sperm. Since, the refrigeration caused greater depolymerization of the cytoskeleton, however, it practically did not affect the acro-some. The reduction of cells with MPI, APM and PIAIA, occurs at the final moment of freezing -55°C and -196°C. The acrosome is the membrane that suffepe damages from freezing process. Also, similarities were observed between the freezing (-33°C/min) and slow (-15°C/min) freezing curves for the studied parameters. Thus, this study allowed to progressively evaluate the spermatozoid biological response during cryopreservation, obtaining a dynamic and quantita-tive understanding of the most critical mommies for the spermatozoon, for the evaluated para-meters and techniques used.

Orientadores: Luis Antonio Violin Dias Pereira, Suzana de Fatima Paccola Mesquita / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T22:34:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Garcia_PatrickVianna_D.pdf: 2682268 bytes, checksum: c80303a2f196fc3cdb21e73865600ba4 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Durante o processo de maturação epididimária, proteínas secretadas pelo epidídimo interagem com os espermatozoides modificando-os funcionalmente. Cerca de 75% das proteínas que participam da maturação epididimária são secretadas pelas células epiteliais do segmento inicial e cabeça do epidídimo e 48% destas proteínas tem a síntese dependente de dihidrotestosterona (DHT), a qual é sintetizada a partir da testosterona pela ação da enzima 5 ? redutase. A DHT é de extrema importância para a fisiologia do sistema reprodutor masculino. Níveis elevados de DHT na vida adulta podem predispor a vários distúrbios, tais como a alopecia androgênica. Com o intuito de se minimizar os efeitos da DHT, a finasterida foi o primeiro inibidor da 5 ? redutase que recebeu aprovação clínica para o tratamento desses distúrbios.Um público cada vez mais jovem utiliza a finasterida como um método preventivo e paliativo contra a alopecia androgênica, com isso, estudos dos efeitos da finasterida no sistema reprodutor masculino são de grande interesse clínico. O ojetivo desse estudo foi avaliar as possíveis alterações no segmento da cabeça do epidídidmo e na qualidade espermática em animais submetidos ao tratamento agudo (15 dias), crônico (56 dias) e animais que tiveram o tratamento (agudo e crônico) interrompido por um período de 30 dias. Na administração aguda (15 dias) de finasterida em ratos observou-se algumas alterações na integridade da membrana plasmática do espermatozoide. A administração crônica (56 dias) de finasterida em ratos leva a alterações no epidídimo, tais como: redução do peso, alterações morfométricas-estereológicas, diminuição do tempo de trânsito do espermatozoide, redução da motilidade, alterações na integridade da membrana do espermatozóide e redução nos parâmetros de fertilidade desses animais. Mesmo com a interrupção do tratamento com finasterida (por 30 dias) a qualidade do espermatozóide continua comprometida. Dessa forma, estudos adicionais devem ser realizados para complementar o conhecimento existente sobre a fisiologia do epidídimo após a depleção DHT, sobre o tempo que necessário para a recuperação dos parâmetros de fertilidade após a interrupção do tratamento com finasterida, e se estes parâmetros podem ser totalmente recuperados / Abstract: During epididymal maturation, proteins secreted by epididymis functionally interact with the spermatozoa modifying it. About 75% of the proteins that participate in the epididymal maturation are secreted by the epithelial cells of the initial segment and caput of the epididymis and 48% of the synthesis is dependent on dihydrotestosterone (DHT), which is synthesized from testosterone by the action of the enzyme 5 ? reductase.The DHT is extremely important for the physiology of the male reproductive system. High levels of DHT in adulthood may predispose to various disorders such as androgenic alopecia. In order to minimize the effects of DHT, medications were produced with the purpose of inhibit the action of 5 ?-reductase and among those medications the finasteride was the first 5 ? reductase inhibitor that received clinical approval for the treatment of these disorders. A public increasingly young uses finasteride as a preventive and palliative method and against androgenic alopecia, in this way; studies of the effects of finasteride in the male reproductive system are of clinical and commercial interest. The aim of this study was to evaluate the possible alterations in the caput epididymis and sperm quality in animals submitted to acute (15 days) and chronic (56 days) treatment and animals with 30 days post- treatment. Acute administration of finasteride in rats (15 days) was observed reduction in sperm membrane integrity. Chronic administration of finasteride in rats (56 days), leads to changes in the epididymis, such as weight reduction, morphometric-stereological changes, decreased transit time of sperm, motility of the sperm membrane integrity and consequently in fertility parameters of these animals. Even with the interruption of treatment with finasteride (30 days) sperm quality remains committed. Thus, further studies should be performed to complement the existing knowledge on the physiology of the epididymis after DHT depletion, on the time that is needed for the recovery of fertility parameters after interruption of finasteride treatment, and if it these parameters can be fully recovered / Doutorado / Histologia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Recentes estudos do gênero Micrurus, o qual é popularmente conhecido como o das &ldquo;cobras-corais verdadeiras&rdquo;, dividem este táxon em dois grupos morfologicamente distintos, o grupo das cobras corais com anéis negros em mônades (BRM) e o grupo das cobras corais com anéis negros em tríades (BRT) e, com base na morfologia macroscópica, supõe-se que esses grupos possuam estratégias reprodutivas diferenciadas. Assim, este estudo analisa e descreve a biologia reprodutiva de machos e fêmeas da espécie de serpente de tríades Micrurus lemniscatus de algumas regiões do Brasil. Micrurus lemniscatus é um complexo, com evidências polifiléticas, sendo composto por quatro subespécies: Micrurus l. carvalhoi, Micrurus l. helleri, Micrurus l. diutius e M. l. lemniscatus que habitam Mata atlântica, Cerrado e Floresta Amazônica brasileiros. Para isto foram utilizados animais preservados em coleções herpetológicas, dos quais obteveram-se dados biométricos e merísticos. Além disso, estes espécimes foram dissecados e suas gônadas medidas e coletadas para análises morfológicas e histológicas. Outras características, relacionadas à biologia reprodutiva, como presença de dimorfismo sexual, morfologia macro e microscópica, diferenciação das gônadas durante as estações e estocagem de espermatozoides também foram estudadas. O ciclo reprodutivo de Micrurus lemniscatus carvalhoi da Mata Atlântica e Cerrado foi estudado separadamente do ciclo reprodutivo de Micrurus lemniscatus lemniscatus da Amazônia e a comparação entre eles evidencia diferenças consideráveis, assim, é provável que o habitat esteja influenciando o ciclo dessas subespécies, o que pode gerar uma barreira reprodutiva e futura especiação entre elas / Recent studies about the genus Micrurus, popularly known as &ldquo;true coral snakes&rdquo;, divide this taxon in two morphologically distinct groups: the group which has black rings arranged in monads (BRM) and the group which has black rings in triads (BRT) and, based on macroscopic morphology, it is assumed that these groups have different reproductive strategies. Therefore, this research analyzes and describes male and female Micrurus lemniscatus reproductive biology of some regions in Brazil. M. lemniscatus is a species complex with polyphyletic evidence, consisting of four subspecies: Micrurus l. carvalhoi, Micrurus l. helleri, Micrurus l. diutius and M. l. lemniscatus, which inhabit the Atlantic rainforest, Cerrado and Amazon rainforest. For such, animals of herpetological collections were used to obtain biometric and meristic data. In addition, these specimens were dissected and their gonads measured and collected for morphological and histological analyzes. Other features related to reproductive biology were examined, such as the presence of sexual dimorphism, macroscopic and microscopic morphology, gonadal differentiation during the seasons, and sperm storage. The reproductive cycle of Micrurus lemniscatus carvalhoi from Atlantic forest and Cerrado was studied separately from the reproductive cycle of Micrurus lemniscatus lemniscatus from the Amazon forest and the comparison between them shows considerably differences, so it is likely that the habitat is influencing the cycle of these subspecies, which can generate a reproductive barrier and future speciation between them

Magister Scientiae - MSc / Male infertility in humans has increased in the last few decades and could be as high as 40%, while up to 50% of these men have ''unexplained'' (idiopathic) infertility. Although newly developed molecular techniques have great value in detecting subtle causes of male infertility, more detailed sperm functional tests are required to identify compromised fertility, especially in a clinical set-up. Since ethical constraints often preclude the pursuit of many basic research questions in humans, non-human primates (NHPs) have been identified as key models in human-related studies. NHPs are often used in studies on male fertility/infertility, IVF or assisted reproductive technology (ART) procedures, male contraception and reproductive toxicology. However, comparing results of NHP and human studies require that techniques used for assessment must be objective, standardized and sensitive to recognize compromised sperm function. The aim of this study was to evaluate standard sperm functional tests and develop new functional tests using NHP sperm, specifically from vervet monkeys (Chlorocebus aethiops), chacma baboons (Papio ursinus) and rhesus monkeys (Macaca mulatta), for application in human and NHP studies and to ultimately develop a basic primate model. The sperm functions investigated included sperm motility, longevity, vitality, DNA integrity, acrosome reaction, and hyperactivation. The sperm functional tests evaluated were: CASA motility analysis; Sperm Longevity test; Eosin-Nigrosin and Hoechst and Propidium Iodide staining, as well as the use of WST-1 cytotoxicity assay for vitality; the TUNEL assay for DNA integrity; Acrosome Intactness Test; and induction of hyperactivation via stimulants. The validity of each test was investigated by inhibiting sperm function through the use of copper sulphate and cadmium chloride. All functional tests were successfully performed across all three species, except the TUNEL assay for DNA integrity, and was further used for validation testing. Validation testing proved that all sperm functional parameters were significantly affected by the highest concentrations of the chemicals (250 µg/ml CuSO4 and 500 µg/ml CdCl2) and if not significant, trends of reduction were seen. The tests employed were therefore sensitive to the inhibitory effect of the metals. By evaluating these established sperm functional tests we found that primates would serve as good models for research study. Furthermore, we optimized and modified techniques for sperm and functional analysis in these three primate species and this study will standardize protocols for use in future studies on male infertility. Additionally, comparing human and NHP sperm function can possibly reveal or explain the high infertility rates in humans.

While the introduction of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) has revolutionized the treatment of male infertility, concerns have been raised regarding the risk of chromosomal abnormalities in pregnancies derived from ICSI. Studies on sperm from infertile men have suggested that this population may produce higher rates of aneuploid sperm. Thus, we hypothesized that defects in early meiotic events may contribute to both male infertility and the production of aneuploid sperm. We used immunofluorescent techniques to observe the synapsis and recombination of chromosomes during meiosis, and fluorescent in-situ hybridization (FISH) to assess sperm aneuploidy. We analyzed testicular tissue from thirty-one men (10 fertile and 21 infertile men). We observed that ~36% (5/14) of men with impaired spermatogenesis displayed reduced genome-wide recombination. When all men were pooled, we observed an inverse correlation between the frequency of sex chromosome recombination and XY disomy in the sperm. We combined immunofluorescent and FISH techniques to study recombination patterns on chromosomes 13, 18 and 21 in fifteen men (5 fertile and 10 infertile men). Four of the infertile men displayed altered recombination distributions on at least one of the chromosome arms studied. Finally, we examined early meiotic events in two biopsies from an azoospermic t(8;13) carrier. While global recombination rates were not altered, recombination frequencies were reduced specifically on the rearranged chromosomes. Asynapsed quadrivalents were observed in 90% and 87% of pachytene nuclei from the first and second biopsies, respectively, and were frequently associated with the sex chromosomes. BRCA1 and γH2AX, two proteins implicated in meiotic sex chromosome inactivation, localized along asynapsed regions regardless of whether or not they were associated with the sex chromosomes, suggesting that regions of autosomal chromosomes that fail to synapse undergo transcriptional silencing in humans. In summary, we observed that a subset of infertile men display alterations in the number and position of meiotic crossovers, which may contribute to both infertility and an increased risk of sperm aneuploidy. The fidelity of synapsis is also a critical factor in determining the outcome of gametogenesis in humans, as the transcriptional inactivation of asynapsed regions may silence meiotic genes, leading to meiotic arrest and infertility. / Medicine, Faculty of / Obstetrics and Gynaecology, Department of / Graduate