O resveratrol, encontrando principalmente sob as formas trans-3,5,4\',5-trihidroxiestilbeno e cis-3,5,4\'-trihidroxiestilbeno é uma substância que possui muitas propriedades benéficas a saúde, entre elas, vasodilatação, metabolismo de lipoproteínas, inibição da agregação de plaquetas e até mesmo possui ação terapêutica e preventiva de câncer. Um importante destaque é a sua capacidade de agir como antioxidante, o tornando atraente para uso como substância radiomodificadora. A radiação ionizante (RI), que é utilizada na radioterapia, pode ocasionar diversos danos a células saudáveis, seus componentes e estruturas moleculares, dependendo da dose absorvida e do tipo de célula. O Danio rerio é um modelo animal ideal para avaliação dos efeitos biológicos da RI. Neste trabalho, o resveratrol foi avaliado como potencial radiomodificador em ensaios com embriões de Danio rerio expostos em diferentes horas pós fertilização(hpf), com e sem o córion, a radiação gama. Todos os ensaios foram baseados no protocolo da OECD 236. Para entender os efeitos na mortalidade dos embriões expostos ao resveratrol a radiação separados, foram obtidos valores de CL50 e DL50, respectivamente. Os resultados foram: CL50 de 154 μM (para embriões de 2hpf), 283 μM (para embriões de 12hpf), 699 μM (para embriões de 24 hpf sem córion). E DL50 de 11,50Gy e 12,18Gy (embriões de 4 e 6hpf), 24,8Gy (embriões de 24hpf com córion) e 16,99(embriões de 24 hpf sem o córion). A partir destes resultados foram escolhidas as concentrações de 15, 30 e 60 μM de resveratrol e as doses 5 e 15 Gy (para embriões de 4 e 6 e 24 hpf sem córion) 10 e 20 Gy (para embriões de 24hpf com córion) de radiação gama para observar a atividade radiomodificadora do resveratrol em ensaios com duração de 144 horas, a cada 24 horas foram contabilizados os embriões mortos para comparação estatística por meio do teste Z. Houve diferença na porcentagem de mortalidade em todos os ensaios, mas para embriões expostos a radiação com 24hpf sem córion na presença de 30μM de resveratrol essa diferença foi estatisticamente significativa apontando um indício de radioproteção. Nos embriões de 24hpf sem córion irradiados na presença de 60μM a mortalidade dos embriões irradiados é foi maior quando comparada apenas aos irradiados, indicando que em concentrações mais altas o resveratrol pode exercer a função de radiosensibilizador, embora neste caso não tenha sido estatisticamente significativo, o resultado corrobora com dados na literatura que indicam ação sensibilizadora do composto em células expostas a radiação nessa mesma concentração. / Resveratrol, mainly found in the forms trans-3,5,4 \', 5-trihydroxystilbene and cis-3,5,4\'-trihydroxystilbene is a substance that has many beneficial health properties, among them, vasodilation, lipoprotein metabolism, inhibition of platelet aggregation and even has therapeutic and preventive action of cancer. An important highlight is its ability to act as an antioxidant, making it attractive for use as a radiomodifying substance. Ionizing radiation (IR), which is used in radiotherapy, can cause various damage to healthy cells, their components and molecular structures, depending on the absorbed dose and the cell type. Danio rerio (paulistinha)is an ideal animal model to evaluate the biological effects of IR. In this work, resveratrol was evaluated as a potential radiomodifier in assays with embryos exposed at different hours post-fertilization (hpf), with and without the chorion, to different doses of gamma radiation. All assays were based on the protocol of OECD 236. To understand the effects on mortality of embryos exposed to resveratrol and radiation apart, values of LC50 and LD50, respectively, were obtained. The results were: LC50 of 154 μM (for 2hpf embryos), 283 μM (for 12hpf embryos), 699 μM (for embryos of 24 hpf without chorion). And DL50 of 11.50Gy and 12.18Gy (embryos of 4 and 6hpf), 24.8Gy (embryos of 24hpf with chorion) and 16.99 (embryos of 24 hpf without the chorion). From these results, concentrations of 15, 30 and 60 μM of resveratrol and doses 5 and 15 Gy (for embryos of 4 and 6 and 24 hpf without chorion) 10 and 20 Gy (for 24hpf embryos with chorion) were chosen from gamma radiation to observe the radiomodifying activity of resveratrol in trials with a duration of 144 hours, the dead embryos were counted every 24 hours and these results were compared with a Z test. There was difference in the percentage of mortality in all the trials, but for the exposed to radiation with 24hpf without chorion in the presence of 30μM of resveratrol the number of dead embryos was less and statistically significant indicating radioprotection of resveratrol. In the 24hpf embryos irradiated in the presence of 60μM, the mortality of irradiated embryos was higher when compared to irradiated embryos, indicating that in higher concentrations resveratrol may exert the radiosensitizer function, although in this case it was not statistically significant, these result corroborates with data in the literature that indicate the sensitizing action of the compound in cells exposed to radiation in this same concentration.

Atualmente os gliomas representam cerca de 81% dos tumores cerebrais malignos, com aumento na incidência tanto em crianças, como em adultos acima dos 45 anos. Um número elevado de receptores neuroquinina tipo 1 (NK-1) estão expressos em células de glioma, estando a ligação da Substância P (SP) a esses receptores, envolvida no desenvolvimento e progressão desse tipo de tumor. A SP quelada ao DOTA (SP-DOTA), radiomarcada, vem sendo testada para utilização na terapia de gliomas, sendo o lutécio-177 (177Lu), devido a seu menor alcance tecidual, o radioisótopo mais indicado para tumores localizados em áreas críticas do cérebro. No entanto, estudos indicam a necessidade da adição de um excesso de metionina para prevenção da oxidação peptídica da SP-DOTA-177Lu, visando aumentar a estabilidade e a capacidade de ligação às células tumorais. Para superar esse desafio, surge a perspectiva da utilização de um novo análogo da SP, com estrutura modificada, para prevenir a oxidação peptídica. Neste contexto, o objetivo desse trabalho foi estudar a marcação de um novo análogo da SP com 177Lu e caracterizar suas propriedades in vitro e in vivo, visando a obtenção de um radiofármaco inédito e com potencial aplicação na terapia de tumores cerebrais e realizar estudos preliminares de marcação deste novo análogo com Ítrio-90 (90Y). O novo análogo foi obtido pela troca do aminoácido metionina (Met) pelo aminoácido norleucina (Nle) na posição 11 da cadeia peptídica da SP, sendo esses peptídeos denominados respectivamente SP(Met11)-DOTA e SP(Nle11)-DOTA. Após análise da oxidação peptídica dos dois peptídeos, os parâmetros da radiomarcação da SP(Nle11)-DOTA, com 177LuCl3, foram estudados para determinar a melhor condição de marcação. As estabilidades in vitro da SP(Nle11)-DOTA-177Lu sob refrigeração (2-8°C), no freezer (-20°C) e em soro humano (37°C) foram determinadas após radiomarcação com alta atividade, quanto ao uso de agentes estabilizantes e após diluição. A SP(Nle11)-DOTA também foi radiomarcada com 90Y, utilizando-se a condição padrão determinada, sendo a estabilidade in vitro da SP(Nle11)-DOTA-90Y sob refrigeração (2-8°C) e em freezer (-20°C), avaliada após radiomarcação com alta atividade e quanto a utilização de agente estabilizante. A capacidade de ligação in vitro às células tumorais (U-87 MG e M059J) e a biodistribuição in vivo em camundongos BALB/c sadios foram determinadas para a SP(Nle11)-DOTA-177Lu e comparadas à SP(Met11)-DOTA-177Lu. A ligação às proteínas plasmáticas e a biodistribuição em camundongos Nude com modelo tumoral também foram avaliadas. Os resultados obtidos na análise da oxidação peptídica comprovaram a importância da adição de excesso de metionina para prevenção da oxidação peptídica e indicaram uma alta estabilidade da SP(Nle11)-DOTA, durante e após o processo de radiomarcação. A adição de 148 MBq (4 mCi) da solução de 177LuCl3 em HCl 0,05N à 10 μg de SP(Nle11)-DOTA diluída em tampão acetato de sódio 0,4 M pH 4,5 seguida pela incubação a uma temperatura de 90ºC por 30 minutos, sob agitação de 350 rpm foi definida com condição padrão de marcação. O congelamento (-20°C), o uso de agentes estabilizantes e a diluição apresentaram-se como métodos efetivos para garantir uma alta estabilidade in vitro da SP(Nle11)-DOTA-177Lu, após a marcação com alta atividade. Bons resultados também foram observados para a marcação da SP(Nle11)-DOTA com 90YCl3 e para a estabilidade in vitro da SP(Nle11)-DOTA-90Y, após congelamento (-20°C) e quando utilizado ácido gentísico como estabilizante. A SP(Nle11)-DOTA-177Lu apresentou uma boa especificidade pelas células tumorais, principalmente pelas células de glioma humano M059J, sugerindo que a substituição do aminoácido metionina por norleucina na posição 11 não compromete a capacidade de ligação da SP(Nle11) às células tumorais. Uma baixa porcentagem de ligação às proteínas plasmáticas e um rápido clareamento sanguíneo foram observados para a SP(Nle11)-DOTA-177Lu, sendo esse radiofármaco eliminado preferencialmente por via renal. A SP(Nle11)-DOTA-177Lu apresentou uma boa estabilidade in vivo e se mostrou incapaz de atravessar a barreira hematoencefálica, sendo seu uso indicado por injeção intratumoral ou intracavitária. O estudo de biodistribuição em animais com modelo tumoral, mostrou que esse radiofármaco se liga às células tumorais por ligações receptor específicas. Com base nesse dados conclui-se que a SP(Nle11)-DOTA-177Lu, apresenta-se como um radiofármaco inédito que devido às suas propriedades in vitro e in vivo favoráveis, apresenta potencial aplicação na terapia de tumores cerebrais, representando uma nova possibilidade dentro do limitado arsenal terapêutico para esse tipo de tumor. / Currently gliomas represent about 81% of malignant brain tumors with increased incidence in children and in adults over 45 years. A large number of type 1 neurokinin receptor (NK-1) are expressed in glioma cells, being the binding of substance P (SP) to these receptors, involved in the development and progression of this tumor type. The SP conjugated at DOTA chelator (SP-DOTA), radiolabeled, have been tested for use in the treatment of gliomas, and the lutetium-177 (177 Lu), due to its lower tissue range, has been the most suitable radioisotope for tumors located in critical areas brain. However, studies indicate the necessity of adding an excess of methionine to prevent the peptide SP-DOTA-177Lu oxidation in order to increase the stability and capacity to bind to tumor cells. To overcome this challenge, there is the prospect of using a new analog of SP with a modified structure, to prevent peptide oxidation. In this context, the aim of this work was study the labeling of a new analog of SP with 177Lu and characterize their properties in vitro and in vivo, in order to obtain a novel radiopharmaceutical with potential application in brain tumor therapy, and perform preliminary studies labeling of this new analog with yttrium-90 (90Y). The new analog was obtained by replacement of the amino acid methionine (Met) by the amino acid norleucine (Nle) at position 11 of the peptide chain of SP, and these peptides were called SP(Met11)-DOTA and SP(Nle11)-DOTA respectively. After analysis of the oxidation for the two peptides, the radiolabeling parameters of the SP(Nle11)-DOTA with 177LuCl3 were studied to determine the best labeling condition. The SP(Nle11)-DOTA was also radiolabeled with 90Y, using standard condition, and the stability in vitro of the SP(Nle11)-DOTA-90Y assessed under refrigeration (2-8 °C) and under freezing (-20° C), after radiolabeling with high activity and use of stabilizing agent. The stabilities in vitro of the SP (Nle11)-DOTA-177Lu under refrigeration (2-8 °C), under freezing (-20 °C) and in human serum (37 °C) were determined after radiolabeling with high activity, with use of stabilizing agents and after dilution. The ability of in vitro binding to tumor cells (U-87 MG and M059J) and the biodistribution in vivo in healthy BALB/c mice were determined for the 177Lu-DOTA-SP(Nle11) and compared to 177Lu-DOTA-SP(Met11). The plasma protein binding and biodistribution in Nude mice with tumor model were also evaluated. The results obtained from analysis of oxidation for the two peptides confirmed the importance of adding excess methionine to prevent peptide oxidation and indicated a high stability of the DOTA- SP(Nle11), during and after the radiolabeling process. The addition of 148 MBq (4 mCi) of 177LuCl3 solution in 0.05N HCl at 10 μg DOTA-SP(Nle11) diluted in 0.4 M sodium acetate buffer pH 4.5 followed by incubation at a temperature of 90 °C for 30 minutes under constant agitation to 350 rpm was defined as standard labeling condition. The freezing (-20 °C), the use of stabilizing agents and the dilution were presented as effective methods to ensure high stability in vitro 177Lu-DOTA-SP(Nle11), after labeling with high activity. Good results were also observed for labeling DOTA-SP(Nle11) with 90YCl3 and for stability in vitro of the 90Y-DOTA-SP(Nle11) after freezing (-20 °C) and when gentisic acid was used as a stabilizer. The 177Lu-DOTA-SP(Nle11) showed good specificity to tumor cells, particularly human glioma cells (M059J), suggesting that substitution of the amino acid norleucine for methionine at position 11 does not compromise the capacity of SP(Nle11) binding to tumor cells. A low percentage of plasma protein binding and rapid blood clearance were observed for the 177Lu-DOTA-SP(Nle11), being this radiopharmaceutical preferably eliminated by the kidney. The 177Lu-DOTA-SP(Nle11) showed good stability in vivo and inability to cross the blood brain barrier, being its use indicated through intratumoral or intracavitary injection. The biodistribution studies in animals with tumor model showed that the radiopharmaceutical binds to the tumor cells by specific receptor binding. Based on this data was concluded that the 177Lu-DOTA-SP(Nle11), can be presented as a novel radiopharmaceutical that due to its favorable properties in vitro and in vivo, presents a potential application in the therapy of brain tumors, representing a new possibility within the limited therapeutic options for this type of tumor.

Atualmente observa-se que a proporção de pessoas com 60 anos ou mais está crescendo mais rápido do que a de outras faixas etárias. Um dos resultados desta transição epidemiológica é o aumento das doenças cujo fator de risco é o envelhecimento, entre elas, a doença de Parkinson. Embora muitas regiões exibam os sinais neuropatológicos da doença de Parkinson, a degeneração dos neurônios, contendo neuromelanina, da substância negra é considerada como sendo uma característica importante, representando o critério cardinal para o diagnóstico. No entanto, ainda não está claro por que certas regiões do cérebro, como a substância negra, são vulneráveis em algumas doenças neurodegenerativas e alguns neurônios vizinhos, às vezes morfologicamente indistinguíveis, permanecem preservados. Análises moleculares de populações de neurônios podem conduzir a uma melhor compreensão sobre a fisiologia dos mesmos, bem como os mecanismos envolvidos nos processos de doença. Na era pós genômica, realizar análises proteômicas são de grande interesse científico, pois permitem avanços no conhecimento dos processos biológicos. A técnica de microdissecção e captura a laser tem sido uma ferramenta importante e cada vez mais utilizada para aquisição de populações puras de células a partir de secções histológicas, evitando que áreas não pertencentes ao tecido alvo sejam dissecadas. A união destes métodos pode contribuir de maneira relevante para o entendimento fisiopatológico dos neurônios contendo neuromelanina da substância negra. No entanto, para que a microdissecção e captura a laser e as análises proteômicas sejam eficazes, é imprescindível a aplicação de um protocolo bem estruturado. Dentro desse contexto, o presente trabalho tem como objetivo criar um protocolo de microdissecção a laser de neurônios contendo neuromelanina em indivíduos cognitivamente normais, para subsequente análise proteômica. Os casos utilizados neste estudo são provenientes do Banco de Encéfalos Humanos do Grupo de Estudos em Envelhecimento Cerebral. Para o desenvolvimento da nossa proposta, contamos com a colaboração do Centro de Proteômica Médica da Universidade de Bochum, Alemanha. O protocolo foi desenvolvido baseado em outros previamente descritos na literatura e otimizado de acordo com objetivos pretendidos. Analisamos o plano anatômico de amostragem do tecido, o método de congelamento, a espessura do corte para a microdissecção, a solução utilizada para a coleta do tecido durante a microdissecção e o método de digestão proteolítica para posteriores análises proteômicas. Através de ensaios comparativos, alcançamos os resultados desejados e os mesmos foram validados através de análises por espectrometria de massas. Consequentemente, também fomos capazes de reconhecer fatores técnicos que possivelmente impossibilitariam um efetivo estudo do proteoma / Currently the worldwide proportion of people aged 60 years and over is growing faster than any other age group. This strikingly epidemiological transition results in an increase of aging related diseases, including Parkinson\'s disease (PD). Although many brain areas exhibit the neuropathological signs of Parkinson\'s disease, the degeneration of neuromelanin containing cells in the substantia nigra is considered a hallmark feature, representing cardinal diagnostic criteria for PD. However, why certain brain regions -- such as the substantia nigra -- are vulnerable in some neurodegenerative diseases, while some neighboring morphologically indistinguishable neurons remain preserved, is still unclear. Molecular analysis of specific neuronal populations can lead us to a better understanding about the physiological role played by these neurons and mechanisms involved in disease\'s processes. In a post-genomic era, proteomic analyses are of great scientific interest since they allow a better understanding of the biological processes. The laser capture microdissection technique has also became an important tool in biological research, being increasingly used for acquisition of pure populations of cells from histological sections, preventing the dissection of areas outside the target tissue. The combination of these methods can significantly contribute to understand the pathophysiological role of the containing neuromelanin neurons of the substantia nigra. However, for an effective application of both techniques, laser capture microdissection and proteomic analysis, it is essential the application of an efficient protocol. In this context, this study aims to establish a protocol for laser microdissection of containing neuromelanin neurons in cognitively normal individuals for subsequent proteomic analyses. We selected cases from the Brain Bank of the Brazilian Aging Brain Study. A collaboration with the Medical Proteome Center, University of Bochum, Germany took part during the development of our proposal. Our protocol was developed based on previous published protocols and optimized according the intended aims. We analyzed anatomical planes for neuronal collection, freezing methods, thickness of tissue for microdissection sections, solution for tissue collection during laser microdissection and the proteolytic digestion methods. Through our comparative tests, we have achieved the desired results and validated them by mass spectrometry analyses. Consequently, we were also able to exclude technical factors that could possibly preclude one effective proteome analysis

O tratamento com morfina ao final da prenhez, faz com que uma única dose dessa droga durante a lactação iniba o comportamento maternal e estimule a caça predatória. A intensidade dessa mudança comportamental depende da dose desafio de morfina utilizada. A exposição a drogas de abuso pode levar a um fenômeno denominado tolerância reversa, que consiste na exacerbação dos efeitos do tratamento agudo com um fármaco observada após a interrupção de um tratamento crônico. O objetivo deste estudo foi avaliar como os efeitos do pré-tratamento com morfina durante a gestação podem influenciar na seleção comportamental após o parto. Ratas foram expostas simultaneamente a filhotes e insetos, sendo observada a expressão dos comportamentos maternal e predatório. As ratas foram tratadas com injeções diárias de morfina (3,5 mg/Kg, s.c.) do 17º ao 21º dia de gestação, e desafiadas agudamente no 5o ou 6o dia de lactação com doses distintas de morfina (0,5, 1,0 e 1,5mg/Kg; grupos MM0,5, MM1,0 e MM1,5) ou salina (grupo MS). Grupos controle foram pré-tratados com salina e desafiados com morfina (0,5, 1,0 e 1,5mg/Kg; grupos SM0,5, SM1,0 e SM1,5) ou salina (grupo SS), respectivamente. Em seguida foram testadas no paradigma de escolha entre cuidar dos filhotes e caçar. Animais pré-tratados com morfina e desafiados com 1,0 mg/Kg tiveram parâmetros de comportamento maternal prejudicados e facilitação ao comportamento de caça de maneira significante, o que não foi observado nos animais desafiados com a dose de 0,5 mg/Kg. Animais desafiados com 1,5 mg/Kg de morfina tiveram prejuízo em relação ao comportamento maternal e facilitação do comportamento predatório tanto no grupo de fêmeas pré-tratadas com morfina, quanto com salina. Em ratas lactantes a exposição simultânea a filhotes e insetos permitiu revelar a existência de tolerância reversa à mudança comportamental induzida por estímulo opioidérgico. / Treatment of postpartum female rats with morphine inhibits maternal behavior. The same treatment also stimulates foraging in adult animals. Exposure to drugs of abuse may result in a progressive and enduring enhancement of their reinforcing effects. Puerperal treatment with morphine leads to reverse tolerance to this drug, ultimately influencing the effects of opiates on maternal behavior. The aim of the present study was to investigate whether abrupt withdrawal from repeated morphine treatment during late pregnancy may influence the effects of morphine on behavioral selection in lactating rats. Animals were exposed simultaneously to pups and insects, and the choice between taking care of the pups and hunting for insects was observed. Female Wistar rats were treated with morphine (3.5 mg/kg/day, subcutaneous [s.c.]) or saline for 5 days beginning on pregnancy day 17. On day 5 of lactation, animals were acutely challenged with morphine (0.5, 1.0, or 1.5 mg/kg, s.c.; MM0.5, MM1.0, and MM1.5 groups, respectively) or saline (MS group) and simultaneously tested for predatory hunting and maternal behavior. Control groups were pretreated with saline and challenged with morphine (SM0.5, SM1.0, and SM1.5 groups) or saline (SS group). Animals treated with morphine during late pregnancy and acutely challenged with 1.0 mg/kg morphine (MM1.0 group) exhibited significantly decreased maternal behavior and enhanced hunting. This effect was not evident for the 0.5 mg/kg dose. The 1.5 mg/kg morphine dose decreased maternal behavior and increased hunting in both the MM1.5 group and in animals acutely challenged with morphine after previous saline treatment (SM1.5 group). These results provide evidence of plasticity of the opioidergic role in behavioral selection during lactation.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:38:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LUCIANA MAIA ESCHER DOS SANTOS.pdf: 3201320 bytes, checksum: f5c8c078f60bbba17912e8c39742ed0a (MD5) Previous issue date: 2013-06-24 / Molecular Biology shown to be an effective tool in forensic laboratories for the ability to identify an individual from minute amounts of biological samples such as blood, bones, semen, hair, teeth, nails, spittle, urine and other biological fluids recovered from the crime scene. One of the main biological evidence found at a crime scene are traces of bloodstains. This study aimed to analyze the molecular profiles of biological samples exposed to the chemiluminescent reagent luminol based on different storage times (48 hours and 30 days). With the measurement of all samples can be inferred that in the first 48 hours of storage, there was obtained DNA and varying concentrations after application of the chemiluminescent reagent. The samples were amplified by PCR using a multiplex system AmpFlSTR ® Select NGM and capillary electrophoresis. Molecular profiles were obtained complete and incomplete denoting specificity as the quality and quantity of the sample analyzed. The selection of molecular markers mini-STRs greatly contributed to the success of these profiles, allowing the study and analysis of degraded material. Our data suggest that the degradation of the DNA molecule exposed to the chemiluminescent reagent was higher in the samples compared to those containing diluted whole blood impregnation. Therefore, analyzing the bloodstains samples exposed to luminol in shorter storage provide molecular profiles compatible to clash samples. / A Biologia Molecular mostrou-se uma ferramenta efetiva nos laboratórios forenses pela capacidade de identificar um indivíduo a partir de quantidades ínfimas de amostras biológicas como sangue, ossos, sêmen, cabelo, dentes, unhas, saliva, urina, entre outros fluidos biológicos recuperados no local do crime. Uma das principais evidências biológicas encontradas em local de crime são vestígios de substâncias hematóides. Esta pesquisa visou a análise de perfis moleculares de amostras biológicas expostas ao reagente quimioluminescente a base de luminol em diferentes tempos de armazenamento (48 horas e 30 dias). Com a quantificação de todas as amostras pode-se inferir que nas primeiras 48 horas de armazenamento, obtiveram-se concentrações variáveis de DNA e após a aplicação do reagente quimioluminescente. As amostras foram amplificadas por PCR utilizando um sistema multiplex AmpFlSTR® NGM SElect e eletroforese capilar. Foram obtidos perfis moleculares completos e incompletos denotando inespecificidade conforme a qualidade e quantidade da amostra analisada. A seleção dos 17 marcadores moleculares mini-STRs em muito contribuiu para o sucesso desses perfis, permitindo estudo e análise de material degradado. Os dados indicam que a degradação da molécula de DNA exposta ao reagente quimioluminescente foi maior nas amostras diluídas em relação àquelas contendo impregnação com sangue total. A análise estatística das amostras com e sem exposição ao reagente quimioluminescente comparado ao grupo controle e em diferentes concentrações, mostrou não haver diferença estatísticamente significativa entre os valores quantificados obtidos. Ainda assim, analisar as amostras hematóides expostas ao luminol em menor tempo de armazenamento proporcionarão perfis moleculares compatíveis ao confronto de amostras.

As reações incondicionadas de defesa observadas em mamíferos são organizadas pelo Sistema Encefálico de Aversão (SEA), composto, entre outras estruturas, pela substância cinzenta periaquedutal dorsal (SCPd) e o colículo inferior (CI). Tem sido proposto que o CI seja parte do circuito sensoriomotor para os estímulos auditivos de natureza aversiva e a SCPd como a principal via de saída (output) do SEA para a elaboração de comportamentos defensivos. Ambas as estruturas são reguladas tonicamente pelo neurotransmissor inibitório ácido gama-aminobutírico (GABA). Este trabalho aborda a mediação química GABA/Benzodiazepínica (BZD) do processamento da informação aversiva no CI e das respostas de medo elaboradas pela SCPd. Grupos independentes de animais submetidos ao implante de quimitrodos (eletrodos acoplados a cânulas-guia para injeção de drogas) foram usados para avaliar no CI e SCPd os efeitos de injeções locais de muscimol (agonista de receptores GABA-A), semicarbazida (inibidor da síntese da enzima precursora do GABA descarboxilase do ácido glutâmico) ou midazolam (agonista BZD). Foram registrados potenciais evocados auditivos (PEA) no CI como medida eletrofisiológica da ativação neuronial, além da determinação dos limiares de congelamento e fuga, com o procedimento de estimulação elétrica (EE), tanto do CI quanto da SCPd. A mesma abordagem farmacológica com injeções de drogas intra-CI foi empregada em animais submetidos ao teste do Labirinto em Cruz Elevado (LCE), um modelo animal tradicional de ansiedade. Adicionalmente, investigou-se a participação de ambas as estruturas na expressão do comportamento de desligar uma luz de intensidade aversiva em um novo teste de medo incondicionado (Light Switch Off Test; LSOT) recentemente proposto pelo nosso grupo. Encontramos uma clara segregação funcional entre a porção dorsal e ventral do CI, sendo a última envolvida nos comportamentos defensivos. Mecanismos GABAérgicos em ambas as estruturas influenciam a amplitude do PEA e o congelamento pós-fuga da EE, sugerindo uma relação funcional entre as duas estruturas. Já no LSOT, os resultados indicam o envolvimento de mecanismos GABAérgicos do vCI, mas não da SCPd, na modulação da resposta incondicionada à luz em ratos. Os resultados obtidos permitem ampliar o conhecimento atual sobre a neurobiologia dos estados de medo e ansiedade, em uma abordagem integrada dos mecanismos de processamento das informações sensoriais e da expressão de reações de defesa. / Unconditioned defense reactions observed in mammals are organized by the Brain Aversive System, comprising, among other structures, the dorsal periaqueductal gray matter (dPAG) and the inferior colliculus (IC). It has been proposed that the IC is part of the sensorimotor circuitry that processes aversive auditory information and the dPAG is considered the main neural substrate for the expression of defensive behaviors. Both structures are tonically regulated by the inhibitory neurotransmitter gamma-aminobutyric acid (GABA). This work addresses the chemical mediation of GABA/Benzodiazepine (BZD) on aversive information processing in the IC and the elaboration of fear responses by dPAG. Independent groups of animals implanted with chemitrodes (electrodes attached to a guide cannula for drug injection) have been used to evaluate the IC and dPAG regarding the effects of local injections of GABAergic agents (muscimol, semicarbazide, and midazolam). Auditory evoked potentials (AEP) have been recorded in the IC as a measure of electrophysiological neuronal activation, in addition to determining the thresholds of defensive freezing and flight behaviors, using the electrical stimulation (EE) procedure in both IC and dPAG. The same pharmacological regimen of drug injections intra-dPAG and intra-CI have been applied to animals subjected to the elevated plus maze (EPM), a well-known animal model of anxiety, and also to a novel animal test for innate fear (Light Switch Off Test, LSOT) that has been developed and proposed by our group. We found a clear functional segregation between the dorsal and ventral portions of the IC, the latter being the specific collicular substrate of defensive behaviors. GABAergic mechanisms in both structures influence the amplitude of the AEP and post-stimulation freezing of EE, suggesting a functional link between the two structures. In the LSOT, our data indicate the involvement of GABAergic mechanisms of the ICv, but not the dPAG, in the modulation of the unconditioned response to light in rats. These original findings presented here contribute to broaden the current knowledge on the neurobiology of fear and anxiety, in an integrative approach of the mechanisms underlying sensory processing and the expression of defensive behaviors.

Nossa hipótese é de que os efeitos pró-inflamatórios iniciais da ativação do receptor ativado por protease 2 (PAR2) na articulação temporomandibular (ATM) sejam mediados por mecanismos neurogênicos. A análise por imunofluorescência revelou um alto grau de imunorreatividade ao PAR2 em aferentes primários trigeminais da ATM. Além do mais, a imunorreatividade ao PAR2 também foi observada na camada íntima da sinóvia, além de co-localizar com o marcador neuronal PGP9.5 e o neuropeptídeo substância P. A injeção intra-articular de agonistas PAR2 na ATM induziu um aumento dependente da dose no extravasamento plasmático, influxo de neutrófilos e indução de alodinia mecânica. O bloqueio farmacológico de receptors NK1 inibiu o aumento no extravasamento plasmático, influxo de neutrófilos e alodinia induzido pela ativação do PAR2. Em conclusão, a ativação do PAR2 é pró-inflamatório na ATM, via mecanismos neurogênicos envolvendo receptores NK1, sugerindo que o PAR2 é um importante componente da resposta imunológica inata na ATM. / We hypothesised that the early pro-inflammatory effects of proteinase-activated receptor 2 (PAR2) activation in the temporomandibular joint (TMJ) are mediated by neurogenic mechanisms. Immunofluorescence analysis revealed a high degree of neurons expressing PAR2 in retrogradely labelled trigeminal ganglion neurons. Furthermore, PAR2 immunoreactivity was observed in the lining layer of the TMJ, co-localizing with the neuronal marker PGP9.5 and substance P-containing peripheral sensory nerve fibres. The intra-articular injection of PAR2 agonists into the TMJ triggered a dose-dependent increase in plasma extravasation, neutrophil influx and induction of mechanical allodynia. The pharmacological blockade of NK1 receptors abolished PAR2-induced plasma extravasation and inhibited neutrophil influx and mechanical allodynia. We conclude that PAR2 activation is pro-inflammatory in the TMJ, through a neurogenic mechanism involving NK1 receptors. This suggests that PAR2 is an important component of innate neuro-immune response in the TMJ.

A técnica de Mobilização Neural (MOB) é um método não invasivo que demonstrou tanto na pesquisa básica, como na pesquisa clinica ser eficaz na redução da sensibilidade à dor. O presente, estudo visa examinar os efeitos da MOB na disfunção locomotora, na força muscular, nas alterações morfológicas no nervo isquiático e nas alterações moleculares induzida pela constrição crônica (CCI) do nervo isquiático de ratos Wistar. Para analisar a disfunção locomotora utilizamos o índice funcional do nervo Isquiático (IFC). Para analisar a força muscular, o sistema Biopac System. A ultraestrutura do nervo foi analisada pela técnica de microscopia eletrônica de transmissão e as alterações moleculares por meio de ensaios de Western blot. Ao finalizarmos os tratamentos com MOB os animais foram eutanasiados e os tecidos como, nervo isquiático, gânglios das raizes posteriores (DRG L4-L6) e Susbtância Cinzenta Periaquedutal (PAG) foram retirados. Os DRG´s foram processados pela técnica de Western Blot para a detecção da substância P (SP), receptor de potencial transitório vanilóide tipo I (TRPV1) e receptores opióides dos tipos µ (MOR), δ (DOR) e k (KOR). Com relação a PAG, analisamos somente os receptores opióides por Western Blot. Nossos resultados demonstraram uma reverção da disfunção locomotora induzida pela CCI após a MOB e aumentou 172% a força do músculo tibial anterior nos animais tratados quando comparado com os animais do grupo CCI. Nossos estudos sobre a ultraestrutura do nervo isquiático demonstraram intenso processo de degeneração Waleriana após a CCI e regeneração após a MOB. Podemos sugerir um papel importante da MOB na modulação da expressão da SP e do TRPV 1. Sobre os receptores DOR e KOR no DRG, não encontramos alterações estatísticas entre os grupos, mas observamos um aumento da expressão de MOR após a MOB. Na PAG, nós observamos uma diminuição de DOR e KOR no grupo CCI e aumento após a MOB. Por outro lado, não encontramos alterações estatíticas para o receptor MOR. Baseado nestes achados, podemos sugerir que a MOB reverte a disfunção locomotora, aumenta a força muscular, induz a regeneração do nervo isquiático, modula a SP e TRPV 1 e aumentou a expressão de MOR no DRG´s. Sugerimos ainda que, a analsegia induzida pela técnica de MOB possa ter um envolvimento também com o sistema inibitório descendente de dor resultando na inibição da transmissão do estímulo nociceptivo aferente e assim, diminuindo a dor neuropática devido influência da MOB sobre os opióides na PAG. / Neural mobilization technique (MOB) is a noninvasive method that demonstrated to be effective in reducing pain sensitivity in both clinical and research study. The present study aims to examine the effects of MOB in locomotors dysfunction, muscle strength, morphological changes in sciatic nerve and molecular changes induced by chronic constriction (CCI) of the sciatic nerve in Wistar rats. To analyze locomotors dysfunction we used the Sciatic nerve functional index (SFI). To analyze muscle strength, was used Biopac System. The nerve morphology was analyzed using electron microscopy and molecular changes through western blot assays. After MOB treatments, animals were euthanized and tissues such as, sciatic nerve, the posterior root ganglions (DRG L4-L6) and substance periaqueductal gray (PAG) were removed. The DRG were processed by western blot for detection of substance P (SP), transient receptor potential vanilloid type I (TRPV1) and opioids receptors (MOR, DOR, KOR). Regarding PAG, we analyze only opioids receptors. Our results demonstrated a full reversal of locomotors dysfunction-induced by CCI after MOB treatment and an increase of 172% on maximal tetanic muscle strength in animals treated with MOB when compared to the CCI group. Our studies on photomicrography of sciatic nerve showed an intense Wallerian degeneration process in CCI animals and an intense regeneration of myelinated fibers. In western blot assays, we identified, in DRG, an increase of SP and TRPV1 expression after CCI and a decrease of optical density after MOB treatment. Regarding opioid receptor, we did not identify statistical changes on DOR and KOR in DRG, but we observed an increased expression of MOR in CCI after MOB treatment group. In PAG analyses, we observed a decrease in DOR and KOR expression after MOB treatment when compare with CCI animals. On the other hand, we did not identify any changes on MOR receptor. Based on our findings, we suggest that treatment with neural mobilization technique it is able to reverses the locomotors dysfunction and increases maximum tetanic force of the tibialis anterior muscle after CCI. Furthermore, the same treatment was also able to induce a severe regeneration in the sciatic nerve after treatment. Still, we can suggest an important role of MOB in modulating SP and TRPV 1 expression. We suggest that antinociceptive effect induced by MOB technique can also be involved with descending pain inhibitory system resulting in inhibition of the transmission of afferent nociceptive stimulus and thereby reducing neuropathic pain because of the influence of MOB opioids in the PAG.

fato bastante conhecido que os conceitos de tempo e de espaço desempenham papel central na filosofia de Leibniz; a forte oposição que ela fez aos mesmos conceitos utilizados na filosofia newtoniana é prova disso. Nesse sentido, pretendemos oferecer uma série de considerações que partem desses conceitos em sua relação com um outro conceito fundamental da filosofia leibniziana: o conceito de substância individual. Acreditamos que uma compreensão adequada das relações mais fundamentais entre esses conceitos pode lançar luz sobre o que Leibniz entendia ser necessário ter como ponto de partida para sua Dinâmica e para sua Psicologia, como elas se relacionam com sua Metafísica e como isso tem conseqüências para o que ele pensava quanto à Ética e Religião. A partir destas considerações acreditamos poder constituir parte importante das saídas, seja do labirinto do contínuo, seja do labirinto da necessidade ao modo como Leibniz as pensou e como isso pode contribuir para compreendermos questões que ainda são da ordem do dia quanto aos fundamentos da Ciência Contemporânea. / It is a fact sufficiently known that the space and the time concepts play central role in the Leibniz philosophy; the strong opposition that it has made to the same concepts used in the Newtonian philosophy is a prove of that. In this sense, we intend to offer a series of considerations that leave from these concepts in its relation with one another fundamental concept of the leibnizian philosophy: the individual substance concept. We believe that an adequate understanding of the most fundamentals relations between these concepts can light up on what Leibniz understood to be necessary to have as starting point for its Dynamics and its Psychology, as they relate to its Metaphysics and as it has consequences for what he used to think about Ethics and Religion. From these considerations we believe to be able to constitute important part of the exit either of the labyrinth of the continuous either of the labyrinth of the necessity according to the way as them were thought by Leibniz and as this can contribute to understand questions that are still of the order of the day referring to the bases of the Contemporaneous Science.

A colibacilose aviária caracteriza-se como uma infecção extra-intestinal secundária a outros agentes. É responsável por grandes perdas econômicas na criação de aves comerciais, sendo sua prevenção fundamental para minimizar prejuízos. O objetivo deste estudo foi atenuar cepas virulentas de Escherichia coli aviárias, por indução de mutagênese química. Foram selecionadas nove (09) cepas pertencentes à coleção de cultura do Laboratório de Ornitopatologia da FMVZ-USP. Todas as cepas estudadas foram resistentes à eritromicina, lincomicina, oxaciclina, penicilina, tiamulina e tilmicosin e sensíveis ao ácido nalidíxico, cloranfenicol, ciprofloxacina, colistina, enrofloxacina, florfenicol e gentamicina. Ocorreram resistências nas amostras analisadas de 33,33%, 22,22%, 11,11%, 55,55%, 66,66%, 77,77%, 33,33%, 22,22%, 22,22% e 33,33%, respectivamente, a amoxacilina, a ampicilina, a doxaciclina, a espectiomicina, a estreptomicina, a lincomicina-espectiomicina, a neomicina, a rifampicina, a tetraciclina e ao trimetropin-sulfa. Induziu-se resistência a estreptomicina ou rifampicina ou ácido nalidíxico como marcadores. Não houve o desenvolvimento de resistências a outros antimicrobianos testados, após a exposição a substância mutagênica. Os resultados da amplificação dos genes por PCR, mostraram que todas as cepas foram negativas para papC, cnf e astA e todas foram positivas para iuc e irp2. Duas cepas foram positivas para os genes vat, cinco para iss, quatro para o gene tsh, uma para cvi/cva, duas para sfaI e uma para astA. Após o uso da substância mutagênica duas cepas apresentaram reações negativas para os genes tsh, cvi/cva e sfaI e uma cepa para o gene astA. No teste de AFLP verificaram-se diferenças em similaridade de bandas em oito (08) das nove (09) cepas, quando comparadas com a amostra tratada com a substância mutagênica, sendo que este indice variou de 40% a 96,3%. Embora no teste de patogenicidade em pintinhos de um dia de idade não tenha ocorrido diferenças significativas na mortalidade nos diferentes grupos estudados, houve alteração de patogenicidade em cinco cepas expostas à substância mutagênica. Ocorreram reduções significativas em relação ao escore de lesões quando os grupos foram comparados (p<0,05), indicando atenuação pela substância mutagênica. / The avian colibacillosis is characterized as an extraintestinal infection which is secondary to other agents. It is responsible for considerable economic loss in the breeding of commercial birds, making its prevention essential to reducing damages. The aim of this study was to attenuate viral strains of avian Escherichia coli, using chemical mutagenesis induction. Nine (09) strains were selected from the culture collection of the Ornitopathology Laboratory of the School of Veterinary Medicine of the University of São Paulo. All analyzed strains were resistant to erythromycin, lincomicin, oxacillin, penicillin, tiamulin and tilmicosin and they were sensitive to nalidixic acid, chloramphenicol, ciprofloxacin, colistin, enrofloxacin, florfenicol and gentamicin. The analyzed samples presented the following resistance levels: 33.33%, 22.22%, 11.11%, 55.55%, 66.66%, 77.77%, 33.33%, 22.22%, 22.22% and 33.33% to, respectively, amoxicillin, ampicillin, doxycycline, spectinomycin, streptomycin, lincomycin-spectinomycin, neomycin, rifampicin, tetracycline and trimethoprim-sulfa. The resistance to streptomycin or rifampicin or nalidixic acid was induced as a marker. There was no development of resistance to other tested antimicrobials after the exposure to the mutagenic substance. The results of the PCR gene amplification showed that all strains were negative for papC, cnf and astA and they were all positive for iuc and irp2. Two strains were positive for the vat genes, five for iss, four for the tsh gene, one for cvi/cva, two for sfaI and one for astA. After using the mutagenic substance, two strains presented negative reactions for the tsh, cvi/cva and sfaI genes and one strain for the astA gene. In the AFLP test, differences were found for band similarity in eight (08) out of nine (09) strains, when compared with the samples treated with the mutagenic substance and this rate varied from 40% to 96.3%. Although the pathogenicity test in one-day-old chicks did not present significant differences in the mortality rate in the different analyzed groups, there was a pathogenicity alteration in five strains exposed to the mutagenic substance. There were significant reductions regarding the lesion scores when the groups were compared (p<0,05), indicating an attenuation due to the mutagenic substance.