L’interaction du récepteur syndecan-1 de la famille des héparanes sulfates protéoglycanes avec le fragment carboxy-terminal alpha3LG4/5 de la protéine d’adhérence matricielle, la laminine 332, induit une réorganisation du cytosquelette de la cellule conduisant à la formation de filopodes et de microspicules, caractéristiques de la migration cellulaire. Notre laboratoire a mis en évidence que l’adhésion cellulaire syndecan-1 dépendante implique les chaînes d’héparanes sulfates et chondroïtine sulfate. Afin d’identifier le (les) zone(s) impliquée(s) dans l’interaction domaine LG4/5-syndécan-1, une approche de mutagenèse dirigée a été mise en place sur le fragment LG4/5 recombinant. Les résidus conservés parmi les laminines, identifiés dans la littérature comme liant l’héparine, aussi bien que des résidus basiques spécifiques à la chaine α3 identifiés par des approches prédictives, ont été remplacés par le résidu neutre glutamine. Toutes les protéines couplées avec l’étiquette 6-Histidine ont été produites dans des cellules de mammifère, purifiées par chromatographie d'affinité et caractérisées biochimiquement et par dichroïsme circulaire. L’évaluation de l’affinité des protéines produites pour l’héparine nous a permis d’identifier un site d’interaction majeur avec les glycosaminoglycanes dans le domaine LG4/5, entouré par des résidus à mineur affinité. La technique de résonance plasmonique de surface et des tests d’adhérence cellulaire nous ont permis de confirmer ce résultat puisque l’absence du site d’interaction majeur avec l’héparine a produit une inhibition totale de l’adhérence. Des expériences de pull-down nous ont montré que ce site est aussi impliqué dans l’interaction avec le syndecan-4, indiquant que cette séquence pourrait ainsi jouer un rôle dans différents processus cellulaires. Une collaboration avec des bio-informaticiens nous a permis de proposer un modèle structural du domaine LG4/5 et de montrer que la zone identifiée est localisée dans une boucle exposée à l’extérieure du module LG4, entourée par des résidus à plus faible affinité / The HSPG receptor syndecan-1 interacts with the carboxy-terminal LG4/5 domain in laminin 332 to participate in keratinocyte migration by inducing formation of cytoskeleton related protrusive structures. We have shown that syndecan-1 mediated cell adhesion occurs in heparan sulphate and chondroitin sulphate dependent manner and that these two glycosaminoglycan (GAG) chains bind independently to LG4/5 with different affinities. To identify residues involved in the interaction of the LG4/5 domain with syndecan-1 and to apprehend the molecular basis of the GAGs interaction specificity, we have used a site-directed mutagenesis approach of the recombinant LG4/5 fragment. The residues identified as conserved heparin binding residues throughout laminins, as well as “candidate” basic residues identified through predictive approaches, have been replaced by the neutral residue glutamine. All LG4/5 proteins carrying a hexa-histidine tag at their C-terminal end were expressed in mammalian cells. The produced proteins were purified and characterized biochemically. Circular dichroism studies performed on all mutagenised proteins showed that the overall structure of each mutant is comparable to that of the wild type protein. Heparin affinity chromatography analysis allowed us to identify a major heparin binding site in the LG4/5 domain surrounded by several minor GAG binding sites. Surface plasmon resonance analysis of mutated LG4/5 proteins-heparan sulphate interaction confirmed these results. These findings were well correlated with our in cellulo syndecan-1 mediated cell adhesion as the lack of this major heparin binding site totally abrogated cell adhesion. Pull down experiments allowed us to show that this heparin binding site sequence is responsible not only for the interaction of the receptors syndecan-1 but also for syndecan-4 suggesting that additional cellular functions may be carried by this sequence. Our structural predictions suggest that the LG4/5 in laminin 332 encompasses a major GAG binding site surrounded by a track of converging positively charged residues

Guanine nucleotide exchange factor proteins of the Tiam family are activators of the Rho GTPase Rac1 and critical for cell morphology, adhesion, migration, and polarity. These proteins are modular and contain a variety of interaction domains, including a previously uncharacterized post-synaptic density-95/discs large/zonula occludens-1 (PDZ) domain. Here we report on the structure, specificity, and function of the Tiam1 and Tiam2 PDZ domains. A consensus PDZ-binding motif for Tiam1 was used to predict that two cell adhesion proteins, Syndecan 1 (Sdc1) and Caspr4, are potential Tiam1 PDZ domain binding proteins. Binding interactions were confirmed using fluorescence- and NMR- based binding experiments. The Tiam1 PDZ domain in complex with the C-terminal tails of Sdc1 and phosphorylated Sdc1 were solved using X-ray crystallography. Results showed four residues in two binding pockets in the PDZ domain are important for specificity. Cell biological analysis confirmed the Tiam1/Sdc1 interaction and showed that the PDZ domain has a function in cell-matrix adhesion and cell migration. The four residues deemed important determinants of Tiam1 PDZ domain specificity are not conserved in Tiam2. A combinatorial peptide screen, in combination with biophysical studies, identified a consensus binding sequence for both PDZ domains. Analysis of these consensus sequences and binding assays with peptides derived from native proteins indicated that these two PDZ domains have overlapping but distinct specificities - the Tiam2 PDZ domain was found to bind Caspr4 and neurexin1 but not Sdc1. Additionally, the Tiam2 PDZ domain exhibits significant flexibility in two different regions, a feature not seen in Tiam1. Double-mutant cycle analysis of the four important residues revealed ligand- dependent energetic couplings. Mutating all four residues switched the ligand specificity to that of Tiam2. Analysis of Tiam-family PDZ domain sequences indicated that the PDZ domains segregate into four distinct families based on the residues studied here. A set of "evolved peptides" was used to show the PDZ domain interactions are cooperative throughout the binding pocket in a ligand-specific manner. Collectively, our data suggest that Tiam family proteins have highly evolved PDZ domain/ligand interfaces with distinct specificities and that they have disparate PDZ domain-dependent biological functions.

La phase de l'épithélialisation de la réparation cutanée se déroule en impliquant plusieurs processus dynamiques et interactifs pendant lesquels les kératinocytes migrent, prolifèrent et se différentient afin de reconstruire la fonction de la barrière. La migration des kératinocytes est l'événement qui détermine l'efficacité du processus entier. Le comportement migratoire est contrôlé au même temps au niveau extracellulaire et intracellulaire et dépend d'interactions dynamiques entre les cellules et leur environnement extracellulaire, des facteurs de croissance et des cytokines. Parmi les protéines de la matrice extracellulaire, la laminine 332 est un substrat d'adhésion majeur des kératinocytes qui joue un rôle important au cours de la migration des kératinocytes, travers son domaine LG4/5 localisé à l'extrémité carboxy-terminale de sa chaine a. Des études récentes ont rapporté que l'induction de la migration des kératinocytes par LG4/5 est dépendante des Métalloprotéinases Matricielles pro-migratoires (MMP)-9 et -1 qui jouent des rôles essentiels au cours de la cicatrisation et surtout pendant la ré-épithélialisation. Etant donné que des travaux antérieurs du laboratoire ont montré que le domaine LG4/5 participe à la dynamique du cytosquelette et à la motilité cellulaire au travers de liaisons avec les récepteurs de type de protéoglycanes à heparane sulfate, syndécan-1 et -4 on a regardé l'implication potentielle de ces récepteurs au processus. Afin d'analyser la participation possible des syndecans dans ce processus, nous avons développé une approche de mutagénèse dirigée dans la protéine LG4/5 recombinante pour altérer les sites de liaison aux syndécan-1 ou -4. Notre analyse PCR et nos résultats de zymographie ont révélé une différence du profile d'activation des MMPs en fonction de la mutation produite et donc de la capacité de la protéine à recruter le syndécan-1 ou le syndécan-4, ainsi que le syndécan-1, et pas la syndécan-4, est impliqué dans l'activation de la production de la MMP-9 par LG4/5. Nous avons ensuite confirmé ces résultats en réduisant l'expression du syndécan-1 dans des kératinocytes et on a pu aussi montrer que le traitement avec des cytokines telles que TNFalpha et IL-1beta, connues pour leur capacité d'induire l'activation de la MMP-9, a produit le même résultat dans ce systéme. L'addition de l'héparine dans nos experiences a inhibé l'activation de l'expression de MMP-9 suggerant que les heparanes sulfates dans syndecan-1 sont impliqué au mécanisme. Pour confirmer ces résultats des experiences avec des séries de syndecan-1 mutés sont en cours. Pour conclure, nos résultats montrent pour la première fois un rôle important de syndecan-1 à l'expression de MMP-9 suggérant que sa re-distribution au front des kératinocytes migratoires puisse éventuellement être liée au clivage ou à la dégradation des protéines de la matrice extracellulaire. En plus, nos résultats proposent que le domain LG4/5 de la laminin 332 libéré soit capable d'affecter la balance de l'expression de la MMP-9 lors de la migration des kératinocytes en leur permettant de traverser le caillot de fibrine / During skin repair, the epithelialization phase occurs by an orderly series of events whereby keratinocytes migrate, proliferate, and differentiate to restore the barrier function. Keratinocyte migration determines the efficiency of the overall wound repair process. The migratory behaviour is governed at both the extracellular and intracellular levels and depends on the carefully balanced dynamic interactions of the cells with ECM components, growth factors and cytokines. Among extracellular matrix proteins, laminin 332, known as a major adhesion substrate for keratinocytes was shown to contribute to skin reepithelialization through its a3 chain C-terminal domains LG45. Recent studies have reported that LG45 induces keratinocyte migration, an event that relies on the involvement of the pro-migratory matrix metalloproteinases-1 and -9, two MMPs known to play a role in the reepithelialization phase of wound healing. As findings from our laboratory have reported that LG45 domains participate in cytoskeleton dynamic and cell movement through binding of the heparan sulphate proteoglycans syndecan-1 and -4, we analyzed the potential involvement of these receptors in this process. To that end, we have developed a site-directed mutagenesis approach within a recombinant LG45 protein to alter either the syndecan-1 or syndecan-4 binding site. Our PCR analysis and zymography results revealed that depending on the mutants, syndecan-1 or syndecan-4 recruitment induced different MMP activation profile and suggested that syndecan-1 plays a role in LG45 induced MMP-9 expression and activation. We confirmed these results by down regulating syndecans expression in keratinocytes and revealed that this phenomenon also occurred when cells were treated with TNFalpha or IL1beta, two cytokines known to up-regulate MMP-9 expression. Addition of heparin in these experiments abolished MMP-9 expression activation suggesting that syndecan-1 heparan sulfate moieties are involved in this mechanism. Confirming experiments using a series of mutated syndecan-1 in their ectodomain (lacking glycosaminoglycan chains) or in their cytoplasmic tail are ongoing in the lab. Taken together, our data demonstrate for the first time that syndecan-1 plays a pivotal role in MMP-9 expression, suggesting that its re-distribution at the front edge of migrating keratinocyte may have a role to play in the cleavage or degradation of extracellular matrix proteins. Our results further suggest that the released laminin 332 LG45 domain has the ability to impact the MMP9 expression balance during keratinocyte migration therefore facilitating their path through the fibrin clot

L’infection par le virus de l’hépatite C (HCV) est une cause majeure de maladies hépatites sévères et constitue un problème majeur de santé public. Le HCV est associé aux lipopoprotéines formant une lipoviroparticule (LVP) qui est la forme infectieuse du virus. L’apolipoprotéine E (apoE), associée aux lipoprotéines, est impliquée dans les étapes précoces et tardives de l’infection. Elle interagit avec de récepteurs impliqués dans le métabolisme lipidique tels les héparanes sulfates protéoglycanes (HSPG). Durant ma thèse, j’ai démontré que les acides aminés chargés positivement du domaine de liaison aux HSPG d’apoE sont impliqués dans l’entrée du HCV dans l’hépatocyte. J’ai également démontré que la production et/ou l’infectiosité des particules virales est corrélée au taux d’expression d’apoE dans les cellules sans avoir d’impact sur la traduction ou la réplication virales. Enfin, j’ai identifié syndecan-4, un membre de la famille des HSPG, comme l’HSPG principal impliqué dans l’entrée du HCV dans les lignées Huh7.5.1. L’ensemble de ces résultats démontre qu’HCV utilise l’interaction apoE-SDC4 pour établir une infection virale efficace. / Hepatitis C virus (HCV) infection is a major cause of liver disease worldwide and represents a major health problem. HCV associates with host lipoproteins forming host/viral hybrid complexes termed lipoviral particles. Apolipoprotein E (apoE) is a lipoprotein component that interacts with heparan sulfate proteoglycans (HSPG) to mediate hepatic lipoprotein uptake, and may likewise mediate HCV entry. I sought to define the functional regions of apoE with an aim to identify critical apoE binding partners involved in HCV infection. I demonstrated a direct correlation of apoE expression and HCV infectivity, whereas no correlation exists with viral protein translation or replication. Mutating the HSPG binding domain (HSPG-BD) of apoE revealed key residues that are critical for mediating HCV infection. Finally, I identified Syndecan-4 (SDC4), an HSPG family member, as the principal HSPG mediating HCV entry. Our data demonstrate that HCV uses apoE-SDC4 interactions to enter hepatocytes and establish efficient viral infection.

L'autotaxine (ATX) est une glycoprotéine sécrétée qui grâce à son activité lysophospholipase D est à l'origine d'un lipide biologiquement actif, l'acide lysophosphatidique (LPA), dans la circulation sanguine. L'expression de l'ATX par les cellules tumorales contrôle la dissémination métastatique spontanée des cellules de cancer du sein et la formation des métastases osseuses. Au cours de cette thèse, nous avons observé que le ciblage thérapeutique précoce de l'ATX dans un modèle animal préclinique bloque de façon remarquable la dissémination métastatique des cellules de cancer du sein. Cependant les mécanismes moléculaires à l'origine de l'action du LPA sur les cellules tumorales sont mal caractérisés. Nous avons ici montré, via des expériences in vitro et in vivo, que l'ATX circulante d'origine non tumorale libérée par les plaquettes sanguines sous l'action des cellules tumorales, contrôle les évènements précoces de la dissémination métastatique. Cependant, le LPA est un lipide extrêmement sensible à l'action des phosphatases, présentes en grande quantité dans les milieux extracellulaires : l'activité du LPA serait dépendante de sa production locale, au voisinage de ses récepteurs présents à la surface des cellules. Ces travaux ont ainsi mis en évidence que le pouvoir pro-métastatique de l'ATX dépend à la fois de son interaction avec l'intégrine Alpha V/Beta3exprimée par les cellules tumorales, mais également d'un protéoglycane, Syndecan-4 présent en surface cellulaire. En conclusion, le ciblage de l’ATX via son activité ou via ses interactions présente un haut potentiel thérapeutique chez des patientes atteintes d'un cancer du sein à fort risque métastatique / Bone metastases are a frequent complication of cancer, occurring in up to 70 percent of patients with advanced breast or prostate cancer. Despite the improvement of current therapies, the survival of bone metastasis patients is only 24 months. This study aims to find new mechanisms involved in bone metastasis formation. Autotaxin (ATX/NPP2) is a secreted glycoprotein that generates lysophosphatidic acid (LPA) through its lysophospholipase D activity. Our lab previously demonstrated that ATX is overexpressed in multiple types of cancers and together with LPA generated during platelet activation promotes skeletal metastasis of breast cancer. However, the pathophysiological sequelae of regulated interactions between circulating LPA, ATX and platelets remain undefined in cancer. In this work we show that ATX is stored in a- granules of resting human platelets and released upon tumor cell-induced platelet aggregation, leading to the production of LPA. Our in vitro and in vivo experiments using human breast cancers cells that do not express ATX demonstrate that non-tumoral ATX controls the early stage of bone colonization by tumor cells. However, LPA is extremely sensitive to phosphatases, which are highly expressed in extracellular environment and at cell membranes. The molecular mechanisms involved in the local production of LPA at the bone metastatic site are still not well characterized. The present results establish that binding of ATX to alphaV/Beta3 integrin and/or the proteoglycan syndecan-4 allow LPA delivery to its receptors present at the surface of tumor cells. These results may have important implications in the development of new therapies for patients with bone metastases

Ce travail de thèse a eu pour thème principal le protéoglycane syndecan-1 au cours du myélome multiple, une hémopathie maligne caractérisée par la présence d'un clone de plasmocytes tumoraux au sein de la moelle osseuse. Syndecan-1 est un élément majeur de la physiopathologie du myélome multiple, ce protéoglycane étant au coeur d'un réseau complexe d'interactions moléculaires conditionnant le devenir des cellules plasmocytaires tumorales.Les chaînes de glycosaminoglycanes présentes sur le core protéique de syndecan-1sont responsables d'une grande partie de son activité. Nous avons ainsi caractérisé, par une approche transcriptomique, 100 gènes codant les protéines impliquées dans la synthèse et la modification de ces chaînes. Nous avons de cette manière identifié des cibles moléculairesen vue de moduler, voire d'inhiber leur activité.Dans le but d'identifier les métalloprotéinases des familles ADAM et ADAMTS susceptibles d'interagir avec syndecan-1, nous avons réalisé l'étude du profil d'expression des gènes codant ces reprolysines et leurs inhibiteurs dans les cellules de la différentiation lymphocytaire B, les cellules plasmocytaires normales et tumorales ainsi que dans l'environnement médullaire.Dans une dernière partie, nous avons évalué l'efficacité d'une approche d'inhibitiondes chaînes héparanes sulfates via l'utilisation de l'héparine. Nous observons que certaines lignées myélomateuses sont inhibées par l'héparine et ses dérivés et que ces mêmes lignées sont stimulées par l'antidote de l'héparine, le sulfate de protamine. Les mécanismes mis enjeu sont en relation avec la modulation de la biodisponibilité des facteurs permettant la croissance des cellules. / Multiple myeloma is a hematological malignancy characterized by the expansion of aclone of malignant plasma cells in the bone marrow compartment. Syndecan-1 is a majorproteoglycan involved in a complex network of molecular interactions in multiple myelomaphysiopathology. As heparan sulfate and chondroitin sulfate chains are the bioactive components ofsyndecan-1, we first analysed the signature of genes encoding 100 proteins involved in thesynthesis of these chains, from precursor uptake to post-translational modifications, usingAffymetrix microarrays.In order to identify the metalloproteinases belonging to ADAM and ADAMTS familiespotentially implicated in the interactions with syndecan-1, we performed a gene expressionprofile focused on the genes encoding these reprolysines and their inhibitors.In a last part, we evaluated the efficacy of an inhibitory approach based on theutilization of heparin in human myeloma cell lines in vitro, inhibitory effects being in relationwith a modulation of the biodisponibility of heparin-binding factors.This work led us to identify targets of interest in relation with syndecan-1 biology inmultiple myeloma. They could be used to design new therapeutic strategies.

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Le cancer colorectal (CCR) est un problème majeur de santé publique. Les nouvelles stratégies thérapeutiques incluant les anticorps anti-EGFR ou anti-VEGF en association avec les chimiothérapies ont amélioré la survie des patients présentant un CCR métastatique. Nous avons évalué le rôle de nouveaux biomarqueurs pour individualiser les patients porteurs d’un CCR métastatique qui peuvent bénéficier d’un traitement par thérapies ciblées. Dans la première partie, nous avons démontré pour la première fois la valeur de pSTAT3 (STAT3 phosphorylé) comme biomarqueur prédictif pour sélectionner les populations porteuses d’un CCR métastatique qui pourraient bénéficier d’un traitement par anti-EGFR. Dans ce cadre nous avons publié les résultats de la valeur prédictive et pronostique de pSTAT3 chez 94 patients porteurs d’un CCR métastatique traités par cétuximab en 2ème ligne de traitement (Dobi et al, 2012).La probabilité d’avoir une réponse objective était de 13% chez les patients avec l’expression de STAT3 comparé à 41% chez les patients pSTAT3 négatif (p=0.02). Nous avons montré également l’impact négatif de pSTAT3 sur la durée de la survie sans progression (PFS) et de la survie globale (OS) des patients présentant un CCR métastatique. Ce résultat montre l’intérêt de STAT3 comme biomarqueur prédictif de traitement par anti-EGFR. Dans la deuxième partie, nous avons évalué l’impact en survie des facteurs d’angiogenèse complexe comme angiopoetin-2, syndecan-1 (CD138), FGL2. Dans ce cadre nous avons étudié une cohorte exploratoire à Besançon de patients porteurs d’un CCR métastatique, traitée par chimiothérapie cytotoxique et bévacizumab (anti-VEGF). Après la détermination des seuils de valeurs de chaque biomarqueurs dans le sérum de patients utilisant les courbes ROC, nous avons évalué l’impact négatif de score élevé d’angiopoetin-2 et CD138 en survie de ces patients. Nous avons également démontré l’impact négatif de la combinaison de 3 marqueurs combinés en termes d’OS et de PFS dans une cohorte de validation incluant 244 patients de Besançon, Tours et Dijon. / Despite the progress made in the management of metastatic colorectal cancer (mCRC), this disease remains a major health problem. Targeted therapies (anti-EGFR and anti-VEGF therapies) have improved the clinical outcomes achieved by conventional chemotherapy regimens. Half of the patients with K-RAS wild type colo-rectal cancer doen’t benefit from adding anti-EGFR to standard chemotherapy regimen. We decided to assess the clinical outcomes of anti-EGFR containing chemotherapy regimens in 94 patients with mCRC according to phosphorylated STAT3 (pSTAT) status. The probability of achieving an objective reponse was 13% among patients with positive nuclear expression of pSTAT3 compared with 41% for patients displaying pSTAT3 négative tumors (p=0.02). In a multivariate logistic regression model, high-grade skin rash, wild-type K-RAS status, and negative pSTAT3 status significantly improved time to progression (TTP) and overal survival (OS). These results underscore the impact of pSTAT3 on the clinical efficacy of anti-EGFR-containing chemotherapy regimens and support the prospective assessment of this biomarker. Inhibition of pSTAT3 in mCRCs might be a promising strategy to target chemotherapy-resistant cancer cells and should be assessed in association with anti-EGFR monoclonal antibodies. The second goal of our study was the identification of angiopoetin-2, syndecan1 (CD 138) and FGL2 as prognostic biomarquers of metastatic colorectal cancer patients. Plasma angiopoetin-2, FGL2 et CD 138 levels were mesured in 10 healthy volunteers, 13 patients with locally advanced CRC et 51 mCRC, received bevacizumab containing chemotherapy. Angiopoetin-2 and CD138 levels were significantly elevated in patients with mCRC compared with healthy controls. Amongst patients with mCRC, low pre-therapeutic plasma angiopoetin-2 and CD 138 levels were associated with a prolonged median progression-free survival (PFS) (p<0.01 and p=0.03 respectively), and overall survival (p<0.01 and p=0.02 respectively). PFS and OS was prolonged in patients with out or with only one detectable biomarker compared with patients with two or three high biomarker levels (p<0.01).

Heparan sulfate (HS) is a sulfated glycosaminoglycan expressed by all cells in the body. It is found at the cell surface and in the extracellular matrix where it binds a large amount of various ligands including growth factors and morphogens. HS is important for building up morphogen gradients during embryonic development and to act as coreceptors for signaling molecules. Many different Golgi enzymes are involved in the biosynthesis of HS. It is known that some of these enzymes interact with each other but not how the whole biosynthesis machinery works or how the cell regulates the structure of the HS that it produces. In this thesis, cells and mice deficient in two of these biosynthetic enzymes, glucosaminyl N-deacetylase/N-sulfotransferase-1 (NDST1) and the isoform NDST2 have been studied. NDSTs perform the first modifications during biosynthesis where they replace N-acetyl groups on N-acetyl-glucosamine units with sulfate groups. It is known that deficiency of NDST1 is lethal, while lack of NDST2 only results in abnormal connective tissue type mast cells. Here it is shown that deficiency of both NDST1 and NDST2 is embryonically lethal. The embryonic stem (ES) cells extracted from the inner cell mass of double knockout blastocysts show in addition an impaired differentiation capacity compared to wild-type ES cells and fail completely to differentiate into cardiac muscle cells which NDST1-/-, NDST2-/- and wild-type ES cells all do. Cultured mast cells that lack NDST2 produce heparin that is low-sulfated compared to wild-type HS. To our surprise, we could show that mast cells deficient in NDST1 instead produce a more highly sulfated heparin than wild-type cells. We use a model that predicts that the biosynthesis enzymes work together in a multienzyme complex, the GAGosome, to explain our results. We hypothesize that NDST1 has a higher affinity for the GAGosome than NDST2 which only in the absence of NDST1 gets incorporated into the enzyme complex. When all GAGosomes contain NDST2, a more highly sulfated glycosaminoglycan chain will be synthesized. A splice variant of NDST1, NDST1S, has also been studied. We could show that NDST1S lacks enzyme activity but that it probably has the capacity to incorporate into GAGosomes. Overexpression of NDST1S results in altered structure of the HS produced by the cells. We speculate that expression of the splice variant during development may be one way to regulate HS structure.

Heparan sulfate proteoglycan (HSPG) or heparan sulfate (HS) degradation may contribute to endothelial cell (EC) dysfunction in diabetes. HSPGs, syndecan and perlecan, contain a protein core with mainly HS glycosaminoglycans (GAGs) attached. HSPGs modulate growth factors and function in membrane filtering. Heparanase induction is likely responsible for diabetic HS degradation. Heparin protects endothelium and insulin regulates glucose metabolism. Our objectives were to observe HSPG changes by studying EC GAG content and gene expression of syndecan, perlecan and heparanase under hyperglycemic conditions with insulin and/or heparin treatment.<p> GAGs, including HS, were determined by the carbazole assay and visualized by agarose gel electrophoresis in porcine aortic EC cultures treated with high glucose (30 mM) and/or insulin (0.01 U/ml) for 24, 48 and 72 hours and/or heparin (0.5 µg/ml) for 72 hours. High glucose decreased cell GAGs and increased medium GAGs. GAGs increased with time in control cultures and in high glucose plus insulin treated medium. GAGs were decreased with insulin but increased with insulin or heparin plus high glucose.<p> Confluent cultured human aortic ECs were incubated with control medium, high glucose and/or insulin and/or heparin for 24 hours. Real time PCR determination showed that: high glucose increased heparanase, decreased syndecan and had no effect on perlecan mRNA; insulin or heparin with/without high glucose decreased and insulin and heparin with high glucose increased heparanase mRNA; heparin and insulin with high glucose increased but insulin decreased syndecan mRNA. Actinomycin D (10 µg/ml) inhibited heparanase and syndecan mRNA with high glucose plus insulin plus heparin and inhibited heparanase mRNA with high glucose compared to time 0 but not â-actin after addition for 0, 2, 4, 8 and 24 hours. Bioinformatic studies revealed that transcription factor Sp1 activates heparanase promoter by high glucose and may play a role in regulation of perlecan and syndecan promoters.<p> Insulin or heparin inhibited the reduction in EC GAGs and syndecan mRNA and induction in heparanase by high glucose, indicating their protective effect. Decreased GAGs by insulin may relate to the pathology of hyperinsulinemia. Transcriptional regulation by heparin and/or insulin may cause variation in gene expression of heparanase, syndecan and perlecan.