Made available in DSpace on 2015-03-26T13:52:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 582896 bytes, checksum: f0af95b88bc9afacbb9f1a952768a98e (MD5) Previous issue date: 2008-10-03 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Shiga-toxigenic Escherichia coli, STEC, has emerged as a pathogen that can cause food-borne infections and severe and potentially fatal diseases such as hemorrhagic colitis (HC) and hemolytic uremic syndrome (HUS). Most HC and HUS outbreaks have been attributed to strains of entero-hemorrhagic serotype O157:H7, but there is growing interest on the risk to human health associated with the non-O157 STEC serotypes carried by beef products contaminated by ruminant feces. This study aimed to determine the occurrence of STEC in a cattle slaughterhouse located in the State of Minas Gerais. Sampling was carried out in two lots; Lot A with 75 bovines and Lot B with 51 animals in three stages of the slaughtering line: removal of skin after bleeding, carcass after sawing, and feces during evisceration. Samples were collected from ten animals of each lot. The samples were enriched in modified EC broth (mEC) and modified EC added with novobiocin (mECn) followed by isolation of typical colonies on Sorbitol MacConkey Medium. Two hundred and forty-one bacterial isolates obtained from the two lots, were identified as E. coli. Of these, 104 were derived from the skin, 93 from fecal material and 44 from carcasses. Polymerase chain reaction detected the stx gene in 18 isolates of E. coli. These isolates were obtained from six animals: four were of fecal origin and come from lot A; two were from carcasses from lot B. Enrichment in mECn resulted in isolates originated from one animal, whereas in mEC, the isolates were originated from five bovines. Isolates stx positive were analyzed for the hlyA gene encoding enterohemolysin. Four hlyA positive isolates originated from two bovines, one from lot A and another from lot B. Two displayed the entero- hemolytic phenotype and were isolated from the carcass. Ten of the 18 potentially STEC isolates showed cytotoxic effect on Vero cells. Eight isolates from three different animals had the stx PCR amplicons sequenced. The translated sequences obtained from stx of three isolates from the carcass and of one isolate from feces corresponded to Stx2, showing 98% to 99% identity, with references at the GeneBank (NCBI). The sequences inferred from four amplicons obtained from isolates of faecal origin corresponded to Stx1, with 94% to 96% identity. The presence of STEC in the feces and carcasses of cattle at a slaughterhouse in the state of Minas Gerais emphasizes the importance of establishing a HACCP system and the need for implementation, evaluation, and validation of control measures to minimize the risk of cross-contamination during and after slaughter. / Escherichia coli Shiga-toxigênica, STEC, tem emergido como patógeno que pode causar infecções de origem alimentar e doenças severas e potencialmente fatais, como Colite Hemorrágica (CH) e Síndrome Urêmico Hemolítica (SUH). A maioria dos surtos de CH e SUH tem sido atribuída a estirpes do sorotipo entero-hemorrágico O157:H7, entretanto existe interesse crescente sobre o risco à saúde humana associado com os sorotipos STEC não-O157 veiculados em produtos de carne bovina, contaminados por fezes de ruminantes. Este trabalho teve como objetivos determinar a ocorrência de STEC em bovinos em matadouro frigorífico, localizado no Estado de Minas Gerais. A amostragem foi realizada em dois lotes, lote A com 75 bovinos e lote B com 51 bovinos, em três etapas da linha de abate: pele, após a sangria; carcaça, após a serragem; e fezes, durante a evisceração. Dez animais de cada lote foram amostrados. As amostras foram enriquecidas em caldo EC modificado, mEC e EC modificado acrescido de Novobiocina, mECn, seguindo-se o isolamento de colônias típicas em meio MacConkey sorbitol. Duzentos e quarenta e um isolados bacterianos obtidos nos dois lotes foram identificados como E. coli. Desses, 104 foram provenientes da pele, 93 do material fecal e 44 das carcaças. Por reação em cadeia de polimerase, foi detectado o gene stx em 18 isolados de E. coli. Esses isolados foram provenientes de seis bovinos, sendo quatro do lote A (origem fecal) e dois do lote B (carcaça). O enriquecimento em meio mECn resultou em isolados originados de um bovino, enquanto no mEC os isolados se originaram de cinco bovinos. Os isolados stx positivos foram posteriormente analisados para o gene hlyA, codificador de entero-hemolisina. Quatro isolados, positivos para o gene hlyA, foram provenientes de dois bovinos, um do lote A (origem fecal) e outro do lote B (carcaça). Desses, dois isolados da carcaça apresentaram fenótipo entero-hemolítico. Dez dos 18 isolados potencialmente STEC demonstraram ter efeito citotóxico em células Vero. Oito isolados, provenientes de três bovinos distintos, tiveram os amplicons stx seqüenciados. As seqüências traduzidas de três isolados da carcaça e de um das fezes corresponderam a Stx2, com 98% a 99% de identidade, com referências no GeneBank (NCBI). As seqüências inferidas de quatro amplicons, de origem fecal, corresponderam, com 94% a 96% de identidade, a Stx1. A presença de STEC nas fezes e carcaça de bovinos em matadouro frigorífico no Estado de Minas Gerais enfatiza a importância de implementação do sistema HACCP, e a necessidade de implementar, avaliar e validar medidas de controle que minimizem os riscos de contaminação cruzada durante o processo de abate.

Florações de cianobactérias são facilmente encontradas, devido ao crescente aporte de nutrientes nos corpos de águas naturais e artificiais, ocasionado pelos acelerados processos de eutrofização frutos da ocupação urbana e rural sem a observação de critérios mínimos. Microcystis aeruginosa é uma espécie de cianobactéria potencialmente produtora de cianotoxinas, comumente associada a casos de intoxicação em escala mundial. Novas tecnologias para o tratamento de água têm sido implementadas para cumprimento dos padrões de potabilidade exigidos pela legislação. O presente trabalho buscou analisar a produção científica mundial relacionada ao tratamento de água com presença de M.aeruginosa e MCLR, buscando identificar o estado da arte, além de embasar a discussão dos métodos propostos. O presente estudo está dividido em três artigos, no primeiro realizou-se uma análise bibliométrica das pesquisas mundiais relacionadas à cianobactérias, cianotoxinas e o tratamento de água, a partir da base de dados Scopus. No segundo artigo buscou-se avaliar a aplicabilidade dos AOPs UV-C e UV-C/H2O2 na degradação de Microcystis aeruginosa BB005 e MC-LR, e a análise dos efeitos da adição de nanopartículas de Ag, com base em um produto comercial composto por peróxido de hidrogênio (H2O2) e nanopartículas de prata (NAg). No terceiro artigo buscou-se avaliar a qualidade da água produzida a partir de ensaios de toxicidade aguda com Daphnia magna. Os resultados indicam que a fotólise e o processo UV-C/H2O2 apresentaram resultados satisfatórios, sendo uma alternativa eficiente. Porém, os resultados dos ensaios de ecotoxicidade inferem que estes tratamentos utilizados com a finalidade de degradar M. aeruginosa e MC-LR, possuem potencial de geração de subprodutos de degradação tóxicos: os ensaios com D. magna demonstraram toxicidade mesmo quando a água submetida a fotólise foi diluída quatro vezes. Com relação ao processo UV-C/H2O2 (sem e com adição de NAg), a amostra foi tóxica quando não diluída. Já quando empregada as NAg combinadas a radiação UV-C, esta apresentou toxicidade extremamente alta, afetando a mobilidade de todos os organismos teste em todas as diluições (até 16 x). / Cyanobacterial blooms are easily found, due to the increasing nutrient supply in natural and artificial bodies of water, caused by the accelerated processes of eutrophication, fruits of urban and rural occupation without observing minimum criteria. Microcystis aeruginosa is a specie of cyanobacteria that are potentially cyanotoxin-producing, commonly associated with cases of worldwide intoxication. New technologies for water treatment have been implemented to meet the standards of potability required by legislation. The present study looked for analyze the world scientific production related to the treatment of water with presence of M. aeruginosa and MC-LR, seeking to identify the state of the art, besides supporting the discussion of the proposed methods. The present study is divided into three articles, the first one was a bibliometric analysis of the world-wide research related to cyanobacteria, cyanotoxins and water treatment, from the Scopus database. In the second article evaluated the aplicability of UV-C e UV-C/H2O2 AOPs on degradation of Microcystis aeruginosa BB005 and MC-LR, and the analysis of effects Ag nanoparticles addition, based on a commercial product composed of hydrogen peroxide (H2O2) and silver nanoparticles (NAg). In the trird article evaluated the water quality produced, from acute toxicity tests with Daphnia magna. The results indicate that photolysis and the UV-C/H2O2 process presents satisfactory results, being an efficient alternative. However, the results of the ecotoxicity assays infer that these treatments used for the purpose of degrading M. aeruginosa and MCLR, have potential to generate toxic degradation byproducts: the D. magna assays demonstrated toxicity even when the water submitted to photolysis was diluted four times. Regarding the UV-C/H2O2 process (without and with NAg addition), the sample was toxic when undiluted. When NAg was used in combination with UV-C radiation, it showed extremely high toxicity, affecting the mobility of all test organisms at all dilutions (until 16x).

Florações de cianobactérias são facilmente encontradas, devido ao crescente aporte de nutrientes nos corpos de águas naturais e artificiais, ocasionado pelos acelerados processos de eutrofização frutos da ocupação urbana e rural sem a observação de critérios mínimos. Microcystis aeruginosa é uma espécie de cianobactéria potencialmente produtora de cianotoxinas, comumente associada a casos de intoxicação em escala mundial. Novas tecnologias para o tratamento de água têm sido implementadas para cumprimento dos padrões de potabilidade exigidos pela legislação. O presente trabalho buscou analisar a produção científica mundial relacionada ao tratamento de água com presença de M.aeruginosa e MCLR, buscando identificar o estado da arte, além de embasar a discussão dos métodos propostos. O presente estudo está dividido em três artigos, no primeiro realizou-se uma análise bibliométrica das pesquisas mundiais relacionadas à cianobactérias, cianotoxinas e o tratamento de água, a partir da base de dados Scopus. No segundo artigo buscou-se avaliar a aplicabilidade dos AOPs UV-C e UV-C/H2O2 na degradação de Microcystis aeruginosa BB005 e MC-LR, e a análise dos efeitos da adição de nanopartículas de Ag, com base em um produto comercial composto por peróxido de hidrogênio (H2O2) e nanopartículas de prata (NAg). No terceiro artigo buscou-se avaliar a qualidade da água produzida a partir de ensaios de toxicidade aguda com Daphnia magna. Os resultados indicam que a fotólise e o processo UV-C/H2O2 apresentaram resultados satisfatórios, sendo uma alternativa eficiente. Porém, os resultados dos ensaios de ecotoxicidade inferem que estes tratamentos utilizados com a finalidade de degradar M. aeruginosa e MC-LR, possuem potencial de geração de subprodutos de degradação tóxicos: os ensaios com D. magna demonstraram toxicidade mesmo quando a água submetida a fotólise foi diluída quatro vezes. Com relação ao processo UV-C/H2O2 (sem e com adição de NAg), a amostra foi tóxica quando não diluída. Já quando empregada as NAg combinadas a radiação UV-C, esta apresentou toxicidade extremamente alta, afetando a mobilidade de todos os organismos teste em todas as diluições (até 16 x). / Cyanobacterial blooms are easily found, due to the increasing nutrient supply in natural and artificial bodies of water, caused by the accelerated processes of eutrophication, fruits of urban and rural occupation without observing minimum criteria. Microcystis aeruginosa is a specie of cyanobacteria that are potentially cyanotoxin-producing, commonly associated with cases of worldwide intoxication. New technologies for water treatment have been implemented to meet the standards of potability required by legislation. The present study looked for analyze the world scientific production related to the treatment of water with presence of M. aeruginosa and MC-LR, seeking to identify the state of the art, besides supporting the discussion of the proposed methods. The present study is divided into three articles, the first one was a bibliometric analysis of the world-wide research related to cyanobacteria, cyanotoxins and water treatment, from the Scopus database. In the second article evaluated the aplicability of UV-C e UV-C/H2O2 AOPs on degradation of Microcystis aeruginosa BB005 and MC-LR, and the analysis of effects Ag nanoparticles addition, based on a commercial product composed of hydrogen peroxide (H2O2) and silver nanoparticles (NAg). In the trird article evaluated the water quality produced, from acute toxicity tests with Daphnia magna. The results indicate that photolysis and the UV-C/H2O2 process presents satisfactory results, being an efficient alternative. However, the results of the ecotoxicity assays infer that these treatments used for the purpose of degrading M. aeruginosa and MCLR, have potential to generate toxic degradation byproducts: the D. magna assays demonstrated toxicity even when the water submitted to photolysis was diluted four times. Regarding the UV-C/H2O2 process (without and with NAg addition), the sample was toxic when undiluted. When NAg was used in combination with UV-C radiation, it showed extremely high toxicity, affecting the mobility of all test organisms at all dilutions (until 16x).

Fosfolipases D (FLD) do veneno das aranhas do gênero Loxosceles são capazes de causar entre outros efeitos, uma forte agregação plaquetária cujo mecanismo ainda não foi elucidado. Portanto, para estudar o papel das FLDs nesta atividade, uma FLD recombinante de L. gaucho (LgRec1) foi fusionada com a proteína fluorescente verde (EGFP) e utilizada como uma sonda para detectar a interação de LgRec1 com plaquetas. Essa quimera, denominada EGFP-LgRec1, manteve as principais características da LgRec1. A microscopia confocal das plaquetas mostrou que LgRec1 não requer componentes plasmáticos para se ligar às plaquetas, embora estes sejam necessários para que a LgRec1 induza agregação. Além disso, foi observado que a ação da LgRec1 leva à exposição de fosfatidilserina. Contudo, esta exposição não está relacionada à morte celular. Portanto, este trabalho mostrou que uma FLD de Loxosceles se liga a plaquetas, promovendo a exposição de fosfatidilserina, possibilitando a ligação de fatores de coagulação e resultando na agregação plaquetária. / Phospholipases D (PLD) from spider venom of the genus Loxosceles are capable of causing, among other effects, a strong aggregation of platelets and its mechanism has not yet been elucidated. Therefore, to study the role of PLDs in this activity, a recombinant L. gaucho PLD (LgRec1) was fused with a green fluorescent protein (EGFP) and used as a probe to detect the interaction of LgRec1 with platelets. This chimera, named EGFP-LgRec1, remained the main activities of LgRec1. Platelet confocal microscopy has shown that LgRec1 does not require plasma components to bind to platelets, although these are required for LgRec1 to induce aggregation. In addition, it has been observed that the action of LgRec1 leads to exposures of phosphatidylserine. However, this exposure is not related to cell death. Therefore, this work showed that a Loxosceles PLD binds to platelets, promoting an exposure of phosphatidylserine, that may act as a scaffold for coagulation factors, resulting in platelet aggregation.

Abordaram-se diversos aspectos da reação de contração de álcoois homoalílicos promovida por trinitrato de tálio (TTN). A configuração relativa do indano obtido como produto foi estabelecida graças a uma difratometria de raio-x de seu derivado sólido, possibilitando a elaboração de um mecanismo detalhado desta transformação. As reações de contração de anel de alquenóis secundários e terciários com TTN produzem indanos em 33-65%. Por outro lado, os 3-alquenóis terciários que possuem uma metila a mais em posição alílica conduzem a produtos oriundos de uma reação de fragmentação em 51-69%, com a perda de uma molécula de acetona. Álcoois homoalílicos primários, ao reagirem com iodo ou iodo hipervalente, sofrem uma reação de fragmentação, formando formaldeído, que sofre uma ciclização de Prins com o substrato, produzindo hexahidro- benzo-isocromenos em 26-48%. No caso da reação com iodo, parte do substrato sofre também uma ciclização 5-endo-trig seguida de aromatização, levando a um di-hidro-naftofurano em até 30% de rendimento. A ciclização de Prins de 3-alquenóis primário, secundário ou terciário com quantidades equimolares de aldeídos - aromáticos ou alifáticos - ou cetonas alifáticas catalisada por 5 mol% de iodo pode ser alcançada em rendimentos de 54-82%. Estas reações foram efetuadas em condições brandas e não anidras. Esta metodologia foi expandida para a preparação de uma hexa-hidro-benzo-isoquinolina à partir de uma tosilamida homoalílica, em 60% de rendimento. Um método simples e eficiente para a 2,2-dicloração de 1-tetralonas, da indanona e da benzosuberona foi desenvolvido utilizando-se água de cloro e metanol (5:1), à temperatura ambiente, em 61-90% de rendimento. A caramboxina é uma neurotoxina extraída da carambola. Sua síntese seria desejável para a confirmar sua estrutura e realizar novos ensaios biológicos. A rota sintética estudada possui, como etapa-chave, uma reação de Diels-Alder seguida de uma retro-Diels-Alder entre um éster clorotetrólico e um ciclo-hexadieno derivado da dimedona. No entanto, a síntese não pode ser concluída e um análogo ciclizado da caramboxina, uma isoquinolona, foi obtido em um rendimento global de 7%, em 10 etapas, à partir da dimedona. / Several aspects concerning the reaction of homoallylic alcohols and thallium trinitrate were addressed. The relative configuration of the indan obtained as product was established based on an x-ray diffration analysis of its solid derivative. With this information a more detailed mechanism was proposed. The ring contraction reactions of secondary and tertiary alkenols with TTN produced indans in 33-65% yield. Nevertheless, 3-alkenols bearing a methyl group on the allylic position lead to fragmentation products in 51- 69% yield, with the loss of a molecule of acetone. Treatment of primary homoallylic alcohols with iodine or hypervalent iodine leads to hexahydrobenzoisochromenes in 26-48% yield via a fragmentation reaction where formaldehyde is produced and reacts with the substrate on a Prins cyclization reaction. When iodine is used, dihydronaphtofuranes are also produced in up to 30% yield through a 5-endo-trig cyclization followed by an aromatization reaction. The Prins cyclization of 3-alkenols primary, secondary or tertiary with equimolar amounts of aldehydes - aromatic or aliphatic or aliphatic ketones catalysed by 5 mol% of iodine was accomplished in 54- 82% yield. These reactions were performed in mild and non-anhydrous conditions.This methodology was also used for the preparation of a hexahydrobenzoisoquinoline from a homoallylic tosylamide, in 60% yield. An easy and efficient method to the 2,2-dichlorination of 1-tetralones, indanone and benzosuberone was developed using household bleach and methanol (5:1), at room temperature in 61-90% Caramboxin is a neurotoxin isolated from star fruit. Its synthesis was desired to confirm its structure and perform new biological tests. The key step of the synthetic path is a Diels Alder followed by a retro-Diels Alder between a chlorotetrolic ester and a cyclohexene derived from dimedone. Unfortunately the synthesis was not concluded and a cyclized analogous of caramboxin, an isoquinoline, was obtained in 7% global yield, in 10 steps, from dimedone.

Escherichia coli é um microrganismo presente no trato intestinal do homem e de animais de sangue quente, fazendo parte da microbiota, coexistindo sem causar danos ao hospedeiro. No entanto, algumas linhagens desse microrganismo podem ser patogênicas e causar doenças tanto ao homem como aos animais. E. coli produtoras de toxina de Shiga (STEC), consideradas patógenos de origem alimentar, podem causar desde diarréias brandas até severas e sanguinolentas a complicações graves, como colite hemorrágica (HC), síndrome urêmica hemolítica (HUS) e púrpura trombótica trombocitopênica (TTP). O gado é considerado um importante reservatório deste patógeno e a contaminação de seres humanos ocorre, na maioria das vezes, através do consumo de alimentos ou água contaminados. O presente trabalho teve como objetivos avaliar a ocorrência de E. coli O157:H7 e outras STEC em amostras de couro de animais bovinos e de suas respectivas carcaças, na etapa de pré-evisceração, e meia-carcaças, na etapa de pós-evisceração; identificar os genes que codificam para os fatores de virulência (stx1 , stx2, eaeA e ehxA) dos isolados obtidos; evidenciar cepas de E. coli O157:H7 através da pesquisa do gene uidA; identificar os sorotipos dos isolados; verificar a citotoxicidade dos isolados de STEC em células Vero e avaliar a sensibilidade a diferentes antibióticos. De 198 animais amostrados, sete (3,5%) apresentaram cepas de STEC. Em seis (3%) destes, STEC foi detectada no couro e em um (0,5%) foi isolada de meia-carcaça, não tendo sido detectada em amostras de carcaça. As 23 cepas isoladas do couro apresentaram o perfil stx2, eaeA, uidA e ehxA, podendo ser consideradas E. coli enterohemorrágica (EHEC), e a isolada de meia carcaça apresentou o perfil stx2, uidA e ehxA. Das 24 cepas isoladas, 13 (54,2%) pertenciam ao sorotipo O157:H7. Além deste sorotipo, foram isoladas cepas de outros sorotipos previamente descritos e associados a doenças humanas severas no Brasil e em outros países, como O174:H21, O6:H49, ONT:H7, ONT:H8 e OR:H10. Dos sete animais com cepas positivas para stx2e ehxA, cinco (71,4%) apresentaram cepas com atividade citotóxica em células Vero e um (14,2%) apresentou cepas positivas na avaliação da produção de entero-hemolisina. Com relação ao teste com antibióticos, quatro (16,7%) das 24 cepas testadas apresentaram resistência a um ou mais antibióticos, sendo três (12,5%) a estreptomicina e uma (4,2%) a estreptomicina e ampicilina. Diante destes resultados, pode-se dizer que a produção de entero-hemolisina e a pesquisa dos genes ehxA e uidA não demonstraram ser bons marcadores na pesquisa do sorotipo O157:H7. A presença de cepa de STEC na meia-carcaça alerta para a necessidade de vigilância da presença destes microrganismos, uma vez que eles poderiam contaminar o produto final, colocando em risco a saúde do consumidor. / Escherichia coli is a microorganism present in the intestinal tract of humans and warm-blood animals, being part of the normal microbiota and harmless to the host. However, some strains are able to cause human and animal infections. Shiga toxin-producing E. coli (STEC), regarded as foodborne pathogens, can cause since mild or severe and bloody diarrhea to major complications, such as hemorrhagic colitis (HC), hemolytic-uremic syndrome (HUS) and thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP). Cattle are considered the main reservoir of this pathogen and the transmission to humans happens, most of the times, due to the consumption of contaminated food or water. The aim of the present research was to determine the prevalence of E. coli O157:H7 and other STEC on hide samples of beef cattle and on their corresponding carcasses, sampled prior to evisceration, and half-carcasses, sampled after evisceration; identity the genes that code for the virulence factors (stx1, stx2, eaeA e ehxA) of the isolates; detect E. coli O157:H7 strains using the gene uidA as epidemiological marker; identify the serotypes of the STEC isolates; verify the citotoxicity of the isolates in Vero cells and evaluate their resistance to different antibiotics. From 198 animals sampled, seven (3.5%) carried STEC strains. In six (3%) of them, STEC was detected on hide and in one (0.5%) it was isolated from half-carcass. The 23 strains isolated from hide presented the profile stx2, eaeA, uidA e ehxA, and were regarded as enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and the one isolated from half-carcass presented the profile stx2, uidA e ehxA. From the 24 isolated strains, 13 (54.2%) belonged to the serotype O157:H7. Besides this serotype, other strains belonging to serotypes that have been previously described and associated with severe human infections in Brazil and other countries, such as O174:H21 , O6:H49, ONT:H7, ONT:H8 and OR:H10, were isolated. From seven animals with strains harboring stx2, and ehxA, five (71.4%) presented verocytotoxigenic strains and one (14.2%) presented enterohemolisin producing strains. Regarding the antibiotics tested, four (16.7%) of the 24 isolated strains were resistant to some antibiotic, being three (12.5%) to streptomycin and one (4.2%) to streptomycin and ampicilin. Faced with these results, the production of enterohemolisin and the search of the genes ehxA and uidA can not be considered good epidemiological markers for the serotype O157:H7. The isolation of STEC strain from the half-carcass alerts for the need of surveillance on the presence of these microorganisms, since they may contaminate the final product, representing a risk to consumers health.

Toxinas termo-lábeis expressas por Escherichia coli enterotoxigênica (LT-I, LT-IIa e LT-IIb) são adjuvantes sistêmicos e de mucosa. Essas proteínas apresentam reduzida identidade (<14%) em suas subunidades B e ligação a receptores distintos, o que pode resultar em propriedades biológicas diferenciais. O objetivo do trabalho foi avaliar a resposta imune induzida pela toxina LT-IIa e seu pentâmero B (LT-IIaB) administradas pelas vias transcutânea e intradérmica. Inicialmente as proteínas foram expressas em E. coli, purificadas e avaliadas quanto à funcionalidade in vitro. Numa segunda etapa, as propriedades imunomoduladoras de LT-IIa e LT-IIaB, imunogenicidade e atividade adjuvante, foram avaliadas em modelo murino. A resposta imune (humoral e celular) induzida contra ovalbumina (OVA), aplicada como antígeno, foi determinada. Os resultados demonstram que as atividades adjuvantes induzidas por LT-IIa e LT-IIaB variam de acordo com a via de inoculação e que as holotoxinas LT-I e LT-IIa induzem graus de inflamação e ativação de resposta imune distintos em camundongos. / Heat-labile toxins expressed by enterotoxigenic Escherichia coli (LT-I, LT-IIa and LT-IIb) are potent systemic and mucosal adjuvants. These proteins have low identity (<14%) in their B subunits and bind to different receptors, which may result in differential biological properties. The objective of this work was to evaluate the immune response induced by LT-IIa toxin and its pentameric B subunit (LT-IIaB) delivered by transcutaneous and intradermic routes. Initially the proteins of interest were expressed in recombinant E. coli strains, purified and tested for functionality in vitro. In a second moment, the immunomodulatory properties of LT-IIa and LT-IIaB, immunogenicity and adjuvant activity, were evaluated in mouse model. The humoral and cellular immune responses induced against ovalbumin (OVA) used as antigen were determined. The results show that the adjuvant activity of LT-IIa and its B pentamer depends on the route of inoculation and that LT-I and LT-IIa differ both on induction of inflammation and activation of immune responses in mice.

The temporomandibular myofascial pain presents a major challenge in the diagnosis of temporomandibular disorders. Due to the characteristics of this condition, intramuscular injection procedures are often needed for adequate control of symptoms and treatment. Thus, the aim of this study was to evaluate the effectiveness of injection with different substances or dry needling in temporomandibular myofascial pain. The study design consisted of a systematic review of randomized clinical trials and research databases consulted were: Pubmed, EMBASE, CENTRAL/Cochrane, Lilacs, Scopus and Web of Science until October 2014. The selection of studies was carried out by two independent reviewers, who applied eligibility criteria to obtain the final sample of primary studies. After application of the inclusion criteria were selected fifteen studies. Due to the heterogeneity of the primary studies it was not possible to perform a meta-analysis. The narrative analysis of the results showed that most of the studies had methodological limitations and biases that have compromised the quality of its findings. Thus, there is a need of conducting further randomized clinical trials, with follow-up and larger samples, to evaluate the real effectiveness of the technique and evaluated substances. / A dor miofascial temporomandibular apresenta um grande desafio diagnóstico dentro das Disfunções Temporomandibulares. Devido às características dessa condição, procedimentos de infiltração intramuscular muitas vezes são necessários para o adequado controle e tratamento dos sintomas. Assim, o objetivo desse estudo é avaliar a efetividade de infiltrações com diferentes substâncias ou agulhamento à seco em dor miofascial temporomandibular. O delineamento do estudo consistiu em uma revisão sistemática de ensaios clínicos randomizados e as bases de pesquisa consultadas foram: Pubmed, EMBASE, CENTRAL/Cochrane, Lilacs, Scopus e Web of Science no período até outubro de 2014. A seleção dos estudos foi realizada por dois avaliadores independentes, que aplicaram critérios de elegibilidade para a obtenção da amostra final de estudos primários. Após a aplicação dos critérios de inclusão quinze estudos foram selecionados. Devido à heterogeneidade dos estudos primários não foi possível realizar uma meta-análise. A análise narrativa dos resultados mostrou que a maioria dos estudos apresentava limitações metodológicas e vieses que comprometeram a qualidade de seus achados. Assim, existe a necessidade da condução de novos ensaios clínicos randomizados, com tempo de acompanhamento e amostras maiores, para avaliar a real efetividade da técnica e das substâncias avaliadas.

Abrin is a potent toxin obtained from the seeds of Abrus precatorius. It is a heterodimeric glycoprotein consisting of an A and a B subunit linked together by a disulfide bond. The toxicity of the protein comes from the A subunit harboring RNA-N-glycosidase activity which cleaves the glycosidic bond between the ribose sugar and the adenine at position 4324 in 28S rRNA. The depurination of a specific adenine residue at position 4324 results in loss of conformation of the 28S rRNA at the α sarcin/ricin loop to which elongation factor-2 (EF-2) binds, during the transloction step of translation, leading to inhibition of protein synthesis. The B subunit of abrin is a galactose specific lectin. The lectin activity enables the toxin to gain entry inside cells on binding to receptors with terminal galactose. After entering cells, a few molecules of abrin reach the endoplasmic reticulum (ER) via the retrograde transport, where the disulfide bond between the A and the B subunits gets cleaved. Then the A chain escapes into the cytosol where it binds to its target, the α-sarcin loop of the 28S ribosomal RNA and inhibits protein synthesis. Apart from inhibition of protein synthesis, exposure of cells to abrin leads to the loss of mitochondrial membrane potential (MMP) resulting in the activation of caspases and finally apoptosis. However, whether apoptosis is dependent on the inhibition of protein synthesis has not been elucidated. The major objectives of this study are therefore to delineate the signaling pathways involved in abrin-induced apoptosis. The thesis is divided into 4 Chapters: Chapter 1. provides a overview of the general properties of RIPs, with a brief history, classification, trafficking and biological activities of the toxins. This chapter also discusses their potential use in bio-warfare and the treatments available for management of toxicity. Chapter 2 and 3 discuss the results obtained on studies aimed at gaining insights into the signaling pathways involved in abrin-induced apoptosis. Chapter 4 focuses on the research carried out to understand the mechanisms of neutralization of abrin by the mAb D6F10. Towards the first objective, chapter 2 elucidates the role of endoplasmic reticulum (ER) stress signaling in abrin-induced apoptosis using the human T-cell line, Jurkat as a model system. It could be concluded that the inhibition of protein synthesis by the catalytic A subunit of abrin could result in accumulation of unfolded proteins in the ER leading to ER stress which triggers the unfolded protein response (UPR) pathway. The ER resident trans-membrane sensors IRE1 (Inositol-requiring enzyme 1), PERK (PKR-like ER kinase) and ATF6 (Activating transcription factor 6) are the important players of UPR in mammalian cells. These sensors inhibit translation and increase the levels of chaperones to restore protein homeostasis. However, if the ER stress is prolonged, apoptotic pathways get activated to remove severely damaged cells in which protein folding defects cannot be resolved. Recent studies have shown that endoplasmic reticulum (ER) stress induces apoptosis by activating initiater caspases such as caspase-2 and -8 which eventually trigger mitochondrial membrane potential loss and activation of downstream effector capases-9 and -3. Phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2α and upregulation of CHOP [CAAT/enhancer binding protein (C/EBP) homologous protein], important players involved in ER stress signaling by abrin, suggested activation of ER stress in the cells. ER stress is also known to induce apoptosis via stress kinases such as p38 MAPK and JNK. Activation of both the pathways was observed upon abrin treatment and found to be upstream of the activation of caspases. However, abrin-induced apoptosis was found be dependent on p38 MAPK but not JNK. We also observed that abrin induced activation of caspase-2 and caspase-8 and triggered Bid cleavage leading to mitochondrial membrane potential loss and thus connecting the signaling events from ER stress to mitochondrial death machinery. Few toxins belonging to the family of ribosome inactivating proteins such as Shiga toxin have been observed to induce DNA damage in human endothelial cells and activate p53/ATM-dependent signaling pathway in mammalian cells. To further investigate the role of abrin on activation of DNA damage signaling pathway, we analysed the phosphorylation of H2AX and ATM, which are markers for double strand DNA breaks. We observed phosphorylation of H2AX and ATM upon abrin treatment but not when cells were pretreated with the broad spectrum pan caspase inhibitor. This study suggested that the DNA damage observed was an indirect effect of caspase-activated DNase. We concluded from the studies in chapter 2 that inhibition of protein synthesis by abrin can trigger endoplasmic reticulum stress leading to mitochondria-mediated apoptosis. Further studies were conducted to understand the dependence of ER stress on inhibition of protein synthesis and are presented in chapter 3. For this study, we have used an active site mutant of abrin A chain (R167L) which exhibits lower protein synthesis inhibitory activity than the wild type abrin A chain. Recombinant wild type and mutant abrin A chains were expressed in E.coli and purified. Since, abrin A chain requires the B chain for internalization into cells, both wild type and mutant abrin A chains were conjugated to native ricin B chain to generate a hybrid toxin. Next, we have compared the toxic effects of the two conjugates in cells. The rate of inhibition of protein synthesis mediated by the mutant ricin B-rABRA (R167L) conjugate was slower than that of the wild type ricin B-rABRA conjugate but it could trigger ER stress leading to mitochondrial mediated apoptosis in cells though delayed, suggesting that inhibition of protein synthesis is the major factor contributing to abrin-mediated apoptosis. Abrin is extremely lethal and considered as a potential agent for use in biological warfare. Currently, there are no antidotes or effective therapies available for abrin poisoning. Antibody based antitoxins function by either preventing toxin binding to cell surface receptors or by translocation. Antibodies against the B chain of RIPs function by inhibiting the binding of B chain of the toxin to cells, whereas the exact mechanism by which antibodies against A chain function is still not clear. The only known neutralizing monoclonal antibody against abrin A chain, namely, D6F10, was generated in our laboratory and was shown to rescue cells and mice from abrin intoxication. Earlier experiments with confocal microscopy suggested that mAb D6F10 could internalize in HeLa cells along with abrin, suggesting that the antibody can function intracellularly. Chapter 4 discusses the work carried out to delineate the mechanism of intracellular neutralization of abrin by the mAb D6F10. We observed significant reduction in binding and delay in abrin internalization in the presence of the neutralizing monoclonal antibody (mAb) D6F10. Considering that the majority of the abrin after internalization is removed by lysosomal degradation, we studied the fate of abrin in the presence of mAb D6F10. Confocal images did not show any difference in the distribution of abrin in the lysosomes in the absence or presence of antibody. However, the antibody remained persistently colocalized with abrin in the cells, suggesting that the antibody might inhibit enzymatic activity of abrin at its cellular site of action.

Neste trabalho visamos otimizar o isolamento da BnP1, uma SVMP presente no veneno de B. neuwiedi, e isolar disintegrinas desse veneno, ambas originadas de precursores tipo P-II, analisando as seqüências de cDNA e a ação sobre plaquetas. A purificação da BnP1 foi por exclusão molecular e troca iônica; duas novas disintegrinas, D2 e D4, foram isoladas por cromatografia em fase reversa; e outra disintegrina, MS, foi caracterizada a partir do SDS-PAGE. As proteínas foram parcialmente seqüenciadas por espectrometria de massas. Diferentes cDNAs foram clonados a partir da glândula de veneno de B. neuwiedi e os precursores da BnP1 e MS se localizaram em um cluster que inclui SVMPs classe P-I e P-II. O precursor de D4 correspondeu a uma SVMP tipicamente P-II. A BnP1, ao contrário das disintegrinas, não inibiu a agregação plaquetária induzida por diferentes agonistas. Este trabalho indica ainda que a biossíntese de SVMPs da classe P-II pode envolver processamento de mRNA, um novo mecanismo de geração de diversidade das SVMPs. / The aim of this study was to optimize the isolation of BnP1, a SVMP from B. neuwiedi venom, and isolate new disintegrins from this venom, both originated from P-II class precursors, and analyze the sequence of their precursors and their action on platelets. BnP1 was isolated by size exclusion and anion-exchange chromatography; the disintegrins D2 and D4 by reverse-phase chromatography and MS was isolated from SDS-PAGE. These proteins were partially sequenced by mass spectrometry. Several SVMPs cDNAs were cloned from B. neuwiedi venom gland, and BnP1 and MS precursors localized in a cluster enclosing P-I and P-II SVMPs. MS cDNA was tipical of P-II class of SVMPs. BnP1, unlike the disintegrins, was not able to inhibit platelet aggregation induced by different agonists. This work suggested that the biosynthesis of class P-II SVMPs include mRNA processing as a further step to generate venom diversity.