En 1977, Carl Woese sépare les procaryotes en deux grands groupes en proposant une nouvelle classification basée sur des critères phylogénétiques. Les Archaea deviennent ainsi un domaine à part entière aux cotés des Bacteria et des Eucarya. Depuis, la compréhension de ce nouveau groupe et de ses relations avec les deux autres domaines, essentielles pour comprendre l’évolution ancienne du vivant, est largement passée par l’étude de leur phylogénie. Presque 40 ans de recherche sur les archées ont permis de faire évoluer leur image : de bactéries vivant dans des milieux spécialisés, souvent extrêmes, on est passé à un domaine indépendant, très diversifié aussi bien génétiquement, métaboliquement ou encore écologiquement. Ces dernières années la barre symbolique de cent génomes complets d’archées séquencés a été franchie et, parallèlement, les projets génomiques et métagénomiques sur des groupes peu caractérisés ou de nouvelles lignées de haut rang taxonomique (e.g. Nanohaloarchaea, Thaumarchaeota, ARMAN, Aigarchaeota, groupe MGC, groupe II des Euryarchaeota, etc.) se sont multipliés. Tout ceci apporte un matériel sans précédent pour l’étude de l’histoire évolutive et de la diversité des Archaea. Les protéines ribosomiques ont été utilisées de façon courante pour inférer la position phylogénétique des nouvelles lignées d’Archaea. Néanmoins, les phylogénies résultantes ne sont pas complètement résolues, laissant des interrogations concernant d’importantes relations de parenté. La recherche de nouveaux marqueurs est donc cruciale et c’est dans ce contexte que mon projet de thèse s’inscrit. À partir de l’analyse des génomes de deux Thaumarchaeota et d’une Aigarchaeota, nous avons identifié 200 protéines conservées et bien représentées dans les différents phyla d’archées. Ces protéines sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires, ce qui peut apporter un signal phylogénétique complémentaire à celui des marqueurs de type informationnel utilisés par le passé. En plus de confirmer la plupart des relations phylogénétiques inférées à partir de ces derniers (i.e., protéines ribosomiques et sous unités de l’ARN polymérase), l’analyse phylogénétique de ces nouveaux marqueurs apporte un signal permettant une meilleure résolution de la phylogénie des archées et la clarification de certaines relations jusqu’ici confuses. Un certain nombre de ces nouveaux marqueurs sont aussi présents chez les bactéries. Les relations entre les grands phyla d’archées restant encore non résolues, nous avons utilisé ces protéines pour essayer de placer la racine de l’arbre des Archaea en utilisant comme groupe extérieur les bactéries. Nous avons ainsi pu identifier 38 protéines, parmi les 200 sélectionnées précédemment, ayant un signal phylogénétique suffisamment fiable pour cette étude, auxquelles nous avons ajouté 32 protéines ribosomiques universelles. L’utilisation conjointe de ces données nous a permis de placer la racine entre les Euryarchaeota, d’une part, et un groupe rassemblant les Thaumarchaeota, les Aigarchaeota, les Korarchaeota et les Crenarchaeota, d’autre part. Ce nouvel éclairage sur l’évolution ancienne des archées nous a amené à proposer une révision de leur taxonomie avec, principalement, la création du nouveau phylum "Proteoarchaeota" contenant les quatre phyla actuels que nous proposons de rétrograder en classes : Thaumarchaea, Aigarchaea, Korarchaea et Crenarchaea.Finalement, l’analyse des protéines codées dans les trois génomes qui ont servi de point de départ de ma thèse nous a permis de générer une masse considérable de données qui ont révélé des traits particuliers ou encore des histoires évolutives inattendues. Un exemple est l’histoire du complexe formé par la chaperonne DnaK et de ses co-chaperonnes GrpE, DnaJ, et DnaJ-Fer chez les Thaumarchaeota, impliquant plusieurs transferts horizontaux entre les trois domaines du vivant. / In 1977, Carl Woese proposed a new classification of organisms based on phylogenetic criteria where he divided prokaryotes into two major groups. Thus, Archaea were defined as a new domain, together with Bacteria and Eucarya. Since then, the study of this group and its relationships with the two other domains, essential to understand the early evolution of Life, has been largely done through the investigation of its phylogeny. Almost 40 years of research on the archaea have led to a significant evolution of the knowledge on this group: from considering them as bacteria living in specialized environments, most often extreme ones, to defining them as an independent domain, highly diversified in genetic, metabolic and ecological terms. During the last years, the symbolic barrier of 100 complete archaeal genome sequences has been reached and, simultaneously, many genome projects from poorly-known groups or new high-rank lineages (e.g., Nanohaloarchaea, Thaumarchaeota, ARMAN, Aigarchaeota, MGC, group II Euryarchaeota, etc.) have been launched. All this provides unprecedented information to study the evolutionary history of Archaea. Ribosomal proteins have been used recurrently to infer the phylogenetic position of new archaeal lineages. Nevertheless, the resulting phylogenies are not fully resolved and several important nodes remain uncertain. The identification of new phylogenetic markers is therefore crucial. This represents the framework of my PhD thesis project. On the basis of the analysis of the genome sequences of two Thaumarchaeota and one Aigarchaeota, we have identified 200 conserved proteins well represented among the different archaeal phyla. These proteins are involved in a number of cellular functions, thus providing a phylogenetic signal complementary to the one obtained from the informational proteins (i.e., ribosomal proteins and RNA polymerase subunits). The phylogenetic analysis of these new markers has led to a better resolution of the archaeal phylogeny, including several relationships that remained unclear. Several of the new markers are also present in bacteria. Since the relationships among the different archaeal phyla are not yet resolved, we have used those markers to try to place the root of the archaeal phylogeny using the bacterial sequences as outgroup. We have identified 38 proteins among the 200 detected before containing a phylogenetic signal useful for that purpose, to which we have added 32 universal ribosomal proteins. The use of this complete dataset allowed us locating the root between the Euryarchaeota and a large group joining the Thaumarchaeota, Aigarchaeota, Korarchaeota and Crenarchaeota. This new result on the ancient evolutionary history of Archaea has led us to propose a taxonomic revision for this domain, in particular the erection of a new phylum "Proteoarchaeota", containing the current four phyla that we propose to retrograde into classes (Thaumarchaeales, Aigarchaeales, Korarchaeales and Crenarchaeales). Finally, the analysis of the proteins encoded by the three reference genomes at the origin of this work has generated a large amount of data, which reveals particular traits in certain organisms or unexpected evolutionary histories. One example concerns the evolution in Thaumarchaeota of the protein complex composed of the DnaK chaperon and its co-chaperons GrpE, DnaJ, and DnaJ-Fer, which involves several horizontal gene transfer events among the three domains of Life.

Les transferts horizontaux de gènes (THG) ont été démontrés pour jouer un rôle important dans l'évolution des procaryotes. Leur impact a été le sujet de débats intenses, ceux-ci allant même jusqu'à l'abandon de l'arbre des espèces. Selon certaines études, un signal historique dominant est présent chez les procaryotes, puisque les transmissions horizontales stables et fonctionnelles semblent beaucoup plus rares que les transmissions verticales (des dizaines contre des milliards). Cependant, l'effet cumulatif des THG est non-négligeable et peut potentiellement affecter l'inférence phylogénétique. Conséquemment, la plupart des chercheurs basent leurs inférences phylogénétiques sur un faible nombre de gènes rarement transférés, comme les protéines ribosomales. Ceux-ci n'accordent cependant pas autant d'importance au modèle d'évolution utilisé, même s'il a été démontré que celui-ci est important lorsqu'il est question de résoudre certaines divergences entre ancêtres d'espèces, comme pour les animaux par exemple. Dans ce mémoire, nous avons utilisé des simulations et analyser des jeux de données d'Archées afin d'étudier l'impact relatif des THG ainsi que l'impact des modèles d'évolution sur la précision phylogénétique. Nos simulations prouvent que (1) les THG ont un impact limité sur les phylogénies, considérant un taux de transferts réaliste et que (2) l'approche super-matrice est plus précise que l'approche super-arbre. Nous avons également observé que les modèles complexes expliquent non seulement mieux les données que les modèles standards, mais peuvent avoir un impact direct sur différents groupes phylogénétiques et sur la robustesse de l'arbre obtenu. Nos résultats contredisent une publication récente proposant que les Thaumarchaeota apparaissent à la base de l'arbre des Archées. / Horizontal gene transfer (HGT) had been demonstrated to play an important role in the evolution of prokaryotes. Their impact on phylogeny was the subject of a heated debate, with some proposing that the concept of a species tree should be abandoned. The phylogeny of prokaryotes does contain a major part of the historical signal, because stable and functional horizontal transmissions appear to be by far rarer than vertical transmissions (tens versus billions). However, the cumulative effect of HGT is non-negligible and can potentially affect phylogenetic inference. Therefore, most researchers base their phylogenetic inference on a low number of rarely transferred genes such as ribosomal proteins, but they assume the selection of the model of evolution as less important, this despite the fact that it has been shown of prime importance for much less deep divergences, e.g. like animals. Here, we used a combination of simulations and of real data from Archaea to study the relative impact of HGT and of the inference methods on the phylogenetic accuracy. Our simulations prove that (1) HGTs have a limited impact on phylogeny, assuming a realistic rate and (2) the supermatrix is much more accurate than the supertree approach. We also observed that more complex models of evolution not only have a better fit to the data, but can also have a direct impact on different phylogenetic groups and on the robustness of the tree. Our results are in contradiction to a recent publication proposing that the Thaumarchaeota are at the base of the Archaeal tree.

En 1977, Carl Woese sépare les procaryotes en deux grands groupes en proposant une nouvelle classification basée sur des critères phylogénétiques. Les Archaea deviennent ainsi un domaine à part entière aux cotés des Bacteria et des Eucarya. Depuis, la compréhension de ce nouveau groupe et de ses relations avec les deux autres domaines, essentielles pour comprendre l'évolution ancienne du vivant, est largement passée par l'étude de leur phylogénie. Presque 40 ans de recherche sur les archées ont permis de faire évoluer leur image : de bactéries vivant dans des milieux spécialisés, souvent extrêmes, on est passé à un domaine indépendant, très diversifié aussi bien génétiquement, métaboliquement ou encore écologiquement. Ces dernières années la barre symbolique de cent génomes complets d'archées séquencés a été franchie et, parallèlement, les projets génomiques et métagénomiques sur des groupes peu caractérisés ou de nouvelles lignées de haut rang taxonomique (e.g. Nanohaloarchaea, Thaumarchaeota, ARMAN, Aigarchaeota, groupe MGC, groupe II des Euryarchaeota, etc.) se sont multipliés. Tout ceci apporte un matériel sans précédent pour l'étude de l'histoire évolutive et de la diversité des Archaea. Les protéines ribosomiques ont été utilisées de façon courante pour inférer la position phylogénétique des nouvelles lignées d'Archaea. Néanmoins, les phylogénies résultantes ne sont pas complètement résolues, laissant des interrogations concernant d'importantes relations de parenté. La recherche de nouveaux marqueurs est donc cruciale et c'est dans ce contexte que mon projet de thèse s'inscrit. À partir de l'analyse des génomes de deux Thaumarchaeota et d'une Aigarchaeota, nous avons identifié 200 protéines conservées et bien représentées dans les différents phyla d'archées. Ces protéines sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires, ce qui peut apporter un signal phylogénétique complémentaire à celui des marqueurs de type informationnel utilisés par le passé. En plus de confirmer la plupart des relations phylogénétiques inférées à partir de ces derniers (i.e., protéines ribosomiques et sous unités de l'ARN polymérase), l'analyse phylogénétique de ces nouveaux marqueurs apporte un signal permettant une meilleure résolution de la phylogénie des archées et la clarification de certaines relations jusqu'ici confuses. Un certain nombre de ces nouveaux marqueurs sont aussi présents chez les bactéries. Les relations entre les grands phyla d'archées restant encore non résolues, nous avons utilisé ces protéines pour essayer de placer la racine de l'arbre des Archaea en utilisant comme groupe extérieur les bactéries. Nous avons ainsi pu identifier 38 protéines, parmi les 200 sélectionnées précédemment, ayant un signal phylogénétique suffisamment fiable pour cette étude, auxquelles nous avons ajouté 32 protéines ribosomiques universelles. L'utilisation conjointe de ces données nous a permis de placer la racine entre les Euryarchaeota, d'une part, et un groupe rassemblant les Thaumarchaeota, les Aigarchaeota, les Korarchaeota et les Crenarchaeota, d'autre part. Ce nouvel éclairage sur l'évolution ancienne des archées nous a amené à proposer une révision de leur taxonomie avec, principalement, la création du nouveau phylum "Proteoarchaeota" contenant les quatre phyla actuels que nous proposons de rétrograder en classes : Thaumarchaea, Aigarchaea, Korarchaea et Crenarchaea.Finalement, l'analyse des protéines codées dans les trois génomes qui ont servi de point de départ de ma thèse nous a permis de générer une masse considérable de données qui ont révélé des traits particuliers ou encore des histoires évolutives inattendues. Un exemple est l'histoire du complexe formé par la chaperonne DnaK et de ses co-chaperonnes GrpE, DnaJ, et DnaJ-Fer chez les Thaumarchaeota, impliquant plusieurs transferts horizontaux entre les trois domaines du vivant.

En dépit de leur importance, la caractérisation des communautés bactériennes dans l’environnement reste encore très incomplète. Les principales raisons sont, d’une part, la difficulté d’appréhender la totalité de la communauté bactérienne quand plus de 99% des bactéries demeurent récalcitrantes à la culture in vitro et ne peuvent donc être étudiées par les approches classiques de microbiologie. D’autre part, la métagénomique, censée contourner cette méthode de culture en s’intéressant à l’ensemble des génomes extraits des milieux d’études, demeure elle aussi imparfaite du fait de limitations techniques (biais d’extraction de l'ADN, de clonage, de PCR, de séquençage et d’assemblage des génomes etc.) et conceptuelles, inhérentes à la complexité et l’hétérogénéité des environnements. Pour compenser les limites de chacune de ces techniques, des méthodes de tri cellulaire appliquées en conjonction avec les deux premières pourraient aider à un meilleur décryptage de la diversité microbienne. Basée sur la sélection spécifique (taxonomique et/ou fonctionnelle) et l’isolement direct des cellules bactériennes ciblées à partir d’un échantillon environnemental complexe, l’étude est restreinte à une population spécifique, voire à une cellule isolée. Pourront alors être appliquées les approches classiques de mise en culture ou d’extraction de l’ADN pour une étude restreinte à l’ADN ou l’ARN, leur répétition sur les différentes populations devant à terme (lointain) approcher l’exhaustivité. C’est dans ce contexte que s’est positionné ce travail de thèse visant dans un premier temps à mettre au point un nouvel outil de tri cellulaire basé sur l’intégration de micro-aimants permanents dans un canal microfluidique. A partir de ce système de tri magnétique miniaturisé, offrant de nombreux avantages (dispositif portable, peu coûteux, nécessitant de faibles volumes réactionnels et potentiellement intégrable en « laboratoire sur puce »), une technique d’isolement sélectif de cellules bactériennes marquées magnétiquement a alors été développée. Ciblées sur des critères taxonomiques après hybridation in situ avec des sondes d’acides nucléiques biotinylés complémentaires d’une région spécifique du gène 23S rRNA, des cellules bactériennes ont été marquées magnétiquement après réaction de la sonde avec des nanoparticules magnétiques fonctionnalisées par des molécules de streptavidine. Les premiers résultats montrent l’établissement d’une méthode de tri suffisamment spécifique et sensible pour piéger les cellules marquées diluées (0,04%) au sein d’une suspension, à des niveaux compatibles avec l’isolement futur de populations d’intérêt à partir de communautés d’environnements complexes. Sur un principe comparable, l’approche a été adaptée à l’étude des transferts horizontaux de gènes in situ. Les applications d’un tri cellulaire grâce au marquage par des nanoparticules magnétiques et l’emploi de micro-aimants intégrés dans des microsystèmes fluidiques semblent donc très prometteuses pour le développement de la microbiologie environnementale. / Despite their importance, bacterial communities in the environment remain poorly characterized. On the one hand, it is difficult to gain knowledge of the community as a whole because over 99% of bacteria are recalcitrant to in vitro culture, rendering classic microbiological approaches imposible to carry out. On the other hand, metagenomics, which can be used to circumvent culture-based approaches by extracting all the genomes from a given environment, is also problematic given the associated technical limitations (biases related to DNA extraction, cloning, PCR, genome sequencing and assembling etc.), and conceptual difficulties related to the complexity and the homogeneity of the environments. In order to overcome some of the limitations of these approaches, bacterial cell selection methods have been developed and can be used to improve our understanding of microbial diversity. Based on taxonomic and/or functional selection and the direct isolation of bacterial cells from an environmental sample, bacterial cell selection can be used to reduce microbial community complexity by targeting specific populations, or even an isolated cell. A variety of classic approaches such as cultivation or DNA/RNA extraction can then be carried out. This cycle can theoretically be repeated until all members of the community are characterized. The aim of this doctoral thesis was to design a novel cell selection tool based on the permanent integration of micro-magnets into a microfluidic canal. In conjunction with a new miniaturized magnetic selection system that provides several advantages over larger systems (portable, low cost, requiring smaller reaction volumes and can be potentially integrated on “laboratory on a chip” systems), a method for selective bacterial cell isolation using magnetic labeling was developed. The bacterial cells were targeted based on taxonomic criteria; biotin-labeled probes were developed for a specific region of the 23S rRNA gene. Following in situ hybridization with the probes, baceterial cells were labeled with streptavidin-functionalized magnetic nanoparticles. First results showed that the tool was specific and sensitive enough to trap labeled and diluted (0,04%) cells from a suspension at levels that are comparible to populations of interest found in complex environmental communities. This tool has also been adapted to study in situ horizontal gene transfer as well. The application of a cellular selection tool that labels targets with magnetic nanoparticles coupled to fluidic microsystems with integrated nano-magnets looks very promising for future studiesin environmental microbiology.

Chez les mammifères, les cellules apoptotiques peuvent être complètement dégradées par des cellules phagocytaires spécialisées ou servir de vecteur d'ADN Le transfert d'oncogènes via les cellules apoptotiques aboutit à la transformation des cellules receveuses uniquement si celles-ci sont déficientes en p53. Sachant que Fniicogène E6 des papillomavirus humains (HPV) à haut risque induit la dégradation de p53, il est concevable que son transfert par la cellule apoptotique soit à l'origine d'un mécanisme alternatif de carcinogenèse associée aux HPV. Afin de confirmer cette hypothèse, l'apoptose de cellules dérivées de cancer du col de l'utérus, abriiam ou non des séquences d'HPV, a été induite. En collaboration avec l'équipe de Patrick Sandoz du laboratoire d'optique de FEMTO-ST, nous avons adapté leur inicr;système référencé en position à l'observation automatisée de Finternalisation des cellules apoptotiques. Nous avons aussi déterminé que les cellules apoptotiques son! phagocytées par les fîbroblastes quel que soit leur statut virologique. Seules les cellules apoptotiques dérivées de cellules abritant de l'ADN d'HPV transforment les cellules receveuses. L'expression de l'ADN viral, dont E6, dans les fîbroblastes transformés ainsi que la perte d'expression des protéines p53 et p21 suggère que les oncogènes d'HPV pourraient être à l'origine de la transformation. Les résultats présentés dans ces travaux mettent en évidence un nouveau mécanisme de carcinogenèse associée aux HPV via la phagocytose des cellules apoptotiques, potentiellement impliqué dans la transformation de cellules primaires et la progression des tumeurs associées aux HPV. / Apoptotic cells in mammals may be completely degraded by specialized phagocytic cells or serve as a DNA vector. The oncogene transfer via apoptotic cells leads to the transformation of récipient cells but only when they are p53 deficient. As the E6 oncogene of high-risk human papillomavirus (HPV) leads to p53 dégradation, its transfer from apoptotic cells may be the cause of an alternative mechanism of HPV-associated carcinogenesis. To confirm this hypothesis, we induced apoptosis of cervical cancer cells that may harbor HPV sequences. In collaboration with Patrick Sandoz's team at the FEMTO-ST optical laboratory, we used their position-referenced microsystem for the automated observation of apoptotic cell internalization. We also found that apoptotic cells are phagocytized by fibroblasts regardless of their virological status. Only apoptotic cells from cells harboring HPV DNA transform recipient cells. Viral DNA expression, including E6, in transformed fibroblasts and the loss of p53 and p21 protein expression suggest that HPV oncogènes may cause transformation. These results highlight a new mechanism of HPV-associated carcinogenesis via apoptotic cell phagocytosis. This mechanism may be involved in thé transformation of primary cells and the progression of HPV-associated tumors.

Le pangénome est l’ensemble des gènes uniques retrouvé chez une espèce. Dans le cas des espèces procaryotes, notamment celles qui sont présentes dans le microbiote intestinal humain, la variation du contenu en gène est caractérisée par des événements de gain de gènes principalement par transfert horizontal de gènes (THG) et de perte de gène. Cette variation du contenu en gène peut être plus rapide que le taux de mutation et permettre aux microbes de s’adapter rapidement à des pressions sélectives. Cela justifie donc l’étude de l’évolution pangénomique des procaryotes sur des échelles de temps humaines qui sont considérées comme étant courtes du point de vue évolutif, par exemple de l’ordre de quelques années. La plupart des études sur ce sujet impliquent des espèces relativement distantes qui ont divergé depuis des millions d’années. De plus, l'équilibre des forces évolutives majeures impliquées, telles que le THG, la sélection, la dérive génétique et les mutations, n’est pas clairement défini et est au cœur d’un débat dans la littérature. Ce projet de maîtrise permet donc d’élargir le portrait évolutif des pangénomes de procaryotes en s’intéressant à l’évolution des gènes transférés horizontalement, aussi appelés gènes mobiles, sur de courtes échelles de temps. Pour ce faire, nous allons d’abord passer en revue la littérature pertinente en lien avec ce sujet, notamment les méthodes employées pour détecter les gènes mobiles et les modèles d’évolution pangénomique. Nous allons ensuite analyser l’évolution d’une collection de 37 853 gènes mobiles impliqués dans des THG récents détectés dans le microbiote intestinal d’individus provenant d’Amérique du Nord ou des îles Fidji. Pour détecter des signatures évolutives des forces en action, nous estimerons divers paramètres de génétique des populations à partir de l’alignement entre les lectures de séquençage métagénomique de 176 microbiotes fidjiens et cette collection de gènes mobiles. Nous expliquerons aussi l’outil de simulations évolutives que nous avons développé afin de valider et expliquer certaines de nos observations. Sans exclure la présence de pressions de sélection pour des gènes mobiles ayant des fonctions spécifiques, les données réelles et les simulations nous amènent à conclure que l’évolution des gènes mobiles sur de courtes échelles de temps peut être expliquée par un modèle d’évolution où les gènes mobiles ne sont pas largement adaptifs à leurs hôtes humains ou microbiens, contrairement à ce qui est parfois observé sur de longues échelles de temps évolutif. / The pangenome is the collection of unique genes found in a species. For prokaryotes, especially those present in the human gut microbiota, variation in gene content is characterized by gene gain through horizontal gene transfer (HGT) and gene loss. In human gut, gene content variations can occur at faster rates than mutation, which allow microbes to adapt rapidly to environmental changes. This justifies the study of the prokaryotes pangenome evolution on human time scales which are considered evolutionarily short, e.g. in the order of few years. Most studies about the evolution of prokaryotic pangenomes involve relatively distant species that have diverged since millions of years. In addition, the balance of major evolutionary forces involved, such as horizontal transfer, selection, genetic drift, and mutations, is not clearly defined and is debated in literature. This master's project therefore aims to broaden the evolutionary portrait of prokaryotic pangenome evolution by focusing on near-term evolution. To do this, we will first review the relevant literature related to this topic, including the methods used to detect mobile genes and the pangenome evolution models. We will then analyze the evolution of a pre-existing collection of 37 853 mobile genes involved in recent HGT events detected in the gut microbiota of individuals from North America and Fiji Islands. To detect evolutionary signatures of the forces in action, we will estimate various population genetics parameters from the alignment between metagenomic sequencing reads of 176 Fijian microbiomes and this collection of mobile genes. We will also explain the evolutionary simulation tool that we have developed in order to validate and explain some of our observations. While we don’t exclude the importance of selection for specific cellular functions for pangenome evolution, we found that the near-term evolution of mobile genes can be explained by a model in which mobile genes can spread selfishly without being largely adaptive to their human or microbial hosts, contrarily to what is often observed over longer evolutionary time scales.

Les modèles de Markov d’ordre 2 (HMM2) sont des modèles stochastiques qui ont démontré leur efficacité dans l’exploration de séquences génomiques. Cette thèse explore l’intérêt de modèles de différents types (M1M2, M2M2, M2M0) ainsi que leur couplage à des méthodes combinatoires pour segmenter les génomes bactériens sans connaissances a priori du contenu génétique. Ces approches ont été appliquées à deux modèles bactériens afin d’en valider la robustesse : Streptomyces coelicolor et Streptococcus thermophilus. Ces espèces bactériennes présentent des caractéristiques génomiques très distinctes (composition, taille du génome) en lien avec leur écosystème spécifique : le sol pour les S. coelicolor et le milieu lait pour S. thermophilus / Second-order Hidden Markov Models (HMM2) are stochastic processes with a high efficiency in exploring bacterial genome sequences. Different types of HMM2 (M1M2, M2M2, M2M0) combined to combinatorial methods were developed in a new approach to discriminate genomic regions without a priori knowledge on their genetic content. This approach was applied on two bacterial models in order to validate its achievements: Streptomyces coelicolor and Streptococcus thermophilus. These bacterial species exhibit distinct genomic traits (base composition, global genome size) in relation with their ecological niche: soil for S. coelicolor and dairy products for S. thermophilus. In S. coelicolor, a first HMM2 architecture allowed the detection of short discrete DNA heterogeneities (5-16 nucleotides in size), mostly localized in intergenic regions. The application of the method on a biologically known gene set, the SigR regulon (involved in oxidative stress response), proved the efficiency in identifying bacterial promoters. S. coelicolor shows a complex regulatory network (up to 12% of the genes may be involved in gene regulation) with more than 60 sigma factors, involved in initiation of transcription. A classification method coupled to a searching algorithm (i.e. R’MES) was developed to automatically extract the box1-spacer-box2 composite DNA motifs, structure corresponding to the typical bacterial promoter -35/-10 boxes. Among the 814 DNA motifs described for the whole S. coelicolor genome, those of sigma factors (B, WhiG) could be retrieved from the crude data. We could show that this method could be generalized by applying it successfully in a preliminary attempt to the genome of Bacillus subtilis

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Bien que l’évolution de la résistance aux médicaments soit l'un des plus grands défis dans la lutte contre les maladies infectieuses, beaucoup de phénomènes restent inexpliqués. Dans le cas de la leishmaniose, la résistance est un problème majeur depuis plusieurs années. Cette maladie zoonotique négligée est causée par le parasite protozoaire Leishmania, transmis par des phlébotomes lors du repas sanguin. Chez l’humain, elle se décline en trois formes principales : viscérale, cutanée et muco-cutanée. La leishmaniose peut aussi se développer chez les chiens infectés, qui constituent un réservoir majeur de transmission. Sans vaccin efficace, le contrôle de la maladie repose principalement sur la chimiothérapie, mais peu de molécules homologuées sont disponibles. En outre, les mêmes produits sont utilisés chez les chiens et les humains, ce qui favorise l'émergence et la propagation de souches résistantes aux médicaments. Leishmania est en effet connu pour détenir d’incroyables particularités génomiques (telles que la formation d’amplicons circulaires contenant des gènes de résistance) qui lui permettent de survivre dans des conditions de stress, telles que la pression médicamenteuse. Par ailleurs, Leishmania est un eucaryote qui a conservé la capacité de produire des vésicules extracellulaires (EVs) au cours de l’évolution. Ces particules de taille nanométrique sont produites naturellement par la majorité des cellules biologiques et ont un contenu riche en protéines, lipides et acides nucléiques. Bien que des caractéristiques clés des EVs du protozoaire aient été découvertes, aucune étude n’a encore été réalisée sur les EVs de souches résistantes. Ainsi, cet aspect constitue le cœur de mon projet de recherche de doctorat : l’étude des EVs de Leishmania et leur rôle dans le phénomène de la résistance aux médicaments. Nos travaux sont les premiers à démontrer que les mécanismes de résistance aux médicaments peuvent induire des changements dans la morphologie, la taille et la distribution des EVs de Leishmania. Nous avons identifié le protéome de base des EVs du parasite et nous avons mis en évidence des protéines enrichies dans les EVs libérées par des parasites résistants à l'antimoine, à la miltéfosine et à l'amphotéricine B. Nous avons également étudié le contenu en ADN des EVs de parasites résistants et confirmé l'enrichissement des amplicons porteurs de gènes de résistance aux médicaments, associés aux EVs. En complément, nos tests de transferts d’EVs ont prouvé que ces vésicules permettent le transfert horizontal de gènes de résistance : un mécanisme alternatif de résistance aux médicaments. Finalement, nous avons montré que les EVs des parasites résistants améliorent la croissance des promastigotes et réduisent l'accumulation de ROS, ce qui favorise la survie et la propagation des populations résistantes aux médicaments. En conclusion, ces découvertes permettront le développement de nouveaux tests diagnostiques et de nouvelles approches thérapeutiques pour certaines maladies infectieuses zoonotiques, basés sur les profils des EVs. De plus, elles ont une importance majeure dans la compréhension de la résistance médicamenteuse et prouve que les EVs fonctionnent comme des médiateurs efficaces dans le transfert horizontal de gène. Ce nouveau mécanisme facilite ainsi la transmission des gènes de résistance aux médicaments entre les parasites et favorise leur survie lorsqu'ils sont confrontés à des environnements stressants. / Although the evolution of drug resistance is one of the greatest challenges in the fight against infectious diseases, many phenomena remain unexplained. In the case of leishmaniasis, resistance has been a major problem for several years. This neglected zoonotic disease is caused by the protozoan parasite Leishmania, transmitted by sandflies during the blood meal. In humans, it comes in three main forms: visceral, cutaneous, and mucocutaneous. Leishmaniasis can also develop in infected dogs, which constitute a major reservoir of transmission. Without an effective vaccine, the control of the disease relies mainly on chemotherapy, but few approved molecules are available. Furthermore, the same products are used in dogs and humans, which promotes the emergence and spread of drug-resistant strains. Leishmania is indeed known to possess incredible genomic peculiarities (such as the formation of circular amplicons containing resistance genes) which allow it to survive under stressful conditions, such as drug pressure. Furthermore, Leishmania is a eukaryote that has retained the ability to produce extracellular vesicles (EVs) during evolution. These nano-sized particles are produced naturally by most biological cells and have a rich content of proteins, lipids, and nucleic acids. Although key characteristics of the protozoan EVs have been discovered, no studies have yet been performed on the EVs of resistant strains. Thus, this aspect constitutes the heart of my doctoral research project: the study of Leishmania EVs and their role in the phenomenon of drug resistance. Our work is the first to demonstrate that drug resistance mechanisms can induce changes in the morphology, size, and distribution of Leishmania EVs. We have identified the basic proteome of parasite EVs, and we have demonstrated enriched proteins in EVs released by parasites resistant to antimony, miltefosine and amphotericin B. We also studied the DNA content of EVs from resistant parasites and confirmed the enrichment of amplicons carrying drug resistance genes associated with EVs. In addition, our EV transfer tests have proven that these vesicles allow the horizontal transfer of resistance genes: an alternative mechanism of drug resistance. Finally, we showed that EVs from resistant parasites enhance promastigote growth and reduce ROS accumulation, which promotes the survival and spread of drug-resistant populations. In conclusion, these discoveries will allow the development of new diagnostic tests and new therapeutic approaches for certain zoonotic infectious diseases, based on the profiles of EVs. Moreover, these findings are of major importance in the understanding of drug resistance and prove that EVs function as effective mediators in horizontal gene transfer. This new mechanism thus facilitates the transmission of drug resistance genes between parasites and promotes their survival when confronted with stressful environments.

Les champignons mycorhiziens à arbuscules (CMA) sont des organismes microscopiques du sol qui jouent un rôle crucial dans les écosystèmes naturels et que l’on retrouve dans tous les habitats de la planète. Ils vivent en relation symbiotique avec la vaste majorité des plantes terrestres. Ils sont des biotrophes obligatoires, c'est-à-dire qu'ils ne peuvent croître qu'en présence d'une plante hôte. Cette symbiose permet entre autres à la plante d'acquérir des nutriments supplémentaires, en particulier du phosphore et du nitrate. Malgré le fait que cette symbiose apporte des services importants aux écosystèmes, la richesse des espèces, la structure des communautés, ainsi que la diversité fonctionnelle des CMA sont mal connues et l'approfondissement des connaissances dans ces domaines dépend d’outils de diagnostic moléculaire. Cependant, la présence de polymorphisme nucléaire intra-isolat combiné à un manque de données génomiques dans différents groupes phylogénétique de ces champignons complique le développement de marqueurs moléculaires et la détermination de l'affiliation évolutive à hauts niveaux de résolution (c.a.d. entre espèces génétiquement similaires et/ou isolats de la même espèce). . Pour ces raisons, il semble une bonne alternative d’utiliser un système génétique différent en ciblant le génome mitochondrial, qui a été démontré homogène au sein d'un même isolat de CMA. Cependant, étant donné le mode de vie particulier de ces organismes, une meilleure compréhension des processus évolutifs mitochondriaux est nécessaire afin de valoriser l'utilisation de tels marqueurs dans des études de diversité et en génétique des populations. En ce sens, mon projet de doctorat consistait à investiguerétudier: i) les vecteurs de divergences inter-isolats et -espèces génétiquement rapprochéesphylogénétiquement apparentées, ii) la plasticité des génomes mitochondriaux, iii) l'héritabilité mitochondriale et les mécanismes potentiels de ségrégation, ainsi que iv) la diversité mitochondriale intra-isolat in situ. À l'aide de la génomique mitochondriale comparative, en utilisant le séquençage nouvelle génération, on a démontré la présence de variation génétique substantielle inter-isolats et -espèces, engendrées par l'invasion d'éléments mobiles dans les génomes mitochondriaux des CMA, donnant lieu à une évolution moléculaire rapide des régions intergéniques. Cette variation permettait de développer des marqueurs spécifiques à des isolats de la même espèce. Ensuite, à l'aide d'une approche analytique par réseaux de gènes sur des éléments mobiles, on a été en mesure de démontrer des évènements de recombinaisons homologues entre des haplotypes mitochondriaux distincts, menant à des réarrangements génomiques. Cela a permis d'ouvrir les perspectives sur la dynamique mitochondriale et l'hétéroplasmie dans un même isolatsuggère une coexistence de différents haplotypes mitochondriaux dans les populations naturelles et que les cultures monosporales pourraient induirent une sous-estimation de la diversité allélique mitochondriale. Cette apparente contradiction avec l'homogénéité mitochondriale intra-isolat généralement observée, a amené à investiguer étudier les échanges génétiques à l'aide de croisements d'isolats génétiquement distincts. Malgré l'observation de quelques spores filles hétéroplasmiques, l'homoplasmie était le statut par défaut dans toutes les cultures monosporales, avec un biais en faveur de l'un des haplotypes parentaux. Ces résultats suggèrent que la ségrégation opère durant la formation de la spore et/ou le développement de la coloniedu mycélium. De plus, ils supportent la présence d'une machinerie protéique de ségrégation mitochondriale chez les CMAAMF, où l'ensemble des gènes impliqués dans ce mécanisme ont été retrouvé et sont orthologues aux autres champignons. Finalement, on est revenue aux sources avecon a étudié le polymorphisme mitochondrial intra-isolat à l'aide d'une approche conventionnelle de PCR en utilisant une Taq polymérase de haute fidélité, suivie de clonage et de séquençage Sanger, sur deux isolats de R. irregularis. Cela a permis l'observation d'hétéroplasmie in situ, ainsi que la co-expression de variantes de variantes de protéines'ARNm dans une souche in vitro. Les résultats suggèrent que d'autres études basées sur le séquençage nouvelle génération aurait potentiellement ignorée cette variation, offrant ainsi plusieurs nouveaux arguments permettant de considérer les CMA comme des organismes possédant une population de génomes mitochondriaux et nucléaires distincts. / The association between arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) and plant roots is one of the most widespread symbioses involving plants, and thus has an important role in terrestrial ecosystems. In exchange for carbohydrates, AMF improve plant fitness by enhancing mineral nutrient uptake, especially in particular phosphate and nitrate. Although this symbiosisDespite the fact that these symbioses contribute provides to important services toin ecosystems, the species richness, community structure and functional diversity of AMF is not well understood due to a lack of reliable molecular tools. The intra-isolate genetic polymorphism of nuclear DNA observed in AMF, combined with a lack of genomic data in a broad range of phylogenetic groups, has made it difficult to develop molecular markers and to determine evolutionary relatedness at high levels of resolution (i.e. between genetically-similar species and/or isolates). For these reasons, it seems a good alternative to use a different genetic system by targeting the mitochondrial genome, which have been shown to be homogeneous within AMF isolates. However, given the peculiar lifestyle of these organisms, a better understanding of the mitochondrial evolutionary processes and dynamics were is necessary in order to validate the usefulness of such markers in diversity and population genetics studies. In that regard, the objectives of my PhD project were to investigate: i) the divergence between closely related species and isolates, ii) mitochondrial genomes plasticity, iii) mitochondrial heritability and potential segregation mechanisms and iv) in situ mitochondrial intra-isolate allelic diversity. With Using comparative mitochondrial genomics using and next generation sequencing (NGS) sequencing, we found substantial sequence variation in intergenic regions caused by the invasion of mobile genetic elements. This variation gives risecontributes to rapid mitochondrial genome evolution among closely related isolates and species, which makes it possible to design reliable intra- and inter-specific markers. Also, an extensive gene similarity network-based approach allowed us to provide strong evidence of inter-haplotype recombination in AMF, leading to a reshuffled mitochondrial genome. These findings suggest the coexistence of distinct mtDNA haplotypes in natural populations and raise questions as to whether AMF single spore cultivations artificially underestimates mitochondrial genetic diversity in natural population.. This apparent contradiction with the intra-isolate mtDNA homogeneity usually observed in these fungi, led to the investigation of mitochondrial heritability in the spore progeny resulting from crossed-cultures. Although an heteroplasmic state was observed in some daughter spores, we found that homoplasmy was the dominant state in all monosporal cultures, with an apparent bias towards one of the parental haplotypes. These results strongly support the presence of a putative mitochondrial segregation proteic machinery in AMF, whose complete set of genes were orthologous with those found in other fungi. Our findings suggest that segregation takes place either during spore formation or colony mycelium development. Finally, we performed a conventional PCR based approach with a high fidelity Taq polymerase, followed by downstream cloning and Sanger sequencing using the model organism Rhizophagus irregularis. We found in situ heteroplasmy along with substantial intra-isolate allelic variation within the mtDNA that persists in the transcriptome. Our study also suggest that genetic variation in Glomeromycota is higher than meets the eye and might be critically underestimated in most NGS based-AMF studies both in nuclei and mitochondria.