Orientador: Paulo Sérgio Perri de Carvalho / Banca: Alberto Consolaro / Banca: Luis Ronaldo Picosse / Banca: Edgard Franco Moraes Júnior / Resumo: A reabsorção óssea associada à perda dos dentes por vezes impossibilita a instalação imediata de implantes dentários. Nesta circunstância, pode ser necessária a reconstrução óssea prévia, realizada por meio de enxertos ósseos autógenos. A compreensão dos fenômenos iniciais da reparação dos enxertos é fundamental para favorecer sua consolidação clínica. Neste estudo, foram realizados enxertos ósseos autógenos em bloco ou em partículas na mandíbula de 6 cães, bilateralmente. Os leitos receptores foram preparados, os blocos foram rigidamente fixados e os enxertos em partículas foram adaptados e condensados. Três animais foram sacrificados após 7 dias e os outros 3, após 14 dias. Os espécimes foram submetidos a análise microscópica. Após 7 dias, os enxertos em bloco exibiram desvitalização, com canais vasculares vazios e interface enxerto-leito constituída por um tecido conjuntivo vascularizado e rico em fibras colágenas. As partículas, desvitalizadas, foram completamente envolvidas por tecido conjuntivo, com áreas de reabsorção osteoclástica. Aos 14 dias, os blocos já eram invadidos por canais de reabsorção, e os canais vasculares de Havers e Volkmann eram alargados e revascularizados junto ao leito. As partículas foram quase completamente reabsorvidas e o tecido conjuntivo circundante já exibia áreas de neoformação óssea. As perfurações do leito e a região adjacente ao parafuso de fixação foram sede de início de osteogênese. Os resultados mostraram que a reparação inicial dos enxertos em bloco caracteriza-se por lenta revascularização a partir do leito receptor, que requer alargamento dos canais vasculares préexistentes, enquanto as partículas são rapidamente reabsorvidas. / Abstract: Sometimes, bone resorption in association with loss of teeth makes it impossible to immediately perform dental implants. Under this circumstance, previous bone reconstruction would be necessary, through autogenous bone grafts. The understanding of the initial phenomena involved with bone grafting repair is fundamental for a clinical success. In this study, block or particulate autogenous bone grafts were placed bilaterally in mandibles of dogs. The host sites were prepared, the blocks rigidly fixated, and the particulate graft s were adapted and condensed. Three animals were sacrificed after 7 days, and the other 3, after 14 days. The samples were processed for microscopic analysis. After 7 days, the grafted blocks showed devitalization and empty vessel canals. The interface between the host site and the graft presented a vascularized connective tissue rich in collagen fibers. The grafted particles were devitalized and totally embedded in connective tissue. Areas of osteoclastic resorption were noticed in this group. At 14 days, resorption lacunae could be seen in the blocks. Harvers and Volkmann canals were elongated and revascularized at the host site. The particles had already been almost resorbed, and the surrounding connective tissue presented areas of new bone formation. The perforations of the host site and the region adjacent to the fixation screw represented areas where there was a beginning of osteogenesis. The results showed that the initial repair of block grafts was characterized by slow revascularization, starting from the host site, which required enlargement of pre-existing vascular canals. On the other hand, particulate bone grafts were rapidly resorbed and replaced by areas of forming bone. / Doutor

Orientador: Eduardo Hochuli Vieira / Banca: Leonardo Perez Faverani / Banca: Francisley Ávila Souza / Banca: Nicolas Homsi / Banca: Hernando Valentim da Rocha Junior / Resumo: Objetivo: Avaliar a prevenção da OMIM em ratos em risco de desenvolvimento de osteonecrose na região em que foi realizada a exodontia utilizando apenas coágulo, enxerto de osso xenógeno, e enxerto de β- trifosfato de cálcio (β-TCP). Métodos: Foram utilizados 20 Ratos Wistar machos com 3 meses de idade, pesando 350 - 450g, submetidos a indução da Osteonecrose por uso de ácido zoledrônico (0,04mg/kg) durante 05 semanas. Na 7a semana foi realizado a cirurgia de exodontia dos molares superiores direito e preenchimento do alvéolo com coágulo (controle), enxerto xenógeno (Grupo 2), e β- trifosfato de cálcio (β-TCP) (Grupo 3). A eutanásia foi realizada na 15a semana. Foram realizadas análises morfométrica, estereológica, e imunohistoquímica, onde aplicou-se os testes estatísticos ANOVA e Tukey, considerando-se um nível de significância de 5%. Resultados: Durante a análise macroscópica não houve manifestação clínica da OMIM nos grupos experimentais. A análise quantitativa demonstrou que o Grupo 3 (BTCP) apresentou menor formação de lacunas ósseas e maior formação de tecido ósseo sadio quando comparado com os grupos 1 e 2 (p<0,05). Não houve diferença estatística entre os grupos durante análise de formação de tecido epitelial. Na análise imunohistoquimica, o grupo experimental apresentou maior atividade de remodelação óssea. Conclusão: Os resultados deste trabalho demonstraram que os grupos experimentais apresentaram maior atividade de remodelação óssea, e ausência de manifestação clí... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Objective: To evaluate the bone formation in rats with osteonecrosis in the region where the extraction was performed using only clot, xenogen bone graft, and calcium β-triphosphate (β-TCP) graft. METHODS: Twenty male Wistar rats weighing 350-450 g were submitted to osteonecrosis induction for the use of zoledronic acid (0.2 mg / kg) for 5 weeks. In the 7th week, the maxillary right molar extraction and filling of the alveolus with clot (control), xenogene graft (Group 2) and calcium β-triphosphate (β-TCP) were performed (Group 3). Euthanasia was performed in the 15th week. Morphometric and stereological analyzes were performed. The ANOVA and Tukey statistical tests were used, considering a level of significance of 5%. Results: During the macroscopic analysis there was no clinical manifestation of the OMIM in the experimental groups. Quantitative analysis showed that Group 3 (BTCP) presented less bone formation and greater formation of healthy bone tissue when compared to groups 1 and 2 (p <0.05). There was no statistical difference between groups during analysis of epithelial tissue formation. In the immunohistochemical analysis no difference was found in the bone remodeling process between the groups. Conclusion: The results of this work were favorable for the use of BTCP for guided bone regeneration and prevention of the clinical manifestation of OMIM in rats. However, more studies need to be performed until the development of a protocol to prevent this complication / Doutor

O transplante renal representa atualmente a melhor opção terapêutica e de reabilitação para o paciente com insuficiência renal crônica terminal. As rejeições são as principais causas de perda dos rins transplantados e, entre essas, as rejeições agudas são as que apresentam maior relevância clínica. Desta maneira, a monitorização do transplante renal com vistas ao diagnóstico precoce da rejeição e seu rápido tratamento é de grande relevância no manejo adequado desses pacientes. Como a rejeição celular aguda é mediada predominantemente por linfócitos T e, visto que, a enzima adenosina deaminase (ADA) é encontrada principalmente, a nível de sangue periférico, em linfócitos, objetivou-se com esse estudo, verificar a possível associação entre atividade sérica da ADA e a rejeição aguda do enxerto renal. Buscou-se, também, determinar a sua utilidade como método diagnóstico de rejeição celular aguda. Foram acompanhados até 1 mês de internação 35 pacientes transplantados renais. Dosagens da atividade de ADA sérica foram feitas cinco vezes por semana e sempre que houvesse suspeita clínica de rejeição aguda. O diagnóstico de rejeição aguda foi estabelecido por 2 nefrologistas, aos quais foram omitidos os resultados dos níveis séricos ADA. Estes médicos tinham todas informações clínicas e laboratoriais, incluindo valores séricos de creatinina e ciclosporina, cintilografias, ecografias, citologia aspirativa, punção biópsia renal quando esta era realizada e resposta aos diferentes tratamentos imunossupressores usados. A análise estatística foi feita utilizando-se testes de Mann-Whitney e Qui-quadrado. O nível p menor do que 0,05 foi considerado como significativo. A mediana dos episódios de rejeição celular aguda ficou entre o sexto e sétimo dia pós-transplante, havendo diferença estatisticamente significativa nos valores de ADA no sexto dia de seguimento entre os pacientes com rejeição (60.16), em relação aos que não tiveram rejeição celular aguda (24,55) (p=0,021 MW). Para se avaliar a eficácia da atividade sérica de ADA com método diagnóstico de rejeição aguda, empregou-se pontos de corte de valores de ADA>35,>40,>45, >50 e > que 30% dos valores do período pré-rejeição. Houve associação estatisticamente significativa entre ADA>30% e rejeição celular aguda (p=0.035 MW). Verificou-se, também, aumento significativos da atividade sérica de ADA em pacientes anti-HCV positivos e com necrose tubular aguda, sem interferência sobre os resultados dos episódios de rejeição celular aguda. Usando esses pontos de corte como parâmetros de diagnóstico para rejeição aguda observou-se: sensibilidade = 55,5%, especificidade = 82,3%, valor preditivo positivo = 76,9%, valor preditivo negativo = 63,6% e acurácia = 69,0%. Conclui-se que há um aumento significativo da atividade sérica da ADA durante os episódios de rejeição aguda de enxertos renais humanos, encontrando-se associação significativa entre o aumento de 30% dos valores de ADA pré-rejeição e o diagnóstico de rejeição celular aguda.

As vacinas de DNA têm sido utilizadas para a indução de imunidade contra antígenos virais e bacterianos. A aplicação de modelos experimentais tem sido explorada visando a indução de tolerância imunológica através da expressão de genes cujos produtos podem modular o sistema imune para um estado de não responsividade. A terapia gênica oferece a possibilidade de manipulação do sistema imune do receptor, através de um sistema de administração de genes específicos sob condições pré-definidas. Sua eficácia depende dos níveis de expressão e da natureza do antígeno, da via de administração assim como de sua distribuição nos tecidos (a qual às vezes depende do promotor utilizado). Porém, sua aplicação clínica é limitada em parte devido aos baixos níveis de expressão obtidos in vivo. A VP22 é uma proteína do tegumento do vírus Herpes simples tipo 1, que tem a propriedade de fazer tráfego intercelular. Estudos recentes têm demonstrado a alta eficiência desta molécula no transporte de proteínas heterólogas como VP22-p53, VP22-β galactosidase e VP22-proteína verde fluorescente. Para a indução de tolerância imunológica, tem sido demonstrado que a persistência do antígeno, pelo menos por algum período, é muito importante. Moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) têm sido utilizadas para induzir tolerância a nível central ou periférico, em diferentes protocolos. Dentre estas, as moléculas da classe I do camundongo, Kb, têm sido utilizadas com sucesso. O objetivo desse trabalho foi de construir duas vacinas recombinantes: pVP22::Kb e pCIneo::Kb. A primeira contém dois genes clonados na mesma pauta de leitura: a cadeia pesada de classe I Kb e VP22. O cDNA que codifica para o Kb foi obtido pela extração de RNA total de baço de um camundongo C57BL/6 (haplótipo H-2b) seguido de transcrição reversa. Este produto foi amplificado pela reação em cadeia da polimerase. Esta molécula também foi obtida pela amplificação direta do gene Kb previamente clonado no sítio EcoR I do plasmídeo pBluescriptIISK (Stratagene®). Ambos os produtos de PCR foram subclonados com extremidades cegas no plasmídeo pCRBluntII (Invitrogen®). Foram obtidos dezenove plasmídeos recombinantes, denominados pCRBluntII::Kb, e um deles foi escolhido e digerido com as enzimas de restrição Spe I e Xba I e defosforilado com a enzima fosfatase alcalina (CIAP). O fragmento digerido foi clonado nos plasmídeos pVP22-myc/His (Invitrogen®) e pCIneo (Promega®) previamente digeridos com a enzima Xba I. Os novos plasmídeos pVP22::Kb e pCIneo::Kb foram utilizados para transfectar a linhagem celular eucariótica CHO. A expressão do mRNA para o Kb foi confirmada pela transcrição reversa e PCR e a expressão da proteína por imunofluorescência e citometria de fluxo.

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A ciclosporina (CsA), a despeito da recente introdução de novas drogas imunossupressoras, permanece como a pedra angular da terapia antirejeição do receptor de enxerto renal. No Brasil, 30% dos pacientes em lista de espera para transplante renal são anti-VHC+, e observações prévias do nosso grupo sugerem uma farmacocinética da CsA alterada nesses pacientes. Com o objetivo de avaliar esta hipótese, dois estudos paralelos foram feitos: um estudo pré-transplante com 22 pacientes em hemodiálise aguardando transplante, 11 anti-VHC+ (ELISA3), 7 dos quais PCR+, e 11 anti-VHC-, que receberam uma dose única oral de 8 mg/kg de ciclosporina em microemulsão (CsA-ME); e um estudo no 15º dia pós-transplante, com 24 receptores consecutivos, 10 ELISA+ (6 PCR+) e 14 ELISA-, que receberam a dose oral de CsA em microemulsão indicada pela equipe assistente. Os parâmetros farmacocinéticos foram calculados a partir de 13 dosagens (tempo 0-12 h pós-dose) feitas por fluorimetria polarizada com anticorpos monoclonais (Abbot Laboratories, Illinois). Aqueles HbsAg+, com transaminases elevadas, diabéticos ou usando drogas que tivessem interação farmacocinética com a CsA foram excluídos. A análise estatística foi feita pelo teste t e Mann-Whitney. As variáveis demográficas com conhecida influência sobre a farmacocinética da CsA foram similares nos dois grupos. No estudo pré-transplante, , a Cmáx foi 40% maior, a ASC0-12 42% maior (p<0,05) e a Cmin 56% maior entre os pacientes ELISA+ comparados aos ELISA-. Essas diferenças foram acentuadas comparando o subgrupo PCR+ com os pacientes VHC- (Cmáx 58% maior -p=0,05-, ASC0-12 69% maior -p<0,01-, e Cmin 91% maior -p<0,01-). No estudo pós-transplante a Cmáx, a ASC0-12/dose e a Cmin não diferiram estatisticamente entre os grupo anti-VHC+ e anti-VHC- (21%, 23% e 2% maior, respectivamente). Ao avaliar apenas os pacientes PCR+, a Cmáx foi 50% maior (p<0,01) e a ASC0-12/dose 45% maior (p<0,05) do que o grupo ELISA-. O nível de vale, acompanhado pelos 12 meses pós-transplante, foi sempre superior entre os pacientes ELISA+, a despeito de doses menores de CsA, atingindo significância aos seis meses. Concluímos que os pacientes anti-VHC+, principalmente aqueles com viremia (PCR+), têm a farmacocinética da CsA microemulsão alterada, com níveis de pico e ASC0-12/dose maiores que os controles anti-VHC-. / Cyclosporine (CsA), despite recent introduction of new immunosuppressive drugs, still remains the cornerstone of kidney transplant recipient immunosuppression. In Brazil, 30% of patients waiting for kidney transplantation are anti-HCV+, and previous observations of our group suggest an altered CsA pharmacokinetics in these patients. In order to evaluate that, two parallel studies were done: a pre-transplant study with 22 dialysis patients waiting for transplantation, 11 anti-HCV+ (ELISA third generation), 7 of them PCR+, and 11 anti-HCV-, which received a 8 mg/kg single oral dose of CsA microemulsion (CsAME); and a 15th day post-transplant study with 24 consecutive recipients, 10 ELISA+ (6 PCR+) and 14 ELISA-, which received the CsA microemulsion oral dose indicated by the assistants. Pharmacokinetics parameters were calculated from 13 dosages (time 0-12 hours post-dose) performed by fluorescence polarization immunoassay with monoclonal antibodies (Abbot Laboratories, Illinois). Those patients HbsAg+, with elevated transaminases, diabetics or using drugs interacting with CsA pharmacokinetics were excluded. Statistical analysis was done by t test and Mann-Whitney. Demographic variables with already known CsA pharmacokinetics influences were similar in both groups. In the pre-transplant study, Cmax was 40% higher, AUC0-12 42% higher (p< 0,05) and Cmin 56% higher for HCV+ patients in comparison to HCV- ones. These differences were accentuated comparing PCR+ with HCV- patients (Cmax 58% higher - p= 0,05 -, AUC0-12 69% higher - p< 0,01 -, and Cmin 91% higher- p< 0,01). In the post-transplant study Cmax was 21% higher, AUC0-12/dose 23% higher and Cmin 2% higher for HCV+ patients. When evaluating only PCR+ patients, Cmax was 50% higher (p< 0,01) and AUC0-12/dose 45% higher (p< 0,05) than ELISA- group. Trough levels, followed for 12 months PO, remained higher in HCV+ patients, despite small doses of CsA. We conclude that anti-HCV+ patients, mainly those with viremia (PCR+), have altered CsA microemulsion pharmacokinetics, with higher peak levels and drug exposure than control patients anti-VHC-.

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Introdução: O modelo MELD (Model for End-stage Liver Disease) é um preditor acurado de mortalidade em pacientes em lista de espera para transplante hepático. Além dele há outros escores: o Child-Turcotte-Pugh (CTP), amplamente avaliado, e o EMERALD, um escore novo e ainda não completamente validado. A implementação do MELD na alocação de fígados para transplante no Brasil baseou-se em estudos realizados em países desenvolvidos, pois não há dados brasileiros descrevendo o desempenho do MELD para predizer a sobrevida póstransplante hepático. Objetivos: Avaliar o desempenho do escore MELD em predizer mortalidade três e seis meses após inclusão em lista de espera para o primeiro transplante de fígado, em uma coorte de pacientes com doenças hepáticas crônicas, e comparar sua performance com a dos escores CTP e EMERALD. Determinar a acurácia do MELD pré-transplante para predizer a sobrevida pós-transplante hepático e identificar características associadas com a sobrevida de pacientes. Introdução: O modelo MELD (Model for End-stage Liver Disease) é um preditor acurado de mortalidade em pacientes em lista de espera para transplante hepático. Além dele há outros escores: o Child-Turcotte-Pugh (CTP), amplamente avaliado, e o EMERALD, um escore novo e ainda não completamente validado. A implementação do MELD na alocação de fígados para transplante no Brasil baseou-se em estudos realizados em países desenvolvidos, pois não há dados brasileiros descrevendo o desempenho do MELD para predizer a sobrevida póstransplante hepático. Objetivos: Avaliar o desempenho do escore MELD em predizer mortalidade três e seis meses após inclusão em lista de espera para o primeiro transplante de fígado, em uma coorte de pacientes com doenças hepáticas crônicas, e comparar sua performance com a dos escores CTP e EMERALD. Determinar a acurácia do MELD pré-transplante para predizer a sobrevida pós-transplante hepático e identificar características associadas com a sobrevida de pacientes.Resultados: Os resultados do primeiro estudo de coorte referem-se a 271 pacientes em lista de transplante hepático. Na inclusão em lista, a média dos escores MELD e EMERALD foi 14,8 e 26,6, respectivamente. Aproximadamente61% dos pacientes foram classificados como CTP B. Durante o acompanhamento aos três e seis meses após a inclusão em lista, as porcentagens de pacientes que faleceram, foram transplantados ou permaneceram em lista foram 11,8%, 9,2% e 79,0% e 19,2%, 17,7% e 63,1%, respectivamente. A mortalidade em três meses foi igualmente prevista pelos escores MELD, EMERALD e CTP (estatística-c 0,79, 0,74 e 0,70, respectivamente). Para a mortalidade em seis meses, as curvas ROC e a área sob a curva foram similares. O segundo estudo incluiu 436 pacientes submetidos a transplante hepático que foram acompanhados por aproximadamente 14 anos ou até o óbito. Na coorte pós-transplante hepático a maioria dos receptores e doadores eram homens, com média de idade de 51,6 e 38,5 anos, respectivamente. Os valores da estatística-c para mortalidade em três meses foram 0,60 e 0,61 para o MELD e o CTP, respectivamente. O método KM mostrou que a sobrevida em três, seis e 12 meses foi menor em pacientes com MELD O 21 ou CTP C. Análise multivariada revelou que idade do receptor O 65 anos, MELD O 21, CTP categoria C, bilirrubina O 7 mg/dL, creatinina O 1,5 mg/dL, carcinoma hepatocelular e doador com cor da pele não-branca foram preditores de mortalidade. Conclusões: Mortalidade três e seis meses após inclusão em lista de espera para transplante foi predita pelos escores MELD, CTP e EMERALD. Contudo, o escore MELD apresenta vantagens pela menor variabilidade na determinação de seus componentes, comparativamente ao CTP, e o escore EMERALD necessita de avaliação adicional. Em relação à sobrevida pós-transplante, doença hepática grave prétransplante, pacientes com idade O 65 anos, portadores de carcinoma hepatocelular e doador com cor da pele não-branca associaram-se com pior prognóstico. / Introduction: The Model for End-stage Liver Disease (MELD) is an accurate predictor of mortality in patients on the waiting list for liver transplantation. Other scores are also available: the Child Turcotte Pugh (CTP), a widely evaluated score, and the EMERALD, a new score not yet fully validated. The MELD is used to allocate livers for transplants in Brazil following studies conducted in developed countries because no Brazilian data are available to describe the performance of MELD in predicting survival after liver transplantation. Objectives: To evaluate the performance of the MELD score to predict mortality three and six months after inclusion in the waiting list for a first liver transplant in a cohort of patients with end-stage liver disease, and to compare its performance with the performances of the CTP and EMERALD scores. To determine the accuracy of pre-transplant MELD scores to predict survival after liver transplant and to identify characteristics associated with patient survival. Method: In this cohort study, patients on the waiting list were followed up for a mean 20 months, and the predictive performance of scores of severity of underlying liver disease was evaluated: MELD, CPT and EMERALD. ROC curves and c-statistics were used to establish score accuracy to predict mortality after inclusion in the transplant waiting list. The second cohort consisted only of patients that underwent liver transplant, and the study analyzed the patient characteristics associated with long-term survival. The Kaplan-Meier (KM) method was used to analyze survival along time according to MELD and CTP scores. The Cox proportional hazards regression model was used to estimate risk of death while on the waiting list and to evaluate the association between risk factors for mortality after liver transplant. Results: The first cohort consisted of 271 patients on the liver transplant waiting list. At the time of inclusion in the list, mean MELD and EMERALD scores were 14.8 and 26.6. About 61% of the patients were classified as CTP B. During follow-up after inclusion in the list, the percentages of patients that died, underwent transplant, or remained on the list were 11.8%, 9.2% and 79.0% at three months and 19.2%, 17.7% and 63.1% at six months. Mortality at threemonths was equally predicted by MELD, EMERALD and CTP scores (c-statistics: 0.79, 0.74 and 0.70). For mortality at six months, ROC curves and areas under the curve were similar. The second cohort study evaluated 436 patients that underwent liver transplant and were followed up for about 14 years or until death. In this cohort, most recipients and donors were men, and their mean age was 51.6 and 38.5 years. C-statistics for mortality at three months was 0.60 and 0.61 for MELD and CTP. The KM method showed that survival at three, six and 12 months was lower in patients with MELD O 21 or CTP C. Multivariate analysis showed that recipient age O 65 years, MELD O 21, CTP C, bilirubin O 7 mg/dL, creatinine O 1.5 mg/dL, hepatocellular carcinoma and non-white donor were predictors of mortality. Conclusions: Mortality at three and six months after inclusion in the transplant waiting list was predicted by the MELD, EMERALD and CTP scores. However, the MELD score had a lower variability in the determination of its components than CTP, and the EMERALD score should be further evaluated. The analysis of survival after transplant showed that severity of underlying liver disease, patient age O 65 years, hepatocellular carcinoma, and non-white donor were factors associated with a poor prognosis.