As proteínas são consideradas importantes alvos para os oxidantes, devido à abundância em sistemas biológicos e às altas constantes de reações com estas espécies. Adicionalmente, têmse demonstrado que o triptofano (W) é um aminoácido extremamente susceptível a oxidação, inclusive pelo oxigênio singlete (1O2). A reação do W com o 1O2 tem despertado o interesse de diversos pesquisadores. Recentemente, esta reação tem atraído mais atenção, uma vez que produtos de oxidação do W tais como N-formilquinurenina (FMK) e quinurenina (kn) têm sido associados com algumas condições patológicas, tais como o desenvolvimento de catarata e a formação de agregados covalentes da superóxido dismutase envolvidos na esclerose lateral amiotrófica. Entretanto, há poucos trabalhos enfocando detalhadamente as reações, com estudos de estabilidade, identificação de subprodutos e propostas mecanísticas. Desta forma, pretendemos com este trabalho contribuir no esclarecimento do mecanismo de oxidação do triptofano pelo 1O2, através da análise e caracterização de produtos de oxidação gerados. Com este intuito, dois hidroperóxidos de triptofano isômeros (WOOH cis e trans, em relação ao grupamento carboxila) foram completamente caracterizados por análises de HPLC/espectrometria de massa e RMN como os principais produtos de oxidação do W pelo 1O2. Estes hidroperóxidos demonstraram ser relativamente estáveis às temperaturas ambiente e fisiológica, decompondo lentamente para os alcoóis correspondentes. O aumento do pH e/ou o aquecimento das soluções contendo os WOOH leva a decomposição quimiluminescente dos WOOH à FMK. Utilizando hidroperóxidos isotopicamente marcados com [18O] (W18O18OH) foi possível confirmar que a FMK formada durante esta decomposição era marcada com dois átomos de oxigênio. Este resultado demonstra que os dois átomos da FMK são derivados do grupamento hidroperóxido. Em adição, estas reações são quimiluminescentes, sugerindo o envolvimento de um intermediário dioxetano. Este mecanismo foi confirmado uma vez que o espectro de quimiluminescência da decomposição dos WOOH pode ser sobreposto ao espectro de fluorescência da FMK, inequivocamente identificado a FMK como a espécie emissora. Dioxindoilalaninas diastereoisoméricas também foram caracterizadas como produtos de oxidação do triptofano pelo 102; uma possível via radicalar foi excluída. Em suma, este estudo contribuiu na elucidação das bases químicas envolvidas na oxidação do triptofano por 102, através da caracterização dos produtos formados e da investigação detalhada dos mecanismos de decomposição destes produtos. / Proteins have been considered important targets for reactive oxygen species. Indeed, tryptophan (W) has been shown to be a highly susceptible amino acid to many oxidizing agents, including singlet molecular oxygen (1O2). The reaction of 1O2 with W has long been a matter of concern, and has recently attracted considerably more attention because W-derived oxidation products such as N-formylkynurenine (FMK) and kynurenine (kn) have been associated with some pathological conditions such as the development of cataracts and the formation of covalent aggregates of superoxide dismutase, which has been implicated in amyotrophic lateral sclerosis. Despite the intense interest in the mechanism of W oxidation, there are a lot of gaps that remains to be elucidated. In this context, the current study was undertaken to investigate the chemical basis involved in W oxidation by 1O2. We are concerned about the chemistry of the initially formed hydroperoxides, their stability, further reactions and the mechanism leading to FMK conversion. With this purpose, two cis and trans tryptophan hydroperoxide (WOOH) isomers were completely characterized by HPLC/mass spectrometry and NMR analyses as the major W-oxidation photoproducts. Also, they were shown to be relatively stable at ambient and physiological temperatures, leading to a slow decomposition to the corresponding alcohols. Increasing the pH or heating the solutions gives rise to a luminescent decomposition of the WOOH to FMK. Using 18O-labeled hydroperoxides (W18O18OH), it was possible to confirm the formation of a two-oxygen-labeled FMK molecule derived from W18O18OH decomposition. This result shows that both oxygen atoms in FMK are derived from the hydroperoxide group. In addition, these reactions are chemiluminescent (CL), indicating a dioxetane cleavage pathway. This mechanism was confirmed since the CL spectrum of the WOOH decomposition matched the FMK fluorescence spectrum, unequivocally identifying FMK as the emitting species. Diastereoisomeric dioxindoyalanine were also characterized as oxidation products derived from the reaction of W with 1O2. The involvement of radicals in this reaction was excluded. In summary, this work offers further insights into the chemistry involved in W-oxidation, through the characterization of photoproducts and the detailed investigation about the decomposition mechanism of these products.

Espécies carbonílicas tripletes formadas quimicamente no escuro, por exemplo, durante a peroxidação de lipídios, têm reatividade química análoga à de radicais alcoxilas. Aventou-se que tais espécies possam estar implicadas na fisiopatologia de doenças degenerativas (\"estresse carbonílico\"). A pesquisa dos efeitos de espécies tripletes sobre algumas biomoléculas e consequentes respostas biológicas, propostas e pesquisadas no período 1970 - 1990 (hipótese de \"fotoquímica sem luz\" dos Profs. G. Cilento, IQUSP, e Emil H. White, Johns Hopkins University), encontrou empecilhos instrumentais e relativamente poucas propostas foram confirmadas. Com o uso de técnicas de alta resolução, tais como EPR, HPLC e MS, este trabalho teve como objetivo analisar intermediários e produtos de tais processos e estudar mecanismos de reação de acetona triplete, produzida quimicamente pela decomposição térmica de 3,3,4,4-tetrametildioxetano (TMD) ou, enzimaticamente, pela oxidação aeróbica de isobutanal (IBAL), catalisada por peroxidase de raiz forte (HRP), na presença de aminoácidos e proteínas. Este trabalho demonstra a formação de um radical acetila, presumidamente formado da clivagem α de acetona triplete, e um radical terciário centrado em carbono, formado pela abstração de hidrogênio do IBAL. Resultados de espectrometria de massas demonstraram a formação de três diferentes adutos entre o radical terciário de IBAL, com L-Trp. Aventou-se que um dos produtos era resultante de alteração no nitrogênio e os outros no carbono 3, ambos no anel indólico. Observou-se também a formação de produto correspondente ao radical hidroxipropionil com L-Trp. Também se observaram dois produtos de L-Trp típicos de sua oxidação por oxigênio singlete, a formilquinurenina, e um aduto de função álcool. A formação de base de Schiff entre o L-Trp estudado e o IBAL também é apresentada. A formação de oxigênio singlete foi evidenciada indiretamente via EPR utilizando o spin trap TEMP e através de um captador de adição-9,10 (tipo Diels-Alder) em derivado de antraceno. Foram realizados, também, experimentos com precursores de melanina e demonstrou-se a formação de espécies excitadas do ácido 5,6-dihidroxi-indol-2-carboxílico (DHICA) que poderiam explicar a formação de produtos de DNA tipicamente resultantes de reação fotoquímica, mas na ausência de luz. Tais resultados corroboram a reação de espécies tripletes com biomoléculas, possibilitando a compreensão de número significativo de eventos biológicos conhecidos, mas teoricamente \"proibidos\" de ocorrer no estado fundamental, em tecidos não expostos à luz / Electronically excited triplet carbonyl species formed as products of some biochemical reactions, such as lipid peroxidation, behave similarly as alcoxyl radicals. It has long been hypothesized that such excited species could have a role in some diseases (\"carbonyl stress\"). Research of chemical lesions of triplet carbonyls over biomolecules and their biological response took place principally from 1970 to 1990 (the \"photochemistry without light\" hypothesis proposed by Profs. G. Cilento, IQUSP, and Emil H. White, Johns Hopkins University), but it suffered from the lack of required instrumentation, and just few cases of photo(bio)chemistry without light were confirmed. The aim of this work, using high resolution techniques (EPR, HPLC, and MS), is to analyze the reaction products of excited triplet acetone with aminoacid and protein targets. Triplet acetone was produced from the thermal decomposition of 3,3,4,4-tetramethyldioxetane (TMD) or from the aerobic oxidation of isobutanal (IBAL) catalyzed by horseradish peroxidase (HRP). We revealed the generation of acetyl radical, putatively originated from α-cleavage of triplet acetone, and a carbon-centered tertiary radical, proposed as an IBAL radical formed by hydrogen abstraction from IBAL. Mass spectrometry showed production of three adducts from the reaction of IBAL radical with L-Trp, one of them at the nitrogen 1 and the other two at carbon 3 from the amino acid indole ring. Two adducts with m/z correspondent to the reaction between L-Trp (at carbon 3) and a hydroxypropionyl radical, and two products typically formed from singlet oxygen (formylkynurenine and an alcohol L-Trp adduct) were also observed. A Schiff base between L-Trp and IBAL was also observed. Singlet oxygen production from triplet-triplet energy transfer from excited acetone to ground state molecular oxygen was indirectly showed by EPR spin trapping with TEMP, and by MS using the anthracene derivative EAS to trap (9,10-cycloaddition) of 18O2 (1Δg). Other data reported here include the demonstration of excited species formed when DHICA, a melanin precursor, was oxidized. These results might explain the generation of DNA photochemical products (thymine dimers) in the absence of light. Altogether, we collect strong and significant evidence in this thesis that corroborate the reactivity of triplet excited species with a couple of biomolecules, providing insights over some reportedly known molecular events that are theoretically forbidden to occur in the ground state but happen in tissues non-exposed to light

A artrite reumatoide (AR) é a artropatia inflamatória mais prevalente no mundo, de etiologia multifatorial e fenótipos heterogêneos. Busca-se, além de definir fatores etiológicos, compreender as interações entre mecanismos envolvidos na fisiopatologia da AR. Entre estes, fatores genéticos, tanto genes do antígeno leucocitário humano (HLA), especialmente a presença do epítopo compartilhado (Shared epitope - SE) do HLA-DRB1, como genes não-HLA, e fatores ambientais e epigenéticos têm sido associados à doença. Assim, a identificação de novos fatores relacionados à etiopatogenia da AR e suas possíveis associações com características clínicas motivaram esse estudo. Um estudo caso-controle foi desenhado e dividido em duas etapas. Para a primeira etapa, foi obtido plasma de 18 indivíduos de AR e 18 voluntários saudáveis de Ribeirão Preto, no qual foram identificados quinurenina (Kyn), Trp, serotonina (5-HT) e taxa Kyn/Trp (KTR) por cromatografia líquida de ultra-eficiência (CLUE) acoplada a espectrômetro de massas sequencial (CLUE-DAD-EM/EM). Na segunda etapa, de estudo genético, uma coorte formada por 328 indivíduos com AR e por 234 voluntários saudáveis de Ribeirão Preto e de Porto Alegre foi avaliada quanto ao polimorfismo do gene da enzima indoleamine 2,3-dioxigenase 1 (IDO1). Foram obtidos dados clínicos e epidemiológicos e coletadas amostras de sangue periférico para extração de DNA pelo método de salting-out. Em seguida, tipificação HLA e reação em cadeia de polimerase (RCP) das variantes da IDO1, rs7820268, rs3739319, rs61753677, rs35059413, rs35099072 e rs9298586, foram realizadas. A positividade para fator reumatoide (FR) em indivíduos com AR foi associada ao tabagismo (p= 0.0002) e ao SE (p < 0.0001), e para anticorpo antipeptídeo citrulinado cíclico (anti-CCP), associado ao SE (p < 0.0001). Quando combinadas a presença de SE e a de tabagismo, houve associação estatisticamente significante para FR (p < 0.001) e para anti-CCP (p = 0.03). Foram observadas menores concentrações plasmáticas de 5-HT em indivíduos com AR quando comparados a voluntários saudáveis (p =0.006), mas sem diferença para níveis de Trp, Kyn e KTR. Para estes, diferenças apareceram quando avaliados subgrupos. Em indivíduos com AR sem tratamento com drogas modificadoras do curso da doença (DMCDs), os valores plasmáticos de Trp foram menores quando comparados aos em terapia (p = 0.0016), enquanto em pacientes com AR tabagistas os valores de Kyn e KTR foram menores que em pacientes não tabagistas (p = 0.039 e p = 0.032, respectivamente). Não foram identificadas associações estatisticamente significantes entre as variantes genéticas estudadas e o risco de desenvolver AR, nem entre os polimorfismos da IDO1 estudados e a concentração plasmática de Trp, Kyn e 5-HT e KTR. Este estudo não identificou relação das variantes do gene da IDO1 com suscetibilidade para AR. Assim, novos estudos são necessários para que possam ser explicadas as associações encontradas na via das Kyns e na 5-HT em etiopatogenia da AR. / Rheumatoid arthritis (RA) is the most prevalent inflammatory arthropathy in the world, with multifactorial etiology and heterogeneous phenotypes. Besides defining etiological factors, it is sought to understand the interactions between mechanisms in RA pathophysiology. About these, genetic factors, both human leucocity antigen (HLA) genes, especially the HLA-DRB1 Shared epitope (SE) presence, and not-HLA genes, and environmental and epigenetics factors have been associated with the disease. Therefore, the aim of this study was to identify new possible associations between RA clinical features and its etiopathogenesis. A case-control study was designed and it was divides in two phases. The first phase, it was obtained plasma of 18 RA patients and 18 healthy controls from Ribeirão Preto to identify the kynurenine (Kyn), Trp and serotonin (5-HT) concentrations and Kyn/Trp ratio (KTR) by ultra-high performance liquid chromatography coupled to sequential mass spectrometer. The second phase was a genetic study that evaluated a cohort of 328 RA patients and 234 healthy volunteers from Ribeirão Preto and Porto Alegre about the indoleamine 2,3-dioxygenase 1 (IDO1) gene polymorphism. Clinical and epidemiological data were obtained and peripheral blood samples were collected to DNA extraction by salting-out method. Then, HLA typification and polymerase chain reaction to identify IDO1 genetic variants rs7820268, rs3739319, rs61753677, rs35059413, rs35099072 and rs9298586 were performed. Rheumatoid factor (RF) positivity was associated to smoking (p = 0.0002) and SE (p < 0.0001), and cyclic citrullinated peptide autoantibodies (anti-CCP) positivity was associated to SE (p < 0.0001). When SE presence and smoking were combined, there was statistically significant association to RF (p < 0.001) and anti-CCP (p = 0.03). We observed lower plasma 5-HT concentrations in RA patients than in healthy volunteers (p = 0.006), but no significant difference to Trp, Kyn and KTR levels. For these, differences were observed when subgroups were evaluated. In RA patients not using disease modifying antirheumatic drugs (DMARDs) the plasma Trp levels were lower than RApatients using DMARDs, while the plasma Kyn concentrations and KTR in smokers RA patients were lower than nonsmokers RA patients (p = 0.039 and p = 0.032 respectively). We did not indetify statistically significant associations neither between studied genetic variants and risk to develop RA nor between IDO1 polymorphisms and plasma Trp, Kyn, 5HT concentrations and KTR. This study did not identify relation between IDO1 genetic variants with susceptibility to RA. Therefore, new studies are necessary to explain the searched associations between Kyns pathway and 5-HT in RA etiopathogenenesis.

No câncer, o aumento da expressão das enzimas indolamina 2,3-dioxigenase 1 (IDO1) e triptofano 2,3-dioxigenase (TDO), que convertem o triptofano (Trp) em quinurenina (QUIN), tem sido associado ao mecanismo de imuno escape tumoral e inibidores destas enzimas têm sido considerados como imunoadjuvantes na terapia antitumoral. O mais conhecido deles é o 1-metil-triptofano (1-MT), um inibidor competitivo da IDO e alvo de estudos clínicos. O 1-MT é encontrado nas formas enantioméricas D- e L- e embora o enantiômero 1-L-MT seja mais eficiente na inibição da IDO1 (a isoforma mais ativa em tumores), é o 1-D-MT o enantiômero mais eficiente na redução experimental de tumores. Esse dado sugere que o 1-MT pode ter ações adicionais à inibição da IDO. Neste estudo avaliamos os efeitos diretos dos estereoisomeros, 1-D-MT, 1-L-MT, 1-DL-MT, sobre melanomas humanos e também do composto 680C91 (um inibidor de TDO). Proliferação, migração e invasão são os ensaios usuais in vitro para avaliar como um determinado composto afetaria a progressão tumoral. Observamos que todos os compostos testados possuem algum efeito direto sobre pelo menos um desses parâmetros, sendo que esse efeito varia de acordo com a linhagem. Logo, todos eles possuem ação direta sobre a célula tumoral que deve contribuir com a atividade antineoplásica. Também analisamos os efeitos destes compostos sobre a ação tumoricida de células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC). Em co-culturas, observamos que o 1-MT foi capaz de potencializar a atividade tumoricida de PBMC\'s e levou à diminuição da produção de IFN-&#947; e TNF-&#945; e aumento de IL-10. Essas alterações não cursam com a inibição da produção de QUIN, o que nos faz pensar que esta ação de 1-MT sobre IFN-&#947; ocorre independente da enzima IDO e que parte dos efeitos antitumorais da 1-MT seja consequência de sua ação sobre a liberação destas citocinas. 1-MT também levou a modificações na concentração de outros metabólitos do Trp. Por fim, a co-cultura por si só aumentou o consumo de ácido xanturênico (XA) e aumentou a produção de ácido quinurênico (KA). Esse resultado parece significativo para a imunologia de tumores dado os efeitos biológicos destes compostos. / In cancer, the increased expression of the enzymes indolamine 2,3-dioxygenase 1 (IDO1) and tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO), that convert tryptophan (Trp) to kynurenine (KYN), has been associated with the mechanism of immune escape of tumoral cells and inhibitors of these enzymes have been considered as immuno-adjuvants in antitumor therapy. The most known is the 1-methyl-tryptophan (1-MT), a competitive inhibitor of IDO and a target in clinical trials. 1-MT is found in the enantiomeric forms D- and L- and although 1-L-MT is more efficient to inhibit IDO1 (the isoform more active in tumors), 1-D-MT is more efficient in experimental models. This fact suggests that 1-MT may have additional actions beyond IDO inhibition. In this study, we evaluated the direct effects of 1-D-MT, 1-L-MT and 1-DL-MT on human melanomas. We also tested the effects of the compound 680C91 (an inhibitor of TDO). Proliferation, migration and invasion are the usual in vitro tests to evaluate how a specific compound affects tumor progression. We observed that all of the tested compounds have some direct effect on at least one of these parameters depending on the cell lineage. Therefore, direct effects on proliferation, migration and invasion must compose the antineoplastic activity of these compounds. In co-cultures, we observed that 1-MT was able to potentiate the tumoricidal activity of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and led to a decreased production of IFN-&#947; and TNF-&#945;, and an increase in IL-10. These changes were not linked with the inhibition of KYN production, and led us to consider that the effect of 1-MT on cytokine production occurs independently of the enzyme IDO and is part of its antitumor effects. 1-MT also led to changes in the concentration of other Trp metabolites. Finally, the co-culture by itself led to an increased consumption of xanthurenic acid (XA) and increased production of kynurenic acid (KA). This result seems significant to the immunology of tumors given the biological effects of these compounds.

Um programa computacional foi desenvolvido para otimização de geometria e simulação de dinâmica molecular baseado em um campo de forças clássicas parametrizado. O solvente foi considerado como um contínuo eletrostático e a interface entre o meio aquoso e o interior de uma membrana biológica como uma superfície de descontinuidade dielétrica, tratada pelo \"método das imagens eletrostáticas\". Nesse método, o campo de polarização produzido na superfície de descontinuidade por uma carga pontual é representado por uma carga fictícia, colocada na fase oposta, cuja distância e sinal é definida pelas condições de contorno na superfície. Diversos sistemas foram estudados, tanto em solventes contínuos como na presença de superfícies de descontinuidade: a) Foram estudadas as distribuições populacionais dos rotâmeros do triptofano na forma zwitteriônica e no peptídeo Ala-Trp- Ala, em solvente polar e apolar. Foi demonstrado que a dinâmica do triptofano e as populações de rotâmeros são compatíveis com as observações experimentais de fluorescência resolvida no tempo e NMR; b) Em um estudo das conformações em polialanina, verificou-se que a estabilidade da estrutura secundária hélice- é um efeito cooperativo entre pontes de hidrogênio em solvente de baixa constante dielétrica. Na presença da interface água-membrana, a hélice- anfifílica de um modelo para a -endorfina estabiliza-se sobre a interface. Um comportamento anfifílico foi também observado na seqüência sinal para o receptor- da e. coli, a qual estabilizou-se perpendicularmente à interface, na conformação parcial hélice- proposta na literatura; c) Em um estudo sobre o hormônio -MSH observou-se que, em solvente polar, de uma conformação helicoidal ele passa para uma conformação estendida. Porém, ao atravessar para o interior hidrofóbico de uma membrana, o peptídeo estabiliza-se em dobra-. Observou-se ainda que a estabilidade dessa conformação no interior da membrana é reforçada por pontes salinas entre os resíduos carregados do peptídeo, os quais formam um \"caroço\" hidrofílico circundado por resíduos hidrofóbicos. Esse arranjo estrutural está em concordância com o proposto para a conformação biologicamente ativa. De um modo geral, o modelo para biomembrana proposto no presente trabalho reproduziu o comportamento hidrofóbico, hidrofílico ou anfifílico dos peptídeos estudados. / A software was developed for optimisation of geometry and molecular dynamics simulation, based on a parameterized classical force field. Solvent was assumed as an electrostatic continuum. The interface between the aqueous medium and the hydrophobic core of biological membranes was described by a surface of dielectric discontinuity, treated by the \"method of images\". In this method, the polarization field produced at the surface of discontinuity by a point charge was represented by a fictitious charge, placed in the opposite phase. The position and signal of this charge-image were defined by boundary conditions at the surface. Several systems were studied, either in continuous solvent, as in the presence of discontinuity surfaces: a) the population distribution of tryptophan rotamers was studied in the zwytterion and in the peptide Ala-Trp-Ala, in polar and apolar solvents; the results for the tryptophan dynamics and the rotamers populations agree with experimental observations using time resolved fluorescence and NMR spectroscopies. b) analysis of polyalanin conformations showed that the stabililty of the -helix is a cooperative effect between hydrogen bonds in low dielectric constant solvent; in the presence of the water-membrane interface, the amphyphilic -helix of a -endorphin model stabilizes on the interface; a similar behavior was observed in the signal sequence for the E. Coli -receptor, that stabilized perpendicular to the interface in a partial -helix conformation, as proposed in the literature. c) calculations on melanotropic hormone a.-MSH showed that in polar solvent it goes from helycoidal conformation to an extended one; in the presence of the interface water-membrane, the peptide goes into the interior of the membrane and stabilizes in a -turn; the stability ofthis conformation was reinforced by salt bridges between charged residues, forming a hydrophilic core surrounded by hydrophobic residues; this structural arrangement agrees with the one proposed for the biologically active conformation of the hormone. In general terms, the model proposed here for the biomembrane was able to mimic the hydrophobic, hydrophihlic or amphyphilic behavior of the peptides studied.

O metabolismo do triptofano (TRP) se dá por três vias metabólicas: a via das quinureninas, a via serotonérgica e a via das triptaminas. A primeira gera quinurenina e uma gama de produtos secundários e contribui para os fenômenos de tolerância e imunoescape de células tumorais. A via serotonérgica leva à produção de neuromediadores e pode gerar melatonina. Há evidências de que compostos desta via podem controlar o crescimento tumoral. A via das triptaminas origina triptamina (TRY) e N-N-dimetiltriptamina (DMT) e representa a rota menos conhecida de degradação do TRP. Assim, investigamos a via das triptaminas em linhagens de melanoma humano SK-Mel-19 e SK-Mel-147. A expressão gênica das enzimas aminoácido aromático descarboxilase (DDC) e indoletilamina-N-metiltransferase (INMT), que convertem o TRP em TRY e DMT, respectivamente, foi determinada por PCR em tempo real. Os metabólitos desta via foram detectados por LC/MS no sobrenadante das culturas celulares. O teste da ferida (scratch test) e o ensaio clonogênico foram usados a fim de triar uma possível atividade antitumoral de TRY e DMT. Apesar de termos observado a expressão das enzimas DDC e INMT apenas na linhagem SK-Mel-147, ambas produziram triptaminas e metabolizaram TRY e DMT. Dependendo da linhagem houve a produção de ácido indolacético, DMT hidroxilado e produtos de abertura do anel indólico. Por fim, TRY e DMT diminuíram a migração e a proliferação das células tumorais. Há ainda muito a se estudar sobre a participação da TRY e DMT na biologia do tumor e as nossas descobertas ampliam o papel do metabolismo do triptofano no processo tumoral. / Tryptophan (TRP) metabolism occurs by three pathways: kynurenine, serotonergic and tryptamines paths. The first generates kynurenine and a range of secondary products and contributes to tolerance and tumor immune escape. Serotonergic pathway leads to the production of neuromediators and can generate melatonin. There are evidences that compounds of this pathway may control tumor growth. Tryptamines pathway originates tryptamine (TRY) and N, N-dimethyltryptamine (DMT) and represents the less-known route of TRP degradation. Thus, we investigated tryptamines pathway on human melanoma cell lines SK-Mel-19 and SK-Mel-147. Gene expression of the enzymes aromatic amino acid decarboxylase (DDC) and indoletilamina-N-methyltransferase (INMT), which convert TRP to TRY and DMT, respectively, was determined by real time PCR. The metabolites of this pathway were detected by LC/MS in cell culture supernatant. The scratch test and clonogenic assay were used to screen a potential antitumor activity for TRY and DMT. Although we have observed the expression of the enzymes DDC and INMT only on SK-MEL-147, both cells produced tryptamines and metabolized TRY and DMT. Depending on the cell line, products were indoleacetic acid (IAA), hydroxylated-DMT (OH-DMT) and indole opening ring products. Finally, TRY and DMT decreased tumor cells migration and proliferation. There is much to be studied about the participation of TRY and DMT in tumor biology, and our findings extend the role of tryptophan metabolism in tumoral process.

A gestação confere ao organismo materno uma série de mudanças e desafios, envolvendo especialmente seu sistema imunológico. O feto, do ponto de vista imunológico, é comparado a um enxerto semi-alogenêico, pois expressa moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) paterno, considerado não próprio ao organismo materno, capaz de desencadear uma resposta imunológica no ambiente intrauterino. Porém, durante todo o período gestacional, o organismo materno reconhece o embrião sem uma resposta imunológica contra sua permanência no útero, estabelecendo-se uma tolerância materno-fetal. Vários mecanismos contribuem para esse estado tolerogênico, como a atividade da enzima indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO). A IDO promove o catabolismo do aminoácido triptofano, levando as células T à apoptose, devido à carência deste aminoácido e pela ação de seus catabólitos no micro ambiente placentário. Diversos tipos celulares estão presentes na interface materno fetal e vários deles podem potencialmente expressar a IDO. Em ratas Wistar, sabe-se que diversas proteínas, principalmente o interferon &gamma; e, recentemente, a progesterona, podem aumentar a expressão desta enzima; contudo, ainda não são conhecidos quais tipos celulares são efetivamente influenciados por estas moléculas. Desta forma, este trabalho buscou suprir esta lacuna, por meio da identificação das células IDO positivas pela imunofenotipagem e citometria de fluxo. De acordo com as analises realizadas, os resultados deste trabalho mostraram que todos os tipos celulares fenotipados foram capazes de expressar a enzima. Contudo somente alguns grupos específicos de células presentes no ambiente uterino placentário sofrem influência das proteínas supracitadas, principalmente as células dendríticas, e os linfócitos CD4 que elevam a expressão de IDO na presença de progesterona e IFN-&gamma;. Tais achados sugerem que a ação da enzima em grupos celulares específicos poderiam constituir meios pelo qual o organismo regula o sistema imunológico no ambiente uterino-placentário, em que é capaz de impedir o desenvolvimento de células imunológicas potencialmente ativas, colaborando com a formação de um ambiente tolerogênico favorável para o desenvolvimento embrionário. / Pregnancy causes several changes and challenges to the maternal body, especially involving the immune system. The fetus, on the immunological point of view, is compared to a semialogeneic graft, expressed as molecules of the paternal major histocompatibility complex (MHC) considered not self to the maternal organism, capable of triggering an immune response in the intrauterine environment. However, throughout the gestational period, maternal organism tolerates the embryo without an immune response against its permanence in the uterus, establishing maternal-fetal tolerance. Several mechanisms contribute to this tolerogenic state, as the activity of the enzyme indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO). The IDO promotes the catabolism of tryptophan, inducing T cells apoptosis due to the deprivation of this amino acid and by the action of its catabolites in the placental microenvironment. Several cell types are present in the maternal-fetal interface and many of them can potentially express IDO. In Wistar rats, it is known that interferon &gamma; and recently, progesterone, may increase the expression of this enzyme; however, which cell types are actually influenced by these molecules is still unknown. Thus, this study intends to fill this gap, by identifying IDO positive cells by immunophenotyping and flow cytometry. According to the analysis carried out, the results of this study showed that all phenotyped cell types were able to express the enzyme, however only some specific groups present in placental uterine environment are influenced by the factors above mentioned, especially dendritic cells and lymphocytes CD4 increase the IDO expression at the presence of progesterone and IFN-&gamma;. These findings suggest that the action of the enzyme in specific cell groups may be one of the means by which the body regulates the immune system uterine-placental environment, which is able to prevent the development of potentially active immune cells, contributing to the formation tolerogenic environment favorable for embryonic development.

Indolamina-2,3-dioxigenase (IDO) e o catabolismo do triptofano estão envolvidos no controle da imunidade inata e adaptativa contra patógenos. Investigamos o papel da IDO na paracoccidiodomicose pulmonar (PCM) de animais suscetíveis (B10.A) e resistentes (A/J) ao fungo. Observou-se uma ação marcante da IDO ao início da doença de camundongos B10.A onde a enzima controla a carga fúngica mas, também, induz anergia de células TCD4+ e TCD8+, creditada em parte à expansão de células Treg e aumento de linfócitos em apoptose. Em camundongos A/J, a IDO controla a carga fúngica inicial, porém, o seu efeito supressor sobre linfócitos TCD4+ é somente observado na 8ª semana. Assim como em camundongos B10.A, a IDO mostrou-se indutora de células Treg e linfócitos em apoptose durante a imunidade desenvolvida por camundongos A/J. Em conclusão, foi demonstrado pela primeira vez que a IDO exerce um importante mecanismo microbicida e imunorregulador na PCM de hospedeiros resistentes e suscetíveis ao P. brasiliensis. / Indoleamine-2, 3-dioxygenase (IDO) and tryptophan catabolism are involved in the control of innate and adaptive immunity against pathogens. We investigated the role of IDO in the pulmonary paracoccidiodomycosis developed by susceptible (B10.A) and resistant (A/J) mice to the fungus. We verified that IDO plays a different effect in innate the immunity of B10.A and A/J mice. Early in the infection, IDO controlled the fungal loads but also induced anergy of CD4+ and CD8+ T cells of B10.A mice. T cell anergy was partially due to the expansion of Treg cells and increased apoptosis of lymphocytes. In resistant mice, IDO controlled the initial fungal loads, but exerted a suppressive effect on T lymphocytes only at week 8. As in B10.A mice IDO was shown to induce Treg cells and apoptosis of lymphocytes in the course of immune response developed by resistant mice. In conclusion our work showed for the first time that IDO play an important role in the fungicidal and immunoregulatory mechanisms developed by susceptible and resistant mice to P. brasiliensis infection.

Um programa computacional foi desenvolvido para otimização de geometria e simulação de dinâmica molecular baseado em um campo de forças clássicas parametrizado. O solvente foi considerado como um contínuo eletrostático e a interface entre o meio aquoso e o interior de uma membrana biológica como uma superfície de descontinuidade dielétrica, tratada pelo \"método das imagens eletrostáticas\". Nesse método, o campo de polarização produzido na superfície de descontinuidade por uma carga pontual é representado por uma carga fictícia, colocada na fase oposta, cuja distância e sinal é definida pelas condições de contorno na superfície. Diversos sistemas foram estudados, tanto em solventes contínuos como na presença de superfícies de descontinuidade: a) Foram estudadas as distribuições populacionais dos rotâmeros do triptofano na forma zwitteriônica e no peptídeo Ala-Trp- Ala, em solvente polar e apolar. Foi demonstrado que a dinâmica do triptofano e as populações de rotâmeros são compatíveis com as observações experimentais de fluorescência resolvida no tempo e NMR; b) Em um estudo das conformações em polialanina, verificou-se que a estabilidade da estrutura secundária hélice- é um efeito cooperativo entre pontes de hidrogênio em solvente de baixa constante dielétrica. Na presença da interface água-membrana, a hélice- anfifílica de um modelo para a -endorfina estabiliza-se sobre a interface. Um comportamento anfifílico foi também observado na seqüência sinal para o receptor- da e. coli, a qual estabilizou-se perpendicularmente à interface, na conformação parcial hélice- proposta na literatura; c) Em um estudo sobre o hormônio -MSH observou-se que, em solvente polar, de uma conformação helicoidal ele passa para uma conformação estendida. Porém, ao atravessar para o interior hidrofóbico de uma membrana, o peptídeo estabiliza-se em dobra-. Observou-se ainda que a estabilidade dessa conformação no interior da membrana é reforçada por pontes salinas entre os resíduos carregados do peptídeo, os quais formam um \"caroço\" hidrofílico circundado por resíduos hidrofóbicos. Esse arranjo estrutural está em concordância com o proposto para a conformação biologicamente ativa. De um modo geral, o modelo para biomembrana proposto no presente trabalho reproduziu o comportamento hidrofóbico, hidrofílico ou anfifílico dos peptídeos estudados. / A software was developed for optimisation of geometry and molecular dynamics simulation, based on a parameterized classical force field. Solvent was assumed as an electrostatic continuum. The interface between the aqueous medium and the hydrophobic core of biological membranes was described by a surface of dielectric discontinuity, treated by the \"method of images\". In this method, the polarization field produced at the surface of discontinuity by a point charge was represented by a fictitious charge, placed in the opposite phase. The position and signal of this charge-image were defined by boundary conditions at the surface. Several systems were studied, either in continuous solvent, as in the presence of discontinuity surfaces: a) the population distribution of tryptophan rotamers was studied in the zwytterion and in the peptide Ala-Trp-Ala, in polar and apolar solvents; the results for the tryptophan dynamics and the rotamers populations agree with experimental observations using time resolved fluorescence and NMR spectroscopies. b) analysis of polyalanin conformations showed that the stabililty of the -helix is a cooperative effect between hydrogen bonds in low dielectric constant solvent; in the presence of the water-membrane interface, the amphyphilic -helix of a -endorphin model stabilizes on the interface; a similar behavior was observed in the signal sequence for the E. Coli -receptor, that stabilized perpendicular to the interface in a partial -helix conformation, as proposed in the literature. c) calculations on melanotropic hormone a.-MSH showed that in polar solvent it goes from helycoidal conformation to an extended one; in the presence of the interface water-membrane, the peptide goes into the interior of the membrane and stabilizes in a -turn; the stability ofthis conformation was reinforced by salt bridges between charged residues, forming a hydrophilic core surrounded by hydrophobic residues; this structural arrangement agrees with the one proposed for the biologically active conformation of the hormone. In general terms, the model proposed here for the biomembrane was able to mimic the hydrophobic, hydrophihlic or amphyphilic behavior of the peptides studied.

A gestação confere ao organismo materno uma série de mudanças e desafios, envolvendo especialmente seu sistema imunológico. O feto, do ponto de vista imunológico, é comparado a um enxerto semi-alogenêico, pois expressa moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) paterno, considerado não próprio ao organismo materno, capaz de desencadear uma resposta imunológica no ambiente intrauterino. Porém, durante todo o período gestacional, o organismo materno reconhece o embrião sem uma resposta imunológica contra sua permanência no útero, estabelecendo-se uma tolerância materno-fetal. Vários mecanismos contribuem para esse estado tolerogênico, como a atividade da enzima indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO). A IDO promove o catabolismo do aminoácido triptofano, levando as células T à apoptose, devido à carência deste aminoácido e pela ação de seus catabólitos no micro ambiente placentário. Diversos tipos celulares estão presentes na interface materno fetal e vários deles podem potencialmente expressar a IDO. Em ratas Wistar, sabe-se que diversas proteínas, principalmente o interferon &gamma; e, recentemente, a progesterona, podem aumentar a expressão desta enzima; contudo, ainda não são conhecidos quais tipos celulares são efetivamente influenciados por estas moléculas. Desta forma, este trabalho buscou suprir esta lacuna, por meio da identificação das células IDO positivas pela imunofenotipagem e citometria de fluxo. De acordo com as analises realizadas, os resultados deste trabalho mostraram que todos os tipos celulares fenotipados foram capazes de expressar a enzima. Contudo somente alguns grupos específicos de células presentes no ambiente uterino placentário sofrem influência das proteínas supracitadas, principalmente as células dendríticas, e os linfócitos CD4 que elevam a expressão de IDO na presença de progesterona e IFN-&gamma;. Tais achados sugerem que a ação da enzima em grupos celulares específicos poderiam constituir meios pelo qual o organismo regula o sistema imunológico no ambiente uterino-placentário, em que é capaz de impedir o desenvolvimento de células imunológicas potencialmente ativas, colaborando com a formação de um ambiente tolerogênico favorável para o desenvolvimento embrionário. / Pregnancy causes several changes and challenges to the maternal body, especially involving the immune system. The fetus, on the immunological point of view, is compared to a semialogeneic graft, expressed as molecules of the paternal major histocompatibility complex (MHC) considered not self to the maternal organism, capable of triggering an immune response in the intrauterine environment. However, throughout the gestational period, maternal organism tolerates the embryo without an immune response against its permanence in the uterus, establishing maternal-fetal tolerance. Several mechanisms contribute to this tolerogenic state, as the activity of the enzyme indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO). The IDO promotes the catabolism of tryptophan, inducing T cells apoptosis due to the deprivation of this amino acid and by the action of its catabolites in the placental microenvironment. Several cell types are present in the maternal-fetal interface and many of them can potentially express IDO. In Wistar rats, it is known that interferon &gamma; and recently, progesterone, may increase the expression of this enzyme; however, which cell types are actually influenced by these molecules is still unknown. Thus, this study intends to fill this gap, by identifying IDO positive cells by immunophenotyping and flow cytometry. According to the analysis carried out, the results of this study showed that all phenotyped cell types were able to express the enzyme, however only some specific groups present in placental uterine environment are influenced by the factors above mentioned, especially dendritic cells and lymphocytes CD4 increase the IDO expression at the presence of progesterone and IFN-&gamma;. These findings suggest that the action of the enzyme in specific cell groups may be one of the means by which the body regulates the immune system uterine-placental environment, which is able to prevent the development of potentially active immune cells, contributing to the formation tolerogenic environment favorable for embryonic development.