Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-09-25T17:48:23Z No. of bitstreams: 1 natalia_f_d_teixeira_ioc_bp_0049_2011.pdf: 5762505 bytes, checksum: d6ccbdbbba66e572bb7b109f69447e53 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-25T17:48:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 natalia_f_d_teixeira_ioc_bp_0049_2011.pdf: 5762505 bytes, checksum: d6ccbdbbba66e572bb7b109f69447e53 (MD5) Previous issue date: 2011 / CNPq & FAPERJ / Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro - FAPERJ, Rio de Janeiro, Brasil. / Nesse projeto foram estudadas a fauna de triatomíneos e a ocorrência da transmissão da doença de Chagas na localidade de Cipó, situada no município de Russas, Ceará. No total, foram capturados 508 espécimes de triatomíneos, dos quais 99,6% eram da espécie Triatoma brasiliensis, além de dois exemplares de Triatoma pseudomaculata. As capturas ocorreram nos ambientes peridomiciliar e silvestre, não se detectando infestação intradomiciliar em nenhuma das 54 moradias vistoriadas. No peridomicílio as infestações ocorreram em galinheiros, amontoados de madeira, paióis e rochas. O índice de infestação triatomínica da localidade foi de 18,5% e o de colonização peridomiciliar de 11,1%. No ambiente peridomiciliar, o maior foco de infestação foi encontrado em um amontoado de madeiras, no entanto, a presença de triatomíneos foi observada com maior freqüência nas formações rochosas, o ecótopo natural do T. brasiliensis, tendo sido encontrado espécimes na maioria das rochas investigadas, tanto próximas quanto afastadas das moradias. Embora apenas os espécimes capturados no ambiente silvestre tenham apresentado infecção por Trypanosoma cruzi, cujo índice foi de 2,9%, isso indica que o ciclo do parasito na localidade permanece ativo. A tipagem molecular dos protozoários, isolados dos triatomíneos, os classificou como T. cruzi I. A análise do conteúdo intestinal mostrou que, tanto nos triatomíneos capturados no ambiente peridomiciliar quanto nos das rochas silvestres, a fonte de alimento mais freqüente foi o sangue de aves, que são refratárias ao protozoário o que poderia estar associado com o índice relativamente baixo de infecção dos vetores. O inquérito sorológico, realizado em 171 moradores de Cipó, não revelou nenhum caso soropositivo para T. cruzi, o que pode estar relacionado com a ausência de infestação intradomiciliar e de infecção nos triatomíneos capturados no ambiente peridomiciliar. No entanto, como o ciclo do T. cruzi é ativo no habitat natural e como os ciclos de transmissão de ambos os ambientes podem se interligar, é essencial que seja realizado um controle vetorial regular e sistemático e uma vigilância entomológica efetiva na localidade para que a transmissão da doença para a população humana seja evitada. / Triatomine fauna together with Chagas disease in local residents was investigated in a rural locality, named Cipó, situated in the Russas municipality, Ceará, Brazil. During the survey, 508 triatomine specimens were captured, 99.6% of which were Triatoma brasiliensis, besides two specimens of T. pseudomaculata. Captures were carried out in peridomestic and sylvatic environments only as no indoor infestation was detected in any of the 54 investigated dwellings. In peridomiciles, the infestations appeared in chicken coops, wood piles, barns and rocks. Overall, the rate of triatomine infestation in the locality was 18.5% of all investigated habitats of which 11.1% represented peridomicile colonization. In the peridomestic environment, wood piles harbored the greatest numbers of insects. However, rock formations, both with and without proximity to the homes, were the habitat most frequently infested, as it they are the natural T. brasiliensis ecotope. Although only the insects captured in the sylvatic rocks presented natural Trypanosoma cruzi infection (2.9%), this indicates that the cycle of the disease remains active in the locality. Molecular typing of the parasite isolated from the triatomines determined the classification to be T. cruzi I. The analysis of gut contents revealed that the triatomines captured in both the peridomestic and sylvatic environments fed principally on blood of birds, refractory to the parasite, which might explain the relatively low rate of vector infection. The human population serological survey, performed on 171 residents, did not detected any positive case of Chagas disease, which may be closely associated to the absence of indoor infestation as well as infection in triatomines captured in the peridomestic environment. However, since the cycle of T. cruzi is active in the natural habitat of the locality and the transmission cycles of both environments are interrelated, it is necessary to keep a constant vector control and entomological surveillance avoiding the transmission of disease to the human population.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-10-19T13:04:45Z No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_CarlotaJosefoviczBelisário.pdf: 4313033 bytes, checksum: 60ab172cbc6f3043ea324ea72968567a (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-10-19T13:13:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_CarlotaJosefoviczBelisário.pdf: 4313033 bytes, checksum: 60ab172cbc6f3043ea324ea72968567a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-19T13:13:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_CarlotaJosefoviczBelisário.pdf: 4313033 bytes, checksum: 60ab172cbc6f3043ea324ea72968567a (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / A doença de Chagas (DC) é uma enfermidade causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, cuja principal forma de transmissão é através das fezes de triatomíneos infectados. O Panstrongylus megistus atualmente é o principal vetor do Brasil, sendo responsável pela transmissão da DC na região da Serra do Cipó, MG, na década de 80. O P. megistus possui alta capacidade de reinfestação das casas, exigindo permanente vigilância contra a instalação de novos focos. O peridomicílio apresenta grande importância para a manutenção de triatomíneos e do T. cruzi circulando entre barbeiros e os animais que o frequentam. O objetivo do trabalho foi avaliar o cenário ecoepidemiológico da doença de Chagas no entorno do Parque Nacional da Serra do Cipó (ParnaCipó), visando subsidiar o programa de controle do P. megistus. O estudo se realizou nos municípios de Jaboticatubas e Santana do Riacho que, juntamente com Morro do Pilar e Itambé do Mato Dentro, integram o ParnaCipó. O perfil de infestação pelo P. megistus foi determinado através de captura de triatomíneos nas unidades domiciliares (setembro de 2007 a setembro de 2010) e capturas silvestres, que também incluiram avaliação da infecção em marsupiais e roedores. Cães levados à campanha de vacinação antirrábica de Jaboticatubas foram examinados a fim de determinar sua importância epidemiológica na região. Exemplares de P. megistus capturados foram utilizados para análise populacional pela morfometria geométrica. Os exemplares provenientes de Jaboticatubas foram ainda analisados por RAPD para estudo populacional. As cepas isoladas dos reservatórios e vetores foram caracterizadas como pertencentes ao grupo T. cruzi I ou T. cruzi II utilizando‐se DNA satélite como alvo. A maioria dos exemplares P. megistus foi capturada em galinheiros; no intradomicílio o ecótopo preferencial foi o quarto. Foram realizadas pesquisas em 15 áreas silvestres com a captura de 105 mamíferos, com taxa de infecção de 6,7%; todas as cepas foram caracterizadas como T. cruzi I. A prevalência em cães foi de 2,4%. Em palmeiras foram capturados Rhodnius neglectus, P. megistus e Triatoma sordida. Dentre as cepas isoladas de triatomíneos domiciliados e silvestres, apenas uma cepa proveniente do ambiente domiciliar foi caracterizada como T. cruzi II, as demais, T. cruzi I. A morfometria diferenciou a população silvestre das domiciliares. A RAPD demonstrou grande variabilidade dos P. megistus de Jaboticatubas, entretanto, sem diferenciação populacional. Frente aos resultados, podemos concluir que a população rural dos dois municípios permanece sob o risco de infecção pelo T. cruzi, uma vez que são encontrados vetores e reservatórios infectados no ambiente artificial e natural, e podem infestar as habitações a partir de diversos focos, domiciliares ou silvestres. / Chagas disease (CD) is caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, whose main mode of transmission is through the feces of infected bugs. Panstrongylus megistus is currently the main vector in Brazil, being responsible for the CD transmition in Serra do Cipo, MG, in the 80s. P. megistus has high capacity to reinfestate the houses, requiring constant vigilance against the installation of new focus. The peridomicile has great importance for the maintenance of triatomine bugs and the T. cruzi circulating among triatomines and the animals that occure in this environment. The objective of this study was to evaluate the ecoepidemiologic scenario of Chagas disease in the surrounding of the National Park of Serra do Cipo (ParnaCipó), aiming to support the control program of the P. megistus. The study was conducted in the municipalities of Jaboticatubas and Santana do Riacho, which together with Morro do Pilar and Itambé do Mato Dentro, integrate the ParnaCipó. P. megistus infestation profile was determined by capturing triatomines in the households (September 2007 to September 2010) and in wild captures, which were also performed to evaluate the rodents and marsupials infection. Dogs carried to the anti‐rabies vaccination campaign of the Jaboticatubas were examined to determine their prevalence in the region. The P. megistus exemplaries captured were used to the geometric morphometry analisis. Specimens from Jaboticatubas were further analyzed by RAPD for population study. The strains isolated from reservoirs and vectors were characterized as T. cruzi I or T. cruzi II using satellite DNA as target. Most P. megistus was captured in chicken coops; inside the houses the preferred ecotope was the bedroom. Were investigated 15 wild areas with the capture of 105 mammals, with infection rates of 6.7%, all strains were characterized as T. cruzi I. The prevalence in dogs was 2.4%. In the palm trees examined were captured Rhodnius neglectus, P. megistus and Triatoma sordida. Among the strains isolated from the domiciled and wild triatomines, only one from the intradomicile was characterized as T. cruzi II, the others were T. cruzi I. The morphometric analysis differentiated the wild from the domestics populations. The RAPD showed great variability of P. megistus in Jaboticatubas, however, without population differentiation. Based on the results, we conclude that the rural population of both municipalities remains at risk of infection by T. cruzi, since the infected vectors in artificial and natural environment follow to be found, and can infest the dwellings from various domestic or wild focus.

Submitted by Alison Vanceto (alison-vanceto@hotmail.com) on 2017-01-03T12:37:26Z No. of bitstreams: 1 DissARFKM.pdf: 5277245 bytes, checksum: eb3373a6818032ff6003ee650addae1a (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2017-01-16T17:13:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissARFKM.pdf: 5277245 bytes, checksum: eb3373a6818032ff6003ee650addae1a (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2017-01-16T17:13:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissARFKM.pdf: 5277245 bytes, checksum: eb3373a6818032ff6003ee650addae1a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-16T17:13:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissARFKM.pdf: 5277245 bytes, checksum: eb3373a6818032ff6003ee650addae1a (MD5) Previous issue date: 2016-08-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Chagas Disease is a sickness that affects the population present of Latin America and it is classified by the World Health Organization as a Neglected Tropical Diseases. Chagas disease is caused by the flagellated parasite Trypanosoma cruzi, which belong to the same family as Trypanosoma brucei and Leishmania sp., and has a complex life cycle, going from an invertebrate host to a vertebrate one. In order to survive and proliferate in these host changes, T. cruzi must adapt itself to osmotic and oxidative stresses, changes in the environmental ion composition and shifts in energy sources. To perform this adaptation, the amino acid Lproline has presented an important and essential participation that affects the protozoan life cycle, such as support of the mitochondrial metabolism, the host-cell invasion and metacyclogenesis. T. cruzi 1-Delta-Pyrroline-5-Carboxylate Dehydrogenase (TcP5CDH) is involved in the catabolism of proline holding a major role in its conversion by transforming pyrroline-5-carboxylate into L-glutamate (the second step of the catabolic path) and, thus, seeming to be a promising molecular target for new drug development. The amino acids sequence of PP5CDH was used for conservation analysis, secondary structure prediction, identification of functional domains, and building of tertiary structure computer models with the techniques of Molecular Modeling and Molecular Docking. The TcP5CDH (MW: 60 kDa) was expressed in a heterologous fashion in Escherichia coli, and purified with affinity and size exclusion chromatography, resulting in approximately 2 mg/L of expression. The Dynamic Light Scattering assays where carried out with the recombinant P5CDH in the concentrations of 0.5, 1.0, 1.5 e 2.0 mg/mL, and presented an apparent molecular weight of 223,4 kDa (Rh: 12,01 nm), 246,4 kDa (Rh: 12,53 nm), 310,5 kDa (Rh: 13,83 nm) e 312,0 kDa (Rh: 12,13,86 nm), respespectively. The Circular Dichroism spectroscopy was performed with 0.2 mg/mL of TcP5CDH in the presence and absence of 100 μM of NAD+, L-Glu, and its inhibitor Disulfiram, presenting a Tm of Tm 60,01 ºC, 59,76 ºC, 57,76 ºC e 58,18 ºC, showing that TcP5CDH has a more thermic stability without ligands. Also, a deconvolution was made showing that TcP5CDH has 23% of alfa-helix, 12,3% of antiparallel beta-sheetst and 12,4% parallel beta-sheets, 18,3% of turns 41,7% of disorganized structures. These results will contribute to the understanding of the pathway of L- proline in T. cruzi and the possible future development of new drugs. / A Doença de Chagas é uma enfermidade que afeta a população presente nos países da América Latina e é classificado pela Organização Mundial da Saúde como uma Doença Tropical Negligenciada. A Doença de Chagas é causada pelo parasita flagelado Trypanosoma cruzi, pertencente à mesma família dos parasitas Trypanosoma brucei e a Leishmania sp., organismo que possui um complexo ciclo de vida, passando de um hospedeiro invertebrado para um vertebrado. Para sobreviver e proliferar nessa mudança de hospedeiro, o T. cruzi precisa se adaptar a estresses oxido-redutivos e osmóticos, mudanças da composição iônica do ambiente e mudanças na fonte de energia. Para realizar essas mudanças, o aminoácido Lprolina apresenta uma importante participação que afeta o ciclo de vida do parasita como suporte no metabolismo mitocondrial, invasão de células hospedeiras e na metaciclogênese. A 1-Delta-Pyrrolina-5-Carboxilato Desidrogenase de T. cruzi (TcP5CDH) está envolvida no catabolismo da prolina tendo um papel importante na sua conversão através da transformação da pirroline-5-carboxilato em L-glutamato (a segunda etapa da via) e, assim, parece ser um alvo molecular promissor para desenvolvimento de novos fármacos. A sequência de aminoácidos da P5CDH foi utilizada para análises de conservação, predição de estruturas secundárias, identificação de domínios funcionais e modelos computacionais da estrutura terciária através da técnicas de Modelagem por Homologia e Ancoramento Molecular. A TcP5CDH (MW: 60 kDa) foi expressa de forma heteróloga em Eschericia coli, purificada por cromatografia de afinidade e cromatografia de exclusão molecular e, em seguida, concentrada, resultando em aproximadamente 2 mg/L de expressão. Os experimentos de Espalhamento Dinâmico da Luz foram realizados com a P5CDH recombinante nas concentrações de 0.5, 1.0, 1.5 e 2.0 mg/mL e apresentaram uma massa molecular aparente de 223,4 kDa (Rh: 12,01 nm), 246,4 kDa (Rh: 12,53 nm), 310,5 kDa (Rh: 13,83 nm) e 312,0 kDa (Rh: 12,13,86 nm), respectivamente. A Espectroscopia de Dicroísmo Circular foi realizado utilizando 0,2 mg/mL da TcP5CDH e com a proteína na presença de 100 μM de NAD+, L-Glu e do inibidor Dissulfiram, apresentando uma Tm 60,01 ºC, 59,76 ºC, 57,76 ºC e 58,18 ºC, respectivamente. Além disso, uma deconvolução foi realizada mostrando que a TcP5CDH possui 23% de alfa-hélices, 12,3% de folhas-beta antiparalelas, 12.4% de folhas-beta paralelas, 18,3% de voltas e 41,7% de regiões desorganizadas Estes resultados irão contribuir no entendimento da via da L-prolina em T. cruzi e no possível desenvolvimento futuro de novos fármacos.

CHAPTER I: Leishmania spp are obligate intracellular protozoan that can cause a complex of known infectious diseases such as leishmaniasis, affecting millions of people worldwide. The host-pathogen interaction involves the parasite surface molecules and cellular receptors that culminate in phagocytosis. This internalization process involves changes in cytoskeleton through interaction with proteins related to actin polymerization, as AFAP, Arp 2/3 complex, Galectin-3, Septins and WASp, as well as activation and signaling pathways. It is known that L. amazonensis promastigotes after entry into phagocytes are present in phagosomes, and these vesicles undergo a maturation process, forming phagolysosome, important for differentiation of the promastigote forms to amastigotes. This study aimed to understand which proteins related to actin cytoskeleton exert role in the process of invasion and multiplication of L. amazonensis and which signaling pathways are involved in the formation of phagolysosome, the invasion and multiplication of this protozoan process the host cell. For this, we did invasion and multiplication assays with macrophages C57 BL/6 and BALB/c peritoneal treated or not with cytochalasin D, invasion assay with macrophages C57 BL/6 previously fixed in formaldehyde (0.01%), assay with macrophages C57 BL/6 knockdown for AFAP-1L1, Arp2, Galectin-3, Septin 4, 14 and WASP proteins compared to wild type cells. And yet, assays phagolysosome kinetics of formation and proliferation and invasion assays using inhibitors of Akt, ERK2, MEK1, MEK1/2, mTOR, PI3K and Ras signaling pathways. The results show that L. amazonensis invaded cells defective in actin polymerization, as well as fixed cells as well as decreased expression of Arp2, Galectin-3 and WASp proteins increased internalization of these parasites. The signaling pathways MEK1/2, ERK2 and AKT delayed the recruitment of the lysosomes to phagosome, and inhibition of PI3K, MEK1/2 and ERK2 pathways drastically decreased internalization of the parasite in the cells. We concluded that L. amazonensis were able to actively invade phagocytic cells, and that the Arp2, Galectin-3 and WASp proteins are involved in the process of entry into host cells. In addition, the MEK1/2, AKT and ERK2 signaling pathways are involved in the formation of phagolysosome as well as PI3K, MEK1/2 and ERK2 pathways seem to favor infection with L. amazonensis. CHAPTER II: The flagellate protozoan Trypanosoma cruzi is the causative agent for Chagas disease. It is estimated that there are eight million people infected worldwide. T. cruzi has different surface proteins related to cell invasion. In this context, our research group identified in T. cruzi, a protein of 21 kDa (P21) showed that pro-phagocytic and chemotactic activities, playing an important role in the internalization of this parasite in vitro. This study aimed to evaluate the role of recombinant protein P21-His6 based on native P21 of T. cruzi in Leishmania amazonensis in order to seek greater understanding of the mechanism of action of this protein and its relationship with the host in vivo. To this end, the footpad infect BALB/c mouse treated with 40μg of active and denatured recombinant P21, BSA and PBS for 6 weeks and assess the footpad size, parasitic load (real time PCR) and cytokine production of IL-1β in the paws, the popliteal lymph nodes and spleen. The results showed an increase in the footpad area, as well as increased parasite load in the infected and treated animals with P21-His6. Also, increased production of IL-β in the footpad and the popliteal lymph nodes also in animals treated with P21-His6. We conclude that the P21 protein plays a role in pro-phagocytic also in vivo experiments, favoring infection. / CAPÍTULO I: Leishmania spp são protozoários intracelulares obrigatórios, que podem causar um complexo de doenças infecciosas conhecidas como leishmanioses, que afetam milhões de pessoas mundialmente. A interação entre patógeno-hospedeiro envolve moléculas de superfície do parasito e receptores celulares que culminam na fagocitose. Este processo de internalização envolve modificações no citoesqueleto celular por meio da interação com proteínas relacionadas à polimerização de actina, como AFAP, Complexo Arp2/3, Galectina-3, Septinas e WASp, bem como a ativação de vias de sinalização. Sabe-se que formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis após a entrada nos fagócitos, estão presentes em fagossomos, e essas vesículas sofrem um processo de maturação, formando o fagolisossomo importante para a diferenciação da forma promastigota em amastigota. Este trabalho teve como objetivo, entender quais proteínas relacionadas ao citoesqueleto de actina exercem papel no processo de invasão e na multiplicação de L. amazonensis, bem como, quais vias de sinalização estão envolvidas no processo de formação do fagolisossomo, na invasão e na multiplicação deste protozoário na célula hospedeira. Para isso, fizemos ensaios de invasão e multiplicação em macrófagos imortalizados C57 BL/6 e peritoneais de BALB/c tratados ou não com citocalasina D, ensaio de invasão em macrófagos C57 BL/6 previamente fixadas em formaldeído, ensaio com macrófagos C57 BL/6 knockdown para as proteínas AFAP-1L1, Arp2, Galectina-3, Septina 4 e 14 e WASp, comparando com células Wild Type. E ainda, ensaios de cinética de formação do fagolissomo e ensaios de invasão e multiplicação utilizando inibidores das vias de sinalização envolvendo Akt, ERK2, MEK1, MEK1/2, mTOR, PI3K e Ras foram realizados. Os resultados mostram que L. amazonensis invadiu células deficientes na polimerização de actina, e também células fixadas, bem como a diminuição da expressão das proteínas Arp2, Galectina-3 e WASp aumentaram a internalização desses parasitos. As vias de sinalização MEK1/2, ERK2, AKT atrasaram o recrutamento de lisossomos para o fagossomo, e a inibição das vias PI3K, MEK1/2 e ERK2 diminuíram drasticamente a internalização do parasito nas células. Concluímos que L. amazonensis foi capaz de invadir ativamente células fagocíticas, e que as proteínas Arp2, Galectina-3 e WASp estão envolvidas no processo de entrada na células hospedeira. Além disso, as vias de sinalização MEK1/2, ERK2 e AKT estão envolvidas na formação do fagolisossomo, bem como as vias PI3K, MEK1/2 e ERK2 parecem favorecer a infecção por L. amazonensis. CAPÍTULO II: O protozoário flagelado Trypanosoma cruzi é o causador da Doença de Chagas. Estima-se a existência de 8 milhões de pessoas infectadas em todo o mundo. T. cruzi apresenta diferentes proteínas de superfície relacionadas ao processo de invasão celular. Nesse contexto, nosso grupo de pesquisa identificou em T. cruzi, uma proteína de 21 kDa (P21) que apresentou atividades pro-fagocíticas e quimiotáticas, exercendo papel importante na internalização desse protozoário in vitro. O presente trabalho teve como finalidade avaliar o papel da proteína recombinante P21-His6 baseada na P21 nativa de T. cruzi na infecção por Leishmania amazonensis, a fim de buscar maior entendimento no mecanismo de ação dessa proteína e sua relação com o hospedeiro in vivo. Para isso, infectamos as patas de animais BALB/c e tratamos os animais com 40μg de P21 recombinante ativa e desnaturada, PBS e BSA por 6 semanas e avaliamos o tamanho da pata, a carga parasitária (PCR em tempo real) e a produção da citocina IL-1β nas patas, linfonodos do poplíteo e baços. Os resultados mostraram aumento na área da pata, bem como aumento da carga parasitária nos animais infectados e tratados com a P21-His6. E ainda, aumento da produção da citocina Il-1β na pata e no linfonodo do poplíteo também nos animais tratados com a P21-His6 também foram observados. Concluímos que a proteína P21 exerce papel pro-fagocítico também em experimentos in vivo, favorecendo a infecção. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Trypanosoma cruzi é o agente causador da doença de Chagas, uma das doenças tropicais mais negligenciadas. Estima-se que cerca de 11 milhões de pessoas no mundo estão infectadas por T. cruzi e cerca de 6 a 7 milhões de pessoas estão em risco por encontrarem-se em áreas endêmicas. Durante o processo de invasão moléculas do parasita e do hospedeiro interagem permitindo a transdução de sinal e a expressão de genes de modulação em resposta à invasão. A diversidade de proteínas e vias acionadas para reparar a lesão pela ruptura da membrana plasmática nos interessou e dessa forma o presente estudo desenvolveu uma nova forma de detecção e quantificação por reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) da carga parasitária de T. cruzi e a quantificou os níveis transcricionais relativos (RT-qPCR) da Disferlina, Esfingomielina esferase ácida (ASM), Fator de Transcrição EB (TFEB), Galectinas 1 e 3 e Anexina A2. Neste estudo, foi demonstrado que a quantificação por PCR em tempo real utilizando os iniciadores P21fw e P21rv foi específico e sensível para a detecção de T. cruzi in vivo e in vitro, bem como os níveis transcricionais de genes relacionados a organização do citoesqueleto e reparo de membrana plasmática são moduladas em resposta ao dano gerado pelo parasita. / Trypanosoma cruzi is causative agent of Chagas disease, one of most neglected tropical diseases. Estimated that about 11 million people worldwide are infected by T. cruzi and about 6 to 7 million people are at risk in endemic areas. During the process of invasion of host and parasite interact enabling signal transduction and gene expression modulation in response to invasion. The diversity of activated proteins and pathways to repair the damage by disruption of the plasma membrane interest to us and thus present study developed a new form of detection and quantitation by polymerase chain reaction in real time (qPCR) of parasitic load T. cruzi and quantified transcriptional levels relative (RT-qPCR) of dysferlin, Sphingomyelin acid esferase (ASM), transcription factor EB (TFEB) Galectins 1 and 3 and Annexin A2. This study demonstrated that quantification by real time PCR using primers P21fw and P21rv was specific and sensitive for detection of T. cruzi in vivo and in vitro, as well as transcriptional levels of genes related to cytoskeletal organization and repair plasma membrane are modulated in response to damage generated by parasite. / Tese (Doutorado)

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2016-09-08T19:21:08Z No. of bitstreams: 2 Dissertacão - Taynara Cristina Gomes - 2016.pdf: 2697158 bytes, checksum: efd1f7ed4fcc4ac2659d5cde95cc18fd (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-09-09T14:50:58Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertacão - Taynara Cristina Gomes - 2016.pdf: 2697158 bytes, checksum: efd1f7ed4fcc4ac2659d5cde95cc18fd (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-09T14:50:58Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertacão - Taynara Cristina Gomes - 2016.pdf: 2697158 bytes, checksum: efd1f7ed4fcc4ac2659d5cde95cc18fd (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-07-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / The congenital transmission is considered one of the main pathways of Trypanosoma cruzi infection. Retrospective studies of pregnant women population with Chagas disease (CD) allow the study of the epidemiological profile of this population which contributes to the knowledge of the congenital CD prevalence in Brazil. This study evaluated the triage of T. cruzi congenital infection in new-borns through the newborn screening aiming the precocious detection of congenital transmission as well as its retrospective analysis of the seroepidemiological profile of the infected pregnant women dwelling in Goias State in a period of three years (2013-2015). The retrospective study used the data base of the Association of Parents and Friends of Special Needs Individuals (APAE) of Goiania. The analysis showed that the prevalence of CD infected pregnant women from 0.24% to 0.17%, with a decrease throughout the years. Most of these pregnant women had ≥31 years old, which is in accordance with the success of Triatoma infestans vectorial transmission control and transfusional control programmes, improvement in dwellings and better efficacy in diagnostics and therapeutics. The prospective study used the IFI and ELISA techniques for serology and filter paper detection. A total of 967 samples of dry blood in filter paper were collected in three public health units in Goiania and Aparecida de Goiania. From these samples 19 (1.96%) which were collected in filter paper from newborns were from mothers who declared to have CD. Results showed that 8 (42%) from the 19 samples were reagent to IgG anti-T. cruzi in both technique used. Peripheral blood was collected in seven mothers and their respective children. The serum samples were analyzed and the results confirmed IgG positive serology anti-T. cruzi with rates and titulation similar between mother and their respective newborn. Also there was accordance between the serology and the filter paper results which validates this strategy in the newborn screening triage from children from chronically infected mother. This study highlights the importance of the prenatal and neonatal care that precociously identifies the T. cruzi infection and also of programmes of health education about CD to the pregnant women population. / A transmissão congênita é considerada uma das principais vias de infecção pelo Trypanosoma cruzi. Estudos retrospectivos da população de gestantes com doença de Chagas (DC) viabilizam o estudo do perfil epidemiológico desta população, contribuindo para conhecimento da prevalência da DC congênita no Brasil. Este estudo avaliou a triagem de infecção por T. cruzi em recém-nascidos através do teste do pezinho, visando o diagnóstico precoce da transmissão congênita, como também a análise restrospectiva do perfil soroepidemiológico de gestantes infectadas residentes no estado de Goiás em um período de três anos (2013-2015). Para o estudo retrospectivo foi utilizado a base de dados da Associação de Pais e Amigos dos Excepcionais (APAE) de Goiânia. As análises mostraram que a prevalência de gestantes com DC variou de 0,24% a 0,17%, apresentando um declínio com o decorrer dos anos. Foi também possível evidenciar que a maioria destas gestantes possuía idade ≥31 anos, dados que corroboram com o sucesso de programas de controle da transmissão vetorial pelo Triatoma infestans e transfusional, melhoria habitacional e melhor eficiência do diagnóstico e da terapêutica. Para o estudo prospectivo foram utilizados os métodos de IFI e ELISA para a sorologia tanto em papel filtro (PF) e soro. Um total de 967 amostras de sangue seco em papel filtro (PF) foi coletado em três unidades de saúde pública em Goiânia e Aparecida de Goiânia, destes, 19 (1,96%), amostras de sangue em PF de RN foram de mães que se autodeclararam com a doença de Chagas. Os resultados mostraram que oito (42%) destas 19 amostras foram reagentes para IgG anti-T. cruzi em ambas as técnicas. Foi coletado sangue periférico em sete mães com seus respectivos filhos. As amostras de soro foram analisadas e os resultados confirmaram sorologia IgG anti-T. cruzi com índices e titulações semelhantes entre mães e seus respectivos RN, havendo concordância entre os resultados obtidos pela sorologia e o PF, validando esta estratégia na triagem dos RN de mães cronicamente infectadas. Este estudo salienta a importância de um acompanhamento pré-natal e neonatal que identifique precocemente a infecção por T. cruzi e também programas de conscientização sobre a DC na população de gestantes.

No capítulo 1, a modelagem HQSAR, a docagem e os estudos de ROCS foram construídos utilizando uma série de 57 inibidores de cruzaína. O melhor modelo HQSAR (q2 = 0,70, r2 = 0,95, r2test = 0,62, q2rand. = 0,09 and r2rand. = 0,26) foi utilizado para predizer a potência de 121 compostos extraídos da literatura (conjunto de dados V1), resultando em um valor de r2 satisfatório de 0,65 para essa validação externa. Uma validação externa adicional foi empregada utilizando uma série de 1223 compostos extraído dos bancos de dados ChEMBL e CDD (conjunto de dados V3); nessa validação externa o valor de AUC (área sob a curva) para a curva ROC foi de 0,70. Os mapas de contribuição, obtidos para o melhor modelo HQSAR 3.4, estão de acordo com as predições do modo de interação e com as bioatividades dos compostos estudados. Nos estudos de ROCS, a forma molecular utilizada como filtro, foi útil na rápida identificação de modificações moleculares promissoras para inibidores de cruzaína. O valor de AUC obtido com a curva ROC foi de 0,72, isso indica que o método foi muito eficiente na distinção entre inibidores ativos e inativos da enzima cruzaína. Em seguida, o melhor modelo HQSAR foi utilizado para predizer os valores de pIC50 para novos compostos. Alguns dos compostos identificados, utilizando esse método, demonstraram valores de potência calculada maior do que a série de treinamento em estudo. No capítulo 2, os efeitos sobre a potência na inibição da enzima cruzaína pela substituição de um grupo nitrila como warhead por outros grupos foi avaliada. Com a síntese de 20 compostos do tipo dipeptidil, avaliou-se a relação estrutura-atividade (SAR), baseado na troca do grupo warhead na porção P1\'. O grupo oxima foi mais potente que o grupo correspondente nitrila em 0,7 unidades logarítmicas. Os compostos do tipo dipeptidil aldeídos e azanitrila obtiveram potências mais elevadas do que o correspondente dipeptidil nitrila em duas de magnitude. Os compostos dipeptidil alfa-beta insaturados foram menos potentes do que o correspondente dipeptidil nitrila. No capítulo 3, estratégias de química medicinal foram empregadas nas sínteses de 23 novos análogos, contendo o esqueleto básico de imidazopiridina. Sete e doze compostos sintetizados exibiram EC50 <= 1µM in vitro contra os parasitos Tripanosoma cruzi (T. cruzi) e brucei (T. brucei), respectivamente. Com os resultados promissores de atividade biológica in vitro, citotoxicidade, estabilidade metabólica, ligação proteica e propriedades farmacocinéticas, o composto 41 foi selecionado como candidato para os estudos de eficácia in vivo. Esse composto foi submetido em um modelo agudo da infecção com T. cruzi em ratos (cepa Tulahuen). Depois de estabelecida a infecção, os ratos foram dosados duas vezes ao dia, durante 5 dias; e monitorados por 6 semanas usando um sistema de imagem in vivo IVIS (do inglês, \"In Vivo Imaging System\"). O composto 41 demonstrou inibição parasitária comparável com o grupo de treinamento dosado com benzonidazol. O composto 41 representa um potencial líder para o desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento de tripanossomíases. / In chapter 1, the HQSAR, molecular docking and ROCS were applied to a dataset of 57 cruzain inhibitors. The best HQSAR model (q2 = 0.70, r2 = 0.95, r2test = 0.62, q2rand. = 0.09 and r2rand. = 0.26) was then used to predict the potencies of 121 unknown compounds (the V1 database), giving rise to a satisfactory predictive r2 value of 0.65 (external validation). By employing an extra external dataset comprising 1223 compounds (the V3 database) either retrieved from the ChEMBL or CDD databases, an overall ROC AUC (area under the curve) score well over 0.70 was obtained. The contribution maps obtained with the best HQSAR model (model 3.4) are in agreement with the predicted binding mode and with the biological potencies of the studied compounds. We also screened these compounds using the ROCS method, a Gaussian-shape volume filter able to identify quickly the shapes that match a query molecule. The AUC obtained with the ROC curves (ROC AUC) was 0.72, indicating that the method was very efficient in distinguishing between active and inactive cruzain inhibitors. These set of information guided us to propose novel cruzain inhibitors to be synthesized. Then, the best HQSAR model obtained was used to predict the pIC50 values of these new compounds. Some compounds identified using this method has shown calculated potencies higher than those which have originated them. In chapter 2, the effects on potency of cruzain inhibition of replacing a nitrile group with alternative warheads were explored; with the syntheses of 20 dipeptidyl compounds, we explored the structure activity relationships (SAR) based on exchanging of the warhead portion (P1\'). The oxime was 0.7 units more potent than the corresponding nitrile. Dipeptide aldehydes and azadipeptide nitriles were found to be two orders of magnitude more potent than the corresponding dipeptide nitriles. The vinyl esters and amides were less potent than the corresponding nitrile by between one and two orders of magnitude. In chapter 3, we synthesized 23 new imidazopyridine analogues arising from medicinal chemistry optimization at different sites on the molecule. Seven and twelve compounds exhibited an in vitro EC50 <= 1µM against Trypanosoma cruzi (T. cruzi) and Trypanosoma brucei (T. brucei) parasites, respectively. Based on promising results of in vitro activity (EC50 &lt; 100 nM), cytotoxicity, metabolic stability, protein binding and pharmacokinetics (PK) properties, compound 41 was selected as a candidate for in vivo efficacy studies. This compound was screened in an acute mouse model against T.cruzi (Tulahuen strain). After established infection, mice were dosed twice a day for 5 days, and then monitored for 6 weeks using an in vivo imaging system (IVIS). Compound 41 demonstrated parasite inhibition comparable to the benznidazole treatment group. Compound 41 represents a potential lead for the development of drugs to treat trypanosomiasis.

Este trabalho descreve um novo modelo murino para o estudo da infecção crônica pelo T. cruzi usando o clone Sylvio X10/4. A infecção crônica de camundongos C3H/HePAS é caracterizada por intensas lesões inflamatórias no coração que podem ser comparáveis às observadas na doença de Chagas humana. Lesões moderadas também estavam presente na musculatura estriada esquelética desses animais. No coração dos animais crônicos foram detectados parasitas viáveis, confirmando a hipótese de que o desenvolvimento da patologia cardíaca na doença de Chagas está diretamente relacionada com a persistência do T. cruzi no tecido inflamado. Em contraste, camundongos A/J cronicamente infectados desenvolvem lesões no fígado e no músculo estriado, enquanto que no coração, não foram observados lesões nem parasitas. A análise fenotípica das gerações F1 e F2 (A/J X C3H/HePAS) sugere que a predisposição genética para desenvolver lesões teciduais na infecção pelo T. cruzi é heterogênea uma vez que a patologia no coração e no fígado é segregada na geração F2. Nossos resultados corroboram a hipótese que a heterogeneidade na patologia observada em pacientes com a doença de Chagas (ausência ou presença de lesões cardíacas ou digestivas) pode ser atribuída a fatores genéticos. / This work describes a novel murine model of the chronic infection by T. cruzi using the clone Sylvio X10/4. The infection in the C3H/HePAS mouse strain is characterized by intense inflammatory lesions in the heart, which can be comparable to the observed in the human Chagas\' disease. Moderate striated muscle lesions are also present in C3H/HePAS mice. In the heart of the chronic animals viable parasites were detected, confirming the hypothesis that the development of the heart pathology in the Chagas\' disease is related to parasite persistence in the inflamed tissue. By contrast, in infected A/J mice, develop lesions in the liver and skeletal muscle, while in the heart, lesions nor parasites were not observed. The phenotypic analysis of the generations F1 and F2 (A/J X C3H/HePAS) mice suggests that the genetic predisposition to develop the inflammatory lesions caused by T. cruzi is heterogeneous because the heart and liver pathology segregate in the F2 generation. These findings raise the hypothesis that the pathology heterogeneity observed in humans with Chagas\' disease (absence and presence of cardiac or digestive chronic lesions) can be attributed to host genetic factors.

Orientador: Hyun Mo Yang / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Matemática, Estatística e Computação Científica / Made available in DSpace on 2018-08-21T12:07:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Freitas_LuizFernandodeSouza_M.pdf: 2050755 bytes, checksum: 1743132cb43cdc46b8799405dfa205c2 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O organismo humano possui um complexo sistema de defesa: o sistema imunológico. Tal sistema apresenta diferentes respostas para diferentes ataques ao organismo. A co-infecção por parasitas como protozoário Tripanossoma cruzi e o vírus HIV aciona dois importantes mecanismos de defesa: a imunidade humoral a imunidade celular. Devido à fase crônica da Doença de Chagas, na maioria dos casos assintomática, esta é reativada quando as principais células de defesa do corpo, linfócitos T CD4 não ativos, sucumbem pela ação do vírus HIV. Com o objetivo de estudar a dinâmica de co-infecção por parte das doenças, Doença de Chagas e Síndrome da Imunodeficiência Adquirida, a resposta do sistema imunológico humano, um modelo matemático de equações diferenciais ordinárias autônomas não linear é elaborado. Tal modelo apresenta de forma simplificada a dinâmica entre sistema imunológico, protozoário Tripanossoma cruzi, vírus HIV e células alvo. Após simplificações, obtemos dois sub modelos, com o objetivo de elucidar os mecanismos de defesa do sistema imunológico: imunidade humoral e imunidade celular. A análise quantitativa dos modelos de imunidade faz-se necessária devido a suas complexidades. Sub casos são abordados, com o objetivo de avaliar a eficiência de anticorpos e células que secretam citocinas / Abstract: The human body has a complex system of defense: the immune system. Such a system has different answers for different attacks to the body. Co-infection by parasites such as Trypanossoma cruzi and HIV triggers two important defense mechanisms: humoral immunity cellular immunity. Due to the chronic phase of Chagas's disease, in most cases asymptomatic, it is reactivated, when the main defense cells of the body, linfocity T CD4 no active, succumb by the action of HIV. Aiming to study the dynamics of co-infection by the disease, Chagas's Disease and Acquired Immunode ficiency Syndrome, the response of the human immune system, a mathematical model of autonomous ordinary differential equations nonlinear is elaborate. This model presents a simplified dynamic among the immune system, protozoan Trypanossoma cruzi, HIV and target cells. After simplifications, we get two sub models, aiming to elucidate the defense mechanisms of the immune system: humoral and cellular immunity. Quantitative analysis of models of immunity is necessary due to its complexities. Sub cases are dealt with to evaluate the effectiveness of antibodies and cells that secrete cytokines / Mestrado / Matematica Aplicada / Mestre em Matemática Aplicada

Obesity is very widespread and detrimental to health. Obesity brings with it many changes including heightened immune function, and a higher prevalence of major cardiovascular disorders, cancer, diabetes, and Alzheimer disease. Obesity is also associated with shortened lifespan. The detrimental effects of obesity are linked to the "metabolic syndrome", a broad range of changes in metabolic processes and immune function. As a first approximation, we agree with this formulation but we will then proceed to document some of its weaknesses. (i) Crude mortality rates increase with increasing body mass index (BMI) but as the BMI approaches the normal range, mortality rates reverse (the now classic "J-shaped curve") so that individuals with reduced BMI have elevated mortality. (ii) A multiplicity of medical and surgical conditions have been reported where short term and medium term outcomes are better for overweight patients. These conditions are placed under the heading of "obesity paradox". (iii) The medical community has introduced a binary system for the metabolic syndrome ---- yes, patient has it or no, the patient does not have it, despite the fact that all of the changes that are considered components of the metabolic syndrome are continuous variables. Our work is focused on sharpening focus and improving...