Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AnaCBC.pdf: 1320381 bytes, checksum: 881b82ecb0df2b87414957a1e02761bb (MD5) Previous issue date: 2008-10-20 / One Kunitz-type trypsin inhibitors (PmTI) was purified from Piptadenia moniliformis seeds, a tree of the sub-family Mimosoideae, by TCA precipitation, affinity chromatography on immobilized trypsin-Sepharose, DEAE cellulose (ion exchange) and Superose 12 (molecular exclusion) column FPLC/AKTA. The inhibitor has Mr of 25 kDa by SDS-PAGE and chromatography molecular exclusion. The N-terminal sequence of this inhibitor showed high homology with other family Kunitz inhibitors. This also stable variations in temperature and pH and showed a small decrease in its activity when incubated with DDT in the concentration of 100mM for 120 minutes. The inhibition of trypsin by PmTI was competitive, with Ki of 1.57 x10-11 M. The activity of trypsin was effectively inhibited by percentage of inhibition of 100%, among enzymes tested, was not detected inhibition for the bromelain, was weak inhibitor of pancreatic elastase (3.17% of inhibition) and inhibited by 76.42% elastase of neutrophils, and inhibited in a moderate, chymotrypsin and papain with percentage of inhibition of 42.96% and 23.10% respectively. In vitro assays against digestive proteinases from Lepidoptera, Diptera and Coleoptera pests were carried out. Several degrees of inhibition were found. For Anthonomus grandis and Ceratitis capitata the inhibition was 89.93% and 70.52%, respectively, and the enzymes of Zabrotes subfasciatus and Callosobruchus maculatus were inhibited by 5.96% and 9.41%, respectively, and the enzymes of Plodia. interpunctella and Castnia licus were inhibited by 59.94% and 23.67, respectively. In vivo assays, was observed reduction in the development of larvae in 4rd instar of C. capitata, when PmTI was added to the artificial diet, getting WD50 and LD50 of 0.30% and 0.33%, respectively. These results suggest that this inhibitor could be a strong candidate to plant management programs cross transgenic / Um inibidor de tripsina da fam?lia Kunitz (PmTI) foi purificado de sementes de Piptadenia moniliformis, uma ?rvore da sub-fam?lia Mimosoideae, atrav?s da precipita??o com ?cido tricloroac?tico (TCA), cromatografia de afinidade com tripsina acoplada em sepharose, coluna DEAE- celulose(troca i?nica) e Superose 12 (exclus?o molecular) em sistema FPLC/AKTA. O inibidor possui massa molecular de 25 kDa como confirmado atrav?s de SDS-PAGE e cromatografia de exclus?o molecular. A seq??ncia do N-terminal deste inibidor mostrou alta homologia com outros inibidores da fam?lia Kunitz. Este tamb?m ? est?vel as varia??es de temperatura e pH, e apresentou um pequeno decr?scimo na sua atividade quando incubado com DTT na concentra??o de 100 mM por 120 minutos. A inibi??o da tripsina foi do tipo competitiva com Ki de 1,57x10-11 mM. A atividade da tripsina foi inibida efetivamente com percentual de inibi??o de 100%, entre as outras enzimas testadas n?o foi detectada inibi??o para a bromela?na, foi fracamente inibidor da elastase pancre?tica (3,17% de inibi??o), inibiu em 76,42% elastase de neutr?filos, inibiu de forma moderada quimotripsina e papa?na com percentual de inibi??o de 42,96% e 23,10%, respectivamente. Ensaios in vitro foram realizados com as proteinases digestivas de Lepid?ptera, Cole?ptera e D?ptera. V?rios graus de inibi??o foram encontrados. Para Anthonomus grandis e Ceratitis capitata a inibi??o foi de 89,93% e 70,52%, respectivamente, e as enzimas de Zabrotes subfasciatus e Callosobruchus maculatus foram inibidas com percentuais de 5,96% e 9,41% respectivamente, e as enzimas de Plodia interpunctella e Castnia licus foram inibidas com percentuais de 59,94% e 23,67%, respectivamente. No ensaio in vivo, foi observada redu??o no desenvolvimento de larvas em 4? ?nstar de C. capitata, quando PmTI foi adicionado ? dieta artificial, obtendo WD50 de 0,30% e LD50 0,33% . Estes resultados sugerem que este inibidor possa ser um forte candidato para programas de melhoramentos de plantas via transgenia

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A toxicidade ao meio ambiente, a baixa biodegrabilidade e a crescente resistÃncia de insetos praga da agricultura e de insetos vetores de doenÃas aos inseticidas tradicionalmente utilizados tem estimulado o desenvolvimento de alternativas com maior biodegradabilidade e especificidade, especialmente de origem vegetal. Nesse sentido, o presente estudo consistiu na purificaÃÃo, caracterizaÃÃo e avaliaÃÃo do efeito biolÃgico in vitro de um novo inibidor de tripsina obtido das sementes de Sapindus saponaria sobre as enzimas digestivas de insetos. AtravÃs de precipitaÃÃo com Ãcido tricloroacÃtico (TCA), cromatografia de afinidade à tripsina e cromatografia de fase reversa em sistema UFLC, foi purificado um novo inibidor de tripsina (SSTI2) pertencente ao grupo de inibidores do tipo Batata I, uma categoria de inibidores de peptidases serÃnicas com reconhecido efeito tÃxico sobre insetos. O inibidor nativo e fragmentos desse gerados por tratamento enzimÃtico com tripsina e pepsina foram analisados e sequenciados por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF e ESI-TOF, determinando assim a sua massa molecular acurada (MM = 7571, 976 Da) e elucidando a sua estrutura primÃria (64/69 aminoÃcidos). O inibidor apresentou uma IC50 de 8,3 x 10-2 μmol.L-1 contra a tripsina bovina, mas apresentou baixa atividade inibitÃria sobre as enzimas quimotripsina (13,24  0,28%) e papaÃna (5,28  0,42%), e nÃo foi capaz de inibir a proteÃlise promovida pela bromelaÃna. O SSTI2 inibiu moderadamente a atividade catalÃtica das enzimas digestivas totais dos insetos, com percentual de inibiÃÃo variando entre 4,74  0,45% a 56,06  1,41%. No entanto, o inibidor foi eficaz em atuar sobre as enzimas digestivas do tipo tripsina presentes nos intestinos dos insetos Aedes aegypti (92,44  0,99%), Anthonomus grandis (77,93  0,12%), Anticarsia gemmatalis (32,21  0,57%) e Spodoptera frugiperda (71,44  1,23%). Esse expressivo efeito inibitÃrio do SSTI2 sobre a atividade catalÃtica das peptidases do tipo tripsina provenientes do intestino mÃdio dos insetos sugere um possÃvel efeito supressor no desenvolvimento e sobrevivÃncia de insetos alimentados com dietas contendo o inibidor. Assim, futuros estudos in vivo e avaliaÃÃes de outras propriedades bioquÃmicas do inibidor serÃo importantes para determinar a potencial aplicaÃÃo biotecnolÃgica do SSTI2, especialmente para o combate de A. aegypti, A. grandis e A. gemmatalis. AlÃm disso, a sequÃncia do SSTI2 elucidada nesse estudo possibilita a sÃntese, clonagem do gene codificante e expressÃo heterÃloga dessa potencial ferramenta biotecnolÃgica. / Environmental toxicity, low biodegradability and increased resistance in agricultural pest insects and in insect vectors of diseases to insecticides traditionally used for their control have encouraged the development of chemical alternatives with greater specificity and biodegradability especially from plants. In this way, the present study aimed the purification, characterization and evaluation of activity towards pest insect digestive enzymes of a new trypsin inhibitor obtained from Sapindus saponaria seeds. This new trypsin inhibitor obtained from S. saponaria seeds (SSTI2) belongs to Potato I inhibitor family and was purified by protein precipitation with trichloroacetic acid, affinity chromatography and reverse phase chromatography using UFLC system. The native inhibitor and its fragments generated by enzymatic treatment with trypsin and pepsin were analyzed and sequenced by MALDI-TOF and ESI-TOF mass spectrometry, determining its accurate molecular mass (MM = 7571, 976 Da) and primary structure (64 of 69 amino acids). The SSTI2 showed an IC50 of 8.3 x 10-2 μmol.L-1 against bovine trypsin, and a much lower inhibitory activity on the enzymes chymotrypsin (13.24  0.28%) and papain (5.28  0 , 42%), but was unable to inhibit proteolysis promoted by bromelain. In spite to show moderate inhibition of total digestive enzymes (4.74  0.45% to 56.06  1.41%), the inhibitor was very effective upon trypsin-like enzymes present in Aedes aegypti (92.44  0.99%), Anthonomus grandis (77.93  0.12%), Anticarsia gemmatalis ( 32.21  0.57%) and Spodoptera frugiperda (71.44  1.23%) guts. This strong inhibitory effect of SSTI2 on the catalytic activity of trypsin-like peptidases of insectâs midguts suggests a possible suppressive effect on development and survival of insects fed with diets containing the inhibitor. Thus, future in vivo assays and evaluation of other biochemical properties will be important to establish the potential biotechnological application of SSTI2, especially for the combat of Ae. aegypti, A. grandis and An. gemmatalis. Furthermore, the sequence of SSTI2 elucidated in this study allows the chemical synthesis, cloning of coding gene sequence and heterologous expression of this potential new biotechnological tool.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / Castor bean (Ricinus communis L.) is an important crop for the Northeast of Brazil, which recently has been used to produce biodiesel. Around 90% of the castor bean production in Brazil is concentrated at Northeast region and the state of Cearà is the second largest producer. During the oil extraction process from the castor bean seeds, a resulting residue, called castor cake, is underutilized. However, this byproduct is rich in protein and micronutrients such as nitrogen, phosphorus and potassium, an attribute that qualifies it as a stuff that could be used as organic fertilizer or as animal feed, for example, bringing added value to it. Unfortunately, its use as food has not been possible because of the presence of toxic elements and allergens (ricin, ricinine, complex allergens) in its composition, unless it were previously submitted to a detoxification process. To date, the existing technologies to this end are not economically viable on an industrial scale. Therefore, studies to add value to this abundant byproduct generated in the castor bean biodiesel productive chain is of paramount importance. Thus, in this context, this study was performed to identify, isolate, purify and characterize new bioactive molecules of de-oiled castor cake with biotechnological potential. Through extraction of soluble proteins with 50 mM Tris-HCl pH 7.5, fractionation with ammonium sulfate (50-75%), following by hydrophobic interaction chromatography in Phenyl-Sepharose column and ion exchange chromatography (DEAE-Sepharose), a protein, named Rc-2S-Alb, able to inhibit trypsin was purified. Rc-2S-Alb has a molecular mass of approximately 75.8 kDa, as determined by SDS-PAGE, and under reducing conditions showed a large and a small protein band of 15.8 kDa and 10.5 kDa, respectively. Its NH2-terminal sequence showed similarity with the following proteins: putative 2S albumin precursor (89%), chain A of RicC3 (89%), and chain A of mabilin-1 (89%), all from R. communis seeds; and with the short chain of a "napin-like" protein from Brassica napus (89%). In addition, these similar proteins have two highly conserved domains: QEVQRKDLS and YLRQS. Comparison of the partial primary structure of Rc-2S-Alb generated by the ESI-Q-TOF MS/MS analysis of 17 tryptic peptides, showed 43% similarity to Mabinlin-1 (pI/Mr 6.7 and 29.3 kDa) from R. communis. There were also high similarities among the three-dimensional structures of Rc-2S-Alb, RicC3 and Mabinlin-1. Rc-2S-Alb did not inhibit the spore germination of the phytopathogenic fungi Fusarium oxysporum and Rizoctonia solani, but promoted aggregation of their respective spores. Moreover, Rc-2S-Alb did not inhibit the mycelial growth of Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Rizoctonia solani and Collethotricum gloeosporioides. Contrary, Rc-2S-Alb was effective in inhibiting the growth of the human pathogenic bacteria Pseudomonas aeruginosae, Klebsiella pneumoniae and Bacillus subtilis, at low concentrations. In conclusion, it was established a protocol to purify a new 2S albumin from castor bean cake, which inhibits trypsin and has important antibacterial activity. Thus, the Rc-2S-Alb should be further studied in order to verify its effectiveness as new alternative therapeutic agent against resistant bacteria to commercial antibiotics, which will contribute to improve the human health. / A mamoneira (Ricinus communis L.) à uma cultura importante para a regiÃo Nordeste do Brasil, onde, recentemente, tem sido utilizada para produÃÃo de biodiesel. O Nordeste detÃm 90% da produÃÃo brasileira de mamona, sendo o CearÃ, o segundo maior produtor. No processo de extraÃÃo de Ãleo das sementes de mamoneira para produÃÃo de biodiesel, o resÃduo resultante, denominado de torta da mamona, representa um subproduto pouco utilizado. Apesar disso, essa torta à rica em proteÃnas e micronutrientes, como nitrogÃnio, fÃsforo e potÃssio, atributo que a qualifica como um insumo que poderia ser utilizado como adubo orgÃnico, ou mesmo como raÃÃo animal, o que lhe agregaria valor comercial. Todavia, seu uso como alimento nÃo tem sido possÃvel por causa da presenÃa de elementos tÃxicos e alergÃnicos (Ricina, Ricinina, Complexos AlergÃnicos) na sua composiÃÃo, a nÃo ser que passasse por processamento para sua destoxificaÃÃo. Infelizmente, tecnologia economicamente viÃvel para esse fim, em escala industrial, ainda à inexistente. Portanto, hà necessidade de pesquisas que venham a agregar valor a esse subproduto abundante da cadeia produtiva do biodiesel. Assim, nesse contexto, o presente trabalho està inserido num projeto cujo objetivo maior à identificar, isolar, purificar e caracterizar novas molÃculas bioativas da torta delipidada de sementes de mamoeira com potencial biotecnolÃgico. AtravÃs de extraÃÃo de proteÃnas solÃveis com tampÃo Tris-HCl, 50 mM, pH 7,5, e fracionamento do extrato obtido com sulfato de amÃnio (50-75%), cromatografia de interaÃÃo hidrofÃbica em coluna Phenyl-Sepharose e cromatografia de troca iÃnica (DEAE-Sepharose) foi possÃvel purificar uma albumina 2S, denominada Rc-2S-Alb, capaz de inibir tripsina. A Rc-2S-Alb apresentou massa molecular de, aproximadamente, 75,8 kDa, determinada por SDS-PAGE, mas, em condiÃÃes redutoras, apareceu como uma banda maior de 15,8 kDa e outra menor com 10,5 kDa. Sua sequÃncia NH2-terminal revelou haver similaridade (89%) com o precursor putativo da albumina 2S de R. communis jà descrita, com a cadeia A da estrutura da RicC3 (89%), com a cadeia A da mabilin-1, ambas, tambÃm, de R. communis (89%), com a cadeia pequena de uma proteina ânapin-likeâde Brassica napus (89%). Em todas essas proteÃnas similares, dois domÃnios, QEVQRKDLS e YLRQS, sÃo altamente conservados. ComparaÃÃo da estrutura primÃria gerada por ESI-Q-TOF MS/MS, a apartir de 17 peptÃdeos trÃpticos da Rc-2S-Alb, mostrou similaridade de 43% com a Mabinlin-1 (pI/Mr de 6,7 e 29.3 kDa) de R. communis. Em relaÃÃo à estrutura tridimensional da Rc-2S-Alb, ela apresentou similaridade com a de Ric C3 e Mabinlin-1. A Rc-2S-Alb foi incapaz de inibir a germinaÃÃo de esporos dos fungos fitopatogÃnicos Fusarium oxysporum e Rizoctonia solani, mas foi capaz de promover a aglomeraÃÃo dos mesmos. A Rc-2S-Alb tambÃm nÃo foi capaz de inibir o crescimento micelial dos fungos Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Rizoctonia solani e Collethotricum gloeosporioides. Por outro lado, a Rc-2S-Alb foi eficiente em inibir o crescimento de Pseudomonas aeruginosae, Klebsiella pneumoniae e Bacillus subtilis, todas as bactÃrias patogÃnicas a seres humanos, quando em baixas concentraÃÃes. Como conclusÃo, foi possÃvel a purificaÃÃo de uma nova albumina 2S da torta da mamona, capaz de inibir tripsina e com atividade antibacteriana importante. Assim, a Rc-2S-Alb deve ser explorada no sentido de verificar sua eficÃcia como um novo agente terapÃutico alternativo no combate a bactÃrias resistentes aos produtos disponÃveis, hoje, no mercado, o que, se confirmado, poderà contribuir para a melhoria da saÃde humana.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A cultura da mamoneira (Ricinus communis L.) à de grande importÃncia socioeconÃmica devido Ãs suas sementes, que sÃo utilizadas, principalmente, na produÃÃo do Ãleo que pode ser empregado para diversos fins industriais. A extraÃÃo do Ãleo gera um subproduto de alto valor nutricional, conhecido como torta da mamona. PorÃm, a presenÃa de compostos tÃxicos e alergÃnicos dificulta utilizaÃÃo desse resÃduo como fonte de alimentaÃÃo animal. Outra forma de agregar valor à torta da mamona seria buscar molÃculas bioativas que pudessem ter aplicaÃÃes na agricultura e saÃde humana. O presente trabalho teve como objetivos purificar e caracterizar um inibidor de tripsina da torta da mamona, bem como, testar a atividade deste in vitro contra fungos fitopatogÃnicos de importÃncia agrÃcola e proteases do intestino mÃdio de Aedes aegypti. O inibidor de tripsina da torta da mamona, nomeado RcTI, foi purificado atravÃs de tratamento tÃrmico, coluna de afinidade em matriz de anidrotripsina-Sepharose 4B e cromatografia de troca iÃnica em ResourceTM Q. Essa proteÃna apresentou massa molecular aparente de 14,0 kDa na ausÃncia ou presenÃa de agente redutor, pI 5,2 e nÃo à uma glicoproteÃna. A sequÃncia NH2-terminal do RcTI purificado mostrou similaridade de 83% com uma proteÃna de armazenamento rica em enxofre (albumina 2S) de R. communis e de 48% com uma napin-like (albumina 2S) de R. communis. O RcTI mostrou-se estÃvel apÃs tratamento tÃrmico a 98 ÂC durante duas horas. Da mesma forma, permaneceu com atividade inibitÃria estÃvel na faixa de pHs Ãcidos. No entanto, houve uma perda de, aproximadamente, 20% na capacidade inibitÃria em pHs alcalinos (pH 8-11). O RcTI (13 Âg) nÃo foi capaz de inibir a germinaÃÃo de esporos dos fungos Fusarium oxysporum, Fusarium solani e Rhizoctonia solani. No entanto, foi capaz de inibir a germinaÃÃo de esporos de Colletotrichum gloeosporioides. O RcTI nÃo foi efetivo na inibiÃÃo de crescimento vegetativo dos fungos mencionados acima. Esse inibidor foi efetivo contra as proteases intestinais de Aedes aegypti com 91% de inibiÃÃo. A partir dos resultados obtidos neste trabalho, conclui-se que o RcTI tem potencial biotecnolÃgico, podendo ser utilizado como uma alternativa para o combate do importante fungo fitopatogÃnico C. gloeosporioides e larvas de A. aegypti. / The castor bean (Ricinus communis L.) culture is of great socioeconomic importance because of its seeds, which are used mainly for production of oil that can be used for various industrial purposes. The oil extraction generates a by-product of high nutritional value known as the castor cake. However, the presence of toxic and allergenic compounds hinders the use of this residue to feeding source. Another way to add value to the castor cake would be to seek bioactive molecules that could have applications in agriculture and human health. This study aimed to purify and characterize a trypsin inhibitor of castor cake and, to test this in vitro activity against phytopathogenic fungi of agricultural importance and proteases from the midgut of Aedes aegypti. The trypsin inhibitor of castor cake, named RcTI, was purified by heat treatment, affinity column in anhydrotrypsin-Sepharose 4B and ion-exchange chromatography ResourceTM Q. RcTI has a apparent molecular mass of 14 kDa in the absence or presence of a reducing agent, pI 5.2 and isnât a glycoprotein. The NH2-terminal sequence of purified RcTI showed 83% similarity with sulfur-rich storage protein (2S albumin) R. communis and 48% with napin-like (2S albumin) R. communis. The RcTI was stable after heat treatment at 98 ÂC for two hours. The inhibition on trypsin was stable in the acid pH range. However, there was a loss of approximately 20% inhibitory effect on alkaline pH (pH 8-11). The RcTI (13 Âg) was unable to inhibit the germination of spores of the fungus Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani and Fusarium solani. However, it was able to inhibit the germination of spores of Colletotrichum gloeosporioides. RcTI 100 Âg was not effective in the inhibition of vegetative growth of the fungi mentioned above. This inhibitor was effective against proteases from the midgut of Aedes aegypti with 91% inhibition. The results of the present study indicate that RcTI has biotechnological potential, can be used as an alternative to combat the important plant pathogenic fungus C. gloeosporioides and larvae of A. aegypti.

A soja vem ganhando destaque, pois alguns estudos apontam uma série de potenciais benefícios para a saúde. Estão presentes na soja dois grupos de inibidores de proteases. Alguns estudos demonstram que o tratamento térmico pode não ser suficiente para a inativação completa desses inibidores. Esses inibidores podem afetar a digestibilidade da proteína e a absorção e biodisponibilidade de alguns minerais, como o ferro. Realizaram-se cinco tratamentos: T1 e T2 – com secagem prévia + 10 e 15 minutos de forno, respectivamente; T3, T4 e T5 – sem secagem prévia + 45, 50 e 60 minutos de forno. O controle foi seco em estufa (55ºC) durante 31 horas. A quantidade de ferro nas amostras analisadas variou de 83,67 a 58,8 mg/kg e a porcentagem de ferro dialisado foi de 0,95% a 1,38%, estando de acordo com o encontrado na literatura. Os valores da digestibilidade da proteína in vitro variaram de 91,21% a 93,14%, sem que houvesse correlação com os inibidores de tripsina, sendo a melhora da digestibilidade devida ao tratamento térmico. A atividade dos inibidores de tripsina para os tratamentos com secagem prévia variou de 25,24 a 23,94 UTI/mg de proteína e para os sem secagem prévia de 46,39 a 38,33 UTI/mg de proteína. A atividade dos inibidores para o controle foi de 55,81 UTI/mg de proteína. Os valores estão de acordo com a literatura, sendo, portanto, considerados como adequados, mostrando que a tostagem em forno convencional é bastante eficaz quanto à inativação do inibidor de tripsina. Após a proteólise in vitro, verificou-se reativação dos inibidores de tripsina em todos os tratamentos analisados. Os valores variaram de 5,48 UTI/mg de proteína (controle) a 7,65 UTI/mg de proteína (T1). As maiores porcentagens foram para os tratamentos com secagem prévia, 30,31% e 28,45%, enquanto que para os sem secagem prévia foi de 14,68%, 14,12% e 19,38%. O controle apresentou 9,82% de reativação. Concluiu-se que a tostagem em forno convencional inativou os inibidores de tripsina, sendo o tratamento sem secagem prévia o mais eficaz, pois, com esse tratamento, houve menor reativação dos inibidores após a proteólise in vitro. A tostagem foi responsável pela melhora da digestibilidade da proteína e da diálise de ferro in vitro. O tratamento que promoveu a maior aceitabilidade dos grãos de soja tostados foi o que recebeu o tempo intermediário de 50 minutos, sem secagem prévia. / The soy comes gaining prominence, therefore some studies point a series of potential benefits with respect to the health. Two groups of inhibitors of proteases are present in the soy. Some studies demonstrate that the thermal treatment can not be enough for the complete inactivation of these inhibitors. These inhibitors can affect the digestibility of the protein and the absorption and availability of some minerals, as the iron. Five treatments had been do: T1 and T2 - with previous drying + 10 and 15 minutes of oven, respectively; T3, T4 and T5 - without previous drying + 45, 50 and 60 minutes of oven. The control was dry in oven (55ºC) during 31 hours. The amount of iron in the analyzed samples varied of 58,8 the 83,67 mg/kg and percentage of dialysed iron was of 0,95% the 1.38%, being in accordance with the found one in literature. The values of the digestibility of protein in vitro had varied of 91,21% the 93.14%, without that it had correlation with trypsin inhibitors, being the improvement of the digestibility due to the thermal treatment. The trypsin inhibitors activity for the treatments with previous drying varied of 25,24 the 23,94 UTI/mg of protein and for the ones without previous drying varied of 38,33 the 46,39 UTI/mg of protein. The inhibitors activity for the control was of 55,81 UTI/mg of protein. The values are according with the literature, being, therefore, considered as adjusted, showing that the roasting in conventional oven is sufficiently efficient how much to the inactivation of trypsin inhibitors. After proteolysis in vitro, verified reactivation of trypsin inhibitors in all the analyzed treatments. The values had varied of 5,48 UTI/mg of protein (control) the 7,65 UTI/mg of protein (T1). The biggest percentages had been for the treatments with previous drying, 30.31% and 28.45%, while that for the ones without previous drying it was of 14,68%, 14.12% and 19,38%. The control presented 9.82% of reactivation. The treatment the most efficient without previous drying was concluded that the roasting in conventional oven inactivated trypsin inhibitors, being, therefore, with this treatment, proteolysis had minor after reactivation of inhibitors in vitro. The roasting was responsible for the improvement of the digestibility of protein and dialyse of the iron in vitro. The treatment that promoted the biggest acceptability of the roasted grains of soy was what it received the time intermediate from 50 minutes, without previous drying.

A pancreatite crônica é uma desordem complexa, na qual a interação entre fatores ambientais e genéticos resulta na enfermidade. O presente estudo incluiu 148 pacientes com diagnóstico de pancreatite crônica, 110 etilistas crônicos e 297 controles sadios com o objetivo de investigar a frequência de tabagismo e das mutações N34S e P55S do gene SPINK1 e R254W do gene CTRC nesta população. Foi aplicado questionário presencial e realizada reação de sequenciamento para a pesquisa das mutações genéticas, após assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. Os portadores de pancreatite crônica possuíam etiologia alcoólica em 74% das vezes e idiopática em 26%. A pancreatite alcoólica apresentou-se de maneira distinta da pancreatite crônica idiopática, sendo que o primeiro grupo é composto por maior prevalência do gênero masculino (88,18% versus 34,21%), por maior média de idade (55,64 anos versus 45,20 anos), menor frequência de caucasianos (63,89% versus 84,21%), menor escolaridade (23,30% concluíram ensino médio ou superior versus 57,89%) e maior frequência de repercussões da doença, como diarréia (54,21% versus 24,24%), emagrecimento (56,07% versus 24,24%), diabete melito (57,94% versus 36,36%) e ocorrência de pseudocistos pancreáticos (31,78% versus 12,12%), repercussões estas que não foram acompanhadas de maior frequência de alterações morfológicas, como calcificações pancreáticas ou dilatação do ducto pancreático principal. A frequência de tabagismo foi significativamente maior em pacientes com pancreatite crônica alcoólica do que em etilistas sem pancreatite crônica, podendo ser considerado cofator de risco para o desenvolvimento da pancreatite crônica entre alcoolistas (p = 0,002); a frequência da mutação N34S do gene SPINK1 em pacientes com pancreatite crônica foi de 3,38%, maior do que a frequência de 0,49% encontrada nos grupos controle (p = 0,016); a frequência de 2,03% da mutação P55S do gene SPINK1 e a frequência de 0,67% da mutação R254W do gene CTRC, encontradas nos pacientes com pancreatite crônica, não diferiram estatisticamente quando comparadas às frequências, de 0,49% de ambas mutações, encontradas nos grupos controle. (p = 0,120 e 0,751). Pela investigação da associação de tabagismo e da mutação N34S do gene SPINK1 com as características clínicas e morfológicas da pancreatite crônica, verificou-se que a mutação N34S não se associou a maior gravidade da apresentação clínica ou morfológica da pancreatite crônica; no entanto o tabagismo associou-se a maior frequência de diabete melito entre os portadores de pancreatite crônica. Concluiuse que o tabagismo e a mutação N34S do gene SPINK1 podem ser considerados cofatores de risco para o desenvolvimento da pancreatite crônica / Chronic pancreatitis is a complex disorder in which the interaction between environmental and genetic factors results in the disease. This study included 148 patients with chronic pancreatitis, 110 chronic alcoholics and 297 healthy controls in order to investigate the frequency of smoking and N34S and P55S mutation of SPINK1 gene and R254W of CTRC gene in this population. A questionnaire was applied and gene sequencing was done, after having the Informed Consent Statement. Those with chronic pancreatitis had alcoholic etiology in 74% of cases and idiopathic in 26%. Alcoholic pancreatitis presented in a distinct way of idiopathic chronic pancreatitis. The first group is composed of a higher prevalence of males (88.18% versus 34.21%), by higher mean age (55.64 years versus 45.20 years), lower frequency of Caucasians (63.89% versus 84.21%), lower education (23.30% completed secondary or higher education versus 57.89%) and worst impact from the disease such as diarrhea (54.21% versus 24.24%), weight loss (56.07% versus 24.24%), diabetes mellitus (57.94% versus 36.36%) and occurrence of pancreatic pseudocysts (31.78% versus 12 , 12%). These effects were not accompanied by increased frequency of morphological changes, such as pancreatic calcifications or dilation of the main pancreatic duct. The frequency of smoking was significantly higher in patients with alcoholic pancreatitis than in alcoholics without chronic pancreatitis, therefore tabagism may be considered as a cofactor for the development of chronic pancreatitis among alcoholics (p = 0.002); the frequency of N34S mutation of SPINK1 gene in patients with chronic pancreatitis was 3.38%, higher than the rate of 0.49% found in the control groups (p = 0.016); the frequency of 2.03% of the P55S mutation of SPINK1 gene and the frequency of 0.67% of the CTRC gene R254W mutation found in patients with chronic pancreatitis were not statistically different when compared to the frequencies of 0.49% of both mutations, found in the control groups. (p = 0.120 and 0.751) For the investigation of the association of smoking and N34S mutation of SPINK1 gene with the clinical and morphological features of chronic pancreatitis, it was noticed that the N34S mutation did not determine a greatest severity in the presentation of chronic pancreatitis, however smoking was associated with a higher frequency of diabetes mellitus in patients with chronic pancreatitis. It was concluded that smoking and the N34S mutation of SPINK1 gene are positively correlated with chronic pancreatitis

La relation qui lie la séquence d'une protéine à sa fonction nous échappe toujours en grande partie, pourtant elle est essentielle à la compréhension de l'évolution moléculaire.La microfluidique permet de remplacer les traditionnels tubes à essais par des micro-gouttelettes afin de tester séparément des mutants d'enzyme à des fréquences de l'ordre du kilohertz. Cette technique fournit un moyen de coupler le génotype et le produit de l'activité enzymatique (phénotype). Sélectionner et récupérer les gouttelettes sur demande et séquencer leur contenu permet d'effectuer la cartographie génotype-phénotype de millions de mutants d'enzymes en une seule expérience.Au cours de cette thèse, j'ai tout d'abord développé un système microfluidique basé sur l'expression de protéines in vitro afin de pouvoir réaliser la cartographie génotype-phénotype de Streptomyces griseus aminopeptidase (SGAP). Des gènes mutants de l'enzyme SGAP sont encapsulés (un par gouttelette au maximum) amplifiés, exprimés et testés contre un substrat fluorogénique. Des incompatibilités entre les étapes d'amplification, d'expression et d'essai enzymatique en gouttelettes obligent à réaliser chacune de ces étapes séparément et successivement, afin de diluer le produit de chaque réaction par l'électro-coalescence des gouttelettes. Je montre qu'un work-flow microfluidique dans lequel (i) les gènes sont encapsulés et amplifiés dans des gouttes de 0.2 pL, (ii) exprimés in vitro, (iii) testés contre un substrat fluorogenique dans des gouttelettes de 20 pL, permet de mesurer l'activité de variants de SGAP avec un contraste important. Afin d'optimiser l'essai enzymatique en gouttelettes de SGAP, j'ai aussi développé, en collaboration avec Dr. Johan Fenneteau (Laboratoire de Chimie Organique, ESPCI Paristech), un nouveau substrat fluorogénique basé sur une rhodamine hydrophile. Cette sonde est caractérisée par un échange limité de la rhodamine entre les gouttelettes.J'ai ensuite développé un work-flow microfluidique in vivo, pour Ratus norvegicus trypsin (la trypsine du rat), dans lequel les capacité de sécrétion de Bacillus subtilis sont utilisées afin de simplifier les expériences. Des cellules uniques de B. subtilis sont encapsulées dans des gouttelettes de 20 pL où elles sécrètent des mutants de la trypsine en protéine de fusion avec un rapporteur permettant de mesurer le niveau d'expression. Les mutants sont testés par électro-coalescence avec des gouttelettes de 2 pL contenant un substrat fluorogénique de la trypsine. En normalisant l'activité totale détectée par la fluorescence du rapporteur du niveau d'expression, l'efficacité catalytique peut être directement mesurée en gouttelettes. C'est la première fois qu'un système expérimental d'essai enzymatique haut-débit fournit l'opportunité de mesurer directement l’efficacité catalytique de mutants d'une enzyme à une fréquence de l'ordre du kilo Hertz. Une méthode afin de réaliser la mutagenèse saturée (tous les simples mutants) du gène de la trypsine du rat a aussi été développée. Combinée au séquençage nouvelle génération, la méthode microfluidique développée permettra de réaliser la première cartographie génotype-phénotype de tous les simples mutants de la trypsine du rat / The question of how sequence encodes proteins' function is essential to understand molecular evolution but still remains elusive.Droplet-based microfluidics allows to use micro-metric droplets as reaction vessels to separately assay enzyme variants at the kHz frequency. It also provides an elegant solution to couple the genotype with the product of the catalytic activity of enzymes. Sorting droplets on demand and sequencing their content enables to map the genotype of millions of enzyme variants to their phenotype in a single experiment.First, I developed a cell-free microfluidic work-flow to carry out genotype-phenotype mapping of Streptomyces griseus aminopeptidase (SGAP). Single enzyme variant genes are encapsulated and amplified in droplets, expressed, and assayed against a fluorogenic substrate. Incompatibilities between gene amplification, expression and assay reactions, constrain to execute each one of those steps successively and to dilute the product of each reaction by droplet electro-coalescence. I show that a work-flow in which (i) genes are encapsulated and amplified into 0.2 pL droplets, (ii) expressed using cell-free expression reagents in 2 pL droplets and (iii) assayed with a fluorogenic substrate in 20 pL droplets, allows to measure SGAP variants activity with high contrast. To optimize the SGAP droplet assay, I also developed in collaboration with Dr. Johan Fenneteau (Laboratory of Organic Chemistry, ESPCI Paristech), a hydrophilic rhodamine based substrate, characterized by limited exchange of the released fluorophore between droplets.Second, I developed an in vivo microfluidic work-flow on Ratus norvegicus trypsin (rat trypsin), in which Bacillus subtilis secretion abilities are used to simplify the microfluidic work-flow. Single B. subtilis cells are encapsulated in 20 pL droplets where they secrete trypsin variants as fusion proteins with a fluorescent expression-level reporter. The variants are assayed by droplet electro-coalescence with 2 pL droplets containing a trypsin fluorogenic substrate. Trypsin variants catalytic efficiency can be directly measured in droplets, by normalizing the total trypsin activity by the expression-level reporter fluorescence. This is the first time a high-throughput protein assay work-flow gives the opportunity to directly measure the catalytic efficiency of enzyme variants at the kHz frequency. A method to carry out saturated mutagenesis on the rat trypsin gene was also developed. Together with deep sequencing, the developed experimental work-flow will allow to perform the first quantitative genotype-phenotype mapping of all single point mutants of the rat trypsin protein

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第22148号 / 医博第4539号 / 新制||医||1039(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 坂井 義治, 教授 小西 靖彦, 教授 滝田 順子 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

O presente trabalho avaliou a efetividade do tratamento com tripsina (TT) na eliminação do BoHV-1 Colorado, causador da Rinotraqueíte Infecciosa Bovina (IBR). Camundongos fêmeas Swiss, com idade entre 6 e 8 semanas, foram superovuladas com 0,2mL a 5UI de hormônio eCG e, após 48h com hCG e acasaladas com machos inteiros da mesma linhagem e idade. Após 18 horas, as fêmeas foram eutanasiadas e, através de abertura no peritônio, os zigotos foram coletados. Foram separados zigotos para cinco ensaios que forneceram os seguintes dados: o BoHV-1 Colorado altera a taxa de clivagem e a morfologia do embrião; a tripsina, seguindo recomendações da IETS, não danifica o embrião; os embriões expostos aos vírus e submetidos ao TT não alteram sua morfologia e taxa de clivagem; foram detectados (nested-PCR+) vírus viáveis (MDBK+) após o TT. Estes resultados demonstram que o TT não foi efetivo para eliminar o BoHV-1 Colorado, porém em alguns ensaios o TT demonstrou eficiência na inativação do vírus o que torna-o um importante método de controle in vitro. / This study evaluated the effectiveness of treatment with trypsin (TT) in the elimination of BoHV-1 Colorado, which causes infectious bovine rhinotracheitis (IBR) Swiss female mice, aged 6 and 8 weeks, were superovulated with 0.2 mL 5UI hormone eCG and 48h after hCG and mated with males of the same lineage and age. After 18 hours, females were euthanized, and through na opening in the peritoneum, the zygotes were collected. Zygotes were separated for five trials that provided the following data: the Colorado BoHV-1 alters the cleavage rate and embryo morphology; trypsin, following recommendations of the IETS, does not damage the embryo; the embryos exposed to the virus and subjected to TT does not change their morphology and cleavage rate; were detected (nested-PCR +) viable virus (MDBK +) after the TT. These results demonstrate that TT was not effective to eliminate the BoHV-1 Colorado, but in some tests showed the TT efficiency in inactivating the virus makes it na important method of control in vitro.

Introdução: As proteinases tem um papel importante no desenvolvimento, na destruição tecidual e na produção de muco causada pela DPOC. O inibidor de proteinase de origem vegetal Enterolobium contortisiliquum Tripsin Inhibitor (EcTI) inibe tanto as proteinases da classe serina quanto da classe cisteína. Objetivos: Avaliar os efeitos do tratamento com EcTI nas alterações pulmonares induzidas pela elastase em camundongos. Métodos: Camundongos C57Bl6 receberam elastase via intratraqueal (50 uL/animal, grupo ELA) ou salina (grupo SAL). Os camundongos foram tratados com EcTI (2mg/kg) nos dias 1, 15 e 21 após a instilação de elastase (grupo ELA-EcTI) ou salina (grupo SAL-EcTI). No dia 28 do protocolo, os animais foram anestesiados, a mecânica pulmonar foi medida e o óxido nítrico exalado coletado. Posteriormente, foi realizado o lavado broncoalveolar e os pulmões foram removidos para a preparação de lâminas de histoquímica e imunohistoquímica. Por meio de morfometria analisamos o número de células positivas para neutrófilos, TNF-alfa, MMP-9, MMP-12, TIMP-1, iNOS, eNOS assim como a fração de volume de 8-iso-PGF2alfa, fibras colágenas e elásticas, nos septos alveolares e nas vias aéreas. Também foram avaliados o número de células positivas para macrófagos nos septos alveolares e MUC5ac nas vias aéreas. Resultados: O inibidor de proteinase EcTI reduziu as alterações de mecânica pulmonar (Ers, Htis e Raw), destruição do septo alveolar (Lm) e o número de células no lavado broncoalveolar (células totais, macrófagos, neutrófilos, linfócitos e eosinógilos) induzidos pela elastase. Em relação a resposta inflamatória, o EcTI reduziu o número de neutrófilos e de células TNFalfa positivas no septo alveolar e nas vias aéreas além de reduzir o número de macrófagos no septo alveolar. Considerando o remodelamento de matriz extracelular, o inibidor de proteinase atenuou a fração de volume de fibras colágenas e o número de células MMP-9 e MMP-12 positivas nos septos alveolares e nas vias aéreas. Além disso, nas vias aéreas ocorreu uma atenuação da fração de volume de fibras elásticas, e nos septos alveolares uma atenuação da quantidade de células que expressam TIMP-1. Em relação a resposta de estresse oxidativo, o EcTI reduziu a fração de volume de isoprostano e o número de células iNOS e eNOS positivas tanto nos septos alveolares quanto nas vias aéreas. O EcTI também reduziu o número de células MUC5ac positivas nas vias aéreas. Conclusões: O tratamento como inibidor EcTI modulou a mecânica pulmonar e reduziu as alterações inflamatórias, de remodelamento e de estresse oxidativo induzidas pela elastase intratraqueal. Embora sejam necessários mais estudos para elucidar os mecanismos envolvidos neste processo, o inibidor de proteinase EcTI pode ser considerado como um potencial instrumento terapêutico para o tratamento da DPOC / Background: Proteinases play a key role on emphysema development, tissue destruction and mucus production. Enterolobium contortisiliquum Tripsin Inhibitor (EcTI) is a proteinase inhibitor from plant that neutralizes serine and cysteine proteinases. Aims: To evaluated the effects of the EcTI treatment in pulmonary alterations induced by elastase in mice. Methods: C57Bl6 mice received elastase intratracheally (50 uL/animal, ELA group) or saline (SAL group). Afterwards, mice were treated with EcTI (2 mg/kg) at days 1, 15 and 21 after elastase instillation (ELA-EcTI group). Control group received saline and EcTI using the same protocol (SAL-EcTI group). At day 28, mice were anesthetized, respiratory mechanics were collected, and exhaled nitric oxide were analyzed. Afterwards, broncoalveolar lavage fluid was obtained and lungs were removed to perform histochemistry and immunohistochemistry stains. By morphometry, the number of neutrophils, TNF-alfa, MMP-9, MMP-12, TIMP-1, iNOS, eNOS positive cells as well as the volume proportion of 8-iso-PGF2alfa, collagen and elastic fibers content in alveolar septum and airways walls were performed. In airways walls, we also analyzed the number of MUC-5 positive cells and the number of macrophages. Results: The proteinase inhibitor EcTI was able to reduce the pulmonary mechanical alterations (Ers, Htis and Raw), alveolar septum disruption (Lm) and the BAL cell count (total cells, macrophages, neutrophils, lymphocytes and eosinophils) induced by elastase. Regarding the inflammatory response, EcTI also reduced the number of neutrophils and TNFalfa positive cells in both alveolar septum and airway walls, and also reduced the number of macrophages in alveolar septum. Considering the extracellular matrix remodeling, the proteinase inhibitor attenuated the volume fraction of collagen fibers, MMP-9 and MMP-12 positive cells in both alveolar septum and airway walls. Besides, in airway there were attenuation in the volume fraction of elastic fibers, and in the alveolar septa a decrease of the amount of the cells expressing TIMP-1. Regarding the oxidative stress response, EcTI reduced the volume fraction of isoprostane and the number of iNOS and eNOS positive cells in both airways walls and alveolar septa, Finally, EcTI reduced the number of MUC5ac positive cells in airway walls. Conclusions: The treatment with EcTI modulated lung mechanics and reduced inflammatory, remodeling and oxidative stress alterations induced by elastase. Although more studies need to be performed to elucidate the mechanisms involved in this process, we may considerate EcTI as a potential therapeutic tool for COPD management